KR20140099755A

KR20140099755A - 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20140099755A
Application number: KR1020130012547A
Authority: KR
Inventors: 이성권; 선기환; 김상철; 박차서
Original assignee: (주)삼성신약
Priority date: 2013-02-04
Filing date: 2013-02-04
Publication date: 2014-08-13
Also published as: KR101489480B1

Abstract

본 발명은 고체상 발효를 통한 녹용추출물과 그 제조방법에 관한 것으로서, 분쇄된 녹용을 수증기로 증숙하여 녹용의 중량에 15~20% 중량부의 수분을 함유시키는 증숙 단계와; 증숙 단계에서 얻어진 고체상의 녹용분에 나또 균주 배양액을 접종하여 발효시키고, 발효된 고체상 녹용분에 온도를 60℃로 상승시켜 유지하는 숙성을 통해서 발효녹용을 수득하는 발효 단계와; 발효 단계에서 얻어진 고체상 발효녹용에 정제수를 첨가한 후에 60℃~70℃에서 유효성분을 추출, 수득하는 추출/농축 단계와; 추출/농축 단계에서 얻어진 액상의 추출물을 농축, 동결건조하여 고체상 분말을 수득하는 분말 수득단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 제조방법 및 제조된 녹용추출물을 제공한 것이다.
본 발명은 가장 자연친화적인 발효방법으로 녹용을 추출하였고 녹용의 생리활성 물질의 파괴를 줄이고 유효성분의 함량을 증가시키며 생산성 또한 높일 수 있어, 다양한 분야에서 사용되는 녹용 추출물의 제조 방법으로 유용하게 이용될 수 있다. 특히 본 발명은 주름개선 활성을 체계적으로 밝힘으로써 화장품 등에 널리 사용하기에 적합하다.

Description

고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 및 그 제조방법{Deer antlers extract having facial wrinkle-liftable vitality through solid-state fermentation and its manufacturing method}

본 발명은 고체상 발효를 통한 녹용추출물과 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기존의 녹용 관련하여 전혀 사용하지 않았던 고체상 발효방법을 사용하여 고유의 생리활성 물질이 파괴되지 않도록 저온에서 발효를 수행하면서도 원활한 추출을 유도하여 단시간 내에 충분히 저분자화가 이루어지도록 함으로써 주름개선 활성을 갖는 건강식품 및 화장품등에 사용될 수 있는 유효성분의 함량이 높은 녹용 발효 추출물 및 그 제조방법을 제공코자 하는 것이다.

녹용(Cervi Parvum Corun)은 보통 사슴의 뿔을 말하며, 구체적으로 자라기 시작한지 2개월 이내의 아직 각질화가 되지 않아 만져보면 약간 물렁할 정도로 조직이 연하고 털이 골고루 덮여 있는 수컷의 뿔을 말한다. 가을이 되면 물렁거리던 뿔이 단단하게 각질화가 되는데, 이는 발정기에 암컷을 차지하기 위한 싸움을 위한 것으로, 이렇게 각질화된 뿔이 바로 녹용에 비해 효능이 떨어지는 녹각이다. 이 녹각이 채취시기를 놓쳐 칼슘화된 후 단단해져서 저절로 떨어진 것을 낙각이라 한다.

동의보감 등의 문헌에도 녹용은 강장작용, 보혈작용, 강정작용, 진통작용, 조혈작용, 생장발육촉진작용, 심부전증 치료작용, 기능항진작용, 피부세포재생 등이 있는 것으로 기록되어 있으며, 이밖에도 피로회복, 신체활력증강 및 신장의 이뇨기능강화효과 등 많은 효능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.

전통한방에서 사용하는 녹용의 추출방법으로는, 녹용을 분쇄한 후 물을 용매로 하여 가열 추출하여 그 여액을 사용하는 방법이 주로 이용되고 있다. 위의 방법은 녹용을 복용하기 쉬운 반면에 유효성분의 분자량이 거대구조이기 때문에 인체흡수율이 저하되며 또한, 추출박에 포함되어 있는 콜라겐, 펩타이드계 아미노산 등 유효성분은 버리게 된다. 그리고 녹용을 추출한 후 농축하여 사용할 경우에는 고형분 함량 20% 이상의 경우에 겔화되는 문제점이 있어 제품에 응용하기 어려운 문제가 있다.

한국공개특허 제10-2003-0073134호에서는 세절한 녹용에 물을 가하고 가열, 감압 추출한 후 여액을 농축, 분무 건조시켜 분말화하는 녹용 추출 방법을 기술하고 있는데, 이 방법은 전통한방에서 사용하는 열수 추출법을 일부 개선하고 복용이 용이하도록 추출액을 분말화하고 있으나, 추출박에 포함된 상당량의 유효성분이 이용되지 못하고 폐기되는 종래의 문제점을 그대로 가지고 있다. 또, 한국공개특허 제10-2005-0090041호에서는 녹용 또는 녹각을 분쇄한 후 온수추출, 단백분해효소 처리 및 염산 분해 처리를 하는 녹용 추출 방법을 기술하고 있는데, 이 방법에서는 온수추출의 한계를 극복하기 위하여 추가로 단백분해효소 처리 및 염산 분해 처리를 실시하고 있는데, 공정이 여러 단계로 진행되어 복잡하고 시간이 많이 소요되며, 단백분해효소 및 강산의 사용으로 당이나 지질등의 유효성분은 저분자화하지 못하고 단백질만을 저분자화하여 영양의 불균형을 야기하며, 인체에 유용한 생리활성 물질들이 파괴되는 문제점이 있다.

한국 등록특허 제10-1169775호에서는, 이러한 종래의 단점을 개선하기 위하여 바실러스 카제이(Bacillus casei)로 1차 발효를 하여 유효생리활성물질을 추출하고, 아스퍼질러스 카제이(aspergillus casei)로 2차 발효를 하여 단백질, 펩타이드 등 1차 발효에 의해 추출되지 못한 유효성분을 추출하며 이의 유효성분 안정화를 위하여 분자캡슐을 하였다.

그러나 이 방법에 의하면 발효를 수행하기전 단계에서 열수추출을 하여 유효성분의 열 접촉으로 인한 안정성이 저하되며 열수추출과 같은 낮은 추출수율을 갖는 상태에서 1차 발효가 진행된다. 또한, 이를 보완하기위해 녹용박에 대한 2차 발효로 수율 증대를 유도하였지만 수율이 크게 증대하지 않고 오히려 냄새와 갈변등 제품에 적용이 어려운 상태로 진행된다.

따라서 이들은 이러한 문제점을 해결하기위해 사이크로덱스트린과 같은 포접화합물(inclusion compound)을 사용하여 단지 생산량을 늘리는 방법을 수행하였다. 그러면서 안정성을 강조하였는데 일반적으로 사이크로덱스트린 및 그 유도체들은 유효성분을 포접시킬 수 있는 공동크기가 6 에서 15Å인데 발효된 녹용의 유효성분의 평균분자량이 3,000이라고 하더라도 이는 분자가 10개에서 15개 정도가 결합된 상태의 고분자 구조인데 이는 사이크로덱스트린 공동내에 포접될수 없는 상태이다. 또한 사이크로덱스트린 유도체와 유효성분이 결합된 상태라 하더라도 이는 포접된 상태(분자캡슐)이 아니며 이는 빛, 산, 열에 의한 안정성이 확보되었다고 판단할수 없다.

따라서 이렇게 얻어진 종래의 녹용 추출물은 대부분 불쾌한 냄새 및 색도를 갖고 있어 식품이나 화장품에 적용하는데 어려움이 있고, 원료로서 극히 미량만이 사용되고 있는 실정이다.

KR 1020030073134 A 2003.09.19. KR 1020050090041 A 2005.09.09. KR 101169775 B1 2012.07.24.

이에 본 발명자는 상기한 종래의 녹용 추출 방법의 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 본 발명에서는 기존의 녹용 관련하여 전혀 사용하지 않았던 고체상 발효방법을 사용하여 고유의 생리활성 물질이 파괴되지 않도록 저온에서 발효를 수행하면서도 원활한 추출을 유도하여 단시간 내에 충분히 저분자화가 이루어지도록 함으로써 유효성분의 함량이 높은 녹용 발효 추출물 및 그 제조방법을 제공하여 주름개선 활성을 갖는 건강식품 및 화장품등의 원료로 사용할 수 있게 함에 기술적 과제를 두고 본 발명을 완성한 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 과제 해결수단으로 본 발명에서는,

분쇄된 녹용을 수증기로 증숙하여 녹용의 중량에 15~20% 중량부의 수분을 함유시키는 증숙 단계와;

증숙 단계에서 얻어진 고체상의 녹용분에 나또 균주 배양액을 접종하여 발효시키고, 발효된 고체상 녹용분에 온도를 60℃로 상승시켜 유지하는 숙성을 통해서 발효녹용을 수득하는 발효 단계와;

발효 단계에서 얻어진 고체상 발효녹용에 정제수를 첨가한 후에 60℃~70℃에서 유효성분을 추출, 수득하는 추출/농축 단계와;

추출/농축 단계에서 얻어진 액상의 추출물을 농축, 동결건조하여 고체상 분말을 수득하는 분말 수득단계를 포함하는 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 제조방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에서는 증숙 단계에서 분쇄된 녹용 100중량부 당 수증기로 증숙하여 15~20중량부의 수분이 함유되며, 증숙 온도는 100~120℃에서 1시간 수행되는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 발효 단계에서, 증숙된 녹용 100중량부 당 10~20중량부의 나또 균주 배양액을 접종하며, 30~40℃에서 3~5일 동안 발효를 수행하고, 발효 후 8시간 60℃를 유지하면서 숙성하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서의 상기 나또 균주 배양액은 청국장균 및 파파인을 함유하는 것을 특징으로 한다.

그리고 본 발명의 추출/농축 단계에서, 발효된 고체 녹용 100중량부 당 500~1000중량부의 정제수를 투입한 후에, 60~70℃의 온도 조건에서 교반하고, 이를 상온까지 서서히 냉각시켜 유효성분을 추출시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 분쇄된 녹용 100중량부 당 15~20중량부의 수분이 함유되도록 100~120℃의 수증기로 1시간 동안 증숙하며,

증숙된 녹용 100중량부 당 10~20중량부의 나또 균주 배양액을 접종하여, 30~40℃에서 3~5일 동안 발효하고 발효 후 8시간 60℃를 유지시킨 후 발효된 고체 녹용 100중량부 당 500~1000중량부의 정제수를 투입하고, 60~70℃의 온도 조건에서 교반하고, 이를 상온까지 서서히 냉각시켜 유효성분을 추출한 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 제공하는 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 및 그 제조방법은 기존의 녹용 추출방법과 달리 한국인과 친숙한 청국장균의 일종인 나또균주를 이용하여 고체상에서 녹용을 직접적으로 발효함으로써 단시간 내에 녹용의 유효성분을 충분히 추출해 낼 수 있는 것이다. 또한 종래의 열수추출이나 강산, 효소를 이용한 가수분해법의 생리활성물질의 파괴에 대한 문제를 해소할 수 있으며, 주름개선에 효능이 있는 표피성장촉진인자(EGF)가 다량 함유된 녹용 발효추출물을 얻을 수 있다.

도 1은 본 발명의 제조공정을 나타내는 블록도
도 2는 추출방법별 녹용시료의 콜라겐 합성율을 도시한 그래프
도 3은 추출방법별 녹용시료의 세포독성 테스트를 도시한 그래프

이하에서 본 발명에서 제공하는 실시례를 첨부 도면에 의거하여 설명한다.

도 1은 본 발명의 제조공정을 나타내는 사진을 도시한 것이다.

본 발명은 녹용으로부터 녹용 발효 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것으로, 특히, 본 발명은 분쇄된 녹용을 수증기로 증숙하여 녹용의 중량에 15~20% 중량부의 수분을 함유시키는 증숙 단계와;

수분함유 단계에서 얻어진 고체상의 녹용분에 나또 균주 배양액을 접종하여 발효시키고, 발효된 고체상 녹용분에 온도를 60℃로 상승시켜 유지하는 숙성을 통해서 발효녹용을 수득하는 발효 단계와;

추출/농축 단계에서 얻어진 액상의 추출물을 농축, 동결건조하여 고체상 분말을 수득하는 분말 수득단계를 포함하는 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 제조방법을 제공하하고 있다.

이하에서는 본 발명의 녹용 발효추출물의 제조 방법을 각 단계별로 상세히 설명한다.

증숙 단계

증숙 단계에서는 분쇄된 녹용을 수증기로 증숙하여 수분을 함유시킨다.

보다 구체적으로, 분쇄된 녹용에 녹용 100중량부에 15~20중량부의 수분을 함유시키도록 수증기를 이용하여 증숙한다. 상기 수분 함유의 보다 바람직한 예로는 17~19 중량부이다.

증숙하기 위한 수증기의 온도는 100~120℃가 적당하며, 50~70분 동안 행하며, 바람직하기로는 1시간(60분) 수행한다.

녹용에 함유된 수분의 양이 상기 기재된 범위 보다 적거나 많은 경우에는 고체상 발효가 원활하게 진행되지 못하여 발효 효율이 저하되거나 유효성분이 파괴되는 경우가 있으며, 이후의 발효단계에서 경제적이지 못한 문제점이 발생할 수 있다.

발효 단계

발효 단계에서는 상기 증숙 단계에서 얻어진, 증숙된 녹용 100중량부 당 10~20중량부의 나또 균주 배양액이 접종하며, 나또 균주 배양액은 3% 파파인이 함유된다.

나또 균주 배양액의 접종의 경우, 보다 바람직하게는 14~17중량부가 바람직하며, 발효가 30~40℃에서 보다 바람직하게는 37도가 바람직하며 3~5일 동안 보다 바람직하게는 4일이 수행토록 한다.

또한 발효 단계에서는 나또 균주 배양액을 사용하는데, 이에 함유되는 발효균주로는 바실러스 카제이(Bacillus casei), 그 중에서도 바실러스 서브틸리스 나또(Bacillus subtilis natto)가 적절하다.

한편 발효 단계에서 발효온도가 상기 기술된 온도 범위 보다 낮거나 높은 경우에는 발효가 진행되지 않거나 균주가 활성을 잃어버려 발효가 진행되지 않게 된다.

발효 단계를 거친 후 미 발효 녹용은 각질성분이 많아 상대적으로 낮은 발효온도 조건에서는 완벽한 발효가 진행되지 않기 때문에 보다 높은 온도에서 발효하는 것이 적절하다. 미 발효분을 더욱 발효시키고 균주를 불활화시키기 위해 온도를 60도로 상승시키고 8시간 유지시켜 숙성시킨다. 이 과정에서 나또균은 불활화되며 균주에 함유된 파파인에 의해 미 발효된 단백질 및 콜라겐들이 수용성 펩타이드 및 수용성 콜라겐으로 저분자화 되어 인체 흡수성이 증대된다.

이에 따라, 발효 단계를 거쳐 고체상의 발효 녹용을 수득한다.

추출/농축 단계

추출/농축 단계에서는 상기 발효 단계에서 얻어진 고체상 발효 녹용 100중량부 당 500~1000중량부, 보다 바람직하게는 700~800중량부의 정제수를 투입한 후에, 60~70℃에서 보다 바람직하게는 65℃에서 교반하고, 이를 상온까지 서서히 냉각시켜 유효성분을 추출시키도록 한다.

추출 단계를 거친 후 미반응 고형물질을 제거하기 위한 여과를 실시할 수 있다. 여과는 0.1~3㎛ 필터를 사용하여 1회 이상 여과를 수행하는 것이 바람직하다. 필터의 기공 크기가 0.1㎛ 미만인 경우에는 필터가 초정밀하여 초고가이므로(한외여과법) 경제성이 떨어지는 문제가 있고, 3㎛를 초과하는 경우는 제균력이 없어 진균이나 세균이 최종 추출물에 포함되어 유통 중 오염될 가능성이 높다는 문제가 있다.

또한, 여과 후 얻어진 추출액을 65℃, 0.2기압 하에서 감압농축을 수행하여 25brix의 농축물로 제조하고, 이를 동결 건조하여 수용성 발효녹용 농축 분말을 수득하는 단계를 포함하는, 녹용 발효 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

이에 따라 얻어진 발효 녹용 추출물, 즉, 액상형 또는 분말형의 녹용 발효 추출물을 유효 성분으로 하여 기능성 건강식품 및 주름개선용 화장품 등에 사용될 수 있다.

본 발명에서 얻어진 발효 녹용추출물은 저온에서 고체상 발효방법에 의해 추출되는 바, 생리활성 물질이 파괴되지 않고 함유된 녹용 성분이 종래 추출방법에 의해 얻어진 추출물에 비해 많은 장점이 있으며, 또한, 유효성분이 저분자화가 이루어지도록 함으로써 인체 흡수성이 뛰어난 녹용 발효 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 추출물을 기본적으로 주름개선 활성을 갖는 건강식품 및 화장품을 제공토록 한다.

본 발명의 녹용 추출물 이외에 첨가될 건강식품 및 화장품의 부형제 및 기타 첨가제의 종류 및 양은 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있으며, 이에 대해서는 본 발명에서 제한하지 않는다.

이하 구체적인 실시 예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

그러나 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허 청구범위의 균등범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

(실시예 1)

고체상 발효녹용의 제조

(1)분쇄된 녹용 1kg을 고압멸균기를 이용하여 110℃에서 1시간 증숙시킨 후에 이를 상온까지 냉각시켜 수분이 17% 함유한 고체 녹용을 수득하였다.

(2)고체 발효녹용을 얻기 위해, 수득된 녹용 1kg에 바실러스 서브틸리스 나또(bacillus subtilis natto) 배양액 150g(청국장균 3g, tryptone 15g, soytone 5g, sodium chloride 5g, 파파인 30g을 멸균수 1L에 넣고 용해하고 37℃, PH 7을 유지하며 4일간 배양)을 접종한 후에 37℃에서 4일간 고체상 발효시켰다. 이후 미 발효된 녹용을 저분자 분자구조로 전환하기위해 60℃에서 8시간 유지시켰다.

(3) 발효녹용 추출물을 얻기 위해, 상기 (2) 항에서 수득된 고체상 발효녹용 1kg을 정제수 7kg에 첨가하고, 65℃에서 4시간 교반하고, 이를 상온까지 서서히 냉각시켜 유효성분을 추출시킨다.

추출 단계를 거친 후 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과를 수행한다. 또한, 여과 후 얻어진 추출액을 65℃, 0.2기압하에서 감압농축을 수행하여 25brix의 농축물로 제조하고, 이를 동결건조하여 수용성 발효녹용 농축 분말을 670g을 수득하였다.

(비교예 1)

효소를 이용한 녹용 가수분해물의 제조

건조된 녹용 1㎏을 파쇄기를 이용하여 파쇄하였다.

파쇄된 녹용분말 1㎏에 파파인(papain)10g 및 증류수 5㎏을 첨가한 후에 70℃에서 8시간 반응시켜 녹용분말을 가수분해시켰다.

가수분해된 용액을 여과시켜 미반응 고형분을 제거하였다. 이때, 1차 여과는 2㎛ 필터로, 2차 여과는 0.45㎛ 필터로, 3차 여과는 0.2㎛ 필터로 수행하였다. 이후 여과액을 동결건조하여 분말을 520g을 수득하였다.

(비교예 2)

열수추출을 이용한 녹용 추출물의 제조

건조된 녹용 1㎏ 을 파쇄기를 이용하여 파쇄하였다.

파쇄된 녹용분말 1㎏을 증류수 5L에 첨가하고 100℃에서 7시간 추출한 후 여과시켰다. 이때, 1차 여과는 2㎛ 필터로, 2차 여과는 0.45㎛ 필터로, 3차 여과는 0.2㎛ 필터로 수행하였다. 이후 여과액을 동결건조하였으나 분말이 아닌겔(gel)화된 농축물을 154g을 수득하였다.

(비교예 3)

액체상 발효녹용의 제조(대한민국 제 10-1169775호의 방법)

본 발명의 발효녹용추출물과 비교하기 위하여 대한민국 제10-1169775호의 방법(분자캡슐 제조방법 제외)을 이용하였다.

(1)건조되고 세절된 녹용 10kg을 정제수 35㎏에 첨가하고 90℃에서 4시간 추출시킨 후에 이를 여과를 통해 녹용박을 분리시켜 여액을 수득하였다.

(2)1차 발효물을 얻기 위해, 수득된 여액에 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis) 배양액 1kg을 첨가한 후에 37℃에서 2일간 발효시켰다. 이후 1㎛ 필터를 사용하여 여과를 수행하여 미반응 고형분을 제거하였다.

(3)2차 발효물을 얻기 위해, 상기 (1)항에서 분리된 녹용박을 정제수 60kg에 첨가하고, 여기에 아스퍼질러스 나이거(aspergillus niger) 배양액 1kg을 첨가한 후에 60℃에서 2일간 발효시켰다. 이후 1㎛ 필터를 사용하여 여과를 수행하여 미반응 고형분을 제거하였다.

(4)상기 발효 및 여과된 1, 2차 녹용 발효물을 혼합하고, 이 혼합액을 한천여과를 통하여 여과하였다.

이와 같이 제조된 여과물을 동결건조하여 분말화하였다. 이때 얻어진 동결건조된 분말은 3.2kg을 얻을 수 있었다.

( 실험예 1)

생리활성물질(세포재생 효능)의 분석

① 우론산 정량 (Carbazole assay)

D-glucuronic acid lactone을 standard로 사용하여 carbazole 반응에 의해 530nm에서 UV spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료는 증류수에 녹여 carbazole 반응에 의해 530nm에서 UV spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하고 D-glucuronic acid lactone에 대한 함유량으로 계산하여 함량을 정하였다.

② 효소에 의한 황산콘드로이틴의 분해

프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)에서 유래한 콘드로이티나제 (Chondroitinase) ABC (C2905, Sigma)를 50mM Tris-HCl 60mM 소듐 아세테이트 완충제 (pH 8.0)에 녹여서 1U/ml 되게 하였다. NZP CS를 표준물로 사용하여 표준물과 샘플을 10mg/ml로 녹여서 완충제와 섞어 효소를 30mU 넣고, 이를 37℃에서 12시간 반응하여 콘드로이틴 설페이트의 함유량을 분석하였다.

③ EGF의 분석

EGF의 분석을 위해 녹용열수추출물, 가수분해물, 발효추출물에 대해 사람의 EGF 특이적인 ELISA를 수행하였다. 표준 곡선 작성을 위해 250pg/ml~0pg/ml 농도의 구간에서 선형회귀분석을 통하여 선형성을 갖는 농도구간을 선정하고 이 구간에서 각 3종의 시료를 시험에 적용하여 흡광도 분석을 수행하였다. 이로부터 표준 EGF의 농도에 따른 시료의 EGF를 분석하였다.

단위(㎍/g)

성분 시료	우론산	황산 콘드로이친	EGF	추출율(%)
비교예 1	171.4	3.0	0.000093	52.0
비교예 2	625.2	40.6	0.000407	15.4
비교예 3	707.2	78.6	0.000525	32.0
실시예 1	1324.6	103.2	0.001211	67.0

상기 표 1은 녹용추출방법별 생리활성물질 분석 및 추출율을 나타낸 것으로, 열수추출, 가수분해, 액상발효된 녹용추출물보다 본 발명의 고상발효에 의해 추출된 것이 생리활성물질이 다량 함유되어 있음을 알 수 있다.

(실시예 2)

콜라겐 합성 실험

사람섬유아세포(WI-38:human fibroblast cell line)를 -80℃ 또는 액체질소상에 보관하며 배양하여 실험에 이용하였으며, 96웰 플레이트에 2.0×10⁴cells/well씩 동일하게 분주하였다.

MEM(FBS 5%)배지로 24시간 배양 후 새로운 무혈청 배지로 교환하고 실험대상 시료를 적정농도 단계 희석하여 처리하였다.

시료는 상기 실시예 1에서 제조한 고상 발효농축분말을 사용하였으며, 대조군으로 비교예 1, 2의 녹용 추출분말들 및 상용의 레티놀 표준 품을 사용하였다.

시료가 처리되어진 96웰 플레이트를 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양되어진 배양 상등액을 콜라겐 측정용 키트(procollagen type-I C-peptide MK101, Takara)를 이용하여 생성된 콜라겐의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 보듯이, 고상 발효농축분말은 1×10^-1내지 1×10^- ³농도구간에서 세포 대조군(control, 시료물질을 처리하지 않은 세포대조군) 보다 약 45% 내지 15% 정도 증가된 콜라겐 생성효능을 보였으며 1×10^-4%(w/v) 농도구간 이하의 저농도에서는 대조군과 비교해 약간 저하되는 정도의 콜라겐 생성효능을 보였다.

열수추출농축물은 1×10^-1내지 1×10^-2농도구간에서 세포 대조군(control, 시료물질을 처리하지 않은 세포대조군) 보다 약 25% 내지 10% 정도 증가 된 콜라겐 생성효능을 보였으며 1×10^-3%(w/v) 농도구간 이하에서는 대조군과 비교해 상당히 저하되는 콜라겐 생성 효능을 보였고, 가수분해분말은 1×10^-1농도구간에서 세포 대조군(control, 시료물질을 처리하지 않은 세포대조군) 보다 약 10% 정도 증가 된 콜라겐 생성효능을 보였으며 1×10^-2%(w/v) 농도구간 이하에서는 대조군과 비교해 상당히 저하되는 콜라겐 생성 효능을 보였고, 고시된 성분인 레티놀은 1×10^-1 내지 1×10^-3 %(w/v)농도구간에서 세포 대조군(시료물질을 처리하지 않은 세포대조군) 보다 약 45 내지 15% 정도 증가 된 콜라겐 생성효능을 보였으며 1×10^-4 %(w/v) 농도구간 이하의 저농도에서는 대조군과 비교해 약간 저하되는 정도의 콜라겐 생성효능을 보였다.

따라서 발효녹용농축분말은 같은 농도 구간에서 열수추출농축물, 가수분해분말보다 콜라겐 합성률이 매우 높다는 것을 알 수 있었다.

(실시예 3)

세포독성실험

기능성 화장품의 효능 검증 방법 중 하나로 사용되는 사람 유래의 섬유아세포에 대한 시료의 증식효과를 실험하기 위하여 MTT[3-(4,5-dime thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma M5655]시험법을 실시하였다.

섬유아세포를 -80℃ 또는 액체질소상에 보관하며 배양하여 실험에 이용하였으며, 96 웰 플레이트에 2.0×10⁴cells/well씩 동일하게 분주하였다.

시료는 발효녹용 농축분말과 레티놀을 사용하였다. 시료가 처리되어진 96 웰 플레이트를 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 MTT용액(5mg/ml) 10㎕씩을 각 웰에 첨가하여 4시간 동안 배양하였다.

배양액을 제거한 후 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide)용액 100㎕씩을 넣고 10분간 흔들어 준 다음 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 발효녹용 농축분말과 레티놀 두 가지 시료 모두 1×10^-1%(w/v)미만에서 세포 생존율이 100% (± 10%)로 나타났으며 그 이상 농도에서는 세포 독성을 보이는 것으로 나타났다.

따라서 일반적인 세포독성 실험의 농도 기준상 발효녹용 농축분말은 매우 높은 농도(1×10^-1% (w/v))에서도 자극성이 없음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 가장 자연친화적인 발효방법으로 녹용을 추출하였고 녹용의 생리활성 물질의 파괴를 줄이고 유효성분의 함량을 증가시키며 생산성 또한 높일 수 있어, 다양한 분야에서 사용되는 녹용 추출물의 제조 방법으로 유용하게 이용될 수 있다. 특히 본 발명은 주름개선 활성을 체계적으로 밝힘으로써 식품, 화장품 등에 널리 사용하기에 적합하다.

Claims

분쇄된 녹용을 수증기로 증숙하여 녹용의 중량에 15~20% 중량부의 수분을 함유시키는 증숙 단계와;
증숙 단계에서 얻어진 고체상의 녹용분에 나또 균주 배양액을 접종하여 발효시키고, 발효된 고체상 녹용분에 온도를 60℃로 상승시켜 유지하는 숙성을 통해서 발효녹용을 수득하는 발효 단계와;
발효 단계에서 얻어진 고체상 발효녹용에 정제수를 첨가한 후에 60℃~70℃에서 유효성분을 추출, 수득하는 추출/농축 단계와;
추출/농축 단계에서 얻어진 액상의 추출물을 농축, 동결건조하여 고체상 분말을 수득하는 분말 수득단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 제조방법.
청구항 1에 있어서;
증숙 단계는 분쇄된 녹용 100중량부 당 수증기로 증숙하여 15~20중량부의 수분이 함유되며, 증숙 온도는 100~120℃에서 1시간 수행되는 것을 특징으로 하는 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 제조방법.
청구항 1에 있어서;
발효 단계는 증숙된 녹용 100중량부 당 10~20중량부의 나또 균주 배양액을 접종하며, 30~40℃에서 3~5일 동안 발효를 수행하고, 발효 후 8시간 60℃를 유지하면서 숙성하는 것을 특징으로 하는 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 제조방법.
청구항 3에 있어서;
상기 나또 균주 배양액은 청국장균 및 파파인을 함유하는 것을 특징으로 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 제조방법.
청구항 1에 있어서,
추출/농축 단계는 발효된 고체 녹용 100중량부 당 500~1000중량부의 정제수를 투입한 후에, 60~70℃의 온도 조건에서 교반하고, 이를 상온까지 서서히 냉각시켜 유효성분을 추출시키는 것을 특징으로 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물 제조방법.
분쇄된 녹용 100중량부 당 15~20중량부의 수분이 함유되도록 100~120℃의 수증기로 1시간 동안 증숙하며,
증숙된 녹용 100중량부 당 10~20중량부의 나또 균주 배양액을 접종하여 30~40℃에서 3~5일 동안 발효하고, 발효 후 8시간 60℃를 유지시킨 후 발효된 고체 녹용 100중량부 당 500~1000중량부의 정제수를 투입하고, 60~70℃의 온도 조건에서 교반하고, 이를 상온까지 서서히 냉각시켜 유효성분을 추출한 것을 특징으로 하는 고체상 발효를 통한 주름개선 활성을 갖는 녹용추출물.