CN111999236A - 一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法，其包括以下步骤：步骤一：目标组织细胞采集，采集受试大鼠目标检测组织并制备单细胞悬液待测；步骤二：表面抗原染色，将待测样本与抗体应用液混合染色；步骤三：核酸染色，将完成步骤二的样本与核酸染料应用液混合染色；步骤四：结果检测，染色结束后，使用双激光流式细胞仪对样本进行检测以获取数据。该检测方法只需普通双激光流式细胞仪，并无需细胞破膜和消化RNA等步骤便可进行遗传毒性检测，可为食品/保健食品、药品、化妆品、农药等安全性评价提供一种更为高效简便、稳定性较高、节约成本的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及毒理学安全性评价遗传毒性试验技术领域，具体涉及一种大 鼠体内微核试验流式细胞术检测方法。
背景技术
遗传毒性评价作为食品/保健食品、药品、化妆品、农药等安全性评价 的重要部分，与致癌性、致畸性密切相关，可为政府审批和上市相关化学物 和/或制定相关标准及进行监督/管理提供科学依据，对于确保食品/环境安 全、保护居民健康、防止相应危害的发生具有重要作用。微核试验用于检测 染色体断裂剂和非整倍体诱导剂，是一项经典的遗传毒性研究方法，人用药 品注册技术要求国际协调会议、我国卫生健康委员会等国际组织和国家管理 部门均将体内微核试验作为首选的体内遗传毒性试验之一。传统微核试验检 测方法为人工计数方法，然而随着毒理学检验要求的提高，微核人工检测方 法与待检任务、检测能力之间的矛盾越来越突出，评价机构和科研单位对微 核试验自动化检测的需求日益增加。
目前，已建微核试验流式细胞术检测方法主要有：4',6-二脒基-2-苯基 吲哚单染、Hoechst 33258单染、Hoechst 33342/噻唑橙双染等，这些方法 存在操作步骤繁琐、需要配备特定激光的流式细胞仪、重复性较差等缺陷， 限制了这些方法的应用。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种大鼠体内微核试验流 式细胞术检测方法，只需普通双激光流式细胞仪，并无需细胞破膜和消化RNA 等步骤便可进行遗传毒性检测。可为食品/保健食品、药品、化妆品、农药 等安全性评价提供一种更为高效简便、稳定性较高、节约成本的检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种大鼠体内微核试验流式 细胞术检测方法，其包括以下步骤：
步骤一：目标组织采集，采集受试大鼠目标检测组织并制备单细胞悬液 待测；所述目标检测组织为外周血或骨髓；目标检测组织为外周血时，加入 与外周血体积比为1:5的1000U/mL的肝素钠溶液混合均匀形成外周抗凝血； 若目标检测组织为骨髓时，收集骨髓时剪去股骨两端，使用注射器吸取胎牛 血清将骨髓冲洗出骨髓腔，以300g/min转速进行5分钟离心，弃上清，使 用PBS重悬；将采集后的外周抗凝血或骨髓作为待测样本置于4℃避光环境 保存待检。
步骤二：表面抗原染色，将待测样本与抗体应用液混合染色；外周抗凝 血作为待测样本时，采用双染方案进行染色，加入与待测样本体积比为5:1 的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色30分钟；其中，每100μ L抗体应用液中含2％胎牛血清和2μg CD71-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)。
外周血抗凝血或骨髓作为待测样本时，可采用三染方案进行染色，加入 与待测样本体积比为5:1的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色 30分钟；其中，每100μL抗体应用液中含2μg CD71-FITC、0.5μg CD45- 藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、2％胎牛血清。
步骤三：核酸染色，将完成步骤二的样本与核酸染料应用液混合染色； 表面抗原染色结束后，使用PBS离心5分钟清洗一次，转速300g/min，弃上 清，收集底层细胞，使用核酸染料应用液就均匀染色，并于37℃避光孵育 30分钟，孵育后使用PBS并以300g/min离心5分钟清洗一次，弃上清，使 用PBS重悬，再将样本转移至流式细胞管中，于4℃避光保存待检；其中， 所述核酸染料应用液为含20μmol/L DRAQ5的PBS。
步骤四：结果检测，染色结束后，使用双激光流式细胞仪对样本进行检 测以获取数据；若所述步骤二中使用双染方案进行染色，则流式细胞仪具体 射门步骤为：a1、使用前向角散射(forward scatter，FSC)、侧向角散射 (side scatter，SSC)确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；b1、 使用别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)通道信号设门排除有核细胞干 扰，限定微核范围；c1、使用APC通道以获取DRAQ5荧光信号，代表DNA含 量，和FITC通道标记CD71以确定不同细胞群；
若所述步骤二中使用三染方案进行染色，则流式细胞仪具体设门步骤 为：a2、使用FSC、SSC确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；b2、 使用PE通道信号排除白细胞干扰；c2、使用APC通道信号设门排除有核细 胞干扰，限定微核范围；d2、使用APC通道以获取DRAQ5荧光信号，代表DNA 含量，和FITC通道标记CD71以确定不同细胞群；
经设门后，DRAQ5+/FITC+为含微核的网织红细胞(reticulocyte，RET) 群，DRAQ5-/FITC+为不含微核的RET群，FITC-为成熟红细胞群；试验分析 指标为RET微核率和RET比例，；具体计算公式为：RET微核率(‰)＝含微 核的RET/总RET×1000，RET比例(％)＝总RET/总红细胞×100；每样本至 少检测20000个RET。
作为优选的，所述步骤二中的待测样本至少为10μL。
作为优选的，所述双激光流式细胞仪为具有488nm和633nm激光器的流 式细胞仪。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种大鼠体内微核试验流式细胞术 检测方法，只需普通双激光流式细胞仪，并无需细胞破膜和消化RNA等步骤 便可进行遗传毒性检测，检测背景微核率较低，具有灵敏度较高、稳定性较 高、操作步骤简便的优点。可为食品/保健食品、药品、化妆品、农药等安 全性评价提供一种更为高效简便、节约成本的检测方法。
附图说明
图1为本发明流式微核试验设门步骤及结果(双染)示意图；
图2为本发明流式微核试验设门步骤及结果(三染)示意图；
图3为本发明外周血微核试验人工计数和流式细胞术方法RET微核率相 关性示意图；
图4为本发明外周血微核试验人工计数和流式细胞术方法RET比例相关 性示意图；
图5为本发明骨髓微核试验人工计数和流式细胞术方法相关性示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。
如图1-图5所示，本实施例公开了一种大鼠体内微核试验流式细胞术检 测方法，其包括以下步骤：
步骤一：目标组织采集，采集受试大鼠目标检测组织并制备单细胞悬液 待测；所述目标检测组织为外周血或骨髓；目标检测组织为外周血时，加入 与外周血体积比为1:5的1000U/mL的肝素钠溶液混合均匀形成外周抗凝血； 若目标检测组织为骨髓时，收集骨髓时剪去股骨两端，使用注射器吸取胎牛 血清将骨髓冲洗出骨髓腔，以300g/min转速进行5分钟离心，弃上清，使 用PBS重悬；将采集后的外周抗凝血或骨髓作为待测样本置于4℃避光环境 保存待检。
步骤二：表面抗原染色，将待测样本与抗体应用液混合染色；外周抗凝 血作为待测样本时，采用双染方案进行染色，加入与待测样本体积比为5:1 的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色30分钟；其中，每100μ L抗体应用液中含2％胎牛血清和2μg CD71-FITC。
外周血抗凝血或骨髓作为待测样本时，采用三染方案进行染色，加入与 待测样本体积比为5:1的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色30 分钟；其中，每100μL抗体应用液中含2μg CD71-FITC、0.5μg CD45-PE、 2％胎牛血清。
步骤三：核酸染色，将完成步骤二的样本与核酸染料应用液混合染色； 表面抗原染色结束后，使用PBS离心5分钟清洗一次，转速300g/min，弃上 清，收集底层细胞，使用核酸染料应用液就均匀染色，并于37℃避光孵育 30分钟，孵育后使用PBS并以300g/min离心5分钟清洗一次，弃上清，使 用PBS重悬，再将样本转移至流式细胞管中，于4℃避光保存待检；其中， 所述核酸染料应用液为含20μmol/L DRAQ5的PBS。
步骤四：结果检测，染色结束后，使用双激光流式细胞仪对样本进行检 测以获取数据；若所述步骤二中使用双染方案进行染色，则流式细胞仪具体 射门步骤为：a1、使用FSC、SSC确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、 粘连；b1、使用APC通道信号设门排除有核细胞干扰，限定微核范围；c1、 使用APC通道以获取DRAQ5荧光信号，代表DNA含量，和FITC通道标记CD71 以确定不同细胞群；经设门后，DRAQ5+/FITC+为含微核的RET群， DRAQ5-/FITC+为不含微核的RET群，FITC-为成熟红细胞群；试验分析指标 为RET微核率和RET比例，每样本至少检测20000个RET。
如图1所示，A～D为设门过程，其中A、B为根据FSC及SSC所设门， 门内为红细胞，并排除粘连、细胞碎片等；C是排除有核细胞干扰，限定 微核范围；D为经设门后CD71-FITC和DRAQ5散点图。E为阳性结果图， 可见右上象限微核细胞群。具体计算公式如下：
式中P4、P5、P6、P7为图1所标记门中的细胞数量。
若所述步骤二中使用三染方案进行染色，则流式细胞仪具体设门步骤 为：a2、使用FSC、SSC确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；b2、 使用PE通道信号排除白细胞干扰；c2、使用APC通道信号设门排除有核细 胞干扰，限定微核范围；d2、使用APC通道以获取DRAQ5荧光信号，代表DNA 含量，和FITC通道标记CD71以确定不同细胞群；经设门后，DRAQ5+/FITC+ 为含微核的RET群，DRAQ5-/FITC+为不含微核的RET群，FITC-为成熟红细 胞群；试验分析指标为RET微核率和RET比例，每样本至少检测20000个RET。
如图2所示，A～D为设门过程，其中A、B为根据FSC及SSC所设门， 门内为红细胞，并排除粘连、细胞碎片等；C是排除白细胞干扰；D为排 除有核细胞干扰，限定微核范围；E为经设门后CD71-FITC和DRAQ5散点 图。F为阳性结果图，可见右上象限RET微核细胞群。具体计算公式如下：
式中P5、P6、P7、P8为图2所标记门中的细胞数量。
作为优选的，所述步骤二中的待测样本至少为10μL。
作为优选的，所述双激光流式细胞仪为具有488nm和633nm激光器的流 式细胞仪。
实施例中图3中，使用4种阳性标准物质对方法进行验证，其中EMS为 甲基磺酸乙酯，CP为环磷酰胺，ENU为N-乙基-N-亚硝基脲，COL为秋水仙 素。图4中，使用4种阳性标准物质对方法进行验证，其中EMS为甲基磺酸 乙酯，CP为环磷酰胺，ENU为N-乙基-N-亚硝基脲，COL为秋水仙素。图5 中，使用4种阳性标准物质对方法进行验证，其中EMS为甲基磺酸乙酯，CP 为环磷酰胺，ENU为N-乙基-N-亚硝基脲，COL为秋水仙素。
实施例1
样本采集
取5周龄SPF级SD雄性大鼠，体重150～160g。受试物A染毒剂量为0、 5、10、20、40、80、160mg/kg.bw/d，溶剂为纯水，连续28日灌胃染毒。
试验最后一日动物麻醉后进行副主动脉取血，收集自然流动血液50μL 至EP管(内含10μL肝素钠溶液)，立即混匀防止凝血。处死动物后进行 分离双侧股骨，清除肌肉和结缔组织，使用生理盐水清洗并吸干多余液体。 剪去股骨两端，使用2.5mL注射器吸取约1mL胎牛血清，从一侧冲洗骨髓 腔将骨髓冲至5mL离心管。取骨髓细胞300g/min 5分钟离心，弃上清， 使用约50μL PBS重悬，此时骨髓细胞密度约为1×107/mL。采集骨髓样本 于4℃避光保存待检。
选择试剂
FITC小鼠抗大鼠CD71购自美国BD公司；PE小鼠抗大鼠CD45购自美国 eBioscience公司；DRAQ5购自英国Abcam公司；胎牛血清购自上海复蒙基 因生物科技有限公司；PBS购自美国Hyclone公司；肝素钠购自美国 Sigma-Aldrich公司。
细胞染色
(1)取20μL待检样本加入100μL染色体系(染色体系含2μg CD71-FITC、0.5μgCD45-PE、2μL胎牛血清)，混匀后置于4℃避光染 色30分钟。
(2)表面抗原染色结束后，将细胞转移至15mL离心管中(内含10mL PBS)300g/min离心5分钟清洗一次。弃上清，收集底层细胞(约20μL)， 重悬于含有1mL DRAQ5应用液(20μmol/L)的离心管中，混匀后37℃避 光孵育30分钟。
(3)将细胞转移至15mL离心管中(内含10mL PBS)300g/min离心 5分钟清洗一次，弃上清，使用1mL PBS重悬。将样本转移至流式细胞管中， 4℃避光保存待检。
流式细胞仪检测
使用美国BD公司流式细胞仪FACSVerse，使用软件BD FACSuite Software Bundlev1.0进行数据收集和分析。每次检测需制备一个空白对照、 一个PE单染对照和一个FITC单染对照。具体设门步骤为：①使用FSC、SSC 确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；②使用PE通道信号排除白 细胞干扰；③使用APC通道信号设门排除有核细胞干扰，限定微核范围；④ 使用APC通道(获取DRAQ5荧光信号，代表DNA含量)和FITC通道(标记 CD71)确定不同细胞群。试验分析指标为RET微核率和RET比例，每样本至 少检测20000个RET。
检测结果
如表1所示：
表1受试物A微核试验结果(n＝6，
)
注：*与溶剂对照组比较差异有统计学意义，p<0.05。
结果评价
该实施例中，试验组与对照组相比外周血和骨髓RET微核率均显著升高， 且具有明显的剂量-反应关系，可确认为阳性结果。
通过上述结果可知：该方法操作简便，检测灵敏度较高。使用双染方法 时，成本低廉；使用三染方法时可识别相对于背景的小幅度微核率增加，可 更进一步提高检测灵敏度，识别受试物低剂量暴露下的遗传毒性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤一：目标组织采集，采集受试大鼠目标检测组织并制备单细胞悬液待测；所述目标检测组织为外周血或骨髓；目标检测组织为外周血时，加入与外周血体积比为1:5的1000U/mL的肝素钠溶液混合均匀形成外周抗凝血；若目标检测组织为骨髓时，收集骨髓时剪去股骨两端，使用注射器吸取胎牛血清将骨髓冲洗出骨髓腔，以300g/min转速进行5分钟离心，弃上清，使用PBS重悬；将采集后的外周抗凝血或骨髓作为待测样本置于4℃避光环境保存待检；
步骤二：表面抗原染色，将待测样本与抗体应用液混合染色；外周抗凝血作为待测样本时，采用双染方案进行染色，加入与待测样本体积比为5:1的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色30分钟；其中，每100μL抗体应用液中含2％胎牛血清和2μgCD71-FITC；
外周血抗凝血或骨髓作为待测样本时，可采用三染方案进行染色，加入与待测样本体积比为5:1的抗体应用液，混合均匀后置于4℃避光环境染色30分钟；其中，每100μL抗体应用液中含2μgCD71-FITC、0.5μg CD45-PE、2％胎牛血清；
步骤三：核酸染色，将完成步骤二的样本与核酸染料应用液混合染色；表面抗原染色结束后，使用PBS离心5分钟清洗一次，转速300g/min，弃上清，收集底层细胞，使用核酸染料应用液就均匀染色，并于37℃避光孵育30分钟，孵育后使用PBS并以300g/min离心5分钟清洗一次，弃上清，使用PBS重悬，再将样本转移至流式细胞管中，于4℃避光保存待检；其中，所述核酸染料应用液为含20μmol/LDRAQ5的PBS；
步骤四：结果检测，染色结束后，使用双激光流式细胞仪对样本进行检测以获取数据；若所述步骤二中使用双染方案进行染色，则流式细胞仪具体射门步骤为：a1、使用FSC、SSC确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；b1、使用APC通道信号设门排除有核细胞干扰，限定微核范围；c1、使用APC通道以获取DRAQ5荧光信号，代表DNA含量，和FITC通道标记CD71以确定不同细胞群；
若所述步骤二中使用三染方案进行染色，则流式细胞仪具体设门步骤为：a2、使用FSC、SSC确定红细胞群，排除血小板、细胞碎片、粘连；b2、使用PE通道信号排除白细胞干扰；c2、使用APC通道信号设门排除有核细胞干扰，限定微核范围；d2、使用APC通道以获取DRAQ5荧光信号，代表DNA含量，和FITC通道标记CD71以确定不同细胞群；
经设门后，DRAQ5+/FITC+为含微核的网织红细胞群，DRAQ5-/FITC+为不含微核的网织红细胞群，FITC-为成熟红细胞群；试验分析指标为网织红细胞微核率和网织红细胞比例；具体计算公式为：网织红细胞微核率‰＝含微核的网织红细胞/总网织红细胞×1000，网织红细胞比例％＝总网织红细胞/总红细胞×100；每样本至少检测20000个网织红细胞。
2.根据权利要求1所述的一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法，其特征在于，所述步骤二中的待测样本至少为10μL。
3.根据权利要求2所述的一种大鼠体内微核试验流式细胞术检测方法，其特征在于，所述双激光流式细胞仪为具有488nm和633nm激光器的流式细胞仪。
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