CN107541474A - 解淀粉芽孢杆菌的固态发酵物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物发酵，具体公开了解淀粉芽孢杆菌的固态发酵方法。本发明通过优化芽孢杆菌固态发酵工艺和固态发酵培养基的配方，显著提升了解淀粉芽孢杆菌固态发酵的产孢率，提高了解淀粉芽孢杆菌固态发酵物及固态发酵菌剂的品质。所述发酵工艺的重点为：将解淀粉芽孢杆菌种子液接种至固态发酵培养基中，自32℃至36℃进行阶段升温发酵(32℃培养24h后升高1℃，之后每培养6h将培养温度升高1℃，至36℃培养6h后结束)。所述固态发酵培养基的配方：麦麸15～25份，豆粕50～60份，稻谷壳1～10份，乳糖0.01～0.05份，大豆蛋白胨0.05～0.10份，NaCl 0.01～0.10份，MnSO₄ 0.001～0.005份，MgSO₄·7H₂O 0.001～0.005份，水5～20份。

Description

解淀粉芽孢杆菌的固态发酵物及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵，具体地说，涉及解淀粉芽孢杆菌的固态发酵。

背景技术

近年来，过量滥用化肥农药等化学品所造成的环境污染、土壤多样性破坏、食品安全等问题日益严峻。随着人们保护环境的意识逐渐增强，对无公害农产品的日益重视，探寻高效、安全、环保的微生物菌剂以替代或部分替代化肥和农药的研究受到越来越多的关注。

芽孢杆菌是一类非常重要的植物根际促生菌资源，能够产生抗菌脂肽抑制病原微生物，分泌促生因子铁载体、植物激素、ACC脱氨酶及挥发性有机物，改善根际营养状况和菌群结构等多种功能。另一方面，芽孢杆菌具有很强的抗逆性、耐高温、耐酸碱，因其独特的营养体-芽孢-营养体的生活周期受到微生物菌剂青睐。芽孢杆菌正成为国内外热点研究的植物根际促生菌。

现今，将有益芽孢杆菌制备成微生肥料是植物根际促生菌研究的必然发展方向。微生物肥料主要通过固态发酵和液态发酵两种工艺来制备。固态发酵有以下优点：低成本，低能耗，产品稳定易于运输，且具有大规模生产的开发前景。因此，制备芽孢杆菌固态菌剂，明确其对植物促生的影响，对提高作物产量与品质、发展绿色食品具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌的固态发酵物及其制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了解淀粉芽孢杆菌的固态发酵方法，将解淀粉芽孢杆菌种子液接种至固态发酵培养基中，自32℃至36℃进行阶段升温发酵。

本发明通过试验研究发现，采用梯度升温法，自32℃至36℃进行阶段升温发酵，可在很大程度上提高解淀粉芽孢杆菌的产孢率。

进一步地，本发明对固态发酵培养基的配方进行了研究并实现了优化：

作为优选，所述固态发酵培养基由如下重量份的原料混合而成：麦麸15～25份，豆粕50～60份，稻谷壳1～10份，乳糖0.01～0.05份，大豆蛋白胨0.05～0.10份，NaCl 0.01～0.10份，MnSO₄ 0.001～0.005份，MgSO₄·7H₂O 0.001～0.005份，水5～20份。

本发明通过试验发现：

(1)符合上述配方的固态发酵培养基，拥有较佳的碳氮比，可同时兼顾较高的菌落生长速度和较高的活菌数。

(2)相比葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉，乳糖能显著促进解淀粉芽孢杆菌活菌数的增加。

(3)由于解淀粉芽孢杆菌为好氧菌，固态基质中的通气量对其发酵的影响很重要，稻谷壳坚硬的外壳能够对固态基质起到有效的支撑作用，增加了固态基质中空气的流动性，符合上述配方的固态发酵培养基，由于稻谷壳添加量适宜，能够显著提高解淀粉芽孢杆菌的活菌数。

更为优选，所述固态发酵培养基由如下重量份的原料混合而成：麦麸20份，豆粕56份，稻谷壳4份，乳糖0.04份，大豆蛋白胨0.076份，NaCl 0.04份，MnSO₄ 0.002份，MgSO₄·7H₂O 0.004份，水10份。

进一步地，所述阶段升温发酵具体为32℃培养24h后升高1℃，之后每培养6h将培养温度升高1℃，至36℃培养6h后结束。即32℃培养24h、33℃培养6h、34℃培养6h、35℃培养6h、36℃培养6h(共48h)。

本发明通过试验研究发现，缓慢升温的方式比快速升温的方式更加利于活菌数和产孢率的提高。

进一步地，所述固态发酵方法具体包括如下步骤：

S1、菌种活化：取解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线培养，进行菌种活化；

S2、一级种子液制备：取活化后的菌落，接种至LB液体培养基进行一级种子液制备；

S3、二级种子液制备：将一级种子液传代于LB液体培养基进行二级种子液制备；

S4、固态发酵：将芽孢杆菌二级种子液接种至固态发酵培养基中，自32℃至36℃进行阶段升温发酵，结束发酵后烘干即得固态发酵物。

其中，步骤S4中，随着固态发酵培养基装瓶量的增大，解淀粉芽孢杆菌的活菌数呈现先增加后减少的趋势，因此优选固态发酵培养基的装瓶量为40％-50％；接种量对解淀粉芽孢杆菌的活菌数的影响也呈先增大后减小的趋势，因此优选接种量为2％-5％。

进一步地，本发明还优化了发酵后的干燥工艺，经研究发现，干燥工艺对活菌数和产孢率的影响较大，最终优化烘干条件为60℃干燥10h，可以显著提升产孢率，从而大幅度地提高固态发酵物或固态菌剂的品质。

作为优选，所述解淀粉芽孢杆菌选用保藏编号为CGMCC NO.10044的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)L-H15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2014年11月21日。

第二方面，本发明提供了应用前述方法制备得到的固态发酵物，以及包含该固态发酵物或由该固态发酵物制备得到的固态发酵菌剂。

按照前述方法制备得到的固态发酵物或固态发酵菌剂中的活菌数可达10⁹CFU/g，产孢率为(90±5)％。所述固态发酵菌剂可按10g/袋的重量分装，贮存于4℃。

本发明的有益效果在于：

本发明通过优化芽孢杆菌固态发酵工艺，显著提升了解淀粉芽孢杆菌固态发酵的产孢率，提高了解淀粉芽孢杆菌固态发酵物及固态发酵菌剂的品质。

芽孢杆菌固态菌剂及其在植物栽培中的应用具有可观的经济效益。本发明所采用的固体培养基原料均是采用农副产品下脚料，成本低，配方合理。解淀粉芽孢杆菌固态菌剂发酵工艺简单，不需要大型设备，对人员要求也相对较低。本发明对环境污染小，能耗低，符合国家产业政策。实验证明利用本发明方法制备的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂的有效活菌数可达100亿/克以下。本发明制备的解淀粉芽孢杆菌固态菌剂对于植物促生具有重大经济价值，特别是经济植物的栽培具有重大应用价值。

芽孢杆菌固态菌剂及其在植物栽培中的应用具有可观的社会效益。芽孢杆菌固态菌剂的应用可以减少化肥、农药的使用量，另外，芽孢杆菌固态菌剂的制备具有能耗低、污染小，产品稳定易于运输，定能受到厂家的欢迎。

附图说明

图1为本发明实验例2中不同碳氮比的结果对比图。

图2为本发明实验例3中不同外加碳源的结果对比图。

图3为本发明实验例4中不同外加氮源的结果对比图。

图4为本发明实验例5中四个单因素对解淀粉芽孢杆菌固态发酵活菌数的影响。

图5为本发明实验例6中不同干燥工艺的结果对比图。

图6为本发明实验例7中不同发酵时间的结果对比图。

图7为本发明实验例8中不同发酵温度和升温方式对产孢率的影响。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的解淀粉芽孢杆菌，选用保藏编号为CGMCC NO.10044的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)L-H15。

实施例1 解淀粉芽孢杆菌固态发酵物及其制备方法

1、取解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线，在32℃活化24h；取活化后的健壮、典型菌落，接种于50ml LB液体培养基中，在32℃培养24h；再接种于200ml LB液体培养基中，在32℃培养24h，获得有效活菌数为2.4×10⁸CFU的种子液；

2、称取麦麸53g，豆粕147g，外源物添加量百分比按此固态基质(麦麸+豆粕)质量为基准，其中稻谷壳含量为20％，乳糖含量0.2％，大豆蛋白胨含量0.38％，NaCl含量0.2％，MnSO₄含量0.01％，MgSO₄·7H₂O含量0.02％，将其用1:0.5的料水质量比混合均匀，装瓶量46％，将步骤1活化的种子液接种5％，32℃培养24h后升高1℃，之后每培养6h将培养温度升高1℃，共培养48h，发酵完成后在60℃的烘箱中将其干燥10h，得到固态发酵物。

实验例1

准确称取10g实施例1所得的固态发酵物，在90mL的生理盐水中充分混合，梯度稀释，用涂布法进行菌落计数，此为解淀粉芽孢杆菌固态发酵物菌落数；将在90mL生理盐水中充分混合的固态发酵物于80℃水浴10min，立即置于冰水中降温，梯度稀释，用涂布法进行菌落计数，此为解淀粉芽孢杆菌固态发酵物的芽孢数，产孢率＝芽孢数/菌落数。此时解淀粉芽孢杆菌的活菌数为7.58×10⁹CFU/g，产孢率为92.20％。

实验例2 固态发酵培养基的碳氮比优化

选取价格低廉，发酵效果良好的农业生产加工副产品麦麸、豆粕作为基础固态基质，对解淀粉芽孢杆菌进行固态发酵。将麦麸和豆粕粉碎后过20目筛，麦麸作为碳源、豆粕作为氮源，碳氮源比例分别调整为5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5，共称取50g，加入25mL的蒸馏水充分搅拌均匀(以捏时指尖有水但不滴下为宜)。将混合好的固态基质121℃灭菌40min，待基质冷却后接入活化好的解淀粉芽孢杆菌菌悬液，32℃培养48h。

试验结果见图1，由图1可知，碳源含量丰富的固态基质发酵速度快，但活菌数不高；氮源丰富的固态基质菌落生长较缓慢，这可能因为氮源是有机氮，菌株在利用其营养时需要将其分解。本发明将基础碳氮比做了详细的摸索，结果表明1:3比例效果最好，菌落数达到最大值9.35×10⁸CFU/g。

实验例3 固态发酵培养基的外加碳源的优化

在碳氮比优化结果的基础上分别添加0.2％、0.6％、1.0％的葡萄糖(现有技术常用)、果糖(现有技术常用)、蔗糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉，将不添加任何外加碳源的处理作为空白对照，结果由图2所示。

由图2可知，蔗糖、果糖和可溶性淀粉对解淀粉芽孢杆菌的生长不仅没有促进作用，活菌数与空白对照相比反而减少。以葡萄糖、麦芽糖和乳糖为外加碳源，可促进活菌数的增长，其中以乳糖的效果最为明显，添加0.2％的乳糖时活菌数达到最大值1.55×10⁹CFU/g。本发明以乳糖为外加碳源，发现乳糖能显著促进解淀粉芽孢杆菌的活菌数，且发现果糖对解淀粉芽孢杆菌的生长有抑制作用。

实验例4 固态发酵培养基的外加氮源优化

在实验例2优化结果的基础上分别添加0.2％、0.6％、1.0％的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏和鱼蛋白胨，将不添加任何外加氮源的处理作为空白对照，结果由图3所示。

由图3可知，以大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉膏和鱼蛋白胨为外加氮源，均可以促进解淀粉芽孢杆菌的生长，其中以大豆蛋白胨和牛肉膏的效果最佳；胰蛋白胨和酪蛋白胨次之；鱼蛋白胨的效果不够明显。大豆蛋白胨添加量在0.2％和0.6％时对活菌数的影响最大且两者无显著性差异，此时菌落数可达2.82×10⁹CFU/g。

实验例5

本实验例分别研究了固态发酵培养基装瓶量、芽孢杆菌种子液接种量、培养基料水比和通气量这四个单因素对解淀粉芽孢杆菌固态发酵活菌数的影响。

各发酵条件单因素试验变量依次如下：

装瓶量分别按照容量的30％、40％、50％、60％和70％装入500mL的锥形瓶中；

接种量分别按照固态基质质量的1％、2％、3％、4％和5％接种10⁸CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌种子液；

料水比分别调节固态基质和水的质量比为1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5和1:0.6进行发酵；

通气量的变化通过添加稻谷壳的不同质量来反映，试验选择添加稻谷壳的质量分别为固态基质的0、1％、5％、10％、15％和20％，各因素在前一因素的最佳水平下逐级优化。

结果由图4所示，由图可知，随着装瓶量的增大，解淀粉芽孢杆菌的活菌数呈现先增加后减少的趋势，装瓶量响应区间选择40％-50％的范围，此时最大活菌数可以达到3.56×10⁹CFU/g；接种量对活菌数的影响也呈先增大后减小的趋势，接种量对活菌数的影响显著性差异较低，响应区间为2％-5％，此时活菌数最大可达到4.05×10⁹CFU/g；固体基质中添加的水分含量对固态发酵也有一定的影响，料水比对活菌数的影响呈抛物线型，响应区间为1:0.3-1:0.5，此时活菌数最大值达到6.08×10⁹CFU/g；菌落数随稻谷壳添加量的增加快速上升最后趋于稳定，响应区间为10％-20％，此时活菌数最大可以达到9.01×10⁹CFU/g。由于解淀粉芽孢杆菌为好氧菌，固态基质中的通气量对其发酵的影响很重要，本发明通气量参数通过添加稻谷壳来模拟，稻谷壳坚硬的外壳能够对固态基质起到有效的支撑作用，以此来增加固态基质中空气的流动性。

实验例6 干燥工艺的优化

按照优化出来的最佳工艺参数对解淀粉芽孢杆菌进行固态发酵，将培养好的固态发酵物在60℃烘箱中烘干10h。一组为空白对照组，一组为干燥处理组，结果由图5所示。

对比可知，干燥处理对解淀粉芽孢杆菌的影响较大。干燥工艺降低了解淀粉芽孢杆菌的活菌数，对照组的活菌数为1.69×10¹⁰CFU/g，干燥处理组的活菌数降为5.27×10⁹CFU/g；但干燥处理能极大的提高菌株的产孢率，对照组的产孢率为32.06％，干燥处理组的产孢率为61.07％。由于产孢率提升可以极大的提高固态菌剂的品质，故我们选择在发酵过程中加入干燥处理，即发酵完成后在60℃烘干10h。

实验例7 发酵时间的优化

按照实验例2-6优化出的最佳工艺参数对解淀粉芽孢杆菌进行固态发酵，发酵温度设定为32℃，分别发酵36、42、48、54和60h，结果由图6所示。

发酵时间对解淀粉芽孢杆菌活菌数的影响呈现先上升后下降的趋势，在48h和54h时菌落数分别为5.40×10⁹CFU/g和5.32×10⁹CFU/g；产孢率随着时间的增加呈现持续上升的趋势，在36-48h上升幅度最大，之后渐趋平缓，产孢率在48h和54h时分别达到61.78％和61.46％。由于48h和54h的活菌数与产孢率相差不多，而48h更具经济效益，综合考虑选取48h为最优发酵时间。

实验例8 发酵温度对产孢率的影响及发酵温度的优化

在发酵时间优化结果的基础上，将发酵温度设定为四组变量，分别为恒温32℃培养48h、恒温36℃培养48h、恒温32℃培养24h后，变温至36℃培养24h、恒温32℃培养24h后，每隔6h将培养温度升高1℃，至36℃后结束，结果如图7所示。

不同发酵温度对解淀粉芽孢杆菌的活菌数有较为显著的影响，与恒温32℃相比，恒温36℃时菌落数上升幅度最高，可达6.12×10⁹CFU/g；32℃培养24h骤升至36℃的活菌数会减少；32℃培养24h缓升至36℃的活菌数也有部分升高，但幅度不大。发酵温度对产孢率的影响也很显著，恒温36℃产孢率较恒温32℃有一些提升，32℃骤升至36℃的产孢率有所下降，32℃缓升至36℃的产孢率有大幅度的提高。由此可见，32℃骤升至36℃对活菌数和产孢率均有不良的影响，而32℃缓升至36℃虽和恒温36℃相比活菌数略低，但能在很大程度上提高产孢率。结合这两种因素，选择32℃缓升至36℃作为最终的发酵温度。此时解淀粉芽孢杆菌的活菌数为5.47×10⁹CFU/g，产孢率可达75.52％。现有技术通常发酵温度为常温，本发明加入变温试验，发现恒温32℃培养24h后，每隔6h将培养温度升高1℃，至36℃后结束能够大量的提高菌落的产孢率。

实验例9 不同无机盐种类对产孢率的影响

Na⁺和K⁺是维持细胞渗透压的重要离子，它能参与细胞内多种代谢途径，同时也是生物体中多种酶的激活剂；Ca²⁺能够控制细胞的生理状态，细胞在形成芽孢的过程中需要Ca²⁺的参与，芽孢形成时细胞需大量吸收Ca²⁺并合成营养体中没有的2,6-吡啶二羧酸钙；Mg^{2 +}能促进碳源分解，加速菌体能量代谢，可参与到300种酶促反应，如糖酵解、脂肪酸氧化、蛋白质合成等；Mn²⁺作为微生物生长所需的微量元素，是超氧化物歧化酶和L-阿拉伯糖异构酶等许多酶的辅助因子，影响细胞的生长和芽孢的形成。因此我们选择对产孢率可能有影响的无机盐NaCl、CaCl₂、MnSO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O，NaCl添加固态基质质量的0.1％，其余每种无机盐均添加固态基质质量的0.01％，将不添加任何外加无机盐的处理作为空白对照。

无机盐种类对解淀粉芽孢杆菌活菌数有较为显著的影响，其中NaCl和MgSO₄·7H₂O能够显著增加活菌数，其中以NaCl的增加量最大，菌落数可达到6.50×10⁹CFU/g，MgSO₄·7H₂O次之，菌落数为5.78×10⁹CFU/g，；MnSO₄和FeSO₄·7H₂O对L-H15活菌数均有一定程度的负面影响；而CaCl₂和KH₂PO₄对活菌数的影响与空白处理组相比基本无显著性差异。无机盐种类对产孢率的影响也很显著，其中MnSO₄能大幅度提升产孢率，产孢率从空白处理组的75.52％升高至88.48％，而FeSO₄·7H₂O对产孢率有显著性的抑制作用，添加了FeSO₄·7H₂O的处理组产孢率只有60.52％，NaCl、CaCl₂、KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O对产孢率的影响与空白处理组相比均无显著性差异。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.解淀粉芽孢杆菌的固态发酵方法，其特征在于，将解淀粉芽孢杆菌种子液接种至固态发酵培养基中，自32℃至36℃进行阶段升温发酵。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固态发酵培养基由如下重量份的原料混合而成：麦麸15～25份，豆粕50～60份，稻谷壳1～10份，乳糖0.01～0.05份，大豆蛋白胨0.05～0.10份，NaCl0.01～0.10份，MnSO₄ 0.001～0.005份，MgSO₄·7H₂O 0.001～0.005份，水5～20份。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固态发酵培养基由如下重量份的原料混合而成：麦麸20份，豆粕56份，稻谷壳4份，乳糖0.04份，大豆蛋白胨0.076份，NaCl 0.04份，MnSO₄ 0.002份，MgSO₄·7H₂O 0.004份，水10份。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述阶段升温发酵具体为32℃培养24h后升高1℃，之后每培养6h将培养温度升高1℃，至36℃培养6h后结束。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、菌种活化：取解淀粉芽孢杆菌，在LB固体平板培养基上划线培养，进行菌种活化；

S2、一级种子液制备：取活化后的菌落，接种至LB液体培养基进行一级种子液制备；

S3、二级种子液制备：将一级种子液传代于LB液体培养基进行二级种子液制备；

S4、固态发酵：将芽孢杆菌二级种子液接种至固态发酵培养基中，自32℃至36℃进行阶段升温发酵，结束发酵后烘干即得固态发酵物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S4中将芽孢杆菌二级种子液以2％-5％的接种量接种至固态发酵培养基。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述烘干条件为60℃干燥10h。

8.根据权利要求1-3或权利要求5-7任意一项所述的方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为保藏编号为CGMCC NO.10044的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)L-H15。

9.权利要求1-8任意一项所述的方法制备得到的固态发酵物。

10.解淀粉芽孢杆菌的固态发酵菌剂，其特征在于，包含权利要求9所述的固态发酵物或由权利要求9所述的固态发酵物制备。