KR102169268B1 - 멜라민 검출용 조성물 및 이를 이용한 멜라민 검출 방법 - Google Patents

멜라민 검출용 조성물 및 이를 이용한 멜라민 검출 방법 Download PDF

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전향숙
허윤석
박경열
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중앙대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 멜라민 검출용 조성물 및 이를 이용한 멜라민 검출 방법에 관한 것으로, 시료 속에 극미량으로 첨가된 멜라민을 간단하고, 고효율적(고민감성, 고특이성)으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 멜라민 검출 방법에 비해 간단하고, 검출 시간을 단축할 수 있으므로, 멜라민을 검출하는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

멜라민 검출용 조성물 및 이를 이용한 멜라민 검출 방법{Composition for Detecting Melamine and Method for Detecting Melamine using the same}
본 발명은 멜라민 검출용 조성물 및 이를 이용한 멜라민 검출 방법에 관한 것이다.
멜라민은 분자 내 3개의 아민 작용기 및 6개의 질소 원자를 가진 화학분자로, 요소로부터 암모니아가스와 이산화탄소를 방출하며 합성된다. 멜라민은 일반적으로 라미네이트나 플라스틱 등에 사용되며, 포름알데하이드와 혼합하여 레진으로 사용되는 공업용 물질이다.
최근 식품 내에 발암물질이나 불법적인 첨가제를 넣어 유통되는 사례가 빈번해짐에 따라 식품안전에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히, 2006년과 2008년에 중국에서 발생한 멜라민 분유 파동으로 인하여 식품내 멜라민 검출은 매우 중요한 문제로 대두되었다. 섭취된 멜라민은 체내 신장에 쌓이며, 시아누릭산과 반응하여 결정을 형성하여 신장이나 방광에 결석을 유발하기 때문에 신속한 검출이 필요하다. 특히, 미국의 FDA와 유럽 EFSA에서는 성인기준 60ppm의 멜라민을 꾸준하게 섭취하지 않는 한 문제가 없다고 발표하였으나, 멜라민 파동 당시 이보다 훨씬 적은 양의 멜라민을 섭취한 사람들에게서도 질병이 나타나, 멜라민의 안전 기준이 크게 수정되었다. 우리나라의 경우, 각종 유아식이나 분유 및 우유 등의 영아용 식품에서는 불검출을 기준으로 하고, 그 외의 모든 식품 및 식품첨가물에서는 2.5ppm 이하로 규정되어있다. 이러한 기준에도 불구하고, 멜라민을 식품에 첨가하는 이유는 낙농제품의 품질을 단백질 함량을 분석해서 결정하는 것이 아니라, 식품 내에 포함된 질소의 양이 얼마나 되는지를 킬달법(Kjeldahl method)을 이용하여 판단하기 때문이다.
일반적으로 식품 등의 시료에 포함된 멜라민의 검출을 위하여 고성능 액체크로마토그래피(HPLC), 질량분석기(MS), 라만 분광법 등이 수행되고 있다. HPLC와 LC/MS의 경우 0.1-1ppm 수준의 검출한계를 나타내며, 라만 분광법은 0.03ppm 수준의 검출한계를 나타낸다. 이와 같은 장비기반의 검출방법은 낮은 검출한계를 나타낸다는 장점은 있으나, 멜라민의 검출을 위하여 고가의 장비가 필요하고, 숙련된 분석자들이 필요하며, 분석에 긴 시간이 요구되므로, 신속한 멜라민의 현장 검출이 어렵다는 한계점이 존재한다.
이러한 문제를 개선하고, 보다 간단하게 멜라민을 검출하기 위하여, 금 또는 은 나노입자 기반의 비색법 및 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상을 이용한 광학적 검출법이 제시되었다. 이와 같은 광학적 검출법은 0.05 내지 20ppm의 낮은 멜라민 검출한계를 나타내나, 이러한 광학적 검출법은 멜라민의 고리구조의 인식 또는 수소결합 등 기본적인 분자인식에 기반한 방법이므로, 다양한 물질이 혼합되어 있는 실제 유제품으로부터 멜라민을 특이적으로 검출하기에는 실효성이 낮다는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 검출방법의 문제를 해결하고자 멜라민을 특이적으로 검출할 수 있는 바이오리셉터를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2010-0104030호
본 발명의 하나의 목적은 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 멜라민 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 다른 목적은 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 멜라민 검출용 조성물을 포함하는 멜라민 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드, 형광물질 및 금속이온을 포함하는 멜라민 검출용 조성물에 미지의 시료를 접촉시키는 단계; 시료에 접촉된 조성물의 형광 세기를 측정하는 단계; 및 형광 세기가 증가할 경우, 상기 시료에 멜라민이 포함되어 있는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 멜라민 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 멜라민 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드는, 파지 디스플레이 기술에 의해 발굴된 펩타이드 기반의 바이오리셉터로써, 식품 속에 함유된 멜라민에도 고민감도 및 고특이적으로 결합할 수 있으므로, 본 발명의 멜라민 검출용 조성물은 식품 속 멜라민을 검출하기 위한 바이오센서의 제작에 유용하게 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오리셉터(Bio-receptor)"는 표적물질에 특이적으로 결합하는 생체분자를 말하며, 예를 들어, 항체 또는 펩타이드일 수 있다.
멜라민 검출용 조성물은 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드 외에 멜라민의 검출 및/또는 분석에 일반적으로 사용되는 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다.
이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있다. 표지물질이 형광물질인 경우에는 형광 세기를 측정하는 데 필요한 기질 등을 더 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 가용성 담체, 예를 들어, 당업계에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS 등); 불용성 담체, 예를 들어, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드 등; 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및/또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 펩타이드는 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(ATPNHSHRSISSC, Melp1)는 멜라민에 대하여 11.23ppm의 검출한계를 갖는다. 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(FYSHSVPSPRVEC, Melp3)는 멜라민에 대하여 16.71ppm의 검출한계를 갖는다. 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(SHIRSISSC, Melp5)는 멜라민에 대하여 11.00ppm의 검출한계를 갖는다. 이와 같은 펩타이드는 멜라민에 특이적으로 결합하고, 낮은 검출한계를 나타내므로, 다양한 멜라민 유사구조를 포함하는 시료에서 멜라민을 신속하고 효과적으로 검출하는데 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 형광물질 및 금속이온을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 형광물질은 산화 그래핀 양자점일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 금속이온은 수은(Ⅱ)이온일 수 있다.
산화 그래핀 양자점은 수은(Ⅱ)이온의 존재 하에서 형광을 나타낸다. 한편, 멜라민 또는 멜라민 유사 물질이 존재할 경우, 산화 그래핀 양자점은 멜라민 및 멜라민 유사 물질과의 작용에 의하여 형광이 소광된다. 한편, 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드와 멜라민이 결합할 경우, 멜라민에 의한 산화 그래핀 양자점의 소광이 해소될 수 있으므로, 상기 펩타이드와 멜라민의 결합에 따라, 산화 그래핀 양자점이 나타내는 형광의 세기가 점차 증가하게 된다. 따라서, 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드와 산화 그래핀 양자점 및 수은(Ⅱ)이온을 사용하여 시료에 포함된 멜라민을 간편하고 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 멜라민 검출용 조성물을 포함하는 멜라민 검출용 키트를 제공한다.
멜라민 검출용 키트는 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드 외에 멜라민의 검출 및/또는 분석에 일반적으로 사용되는 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다.
전술한 내용과 중복되는 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양상은 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드, 형광물질 및 금속이온을 포함하는 멜라민 검출용 조성물에 미지의 시료를 접촉시키는 단계; 시료에 접촉된 조성물의 형광 세기를 측정하는 단계; 및 형광 세기가 증가할 경우, 상기 시료에 멜라민이 포함되어 있는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 멜라민 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 멜라민 검출 방법은 간단하게 시약을 혼합하는 형태로 수행될 수 있으므로, 높은 숙련도를 필요로 하지 않고, 장비를 사용한 분석방법 대비 빠른 멜라민 검출이 가능하므로, 현장에서 멜라민을 신속하고 간편하게 검출하는데 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 멜라민 검출 방법은 하기와 같은 단계로 수행될 수 잇다.
첫 번째 단계는 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드, 형광물질 및 금속이온을 포함하는 멜라민 검출용 조성물에 미지의 시료를 접촉시키는 단계이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "접촉"은 이의 일반적인 의미이며, 하나 이상의 물질이 다른 물질에 영향을 줄 수 있을 정도로 가까운 거리에 위치하는 것을 포함한다.
미지의 시료는 멜라닌이 포함되었을 것으로 의심되는 모든 시료를 포함하며, 일반적으로, 유제품 등의 식품일 수 있다.
두 번째 단계는 시료에 접촉된 조성물의 형광 세기를 측정하는 단계이다.
멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드와 멜라민의 결합에 의하여, 멜라민에 의한 형광물질의 소광이 해소될 수 있다. 형광의 세기는 시료에 포함된 멜라민과 상기 조성물의 반응 후, 60분까지 급격하게 증가하나, 60분 이후에는 증가 폭이 감소하므로, 시료에 접촉된 조성물의 형광 세기는 시료와 조성물을 접촉시킨 후, 약 60분경에 측정하는 것이 바람직하다.
형광 세기의 측정은 통상적으로 형광 정도를 측정하는 방법 및 이에 사용되는 기기를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 통상의 형광 현미경 등을 이용하여 수행될 수 있고, 형광 세기를 정량적으로 비교하기 위한 별도의 장치, 예를 들어, 분광계 등을 추가로 사용하여 수행될 수 있다.
마지막 단계는 형광 세기가 증가할 경우, 상기 시료에 멜라민이 포함되어 있는 것으로 판단하는 단계이다.
본 발명의 조성물은 멜라민의 존재 하에서, 멜라민에 의한 형광물질의 소광이 해소됨에 따라 형광 세기가 점차 증가하므로, 형광 세기가 증가할 경우, 시료에 멜라민이 포함되어 있는 것으로 판단할 수 있다.
멜라민 검출용 조성물 및 이를 이용한 멜라민 검출 방법에 따르면, 시료 속에 극미량으로 첨가된 멜라민을 간단하고, 고효율적(고민감성, 고특이성)으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 멜라민 검출 방법에 비해 간단하고, 검출 시간을 단축할 수 있으므로, 멜라민을 검출하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 플레이트에 직접 멜라민을 고정시켜 파지 디스플레이를 진행하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 헵텐화된 멜라민(헵텐)-BSA를 이용하여 파지 디스플레이를 진행하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 (a) 멜라민의 헵텐화에 대한 반응기작 및 (b) 헵텐에 대한 핵자기공명 분석 결과이다.
도 4는 BSA와 헵텐-BSA에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과이다.
도 5는 (a) 헵텐-BSA 및 (b) BSA에 대한 고성능액체크로마토그래피 결과이다.
도 6은 (a) 헵텐-BSA 및 (b) BSA에 대한 MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry) 분석 결과이다.
도 7은 산화 그래핀 양자점, 수은(Ⅱ)이온 및 멜라민의 소광 현상을 이용한 멜라민 검출 과성을 나타낸 모식도이다.
도 8은 수은(Ⅱ)이온 및 멜라민 농도에 따른 산화 그래핀 양자점의 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 9는 멜라민과 수은(Ⅱ)이온이 첨가되어 소광된 산화 그래핀 양자점에 펩타이드 첨가 후, 초기 형광값 대비 시간에 따라 변하는 형광 세기를 비교한 그래프이다.
도 10은 멜라민 검출 바이오리셉터의 검출범위를 확인하기 위하여, 넓은 농도 범위의 멜라민 조건에서 각 바이오리셉터가 첨가되었을 때 멜라민의 농도에 따라 나타나는 산화 그래핀 양자점의 형광 회복 정도를 비교한 그래프이다.
도 11은 멜라민의 농도에 따른 (a) Melp1, (b) Melp3 또는 (c) Melp5 펩타이드 기반 멜라민 검출 바이오리셉터의 형광 세기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 멜라민 및 벤젠고리를 갖는 방향족 물질에 따른 (a) Melp1, (b) Melp3 또는 (c) Melp5 펩타이드 기반 멜라민 검출 바이오리셉터의 형광 세기 변화를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 멜라민의 헵텐화 및 헵텐-BSA의 합성
<1-1> 멜라민의 헵텐화 및 확인
파지 디스플레이(phage display) 방법(도 1)을 사용하여 멜라민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 발굴하고자 하였다. 본 발명에서는 멜라민과 BSA를 결합시킨 후, 플레이트에 고정하여 사용하였다. 즉, BSA에 결합하는 펩타이드를 제거(negative screening)하고, 멜라민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별(positive screening)하여, 멜라민의 검출을 위한 펩타이드를 발굴하였다(도 2).
멜라민과 BSA의 결합을 위하여, 다음과 같은 방법으로 멜라민에 링커를 결합하여 멜라민의 헵텐화를 진행하였다.
구체적으로, 20㎖의 3차 증류수에 2-클로로-4,6-다이아민-1,3,5-트리아진(2-chloro-4,6-diamine-1,3,5-triazine, CAAT) 1.0g 및 6-아미노카프론산(Aminocaproic acid, AHA) 1.08g을 넣고 가열하여 완전 용해시켰다. 용해 후, 50㎖의 0.27M NaOH를 넣고, 17시간 동안 환류 응축반응을 진행하였다. 반응이 끝난 후, 필터로 반응하지 않은 2-클로로-4,6-다이아민-1,3,5-트리아진을 제거하고, 6M HCl를 가한 후, 20㎖의 디클로로메탄으로 3차례 추출을 진행하였다. 추출 후, 추출한 물질의 용매를 제거하고, 60℃에서 10시간 동안 건조하여 멜라민의 헵텐화를 진행하였다(도 3a). 그 후, 헵텐화된 멜라민은 Agilent의 300MHz Gemini-2000 장치를 사용하여 핵자기공명분석으로 헵텐화된 멜라민을 확인하였다.
그 결과, 2-클로로-4,6-다이아민-1,3,5-트리아진과 아미노카프론산의 수소 피크가 일부 옮겨진 형태의 피크가 확인되어 멜라민의 헵텐화가 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다(도 3b).
이후, 위와 같은 방법으로 제조한 헵텐화된 멜라민(헵텐)을 사용하여 헵텐-BSA를 합성하였다.
<1-2> 헵텐-BSA의 합성 및 확인
실시예 1-1에서 제조한 헵텐화된 멜라민(헵텐)에 다음과 같은 방법으로 BSA를 고정하여 헵텐-BSA를 합성하였다.
구체적으로, 5㎖ 디메틸포름아마이드에 실시예 1-1에서 제조한 헵텐 20.0㎎ 및 N-하이드록시석신이미드 14.0㎎을 넣고 10분간 반응시켰다. 10분 후, N,N-디사이클로헥실카보디이미드 26.0㎎을 넣고 4℃에서 15시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 필터로 반응하지 않은 불순물을 제거하고, 2㎖의 3차 증류수에 녹인 BSA(28.0 ㎎)에 넣은 후, 4℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후, 불순물을 제거하기 위하여, 15,814×g에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 상층액을 제거하고, 3일 동안 투석하였다.
아가로스 젤 전기영동으로 분석한 결과, BSA보다 큰 사이즈의 밴드가 확인되어, 헵텐-BSA가 합성되었음을 확인하였다(도 4).
또한, 주사기 필터로 샘플을 거른 후, Nova-Pak C18 column(3.9mm i.d.×15cm, 4㎛; Waters)을 사용하여 고성능 액체크로마토그래피(1100 series HPLC system, Agilent) 분석을 수행한 결과, BSA(도 5b)보다 늦은 용출시간 및 넓은 피크를 나타내는 것을 확인하여, 헵텐-BSA(도 5a)가 합성되었음을 확인하였다.
한편, MALDI TOF Voyager DE-STR(Applied Biosystems) 모델을 사용하여 MALDI-TOF MS를 분석한 결과, 헵텐-BSA(도 6a)은 71.9kDa의 평균적인 질량 크기를 갖고, BSA(도 6b)는 66.2kDa의 평균적인 질량 크기를 갖는 것을 확인하여, 헵텐-BSA가 성공적으로 합성되었음을 확인하였다.
이후, 위와 같은 방법으로 제조한 헵텐-BSA를 사용하여 파지 디스플레이를 진행하였다.
실시예 2. 헵텐 및 헵텐-BSA를 사용한 파지 디스플레이 진행
<2-1> 헵텐의 플레이트 직접 고정
실시예 1-1에서 제조한 헵텐을 다음과 같은 방법으로 플레이트에 직접 고정하였다.
구체적으로, CUTE-MP(FemtoScience) 장비를 사용하여 12 웰 플레이트에 3분 동안 산소 플라즈마를 처리한 후, 500㎕의 0.5% 3-아미노프로필트리에톡시실란을 넣고 5분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 3차 증류수로 5회 세척하였다. 산소 플라즈마를 처리하는 동안 5㎖의 디메틸포름아마이드에 실시예 1-1에서 제조한 헵텐 10.0㎎ 및 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이미드 9.6㎎을 넣고 1시간 동안 교반하였다. 이후, N-하이드록시숙신이미드(hydroxysuccinimide) 5.7㎎을 가하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응시킨 헵텐을 12 웰 플레이트에 넣고, 1시간 동안 반응시킨 다음, 3차 증류수로 5회 세척하여 헵텐을 플레이트에 직접 고정하였다.
<2-2> 플레이트에 직접 고정한 헵텐의 파지 디스플레이
실시예 2-1에서 플레이트에 직접 고정한 헵텐을 사용하여 파지 디스플레이를 진행하였다.
구체적으로, 1㎖의 0.1M 탄산수소나트륨에 BSA 6.5㎎을 녹인 후, 실시예 2-1에서 제조한 멜라민을 고정시킨 플레이트에 넣어 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 용액을 제거하고 500㎕ TBS(Tris-buffered saline)에 phage library kit(7-mer, 12-mer)를 1×1011pfu/㎖가 되도록 희석한 후, 플레이트에 넣고, 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, TBST(0.1% tween-20)로 10회 세척한 후, 0.2M Glycine-HCl 500㎕을 넣고 20분 동안 반응시킨 다음, 75㎕의 1M Tris-HCl을 넣어 파지 디스플레이를 진행하였다.
그 결과, 표 1과 같이, 파지 디스플레이 스크리닝이 진행될수록 파지의 회복률이 증가하는 것으로 나타나, 멜라민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 파지가 선별되었음을 확인하였다.
Sample Round of panning Input Phage
(PFU)		 Output Phage
(PFU)		 Phage recovery (output/input, %)
hapten-linked plate
(7-mer kit)		 1 1.0×1011 6.0×107 1.6×10-4
2 2.0×109 2.0×106 1.0×10-3
3 1.0×1011 1.0×108 1.0×10-3
hapten-linked plate
(12-mer kit)		 1 2.0×1011 6.0×107 3.0×10-4
2 2.0×1011 2.0×108 1.0×10-3
3 2.0×1011 2.0×106 1.0×10-5
<2-3> 헵텐-BSA의 파지 디스플레이
실시예 1-2에서 합성한 헵텐-BSA을 사용하여 다음과 같은 방법으로 파지 디스플레이를 진행하였다.
구체적으로, 1㎖ 0.1M 탄산수소나트륨에 BSA 6.5㎎ 및 실시예 1-2에서 합성한 헵텐-BSA를 녹인 후, 96 웰 플레이트에 넣고, 4℃에서 15시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 용액을 제거하고 500㎕ TBS(Tris-Buffered Saline)에 phage library kit(7-mer, 12-mer)를 1×1011pfu/㎖가 되도록 희석한 후, 96 웰 플레이트에 넣고, 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 상층액을 96 웰 플레이트에 넣고, 1시간 동안 반응시킨 다음, TBST(0.1% tween-20)로 10회 세척하였다. 그 후, 100㎕의 0.2M Glycine-HCl을 넣고 20분 동안 반응시킨 다음, 15㎕의 1M Tris-HCl을 넣어 파지 디스플레이를 진행하였다.
그 결과, 표 2와 같이, 파지 디스플레이 스크리닝이 진행될수록 파지의 회복률이 증가하는 것으로 나타나, 멜라민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 파지가 선별되었음을 확인하였다.
Sample Round of panning Input Phage
(PFU)		 Output Phage
(PFU)		 Phage recovery (output/input, %)
hapten-BSA
(7-mer kit)		 1 1.0×1011 2.0×106 2.0×10-5
2 2.0×109 1.2×106 6.0×10-4
3 1.0×1011 1.0×108 1.0×10-3
hapten-BSA
(12-mer kit)		 1 1.0×1011 9.0×107 9.0×10-4
2 2.0×1011 1.0×109 5.0×10-2
3 1.0×1011 1.0×109 1.0×10-3
실시예 3. 멜라민 검출을 위한 펩타이드 후보군 선별
실시예 2에서 선별한 멜라민에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 파지의 DNA 추출을 위하여, 독립적인 파지 플라크만을 추출하여 배양하고, DNA 추출 및 시퀀싱을 진행하여 멜라민 검출을 위한 펩타이드 후보군을 선별하였다.
구체적으로, LB(Luria-Bertani) 배지에 0.1㎎/㎖ 테트라사이클린을 넣고, ER2738을 배양하여 600nm에서의 흡광도가 0.01이 되었을 때, 독립적인 파지 플라크를 넣어 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 후, 18,341×g에서 30초간 원심분리하여 수득한 상층액을 깨끗한 튜브에 옮겨 담고, 500㎕의 PEG 8000(polyethylene glycol, M.W.8000)/2.5M NaCl을 넣은 후, 20분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 18,341×g에서 10분간 원심분리 하고, 상층액을 모두 제거한 다음, 펠렛을 Iodide buffer(10mM Tris-HCl; pH8.0, 1mM EDTA, 4M sodium iodide)에 녹이고, 99% 에탄올을 첨가하여 20분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 18,341×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 모두 제거하고, 20㎕의 TE 버퍼(10mM Tris; pH8.0, 1.0mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid))를 첨가하여 펠렛을 현탁하였다. DNA 시퀀싱은 Cosmo Gentech사에 의뢰하여 진행하였다.
그 결과, 실시예 2-2의 플레이트에 직접 고정한 헵텐으로 진행한 파지 디스플레이로부터 얻은 독립적인 파지 플라크에서 선별한 펩타이드는 표 3과 같음을 확인하였다.
샘플 구분 아미노산 서열 서열번호
Sequence 1 hapten-linked plate
(7-mer kit)		 SHRSISC 서열번호 1
Sequence 2 SHRSISS 서열번호 2
Sequence 3 SHRSIYY 서열번호 3
Sequence 4 LIVVFLY 서열번호 4
Sequence 5 hapten-linked plate
(12-mer kit)		 ATPNHSHRSISS 서열번호 5
Sequence 6 ATRNHSHRSISS 서열번호 6
Sequence 7 ATPNHYHRNIYS 서열번호 7
Sequence 8 FYSHSVPSPRVE 서열번호 8
Sequence 9 FYSHSTANYGYD 서열번호 9
Sequence 10 PTPHQHHKHIHS 서열번호 10
한편, 실시예 2-3의 헵텐-BSA을 사용하여 진행한 파지 디스플레이로부터 얻은 독립적인 파지 플라크에서 선별한 펩타이드는 표 4와 같음을 확인하였다.
샘플 구분 아미노산 서열 서열번호
Sequence 11 hapten-BSA plate
(7-mer kit)		 IISIFHA 서열번호 11
Sequence 12 HHKHLHA 서열번호 12
Sequence 13 RHQRLHA 서열번호 13
Sequence 14 SHRSILL 서열번호 14
Sequence 15 HHQHHHA 서열번호 15
Sequence 16 hapten-BSA plate
(12-mer kit)		 ATPHHYHKHLYS 서열번호 16
Sequence 17 ATPHHSHRSISS 서열번호 17
Sequence 18 ATPNHSHRSISS 서열번호 18
Sequence 19 FYSHSTANYGYD 서열번호 19
Sequence 20 LTPHHHHKHLYS 서열번호 20
Sequence 21 LTPHHYHNNIHS 서열번호 21
표 3 및 표 4에서 선별한 펩타이드를 바탕으로, 멜라민과 특이적으로 결합할 것으로 예상되는 5개의 펩타이드를 표 5와 같이 합성하였다.
명칭 아미노산 서열 MW
(g/mol)		 Hydrophilic/Hydrophobic
Ratio (%)		 서열번호
Melp1 ATPNHSHRSISSC 1396.56 75 서열번호 22
Melp2 FYSHSTANYGYDC 1527.64 50 서열번호 23
Melp3 FYSHSVPSPRVEC 1507.75 60 서열번호 24
Melp4 ATRNHSHRSISSC 1455.63 77 서열번호 25
Melp5 SHIRSISSC 875.99 86 서열번호 26
실시예 4. 산화 그래핀 양자점 형광 소광 시스템 최적화 조건 확인
산화 그래핀 양자점이 수은(Ⅱ)이온과 멜라민 하에 형광이 소광되는 현상을 멜라민 검출 바이오리셉터에 적용(도 7)하기 위하여, 멜라민 및 수은(Ⅱ)이온 농도를 최적화하였다.
구체적으로, 50㎕ 산화 그래핀 양자점, 50㎕ 5×TBS, 0 내지 1.25mM 수은이온, 및 0 내지 0.25㎎/㎖ 멜라민을 혼합한 후, 형광의 세기를 측정하였다. 형광의 측정은 BioTek사의 multi-mode microplate reader Synergy H1 장비를 사용하여 측정하였으며, 460 nm의 파장으로 여기 시킨 후 535 nm에서 발하는 형광을 읽어들여 분석했다.
그 결과, 멜라민과 수은(Ⅱ)이온 농도에 따라 산화 그래핀 양자점 형광의 세기가 달라지는 것으로 나타났으며, 수은(Ⅱ)이온 농도의 경우 0.31mM에서 멜라민 농도에 따른 변화가 가장 두드러지는 것으로 확인되었다(도 8).
따라서, 이후의 실험에서는 수은(Ⅱ이온의 농도를 0.31mM로 고정하였다.
실시예 5. 산화 그래핀 양자점 소광현상 기반 멜라민 검출 바이오리셉터의 유효성 검증 및 멜라민의 농도에 따른 검출 양상 확인
<5-1> 멜라민 검출 바이오리셉터의 반응시간 최적화
산화 그래핀 양자점이 수은(Ⅱ)이온 및 멜라민과 반응하여 형광이 소광되는 현상을 바이오리셉터에 적용하기 위하여, 반응시간에 따른 형광 변화를 분석하였다.
구체적으로, 50㎕ 산화 그래핀 양자점, 50㎕ 5×TBS, 0.31mM 수은(Ⅱ)이온 및 0.06㎎/㎖ 멜라민을 혼합한 후, 1㎎/㎖ 펩타이드 50㎕를 첨가하여 시간에 따라 형광의 세기 변화를 측정하였다. 펩타이드는 표 5에서 선별한 Melp1 내지 Melp5 및 노로바이러스 유래 펩타이드 2종류를 사용하였으며, 대조군으로 3차 증류수(DI)를 사용하여 멜라민과의 반응시간에 따른 산화 그래핀 양자점의 형광 세기 변화를 측정하였다.
그 결과, Melp1 내지 Melp5를 사용한 경우, 반응시간에 따라 산화 그래핀 양자점의 형광 세기가 달라지는 것으로 확인된 반면, 대조군으로 사용한 3차 증류수 및 노로바이러스 유래 펩타이드에서는 형광의 세기가 달라지지 않는 것으로 확인되었다(도 9).
한편, 반응시간이 지남에 따라 형광의 세기는 60분까지 급격하게 증가하였으나, 60분 이후에는 증가 폭이 감소하는 것으로 확인되어, 이후의 실험에서는 반응 시간을 60분으로 고정하였다.
<5-2> 멜라민 농도에 따른 멜라민 검출 바이오리셉터의 형광 세기 변화 검증
멜라민 농도에 따른 멜라민 검출 바이오리셉터의 형광 세기 변화를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 50㎕ 산화 그래핀 양자점, 50㎕ 5×TBS, 0.31mM 수은(Ⅱ)이온 및 0 내지 0.25㎎/㎖ 멜라민을 혼합한 후, 1㎎/㎖ 펩타이드 50㎕를 첨가하여 60분 반응시키고, 형광의 세기 변화를 측정하였다. 펩타이드는 표 5에서 선별한 Melp1 내지 Melp5 및 노로바이러스 유래 펩타이드 2종류를 사용하였으며, 대조군으로 3차 증류수(DI)를 사용하여 멜라민 농도에 따른 산화 그래핀 양자점의 형광 세기 변화를 측정하였다.
그 결과, Melp2 및 Melp4를 사용한 경우, 높은 농도에서 형광이 감소하는 것으로 나타나 멜라민 검출 바이오리셉터로 사용하기에 적합하지 않은 것으로 확인되었다. 반면, Melp1, Melp3 및 Melp5를 사용한 경우, 농도에 따른 형광 세기 변화를 나타내는 것으로 확인되어, 멜라민 검출 바이오리셉터에 적용할 수 있는 것으로 확인되었다(도 10).
따라서, Melp1, Melp3 및 Melp5에 대한 멜라민의 검출 한계를 확인한 결과, Melp1은 11.23ppm, Melp3은 16.71ppm, 및 Melp5는 11.00ppm의 멜라민 검출 한계를 나타내는 것으로 확인되었다(도 11).
실시예 6. 멜라민 검출 바이오리셉터의 멜라민 검출 특이성 확인
멜라민에 대한 바이오리셉터의 검출 특이성을 확인하기 위하여, 구조적으로 벤젠고리를 갖는 화합물 중, 실시예 5의 멜라민 검출 바이오리셉터가 멜라민을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 50㎕ 산화 그래핀 양자점, 50㎕ 5×TBS, 0.31mM 수은(Ⅱ)이온에 멜라민, 헵텐, 자일렌, 톨루엔, 1,2-디클로로벤젠 및 페놀을 각각 0.25㎎/㎖ 혼합한 후, 1㎎/㎖의 Melp1, Melp3 또는 Melp5를 50㎕ 첨가하여 60분 동안 반응시키고, 형광의 세기 변화를 측정하였다.
그 결과, 헵텐, 자일렌, 톨루엔, 1,2-디클로로벤젠 및 페놀에서는 형광 세기가 증가하지 않은 반면, 멜라민에서는 형광 세기가 증가한 것으로 나타나, 멜라민 검출 바이오리셉터의 멜라민에 대한 고민감성 및 선택성을 확인하였다(도 12).
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Composition for Detecting Melamine and Method for Detecting Melamine using the same <130> PN180470 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 1 <400> 1 Ser His Arg Ser Ile Ser Cys 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 2 <400> 2 Ser His Arg Ser Ile Ser Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 3 <400> 3 Ser His Arg Ser Ile Tyr Tyr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 4 <400> 4 Leu Ile Val Val Phe Leu Tyr 1 5 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 5 <400> 5 Ala Thr Pro Asn His Ser His Arg Ser Ile Ser Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 6 <400> 6 Ala Thr Arg Asn His Ser His Arg Ser Ile Ser Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 7 <400> 7 Ala Thr Pro Asn His Tyr His Arg Asn Ile Tyr Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 8 <400> 8 Phe Tyr Ser His Ser Val Pro Ser Pro Arg Val Glu 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 9 <400> 9 Phe Tyr Ser His Ser Thr Ala Asn Tyr Gly Tyr Asp 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 10 <400> 10 Pro Thr Pro His Gln His His Lys His Ile His Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 11 <400> 11 Ile Ile Ser Ile Phe His Ala 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 12 <400> 12 His His Lys His Leu His Ala 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 13 <400> 13 Arg His Gln Arg Leu His Ala 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 14 <400> 14 Ser His Arg Ser Ile Leu Leu 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 15 <400> 15 His His Gln His His His Ala 1 5 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 16 <400> 16 Ala Thr Pro His His Tyr His Lys His Leu Tyr Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 17 <400> 17 Ala Thr Pro His His Ser His Arg Ser Ile Ser Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 18 <400> 18 Ala Thr Pro Asn His Ser His Arg Ser Ile Ser Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 19 <400> 19 Phe Tyr Ser His Ser Thr Ala Asn Tyr Gly Tyr Asp 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 20 <400> 20 Leu Thr Pro His His His His Lys His Leu Tyr Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence 21 <400> 21 Leu Thr Pro His His Tyr His Asn Asn Ile His Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Melp1 <400> 22 Ala Thr Pro Asn His Ser His Arg Ser Ile Ser Ser Cys 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Melp2 <400> 23 Phe Tyr Ser His Ser Thr Ala Asn Tyr Gly Tyr Asp Cys 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Melp3 <400> 24 Phe Tyr Ser His Ser Val Pro Ser Pro Arg Val Glu Cys 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Melp4 <400> 25 Ala Thr Arg Asn His Ser His Arg Ser Ile Ser Ser Cys 1 5 10 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Melp5 <400> 26 Ser His Ile Arg Ser Ile Ser Ser Cys 1 5

Claims (7)

  1. 멜라민과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 멜라민 검출용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 22, 서열번호 24 및 서열번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것인 멜라민 검출용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 형광물질 및 금속이온을 더 포함하는 것인 멜라민 검출용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 형광물질은 산화 그래핀 양자점인 것인 멜라민 검출용 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 금속이온은 수은(Ⅱ)이온인 것인 멜라민 검출용 조성물.
  6. 제 1 항의 조성물을 포함하는 멜라민 검출용 키트.
  7. 제 3 항의 조성물에 미지의 시료를 접촉시키는 단계;
    시료에 접촉된 조성물의 형광 세기를 측정하는 단계; 및
    형광 세기가 증가할 경우, 상기 시료에 멜라민이 포함되어 있는 것으로 판단하는 단계
    를 포함하는 멜라민 검출 방법.
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