WO2013140681A1 - ターゲットの分析用デバイスおよび分析方法 - Google Patents

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WO2013140681A1
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nucleic acid
forming sequence
acid molecule
stem
catalytic
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克紀 堀井
金子　直人
穣 秋冨
信太郎 加藤
巌 和賀
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Ｎｅｃソフト株式会社
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    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a target nucleic acid sensor for analysis, an analysis device, and an analysis method.
  • ATP and AMP are known as essential components for energy metabolism in all living organisms. For this reason, the amount of ATP or AMP is considered to correlate with the amount of microorganisms and foods present therein. Therefore, by measuring ATP or AMP in the target area, the degree of microorganisms and food residues remaining in the area can be analyzed, and thus the degree of cleaning can be evaluated.
  • Non-patent Document 1 a nucleic acid element in which a DNA aptamer that specifically binds to AMP and a DNA that causes peroxidase activity (hereinafter, DNAzyme) are linked has been reported (Non-patent Document 1).
  • DNAzyme DNA that causes peroxidase activity
  • this nucleic acid element in the absence of AMP, the aptamer and DNAzyme self-associate to inhibit the catalytic ability of DNAzyme, and in the presence of AMP, the self-association is released by binding of AMP and the aptamer. The structure is controlled so that the catalytic ability of DNAzyme occurs.
  • AMP for example, a peroxidase reaction occurs due to the DNAzyme in which catalytic ability has been generated. Therefore, the amount of AMP can be indirectly measured by measuring the reaction. In addition, in the absence of AMP, the catalytic ability of DNAzyme is not generated, and thus the peroxidase reaction does not occur. However, for such a nucleic acid element, further improvement in sensitivity, ease of operation, etc. is required for practical use. Such a demand is not limited to AMP, but also applies to ATP and other targets.
  • an object of the present invention is to provide a new nucleic acid sensor for detecting a target.
  • the nucleic acid sensor for analysis of the present invention is a nucleic acid sensor for analysis of a target, and has the following (I) and (I) having a catalytic nucleic acid molecule (D) that causes a catalytic function and a bound nucleic acid molecule (A) that binds to the target. II), (II ′) or (III) nucleic acid element.
  • first strand (ss1) the binding nucleic acid molecule (A), the loop forming sequence (L1) and the catalytic nucleic acid molecule (D) are linked in this order
  • second strand (ss2) a stem forming sequence (S A ), a loop forming sequence (L2) and a stem forming sequence (S D ) are linked in this order
  • the terminal region on the loop forming sequence (L1) side of the binding nucleic acid molecule (A) in the first strand (ss1) and the stem forming sequence (S A ) in the second strand (ss2) are complementary.
  • the terminal region on the loop-forming sequence (L1) side of the catalytic nucleic acid molecule (D) in the first strand (ss1) and the stem-forming sequence (S D ) in the second strand (ss2) are complementary.
  • the loop forming sequence (L1) in the first strand (ss1) and the loop forming sequence (L2) in the second strand (ss2) are non-complementary,
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited by the respective stem formation in the stem forming sequence (S A ) and the stem forming sequence (S D )
  • each stem formation in the stem-forming sequence (S A ) and the stem-forming sequence (S D ) is released by the binding between the target and the binding nucleic acid molecule (A), and the catalytic nucleic acid A nucleic acid element (II) in which the catalytic function of the molecule (D) occurs, a single-strand
  • the terminal region on the loop forming sequence (L1) side of the binding nucleic acid molecule (A) and the stem forming sequence (S A ) are complementary,
  • the terminal region on the loop forming sequence (L2) side of the catalytic nucleic acid molecule (D) and the stem forming sequence (S D ) are complementary,
  • the loop forming sequence (L1) and the loop forming sequence (L2) are non-complementary,
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited by the respective stem formation in the stem forming sequence (S A ) and the stem forming sequence (S D )
  • each stem formation in the stem-forming sequence (S A ) and the stem-forming sequence (S D ) is released by the binding between the target and the binding nucleic acid molecule (A), and the catalytic nucleic acid A nucleic acid element (II ′) in which the catalytic function of the molecule (D) occurs,
  • the terminal region on the loop forming sequence (L2) side of the catalytic nucleic acid molecule (D) and the stem forming sequence (S D ) are complementary,
  • the terminal region on the loop forming sequence (L1) side of the binding nucleic acid molecule (A) and the stem forming sequence (S A ) are complementary,
  • the loop forming sequence (L1) and the loop forming sequence (L2) are non-complementary,
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited by the respective stem formation in the stem forming sequence (S A ) and the stem forming sequence (S D )
  • each stem formation in the stem-forming sequence (S A ) and the stem-forming sequence (S D ) is released by the binding between the target and the binding nucleic acid molecule (A), and the catalytic nucleic acid A nucleic acid element (III) in which the catalytic function of the molecule (D) occurs, a single-
  • the analysis device of the present invention is a target analysis device, and includes a base material, a nucleic acid sensor, and a detection unit.
  • the nucleic acid sensor and the detection unit are arranged on the base material, and the nucleic acid sensor is the book
  • the detection unit is a detection unit that detects a catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) in the nucleic acid sensor.
  • the analysis method of the present invention is a target analysis method, the step of bringing a sample containing a target into contact with the target nucleic acid sensor of the present invention, and the catalyst of the catalytic nucleic acid molecule (D) in the nucleic acid sensor
  • the method includes detecting a target in the sample by detecting a function.
  • the analysis method of the present invention is a target analysis method, the step of bringing a sample containing a target into contact with the analysis device of the present invention, and the catalyst in the nucleic acid sensor in the detection unit of the analysis device It includes a step of detecting a target in the sample by detecting the catalytic function of the nucleic acid molecule (D).
  • the nucleic acid sensor of the present invention ON / OFF of the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) can be switched depending on whether or not the binding nucleic acid molecule (A) and the target are bound, and the sensitivity can be increased. Excellent. For this reason, the presence or amount of the target can be easily detected by detecting the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule.
  • the analysis device of the present invention uses the nucleic acid sensor as described above, for example, the device can be reduced in size and chipped, and a simple analysis can be performed even for a large number of samples. .
  • analysis is a concept including, for example, quantitative analysis, semi-quantitative analysis, and qualitative analysis.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a nucleic acid element in the nucleic acid sensor of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing another example of the nucleic acid element in the nucleic acid sensor of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing another example of the nucleic acid element in the nucleic acid sensor of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing another example of the nucleic acid element in the nucleic acid sensor of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of absorbance measurement in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of absorbance measurement in Example 2.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of absorbance measurement in Example 3.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of absorbance measurement in Example 4.
  • the target nucleic acid sensor for analysis of a target comprises the above-described (I) and (II) having the catalytic nucleic acid molecule (D) that causes a catalytic function and the bound nucleic acid molecule (A) that binds to the target. (II ') or (III) nucleic acid element.
  • the binding nucleic acid molecule (A) is not particularly limited as long as it is a nucleic acid molecule that binds to a target.
  • the bound nucleic acid molecule (A) is also referred to as an aptamer, for example.
  • the target is not limited at all, and an arbitrary target can be selected. And according to the said arbitrary target, what is necessary is just to use the binding nucleic acid molecule couple
  • the target include ATP, AMP, microorganisms, viruses, food allergens, agricultural chemicals, and mold poisons.
  • the microorganism include Salmonella, Listeria, Escherichia coli, and mold, and examples of the virus include norovirus.
  • one of ATP and AMP may be the target, or both may be the target.
  • the binding nucleic acid molecule (A) is one of ATP and AMP. In the latter case, it may be bonded to both.
  • “binding to ATP or AMP” may be capable of binding to any of ATP or ATP, ATP derivative, and AMP derivative, in addition to ATP or AMP.
  • the binding nucleic acid molecule (A) is, for example, a single strand.
  • the length of the binding nucleic acid molecule (A) is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 18 base length, preferably 20 base length, more preferably 24 base length, and the upper limit is, for example, It is 120 bases long, preferably 60 bases long, more preferably 26 bases long.
  • binding nucleic acid molecule (A) examples include nucleic acid molecules targeting ATP or AMP (hereinafter referred to as ATP / AMP-binding nucleic acid molecule (A)).
  • examples of the ATP / AMP-binding nucleic acid molecule (A) include those containing the following polynucleotide (a1), (a2), (a3) or (a4).
  • the ATP / AMP-binding nucleic acid molecule (A) may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide or a molecule containing the polynucleotide.
  • the ATP / AMP-binding nucleic acid molecule (A) containing the polynucleotide (a1), (a2), (a3) or (a3) can also be referred to as a binding DNA molecule, for example.
  • A1 a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1 CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG
  • A2 a polynucleotide (a3) wherein the base sequence of (a1) comprises a base sequence in which one or more bases are substituted, deleted, added and / or inserted, and which binds to ATP or AMP
  • the polynucleotide (a2) may be bound to ATP or AMP.
  • the number of the substituted bases is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, still more preferably 1 or 2. Particularly preferred is one.
  • the number of added or inserted bases is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1 or 2.
  • the number of deleted bases is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and further preferably 2 or 1. Particularly preferred is one.
  • the identity is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, 96% or more with respect to the base sequence (a1). 97% or more, 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the identity can be calculated, for example, by calculating under default conditions using BLAST or the like.
  • hybridizes under stringent conditions is, for example, well-known experimental conditions for hybridization by those skilled in the art.
  • the “stringent conditions” are, for example, that hybridization is performed at 60 to 68 ° C. in the presence of 0.7 to 1 mol / L NaCl, and then 0.1 to 2 times the SSC solution is used.
  • Conditions under which the nucleotide sequence can be identified by washing at 65 to 68 ° C. 1 ⁇ SSC consists of 150 mmol / L NaCl, 15 mmol / L sodium citrate.
  • the ATP / AMP-binding nucleic acid molecule (A) is not limited to these examples, and may be any nucleic acid molecule that binds to ATP or AMP as described above.
  • the binding nucleic acid molecule (A) is, for example, a molecule containing a nucleotide residue, and may be a molecule consisting only of a nucleotide residue or a molecule containing a nucleotide residue.
  • the nucleotide is, for example, ribonucleotide, deoxyribonucleotide and derivatives thereof.
  • the binding nucleic acid molecule (A) may contain, for example, only one kind of ribonucleotide, deoxyribonucleotide and derivatives thereof, two kinds or more, or all of them.
  • the nucleic acid molecule may be, for example, DNA containing deoxyribonucleotide and / or a derivative thereof, RNA containing ribonucleotide and / or a derivative thereof, or a chimera (DNA / RNA containing the former and the latter )
  • the nucleotide may contain, for example, either a natural base (non-artificial base) or a non-natural base (artificial base) as a base.
  • a natural base include A, C, G, T, U, and modified bases thereof.
  • the modification include methylation, fluorination, amination, and thiolation.
  • the unnatural base include 2′-fluoropyrimidine, 2′-O-methylpyrimidine and the like. Specific examples include 2′-fluorouracil, 2′-aminouracil, 2′-O-methyluracil, Examples include 2-thiouracil.
  • the nucleotide may be, for example, a modified nucleotide, and the modified nucleotide is, for example, a 2′-methylated-uracil nucleotide residue, 2′-methylated-cytosine nucleotide residue, 2′-fluorinated-uracil nucleotide. Residue, 2′-fluorinated-cytosine nucleotide residue, 2′-aminated-uracil nucleotide residue, 2′-aminated-cytosine nucleotide residue, 2′-thiolated-uracil nucleotide residue, 2′- Thio-cytosine nucleotide residues and the like.
  • the binding nucleic acid molecule (A) may include non-nucleotides such as PNA (peptide nucleic acid) and LNA (Locked Nucleic Acid).
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) may be a nucleic acid molecule that causes a catalytic function.
  • the catalytic function is, for example, a catalytic function of a redox reaction.
  • the oxidation-reduction reaction may be a reaction that causes transfer of electrons between two substrates in the process of generating a product from the substrates, for example.
  • the kind of the redox reaction is not particularly limited.
  • the catalytic function of the oxidation-reduction reaction includes, for example, the same activity as an enzyme, and specifically includes, for example, the same activity as peroxidase (hereinafter referred to as “peroxidase-like activity”).
  • the peroxidase activity examples include horseradish peroxidase (HRP) activity.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) can be referred to as a DNA enzyme or DNAzyme in the case of DNA as described later, and can be referred to as an RNA enzyme or RNAzyme in the case of RNA as described later.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) is preferably a nucleic acid forming a G-quartet (or G-tetrad) structure, more preferably a nucleic acid forming a guanine quadruplex (or G-quadruplex) structure.
  • the G-tetrad is, for example, a surface structure in which guanine is a tetramer
  • the G-quadruplex is, for example, a structure in which a plurality of the G-tetrads are overlapped.
  • the G-tetrad and the G-quadruplex are formed, for example, in a nucleic acid that repeatedly has a G-rich structural motif.
  • the G-tetrad examples include a parallel type and an anti-parallel type, and a parallel type is preferable.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) for example, inhibits the formation of the G-tetrad by forming the stem in a state where the target is not bound to the binding nucleic acid element (A).
  • the stem formation is released to form the G-tetrad.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) is preferably a nucleic acid that can bind to porphyrin, and specifically, a nucleic acid that forms the G-tetrad and can bind to the porphyrin. It is known that the nucleic acid having G-tetrad generates a catalytic function of the oxidation-reduction reaction as described above, for example, by binding to the porphyrin to form a complex. In the nucleic acid element, the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited from binding to the porphyrin, for example, by forming the stem in a state where the target is not bound to the binding nucleic acid molecule (A).
  • the target binds to the binding nucleic acid molecule (A)
  • the stem formation is released and the target binds to the porphyrin.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) for example, inhibits the formation of the G-tetrad in a state where the target is not bound to the binding nucleic acid molecule (A), and thereby The binding to the porphyrin is inhibited, and it is preferable that ATP or AMP binds to the binding nucleic acid molecule (A) to form the G-tetrad and bind to the porphyrin.
  • the porphyrin is not particularly limited, and examples thereof include unsubstituted porphyrin and derivatives thereof.
  • examples of the derivatives include substituted porphyrins and metal porphyrins complexed with metal elements.
  • Examples of the substituted porphyrin include N-methylmesoporphyrin.
  • Examples of the metal porphyrin include hemin, which is a trivalent iron complex.
  • the porphyrin is, for example, preferably the metal porphyrin, more preferably hemin.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) is, for example, a single strand.
  • the length of the catalyst nucleic acid molecule (D) is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 11 bases, preferably 13 bases, more preferably 15 bases, and the upper limit is, for example, It is 60 bases long, preferably 36 bases long, more preferably 18 bases long.
  • Examples of the catalytic nucleic acid molecule (D) include DNAzymes disclosed in the following papers (1) to (4) as DNA having peroxidase activity.
  • Tao et al. Anal. Chem., 2009, vol.81, p.2144-2149
  • catalytic nucleic acid molecule (D) examples include those containing the following polynucleotide (d1), (d2), (d3) or (d4).
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide or a molecule containing the polynucleotide.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) containing the polynucleotide (d1), (d2), (d3) or (d4) can also be referred to as, for example, a catalytic DNA molecule or DNAzyme.
  • (D1) A polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 11 to 31 and 66 to 85 (d2)
  • the nucleotide sequence of (d1) one or more bases are substituted, deleted, added and / or Or consisting of an inserted base sequence, and a polynucleotide (d3) that causes a catalytic function of the oxidation-reduction reaction (d3) consisting of a base sequence having 50% or more identity with the base sequence
  • the number of the substituted bases is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, further preferably 1 or 2. Particularly preferred is one.
  • the number of added or inserted bases is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, further preferably 1 or 2 in the base sequence (d1).
  • the number of deleted bases is, for example, 1 to 5, preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, and further preferably 2 or 1. Particularly preferred is one.
  • the identity is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, 96% or more with respect to the base sequence (d1). 97% or more, 98% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the identity can be calculated, for example, by calculating under default conditions using BLAST or the like.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) is not limited to the examples (d1) to (d4) described above, and may be any nucleic acid molecule that causes the catalytic function as described above.
  • the catalyst nucleic acid molecule (D) is, for example, a molecule containing a nucleotide residue, and may be a molecule consisting only of a nucleotide residue or a molecule containing a nucleotide residue.
  • the nucleotide is the same as described above.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) may contain, for example, only one kind of ribonucleotide, deoxyribonucleotide and derivatives thereof, two kinds or more, or all of them.
  • the nucleic acid molecule may be, for example, DNA containing deoxyribonucleotide and / or a derivative thereof, RNA containing ribonucleotide and / or a derivative thereof, or a chimera (DNA / RNA containing the former and the latter )
  • the nucleotide can be exemplified by the example in the binding nucleic acid molecule (A).
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) may contain non-nucleotides such as PNA (peptide nucleic acid) and LNA (Locked Nucleic Acid).
  • examples of the nucleic acid element include (I), (II), (II ′) and (III) as described above. These three forms will be described below, but each form can incorporate the description unless otherwise indicated.
  • the nucleic acid element (I) is a double-stranded nucleic acid element composed of a first strand and a second strand.
  • the second chain is also called a block chain.
  • the first strand (ss1) the binding nucleic acid molecule (A), the loop-forming sequence (L1) and the catalytic nucleic acid molecule (D) are linked in this order
  • the second strand (ss2) is The stem forming sequence (S A ), the loop forming sequence (L2) and the stem forming sequence (S D ) are linked in this order.
  • the terminal region on the loop forming sequence (L1) side of the binding nucleic acid molecule (A) in the first strand (ss1) and the stem forming sequence (S A ) in the second strand (ss2) are complementary.
  • the terminal region on the loop forming sequence (L1) side of the catalytic nucleic acid molecule (D) in the first strand (ss1) and the stem forming sequence (S D ) in the second strand (ss2) are complementary.
  • the loop forming sequence (L1) in the first strand (ss1) and the loop forming sequence (L2) in the second strand (ss2) are non-complementary.
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited by the respective stem formation in the stem forming sequence (S A ) and the stem forming sequence (S D ).
  • the inhibition of the catalytic function occurs, for example, when the catalytic nucleic acid molecule is caged by this stem formation. That is, due to the formation of the stem, the catalytic nucleic acid molecule (D) cannot take the original structure that causes the catalytic function, thereby inhibiting the catalytic function.
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) occurs.
  • the occurrence of the catalytic function occurs, for example, when stem formation is released and cage formation of the catalytic nucleic acid molecule is released.
  • the catalytic function is generated by releasing the formation of the stem so that the catalytic nucleic acid molecule (D) has an original structure that generates the catalytic function. Note that the present invention is not limited to these mechanisms.
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited by the formation of the stem (switch OFF), and when the target is present, the stem The formation is released and the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) occurs (switch ON).
  • the nucleic acid element (I) for example, in the absence of a target, the terminal region on the loop forming sequence (L1) side of the binding nucleic acid molecule (A) in the first strand (ss1), The stem-forming sequence (S A ) in the second strand (ss2) forms a stem, and the terminal region on the loop-forming sequence (L1) side of the catalytic nucleic acid molecule (D) in the first strand (ss1)
  • the stem forming sequence (S D ) in the second strand (ss2) forms a stem, and the loop forming sequence (L1) and the loop forming sequence (L2) are between the two stems.
  • “complementary” means, for example, that two regions to be aligned may be completely complementary, or may be complementary to the extent that a stem can be formed (hereinafter the same).
  • “non-complementary” means, for example, that the two regions to be aligned may be completely non-complementary or non-complementary to the extent that an internal loop can be formed. (The same applies hereinafter).
  • FIG. 1 shows the state of the nucleic acid element (I) in the absence of the target.
  • 1A and 1B show a form in which the directions of the first chain (ss1) and the second chain (ss2) are opposite to each other.
  • an arrow indicates a direction from the 5 'side to the 3' side (hereinafter the same).
  • the upper strand is the first strand (ss1)
  • A is the binding nucleic acid molecule (A)
  • L1 is the loop-forming sequence (L1)
  • D is the catalytic nucleic acid molecule (D )
  • the lower strand is the second strand (ss2)
  • S A is the stem-forming sequence (S A )
  • L2 is the loop-forming sequence (L2)
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • S D is the stem
  • a stem is formed between the terminal region of the binding nucleic acid molecule (A) on the loop-forming sequence (L1) side and the stem-forming sequence (S A ), and the catalytic nucleic acid molecule (D)
  • a stem is formed between the terminal region on the loop-forming sequence (L1) side and the stem-forming sequence (S D ), and between the loop-forming sequence (L1) and the loop-forming sequence (L2).
  • An internal loop is formed.
  • the direction of each component is not particularly limited.
  • the first strand (ss1) includes, for example, the binding nucleic acid molecule (A), the loop-forming sequence (L1), and the catalytic nucleic acid molecule (D) from the 5 ′ side.
  • the second strand (ss2) is linked in this order, and the stem-forming sequence (S A ), the loop-forming sequence (L2) and the stem-forming sequence (S D ) are arranged in this order from the 3 ′ side. It is preferable to connect with.
  • the 3 ′ terminal region of the binding nucleic acid molecule (A) in the first strand (ss1) and the stem-forming sequence (S A ) in the second strand (ss2) are complementary
  • the 5 ′ terminal region of the catalytic nucleic acid molecule (D) in the first strand (ss1) and the stem-forming sequence (S D ) in the second strand (ss2) are preferably complementary. As shown in FIG.
  • the first strand (ss1) is, for example, from the 3 ′ side, the binding nucleic acid molecule (A), the loop-forming sequence (L1) and the catalytic nucleic acid molecule (D ) Are linked in this order, and the second strand (ss2), from the 5 ′ side, the stem-forming sequence (S A ), the loop-forming sequence (L2) and the stem-forming sequence (S D ) You may connect in this order.
  • the 5 ′ end region of the binding nucleic acid molecule (A) in the first strand (ss1) and the stem-forming sequence (S A ) in the second strand (ss2) are complementary
  • the 3 ′ terminal region of the catalytic nucleic acid molecule (D) in the first strand (ss1) and the stem-forming sequence (S D ) in the second strand (ss2) are complementary.
  • the nucleic acid element (I) is presumed to be able to detect excellent sensitivity by forming an internal loop in this way, but the present invention is not limited to this assumption.
  • the length of the inner loop is not particularly limited.
  • the loop forming sequence (L1) in the first strand (ss1) and the loop forming sequence (L2) in the second strand (ss2) are, for example, 0 to 30 bases in length, preferably 1 to The length is 30 bases, more preferably 1 to 15 bases, and still more preferably 1 to 6 bases.
  • the lengths of the loop forming sequence (L1) and the loop forming sequence (L2) may be the same or different, for example. In the latter case, the difference in length is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 bases, preferably 1 or 2 bases, more preferably 1 base.
  • the nucleic acid element (I) may have only one of the loop forming sequence (L1) and the loop forming sequence (L2).
  • the nucleic acid element (I) is presumed to be able to detect excellent sensitivity by forming an internal loop in this way, but the present invention is not limited to this assumption.
  • the length of each stem is not particularly limited.
  • the length of the stem can be adjusted by, for example, the length of the stem-forming sequence (S A ) and the stem-forming sequence (S D ) in the second strand (ss2).
  • the stem-forming sequence (S A ) has a length of, for example, 0 to 60 bases, preferably 0 to 10 bases, and more preferably 1 to 6 bases.
  • the length of the stem-forming sequence (S D ) is, for example, 0-30 bases long, 1-30 bases long, preferably 0-10 bases long, 1-10 bases long, and more The length is preferably 1 to 6 bases.
  • the lengths of the first strand (ss1) and the second strand (ss2) are not particularly limited.
  • the length of the first strand (ss1) is, for example, 40 to 200 bases long, preferably 42 to 100 bases long, and more preferably 45 to 60 bases long.
  • the length of the second strand (ss2) is, for example, 4 to 120 bases, preferably 5 to 25 bases, and more preferably 10 to 15 bases.
  • the first strand (ss1) is exemplified below.
  • the underlined portion on the 5 ′ side is the ATP / AMP aptamer of SEQ ID NO: 1 (A in FIG. 1)
  • poly dT is the loop forming sequence (L1 in FIG. 1)
  • the underlined portion on the 3 ′ side is It is DNAzyme of SEQ ID NO: 18 (neco0584) (D in FIG. 1).
  • AMP.neco.D0.A0 SEQ ID NO: 2 5'- CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG TTTTTTTTTTTT GGGTGGGAGGGTCGGG -3 '
  • the second chain (ss2) with respect to the first chain (ss1) is exemplified below.
  • the underlined portion on the 5 ′ side is the stem forming sequence ( SD in FIG. 1) complementary to the 5 ′ side region of the DNAzyme of the first strand (ss1), and poly dT is the loop formation
  • the underlined portion on the 3 ′ side is the stem-forming sequence (S A in FIG. 1) complementary to the 3 ′ side region of the ATP / AMP aptamer of the first strand (ss1). is there.
  • the nucleic acid element (II) is a single-stranded nucleic acid element, and the binding nucleic acid molecule (A), the loop forming sequence (L1), the stem forming sequence (S D ), the catalyst The nucleic acid molecule (D), the loop forming sequence (L2) and the stem forming sequence (S A ) are linked in this order.
  • the terminal region on the loop forming sequence (L1) side of the binding nucleic acid molecule (A) and the stem forming sequence (S A ) are complementary, and the loop forming sequence (L2) of the catalytic nucleic acid molecule (D)
  • the terminal region on the side and the stem forming sequence (S D ) are complementary, and the loop forming sequence (L1) and the loop forming sequence (L2) are non-complementary.
  • the nucleic acid element (II) is a catalyst for the catalytic nucleic acid molecule (D) by forming each stem in the stem-forming sequence (S A ) and the stem-forming sequence (S D ) in the absence of a target. Function is inhibited.
  • the inhibition of the catalytic function occurs, for example, when the catalytic nucleic acid molecule is caged by such self-association stem formation. That is, due to the formation of the stem, the catalytic nucleic acid molecule (D) cannot take a structure that causes a catalytic function, thereby inhibiting the catalytic function.
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) occurs.
  • the occurrence of the catalytic function occurs, for example, when the stem formation due to self-association is released and the catalytic nucleic acid molecule is released from the cage.
  • the catalytic function is generated by releasing the formation of the stem so that the catalytic nucleic acid molecule (D) has an original structure that generates the catalytic function. Note that the present invention is not limited to these mechanisms.
  • the nucleic acid element (II) when the target is absent, the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited (switch OFF) by the formation of the stem, and the target is When present, the stem formation is released, and the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is generated (switch ON).
  • the nucleic acid element (II) includes, for example, a terminal region on the loop-forming sequence (L1) side of the binding nucleic acid molecule (A) in the absence of a target, and the stem-forming sequence (S A ).
  • the state of the nucleic acid element (II) in the absence of the target is shown in the schematic diagram of FIG. 2A and 2B show a form in which the directions are opposite to each other.
  • A is the binding nucleic acid molecule (A)
  • L1 is the loop-forming sequence (L1)
  • SD is the stem-forming sequence (S D )
  • D is the catalytic nucleic acid molecule (D)
  • L2 represents the loop forming sequence (L2)
  • S A represents the stem forming sequence (S A ).
  • stems are formed at two locations by self-annealing of the nucleic acid element (II), and an internal loop is formed between the stems.
  • a stem is formed between the terminal region of the binding nucleic acid molecule (A) on the loop-forming sequence (L1) side and the stem-forming sequence (S A ), and the catalytic nucleic acid molecule (D)
  • a stem is formed between the terminal region on the loop-forming sequence (L1) side and the stem-forming sequence (S D ), and between the loop-forming sequence (L1) and the loop-forming sequence (L2).
  • An internal loop is formed.
  • the direction of each component is not particularly limited. As shown in FIG. 2 (B), the nucleic acid element (II) is, for example, from the 3 ′ side, the binding nucleic acid molecule (A), the loop-forming sequence (L1), the stem-forming sequence (S D ), The catalytic nucleic acid molecule (D), the loop forming sequence (L2) and the stem forming sequence (S A ) are preferably linked in this order.
  • the 5 ′ end region of the binding nucleic acid molecule (A) and the stem-forming sequence (S A ) are complementary, and the 5 ′ end region of the catalytic nucleic acid molecule (D) and the stem formation
  • the sequence (S D ) is preferably complementary.
  • the nucleic acid element (II) has, for example, the binding nucleic acid molecule (A), the loop-forming sequence (L1), and the stem-forming sequence ( SD ) from the 5 ′ side. ),
  • the catalytic nucleic acid molecule (D), the loop forming sequence (L2) and the stem forming sequence (S A ) may be linked in this order.
  • the 3 ′ end region of the binding nucleic acid molecule (A) and the stem-forming sequence (S A ) are complementary, and the 3 ′ end region of the catalytic nucleic acid molecule (D) and the stem formation
  • the sequence (S D ) is preferably complementary.
  • the length of the inner loop is not particularly limited.
  • the loop forming sequence (L1) and the loop forming sequence (L2) are each, for example, 0 to 30 bases long, preferably 1 to 30 bases long, more preferably 1 to 15 bases long More preferably 1 to 6 bases in length.
  • the lengths of the loop forming sequence (L1) and the loop forming sequence (L2) may be the same or different, for example. In the latter case, the difference in length is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 bases, preferably 1 or 2 bases, more preferably 1 base.
  • the nucleic acid element (II) may have only one of the loop forming sequence (L1) and the loop forming sequence (L2). The nucleic acid element (II) is presumed to be able to detect excellent sensitivity by forming an internal loop in this way, but the present invention is not limited to this assumption.
  • the length of each stem is not particularly limited.
  • the length of the stem can be adjusted by, for example, the length of the stem forming sequence (S A ) and the stem forming sequence (S D ).
  • the length of the stem forming sequence (S A ) is, for example, 0 to 60 bases long, 1 to 60 bases long, preferably 1 to 10 bases long, more preferably 1 to 7 bases long.
  • the length of the stem-forming sequence (S D ) is, for example, 0-30 bases long, 1-30 bases long, preferably 0-10 bases long, 1-10 bases long, more preferably 0 It is -7 bases long and 1-7 bases long.
  • the length of the nucleic acid element (II) is not particularly limited.
  • the length of the nucleic acid element (II) is, for example, 40 to 120 bases, preferably 45 to 100 bases, and more preferably 50 to 80 bases.
  • nucleic acid element (II) using the ATP / AMP aptamer that is the ATP / AMP-binding nucleic acid (A) as the binding nucleic acid molecule (A) will be shown. Not limited.
  • the lower case sequence is the stem formation sequence (S A )
  • the upper case poly dT is the loop formation sequence (L2)
  • the underlined portion on the 5 ′ side is The DNAzyme (D) of SEQ ID NO: 11 (EAD2)
  • the lower case sequence is the stem forming sequence (S D )
  • the upper case poly dT is the loop forming sequence (L1)
  • the underlined portion on the 3 ′ side is SEQ ID NO: 1.
  • the lower case sequence is the stem formation sequence (S A )
  • the upper case poly dT is the loop formation sequence (L2)
  • the 5 ′ side underline is the sequence DNAzyme (D) of No. 18 (neco0584)
  • the lower case sequence is the stem forming sequence (S D )
  • the upper case poly dT is the loop forming sequence (L1)
  • the underlined portion on the 3 ′ side is the SEQ ID No. 1.
  • the nucleic acid element (II ′) is different from the nucleic acid element (II) in the binding nucleic acid molecule (A), the catalytic nucleic acid molecule (D), the stem-forming sequence (S A ), and the stem formation.
  • the sequence (S D ), the loop-forming sequence (L1), and the loop-forming sequence (L2) are single-stranded nucleic acid elements in a positional relationship in which they are interchanged.
  • the nucleic acid element (II ′) can be referred to the description of the nucleic acid element (II) unless otherwise specified.
  • the nucleic acid element (II ′) includes the catalytic nucleic acid molecule (D), the loop forming sequence (L2), the stem forming sequence (S A ), the binding nucleic acid molecule (A), and the loop forming sequence (L1). ) And stem-forming sequence (S D ) are linked in this order.
  • the terminal region on the loop forming sequence (L2) side of the catalytic nucleic acid molecule (D) and the stem forming sequence (S D ) are complementary, and the loop forming sequence (L1) of the binding nucleic acid molecule (A)
  • the terminal region on the side and the stem-forming sequence (S A ) are complementary.
  • the nucleic acid element (II ′) can form the catalyst nucleic acid molecule (D) by forming each stem in the stem-forming sequence (S A ) and the stem-forming sequence (S D ) in the absence of a target.
  • the catalytic function is impaired.
  • the inhibition of the catalytic function occurs, for example, when the catalytic nucleic acid molecule is caged by such self-association stem formation. That is, due to the formation of the stem, the catalytic nucleic acid molecule (D) cannot take the original structure that causes the catalytic function, thereby inhibiting the catalytic function.
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) occurs.
  • the occurrence of the catalytic function occurs, for example, when the stem formation due to self-association is released and the catalytic nucleic acid molecule is released from the cage.
  • the catalytic function is generated by releasing the formation of the stem so that the catalytic nucleic acid molecule (D) has an original structure that generates the catalytic function. Note that the present invention is not limited to these mechanisms.
  • the nucleic acid element (II ′) like the nucleic acid element (II), in the absence of a target, the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited by the formation of the stem (switch OFF), and the target Is present, the stem formation is released, and the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) occurs (switch ON).
  • the nucleic acid element (II ′) includes, for example, a terminal region on the loop-forming sequence (L1) side of the binding nucleic acid molecule (A) in the absence of a target, and the stem-forming sequence (S A ).
  • FIG. 3 shows the state of the nucleic acid element (II ′) in the absence of the target.
  • 3A and 3B show a form in which the directions are opposite to each other.
  • A is the binding nucleic acid molecule (A)
  • L1 is the loop forming sequence (L1)
  • D is the catalytic nucleic acid molecule
  • L2 is the loop forming sequence (L2)
  • S A Indicates the stem-forming sequence (S A )
  • SD indicates the stem-forming sequence (S D ).
  • stems are formed at two locations by self-annealing of the nucleic acid element (II ′), and an internal loop is formed between the stems.
  • a stem is formed between the terminal region of the binding nucleic acid molecule (A) on the loop-forming sequence (L1) side and the stem-forming sequence (S A ), and the catalytic nucleic acid molecule (D)
  • a stem is formed between the terminal region on the loop-forming sequence (L2) side and the stem-forming sequence (S D ), and between the loop-forming sequence (L1) and the loop-forming sequence (L2).
  • An internal loop is formed.
  • the direction of each component is not particularly limited. As shown in FIG. 3 (B), the nucleic acid element (II ′) is, for example, from the 3 ′ side, the catalytic nucleic acid molecule (D), the loop-forming sequence (L2), and the stem-forming sequence (S A ).
  • the binding nucleic acid molecule (A), the loop forming sequence (L1), and the stem forming sequence (S D ) are preferably linked in this order.
  • the 5 ′ end region of the binding nucleic acid molecule (A) and the stem-forming sequence (S A ) are complementary, and the 5 ′ end region of the catalytic nucleic acid molecule (D) and the stem formation
  • the sequence (S D ) is preferably complementary.
  • the nucleic acid element (II ′) has, for example, the catalytic nucleic acid molecule (D), the loop forming sequence (L2), and the stem forming sequence (S A ), the binding nucleic acid molecule (A), the loop forming sequence (L1), and the stem forming sequence (S D ) may be linked in this order.
  • the 3 ′ end region of the binding nucleic acid molecule (A) and the stem-forming sequence (S A ) are complementary, and the 3 ′ end region of the catalytic nucleic acid molecule (D) and the stem formation
  • the sequence (S D ) is preferably complementary.
  • the nucleic acid element (III) is a single-stranded nucleic acid element, and the catalytic nucleic acid molecule (D), the intervening sequence (I), and the binding nucleic acid molecule (A) Linked in order, the intervening sequence (I) is non-complementary to the catalytic nucleic acid molecule (D) and the binding nucleic acid molecule (A).
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited.
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is caused in the presence of the target.
  • the nucleic acid element (III) like the nucleic acid elements (I), (II) and (II ′), inhibits the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) when the target is absent (switch OFF) ) When the target is present, the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is generated (switch ON).
  • FIG. 4 shows the state of the nucleic acid element (III) in the absence of the target.
  • A indicates the binding nucleic acid molecule (A)
  • I indicates the intervening sequence (I)
  • D indicates the catalytic nucleic acid molecule (D).
  • 4A and 4B show a form in which the directions are opposite to each other.
  • the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is inhibited in the absence of the target, and the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) is generated in the presence of the target.
  • the following reason is presumed. The present invention is not limited to these assumptions.
  • a part of the catalytic nucleic acid molecule (D) and a part of the binding nucleic acid molecule (A) interact, and the catalytic nucleic acid molecule (D) It is presumed that a non-G quartet structure is formed.
  • the main form of the nucleic acid element (III) is inclined to the original structure of the bound nucleic acid element (A), that is, the three-dimensional structure that binds to the target, resulting in an overall structural change. It is considered that the catalytic nucleic acid molecule (D) forms a G quartet structure, and its catalytic function occurs.
  • the direction of each component is not particularly limited.
  • the nucleic acid element (III) includes, for example, the catalytic nucleic acid molecule (D), the intervening sequence (I) and the binding nucleic acid molecule (A) from the 5 ′ side. It is preferable to connect in order.
  • the nucleic acid element (III) includes, for example, the catalytic nucleic acid molecule (D), the intervening sequence (I), and the binding nucleic acid molecule (A) from the 3 ′ side. These may be connected in this order.
  • the length of the intervening sequence (I) is not particularly limited.
  • the length of the intervening sequence (I) is, for example, 0 to 30 bases long, 1 to 30 bases long, preferably 0 to 25 bases long, 1 to 25 bases long, more preferably The length is 0-20 bases, 1-20 bases, more preferably 0-10 bases, 1-10 bases, and particularly preferably 0-8 bases, 1-8 bases.
  • the length of the nucleic acid element (III) is not particularly limited.
  • the length of the nucleic acid element (III) is, for example, 30 to 120 bases, preferably 35 to 80 bases, more preferably 40 to 60 bases.
  • nucleic acid element (III) using the ATP / AMP aptamer that is the ATP / AMP-binding nucleic acid (A) as the binding nucleic acid molecule (A) will be shown. Not limited.
  • AMP.neco.D0.A0 the underlined portion on the 5 ′ side is the DNAzyme of SEQ ID NO: 18 (neco0584) (D in FIG. 4), and the underlined portion on the 3 ′ side is the ATP / AMP of SEQ ID NO: 1. It is an aptamer (A in FIG. 4), and poly dT between them is an intervening sequence (I in FIG. 4).
  • AMP.neco.D0.A0 SEQ ID NO: 65
  • each region may be, for example, a direct connection or an indirect connection.
  • each region is connected by a phosphodiester bond.
  • region connects through an intervening linker, for example.
  • the intervening linker include nucleic acid molecules composed of nucleotides and / or non-nucleotides as described above.
  • the intervening linker is preferably, for example, a single chain.
  • the nucleic acid sensor of the present invention may be, for example, a sensor composed only of the nucleic acid element or a sensor including other components.
  • the nucleic acid sensor of the present invention can also be referred to as a device for detecting SA, for example.
  • the other component include a base material on which the nucleic acid element is disposed.
  • the base material include substrates such as substrates, beads, and tubes.
  • Other examples of the other component include a linker.
  • the linker can be used, for example, for linking the nucleic acid element and the base material when the nucleic acid element is immobilized on the base material.
  • the analytical device of the present invention described later can be referred to.
  • connection site with the linker is not particularly limited, and for example, any end of the nucleic acid element is preferable.
  • the double-stranded nucleic acid element (I) includes, for example, either end of the first strand (ss1) having the binding nucleic acid molecule (A) and the catalytic nucleic acid molecule (D), and / or the first strand. Either end of the two strands (ss2) is preferred.
  • the single-stranded nucleic acid elements (II), (II ′) and (III) are preferably at either end, for example.
  • the linker is also referred to as a terminal linker. Examples of the linker include nucleic acid molecules composed of nucleotides and / or non-nucleotides as described above.
  • the terminal linker is preferably a single chain, for example.
  • the nucleic acid element may be used in a free state, or may be used in a state where the nucleic acid element is immobilized. In the latter case, for example, it can be immobilized on the substrate and used as a device.
  • the method for using the nucleic acid sensor of the present invention is not particularly limited, and can be used for the target analysis method of the present invention as follows.
  • the analysis method of the present invention is a target analysis method.
  • the sample is not particularly limited.
  • the sample may be, for example, a sample including a target or a sample in which it is unknown whether the target is included.
  • the sample is preferably a liquid sample, for example.
  • the nucleic acid element When the nucleic acid element is used in a free state as the nucleic acid sensor of the present invention, it is preferable to bring the nucleic acid element and the sample into contact, for example, in a container such as a tube.
  • a container such as a tube.
  • the nucleic acid element of the present invention When the nucleic acid element of the present invention is used in a state where the nucleic acid element is disposed on the base material, for example, the sample can be brought into contact with the nucleic acid element on the base material.
  • the detection step for example, it is preferable to detect a signal generated by the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D).
  • the signal include an optical signal and an electrochemical signal.
  • the optical signal include a color development signal, a luminescence signal, and a fluorescence signal.
  • the signal is preferably generated from a substrate by the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D), for example. Therefore, the detection step is preferably performed, for example, in the presence of a substrate corresponding to the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D).
  • the substrate is, for example, a substrate that generates a colored, luminescent, or fluorescent product by the catalytic function, a colored, luminescent, or fluorescent substrate, and a generation in which the colored, luminescent, or fluorescent light is lost by the catalytic function.
  • the substrate that generates a product and a substrate that generates a product of different color, luminescence, or fluorescence depending on the catalytic function.
  • the catalytic function can be detected by visually confirming, for example, the presence or absence of color development, luminescence or fluorescence, or the change or intensity of color development, luminescence or fluorescence as a signal.
  • the catalytic function can be detected by measuring the absorbance, reflectance, fluorescence intensity, and the like as signals using an optical technique.
  • the catalytic function include the catalytic function of the oxidation-reduction reaction as described above.
  • the catalytic nucleic acid molecule (D) has a catalytic function for the oxidation-reduction reaction
  • a substrate capable of transferring electrons can be mentioned.
  • a product is generated from the substrate by the catalytic nucleic acid molecule (D), and electrons are transferred in the process.
  • This electron transfer can be detected electrochemically as an electrical signal by application to an electrode, for example.
  • the electric signal can be detected by measuring the intensity of the electric signal such as an electric current.
  • the substrate is not particularly limited, and for example, hydrogen peroxide, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), 1,2-phenylenediamine (OPD), 2,2′-Azinobis (3-ethylbenzothiazole- 6-sulfonic Acid Ammonium Salt (ABTS), 3,3′-Diaminobenzodinine (DAB), 3,3′-Diaminobenzoidine Tetrahhydrochloridate Hydrate (DAB4HCl), 3-Amino-9-EC-9-EC (4C1N), 2,4,6-Tribromo-3-hydroxybenzoic Acid, 2,4-Dichlorophenol, 4-Aminoantipyrine, 4-Aminoantipyrine Hydrochloride, luminol and the like.
  • the substrate may be supplied to the nucleic acid sensor in advance, for example, before contacting the sample with the nucleic acid sensor, or at the same time as contacting the sample or after contacting the sample.
  • the nucleic acid sensor may be supplied.
  • the substrate is preferably supplied to the nucleic acid sensor, for example, as a substrate solution mixed with a liquid.
  • the liquid mixed with the substrate is preferably a buffer such as Tris-HCl.
  • the concentration of the substrate in the substrate solution is not particularly limited, and is, for example, 0.1 to 5 mmol / L, preferably 0.5 to 2 mmol / L.
  • the pH of the substrate solution is, for example, 6-9, preferably 6.8-9.
  • the reaction conditions with the catalytic nucleic acid molecule (D) are not particularly limited.
  • the temperature is, for example, 15 to 37 ° C.
  • the time is, for example, 10 to 900 seconds.
  • porphyrin may coexist in addition to the substrate.
  • Some known DNAzymes exhibit higher redox activity by forming a complex with porphyrin, for example. Therefore, in the present invention, for example, redox activity may be detected as a complex of the catalytic nucleic acid molecule (D) and porphyrin in the presence of porphyrin.
  • the supply of porferin is not particularly limited and can be performed in the same manner as the substrate.
  • the porphyrin is not particularly limited, and examples thereof include unsubstituted porphyrin and derivatives thereof.
  • examples of the derivatives include substituted porphyrins and metal porphyrins complexed with metal elements.
  • Examples of the substituted porphyrin include N-methylmesoporphyrin.
  • Examples of the metal porphyrin include hemin, which is a trivalent iron complex.
  • the porphyrin is, for example, preferably the metal porphyrin, more preferably hemin.
  • the target can be detected as described above.
  • the target is ATP or AMP and the ATP / AMP-binding nucleic acid molecule (A) is used as the binding nucleic acid molecule (A), for example, as described above.
  • the microorganisms remaining on the object can indirectly detect dirt such as food residues.
  • the analysis device of the present invention is a target analysis device, and includes a base material, a nucleic acid sensor, and a detection unit.
  • the nucleic acid sensor and the detection unit are arranged on the base material, and the nucleic acid sensor is the book
  • the detection unit is a detection unit that detects a catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) in the nucleic acid sensor.
  • the analysis device of the present invention is characterized by using the nucleic acid sensor of the present invention, and the other configurations are not limited at all. Unless specifically described, the analysis device of the present invention can use, for example, the description of the nucleic acid sensor of the present invention.
  • the arrangement method of the nucleic acid sensor is not particularly limited.
  • the nucleic acid element in the nucleic acid sensor may or may not be immobilized on the base material. Also good.
  • the nucleic acid element may be directly fixed or indirectly fixed to the base material, for example.
  • the immobilization include linking by chemical bonding.
  • Examples of the indirect immobilization include a form in which the nucleic acid element is immobilized on the base material via a linker.
  • the linker include the terminal linkers described above.
  • a known nucleic acid immobilization method can be adopted.
  • the method include a method using photolithography, and specific examples thereof can be referred to US Pat. No. 5,424,186.
  • the immobilization method include a method of synthesizing the nucleic acid element on the base material. As this method, for example, a so-called spot method can be mentioned.
  • US Pat. No. 5,807,522, Japanese Patent Publication No. 10-503841 and the like can be referred to.
  • the arrangement site of the nucleic acid element in the substrate is not particularly limited, and examples thereof include a form arranged in the detection unit.
  • the analysis device of the present invention may further have a reagent part, for example.
  • the reagent unit may be disposed in the detection unit.
  • a reagent may be arranged in advance in the reagent unit, or the reagent may be supplied at the time of use.
  • the reagent include the aforementioned substrate and the porphyrin.
  • the detection unit is a detection unit that detects the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D).
  • the detection unit is preferably a detection unit that detects a signal generated by the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) as the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D).
  • Examples of the signal include a signal from a substrate due to the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D), as described above.
  • Examples of the signal include an optical signal and an electrochemical signal as described above.
  • the detection unit is, for example, an optical signal detection unit, and examples include a detection unit such as absorbance, reflectance, and fluorescence intensity.
  • the detection unit has, for example, an electrode system.
  • the said detection part can be formed by arrange
  • the arrangement method of the electrodes is not particularly limited, and for example, a known method can be adopted. Specific examples include thin film forming methods such as vapor deposition, sputtering, screen printing, and plating.
  • the electrode may be disposed directly or indirectly on the substrate.
  • An indirect arrangement includes, for example, an arrangement through another member.
  • the electrode system may include, for example, a working electrode and a counter electrode, or may include a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the material of the electrode is not particularly limited, and examples thereof include platinum, silver, gold, and carbon.
  • Examples of the working electrode and the counter electrode include a platinum electrode, a silver electrode, a gold electrode, and a carbon electrode, and examples of the reference electrode include a silver / silver chloride electrode.
  • the silver / silver chloride electrode can be formed, for example, by laminating a silver chloride electrode on a silver electrode.
  • the nucleic acid element is preferably disposed, for example, in the electrode system, and is preferably disposed in the working electrode among the electrodes.
  • the analytical device of the present invention includes the electrode system and the reagent part, for example, the reagent part is preferably disposed on the electrode system.
  • the analysis device of the present invention may include a plurality of detection units, for example.
  • the analytical device fractionates the surface of the base material into a matrix, and includes a detection unit as described above in each fractionation region.
  • the number of nucleic acid sensors arranged in one detection unit is not particularly limited.
  • the substrate is not particularly limited.
  • the substrate is preferably a substrate having an insulating surface, for example.
  • the substrate may be, for example, a substrate made of an insulating material, or a substrate having an insulating layer made of an insulating material on the surface.
  • the insulating material is not particularly limited, and examples thereof include known materials such as glass, ceramic, insulating plastic, and paper.
  • the insulating plastic is not particularly limited, and examples thereof include silicone resin, polyimide resin, epoxy resin, and fluorine resin.
  • the analysis method of the present invention is a target analysis method.
  • the contact step of bringing a sample into contact with the analysis device of the present invention, and in the detection unit of the analysis device, the catalytic nucleic acid molecule It includes a detection step of detecting a target in the sample by detecting the catalytic function of (D).
  • the analysis method of the present invention is characterized in that the analysis device including the nucleic acid sensor of the present invention is used, and other conditions are not limited at all.
  • the analysis method of the present invention for example, the description of the analysis method in the nucleic acid sensor of the present invention can be cited.
  • the analytical reagent of the present invention includes the analytical nucleic acid sensor of the present invention.
  • the analytical reagent of the present invention is characterized by including the nucleic acid sensor, and other configurations are not limited at all.
  • the analytical reagent of the present invention may contain, for example, components such as the substrate, the porferrin, the buffer solution, and / or the substrate in addition to the nucleic acid sensor.
  • the analytical reagent of the present invention may be, for example, an analytical kit.
  • the nucleic acid sensor and the other components described above may be included and separately accommodated.
  • the analysis kit may further include instructions for use, for example.
  • Example 1 The single-stranded nucleic acid element (II) provided with AMP aptamer as the binding nucleic acid molecule (A) and EAD2 as the catalytic nucleic acid molecule (D) was prepared, and the performance as a nucleic acid sensor was confirmed.
  • the lower case sequence is the stem formation sequence (S A )
  • the upper case poly dT is the loop formation sequence (L2)
  • the 5 ′ side The underlined portion is EAD2 (D) of SEQ ID NO: 11
  • the lower case sequence is the stem forming sequence (S D )
  • the upper case poly dT is the loop forming sequence (L1)
  • the 3 ′ side The underlined part is the AMP aptamer (A) of SEQ ID NO: 1.
  • a reaction solution having the following composition was prepared and reacted at 25 ° C. for 60 seconds, and then the absorbance of the reaction solution was measured (wavelength 415 nm). The measurement used the light absorbency measuring apparatus (Brand name TECAN infinite, TECAN company).
  • the composition of the DNAzyme buffer was 50 mmol / L Tris-HCl (pH 7.4), 20 mmol / L KCl, 0.05% Triton X-100.
  • ABTS 2,2′-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt) was used as the substrate.
  • FIG. 5 is a graph showing the absorbance of the reaction solution.
  • the absorbance of the reaction solution containing 1 mmol / L of AMP showed a significant difference from the absorbance of the reaction solution without addition of AMP. From this result, according to the nucleic acid sensor of the example, it can be said that the presence and concentration of AMP can be measured by measuring absorbance, and specifically, it can be detected even with 1 mmol / L AMP.
  • Example 2 The nucleic acid element AMP. D4. A5 (SEQ ID NO: 47) was used as a nucleic acid sensor, and measurement was performed while changing the AMP concentration.
  • the AMP concentration in the reaction solution was a predetermined concentration (0 ⁇ mol / L, 50 ⁇ mol / L, 500 ⁇ mol / L, 1 mmol / L, 2.5 mmol / L, 5 mmol / L) and the reaction time was 170 seconds.
  • the reaction was carried out in the same manner as in Example 1, and the absorbance was measured.
  • Negative control (NC) and positive control (PC) were the same as in Example 1 except for the AMP concentration.
  • FIG. 6 is a graph showing the absorbance of the reaction solution. NC, AMP. D4.
  • A5 and PC each of the five bars shows, from the left, the results of AMP concentrations of 0 ⁇ mol / L, 50 ⁇ mol / L, 500 ⁇ mol / L, 1 mmol / L, 2.5 mmol / L, and 5 mmol / L.
  • NC negative control
  • EAD2 which is DNAzyme
  • no increase in absorbance depending on the concentration of AMP was confirmed.
  • the nucleic acid sensor of the example was used, an increase in absorbance was confirmed depending on the AMP concentration. From this result, it can be said that according to the nucleic acid sensor of the example, the concentration of AMP can be measured by absorbance measurement.
  • Example 3 The single-stranded nucleic acid element (II) comprising AMP aptamer as the binding nucleic acid molecule (A) and neco0584 as the catalytic nucleic acid molecule (D) was prepared, and the performance as a nucleic acid sensor was confirmed.
  • the lower case sequence is the stem formation sequence (S A )
  • the upper case poly dT is the loop formation sequence (L2)
  • the 5 ′ side The underlined portion is neco0584 (D) of SEQ ID NO: 18, the lowercase sequence is the stem forming sequence (S D ), the uppercase poly dT is the loop forming sequence (L1), and the 3 ′ side
  • the underlined portion is ATP or AMP aptamer (A) of SEQ ID NO: 1.
  • the reaction was carried out in the same manner as in the above Example, and the absorbance was measured.
  • the reaction was similarly performed for the reaction solution (NC) excluding the nucleic acid sensor.
  • a reaction was similarly performed with respect to a reaction solution (PC) using neco0548 of SEQ ID NO: 18 instead of the nucleic acid sensor.
  • neco0584 SEQ ID NO: 18
  • FIG. 7 is a graph showing the absorbance of the reaction solution.
  • the absorbance of the reaction solution containing 1 mmol / L of AMP showed a significant difference from the absorbance of the reaction solution to which AMP was not added. From this result, according to the nucleic acid sensor of the example, it can be said that the presence and concentration of AMP can be measured by measuring absorbance, and specifically, it can be detected even with 1 mmol / L AMP.
  • Example 4 The double-stranded nucleic acid element (I) comprising ATP or AMP aptamer as the binding nucleic acid molecule (A) and DNAzyme as the catalytic nucleic acid molecule (D) was prepared, and the performance as a nucleic acid sensor was confirmed.
  • ss1 DNA having the following sequence was synthesized (see FIG. 1).
  • the underlined portion on the 5 ′ side is the AMP aptamer (A) of SEQ ID NO: 1
  • poly dT is the loop-forming sequence (L1)
  • the underlined portion on the 3 ′ side is the DNAzyme of SEQ ID NO: 18 (neco0584).
  • D AMP.neco.D0.A0 (SEQ ID NO: 2) 5'- CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG TTTTTTTTTT GGGTGGGAGGGTCGGG -3 '
  • DNA having the following sequence was synthesized as the second strand (ss2) with respect to the first strand (ss1) (see FIG. 1).
  • the underlined portion on the 5 ′ side is the stem forming sequence ( SD in FIG. 1) complementary to the 5 ′ side region of the DNAzyme of the first strand (ss1)
  • poly dT is the loop formation
  • the stem formation sequence (S A in FIG. 1) is the sequence (L2 in FIG. 1)
  • the underlined portion on the 3 ′ side is complementary to the 3 ′ side region of the AMP aptamer of the first strand (ss1).
  • AMP.neco.D7.A8 (SEQ ID NO: 35) 5'- CTCCTTCC TTTTTTTT CCCACCC -3 '
  • a reaction solution having the following composition was prepared and reacted at 25 ° C. for 60 seconds, and then the absorbance of the reaction solution was measured (wavelength 415 nm). The measurement used the light absorbency measuring apparatus (Brand name TECAN infinite, TECAN company).
  • the composition of the DNAzyme buffer was 50 mmol / L Tris-HCl (pH 7.4), 20 mmol / L KCl, 150 mmol / L NaCl, 0.05% Triton X-100.
  • ABTS was used as the substrate.
  • FIG. 8 is a graph showing the absorbance of the reaction solution.
  • the absorbance of the reaction solution containing 1 mmol / L of AMP showed a significant difference from the absorbance of the reaction solution to which AMP was not added. From this result, it can be said that according to the nucleic acid sensor of the example, the presence and concentration of AMP can be measured by measuring absorbance, and specifically, it can be detected even with 1 ⁇ mol / L AMP.
  • ON / OFF of the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule (D) can be switched depending on whether or not the binding nucleic acid molecule (A) and the target are bound, and the sensitivity is excellent. For this reason, the presence or amount of the target can be easily detected by detecting the catalytic function of the catalytic nucleic acid molecule.
  • the analysis device of the present invention uses the nucleic acid sensor as described above, for example, the device can be reduced in size and chipped, and a simple analysis can be performed even for a large number of samples. . For this reason, the present invention can be said to be an extremely useful technique for research and examination in various fields such as clinical medicine, food, and environment.

Abstract

　ターゲットを検出するための新たなセンサを提供する。本発明の核酸センサは、触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）と、ターゲットに結合する結合核酸分子（Ａ）とを有する核酸素子を含む。前記核酸素子は、第１鎖と第２鎖とから構成される二本鎖核酸素子であり、前記第１鎖（ｓｓ１）は、結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）がこの順序で連結し、前記第２鎖（ｓｓ２）は、ステム形成配列（ＳＡ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＤ）がこの順序で連結している。前記核酸素子は、ターゲット非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）と（ＳＤ）におけるそれぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、ＡＴＰ／ターゲット存在下、前記結合核酸分子（Ａ）とターゲットとの結合によりステム形成が解除され、前記触媒機能が生起される。

Description

ターゲットの分析用デバイスおよび分析方法
　本発明は、ターゲットの分析用核酸センサ、分析用デバイスおよび分析方法に関する。
　近年、大腸菌、サルモネラ菌等の微生物感染による食中毒の増加が問題となっている。この問題の大きな原因は、洗浄不良である。このため、食品加工場等では、洗浄度検査を行うことが必須となっている。
　このような検査では、近年、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）またはＡＭＰ（アデノシン一リン酸）の測定により、洗浄度を分析する方法が実用化されている。ＡＴＰおよびＡＭＰは、あらゆる生物においてエネルギー代謝に必須の成分として知られている。このため、ＡＴＰまたはＡＭＰの量は、そこに存在する微生物および食品由来の量に相関すると考えられる。そこで、目的領域におけるＡＴＰまたはＡＭＰを測定することで、前記領域に残存する微生物や食品残渣の程度を分析できるため、これによって、洗浄度を評価することができる。
　ＡＭＰを検出するためのツールとして、例えば、ＡＭＰに特異的に結合するＤＮＡアプタマーとペルオキシダーゼ活性を生起するＤＮＡ（以下、ＤＮＡｚｙｍｅ）とを連結した核酸素子が報告されている（非特許文献１）。この核酸素子は、ＡＭＰ非存在下では、アプタマーとＤＮＡｚｙｍｅとが自己会合して、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能を阻害し、ＡＭＰ存在下、ＡＭＰと前記アプタマーとが結合することによって、前記自己会合が解除され、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能が生起されるよう、その構造が制御されている。このため、ＡＭＰが存在すれば、触媒能が生起されたＤＮＡｚｙｍｅにより、例えば、ペルオキシダーゼ反応が生じるため、前記反応を測定することによって、間接的にＡＭＰ量を測定することができる。また、ＡＭＰが存在しない場合には、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒能は生起されないため、前記ペルオキシダーゼ反応は起こらない。しかしながら、このような核酸素子については、実用化のために、感度や操作の容易性等について、さらなる向上が求められている。このような要望は、ＡＭＰに限らず、ＡＴＰや、その他のターゲットに関しても同様である。
Carsten　Tellerら、Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．　２００９，　８１，　９１１４－９１１９
　そこで、本発明は、ターゲットを検出するための新たな核酸センサを提供することを目的とする。
　本発明の分析用核酸センサは、ターゲットの分析用核酸センサであり、触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）と、ターゲットに結合する結合核酸分子（Ａ）とを有する下記（Ｉ）、（II）、（II’）または（III）の核酸素子を含むことを特徴とする。
（Ｉ）第１鎖と第２鎖とから構成される二本鎖の核酸素子であり、
前記第１鎖（ｓｓ１）は、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結しており、
前記第２鎖（ｓｓ２）は、ステム形成配列（ＳＡ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結しており、
前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、
前記第１鎖（ｓｓ１）における前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的であり、
ターゲットの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
ターゲットの存在下、前記ターゲットと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
（II）一本鎖の核酸素子であり、
前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）、ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結しており、
前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、
前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的であり、
ターゲットの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
ターゲットの存在下、前記ターゲットと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
（II’）一本鎖の核酸素子であり、
前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）、ステム形成配列（ＳＡ）、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結しており、
前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、
前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的であり、
ターゲットの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
ターゲットの存在下、前記ターゲットと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
（III）一本鎖の核酸素子であり、
前記触媒核酸分子（Ｄ）、介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結しており、
前記介在配列（Ｉ）は、前記触媒核酸分子（Ｄ）および前記結合核酸分子（Ａ）と非相補的であり、
ターゲットの非存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
ターゲットの存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
　本発明の分析用デバイスは、ターゲットの分析用デバイスであり、基材、核酸センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、前記核酸センサが、前記本発明の核酸センサであり、前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
　本発明の分析方法は、ターゲットの分析方法であり、前記本発明のターゲットの分析用核酸センサに、ターゲットを含む試料を接触させる工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の分析方法は、ターゲットの分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスに、ターゲットを含む試料を接触させる工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の核酸センサによれば、前記結合核酸分子（Ａ）とターゲットとが結合したか否かによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能のＯＮ－ＯＦＦをスイッチでき、且つ、その感度に優れる。このため、前記触媒核酸分子の触媒機能を検出することで、ターゲットの有無または量を、容易に検出可能である。また、本発明の分析用デバイスは、前述のように、前記核酸センサを使用することから、例えば、デバイスの小型化およびチップ化等も可能であり、多数の検体でも簡便な分析が可能となる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。本発明において、「分析」は、例えば、定量分析、半定量分析、定性分析を含む概念である。
図１は、本発明の核酸センサにおける核酸素子の一例を示す模式図である。 図２は、本発明の核酸センサにおける核酸素子の他の例を示す模式図である。 図３は、本発明の核酸センサにおける核酸素子の他の例を示す模式図である。 図４は、本発明の核酸センサにおける核酸素子の他の例を示す模式図である。 図５は、実施例１における吸光度測定の結果を示すグラフである。 図６は、実施例２における吸光度測定の結果を示すグラフである。 図７は、実施例３における吸光度測定の結果を示すグラフである。 図８は、実施例４における吸光度測定の結果を示すグラフである。
（核酸センサおよびそれを用いた分析方法）
　本発明のターゲットの分析用核酸センサは、前述のように、触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）と、ターゲットに結合する結合核酸分子（Ａ）とを有する前記（Ｉ）、（II）、（II’）または（III）の核酸素子を含むことを特徴とする。
　前記結合核酸分子（Ａ）は、特に制限されず、ターゲットに結合する核酸分子であればよい。前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、アプタマーともいう。
　本発明において、前記ターゲットは、何ら制限されず、任意のターゲットが選択できる。そして、前記任意のターゲットに応じて、前記ターゲットに結合する結合核酸分子を、前記分析用核酸センサにおける結合核酸分子として使用すればよい。前記ターゲットは、例えば、ＡＴＰ、ＡＭＰ、微生物、ウイルス、食物アレルゲン、農薬、カビ毒等が例示できる。前記微生物は、例えば、サルモネラ菌、リステリア菌、大腸菌、カビ等があげられ、前記ウイルスは、例えば、ノロウイルス等があげられる。具体例として、ＡＴＰおよびＡＭＰは、いずれか一方がターゲットになってもよいし、両方がターゲットとなってもよく、前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、前者の場合、ＡＴＰおよびＡＭＰの一方に結合してもよいし、後者の場合、両方に結合してもよい。本発明において、「ＡＴＰまたはＡＭＰに結合する」とは、例えば、ＡＴＰまたはＡＭＰの他、ＡＴＰまたはＡＴＰの断片およびＡＴＰ誘導体、ＡＭＰ誘導体のいずれに結合可能でもよい。
　前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、一本鎖である。前記結合核酸分子（Ａ）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１８塩基長であり、好ましくは２０塩基長であり、より好ましくは２４塩基長であり、上限は、例えば、１２０塩基長であり、好ましくは６０塩基長であり、より好ましくは２６塩基長である。
　前記結合核酸分子（Ａ）として、ＡＴＰまたはＡＭＰをターゲットとする核酸分子（以下、ＡＴＰ／ＡＭＰ結合核酸分子（Ａ）という）を、以下に例示する。前記ＡＴＰ／ＡＭＰ結合核酸分子（Ａ）は、例えば、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）または（ａ４）のポリヌクレオチドを含むものがあげられる。前記ＡＴＰ／ＡＭＰ結合核酸分子（Ａ）は、例えば、前記ポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。前記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）または（ａ３）のポリヌクレオチドを含む前記ＡＴＰ／ＡＭＰ結合核酸分子（Ａ）は、例えば、結合ＤＮＡ分子ということもできる。
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
　　配列番号１　CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG
（ａ２）前記（ａ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、且つ、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合するポリヌクレオチド
（ａ３）前記（ａ１）の前記塩基配列との同一性が５０％以上の塩基配列からなり、且つ、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合可能なポリヌクレオチド
（ａ４）前記（ａ１）の前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的な塩基配列からなり、且つ、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合可能なポリヌクレオチド
　前記（ａ２）において、「１または複数」は、特に制限されず、前記（ａ２）のポリヌクレオチドが、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合すればよい。前記置換された塩基の数は、前記塩基配列（ａ１）において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記付加または挿入された塩基の数は、前記塩基配列（ａ１）において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記欠失された塩基の数は、前記塩基配列（ａ１）において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは２個または１個、特に好ましくは１個である。
　前記（ａ３）において、前記同一性は、前記塩基配列（ａ１）に対して、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
　前記（ａ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」は、例えば、０．７～１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０～６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５～６８℃で洗浄することにより塩基配列を同定できる条件をいう。１×ＳＳＣは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。
　前記ＡＴＰ／ＡＭＰ結合核酸分子（Ａ）は、これらの例示には限定されず、前述のように、ＡＴＰまたはＡＭＰに結合する核酸分子であればよい。
　前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、ヌクレオチド残基を含む分子であり、ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体のいずれか一種類のみを含んでもよいし、二種類以上を含んでもよいし、全てを含んでもよい。具体的に、前記核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＤＮＡでもよいし、リボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＲＮＡでもよいし、前者と後者とを含むキメラ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）でもよい。
　前記ヌクレオチドは、塩基として、例えば、天然塩基（非人工塩基）および非天然塩基（人工塩基）のいずれを含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、２’－フルオロピリミジン、２’－Ｏ－メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、２’－フルオロウラシル、２’－アミノウラシル、２’－Ｏ－メチルウラシル、２－チオウラシル等があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、修飾されたヌクレオチドでもよく、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基等があげられる。前記結合核酸分子（Ａ）は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等の非ヌクレオチドを含んでもよい。
　前記触媒核酸分子（Ｄ）は、触媒機能を生起する核酸分子であればよい。前記触媒機能は、例えば、酸化還元反応の触媒機能である。前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間に電子の授受を生じる反応であればよい。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応の触媒機能は、例えば、酵素と同様の活性があげられ、具体的には、例えば、ペルオキシダーゼと同様の活性（以下、「ペルオキシダーゼ様活性」という）等があげられる。前記ペルオキシダーゼ活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性があげられる。前記触媒核酸分子（Ｄ）は、後述するようなＤＮＡの場合、ＤＮＡエンザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅと呼ぶことができ、また、後述するようなＲＮＡの場合、ＲＮＡエンザイムまたはＲＮＡｚｙｍｅと呼ぶことができる。
　前記触媒核酸分子（Ｄ）は、Ｇ－カルテット（またはＧ－ｔｅｔｒａｄという）の構造を形成する核酸が好ましく、より好ましくはグアニン四重鎖（またはＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘという）の構造を形成する核酸である。前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄは、例えば、グアニンが四量体となった面の構造であり、Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、例えば、前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄが複数面重なった構造をいう。前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄおよび前記Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘは、例えば、反復してＧリッチの構造モチーフを有する核酸において、形成される。前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄは、例えば、パラレル型およびアンチパラレル型があげられるが、パラレル型が好ましい。前記核酸素子において、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記結合核酸素子（Ａ）にターゲットが結合していない状態で、前記ステムが形成されることにより、前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄの形成が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にターゲットが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄを形成することが好ましい。
　前記触媒核酸分子（Ｄ）は、ポルフィリンと結合可能な核酸が好ましく、具体的には、前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄを形成し且つ前記ポルフィリンと結合可能な核酸が好ましい。前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄを有する核酸は、例えば、前記ポルフィリンと結合して複合体を形成することによって、前述のような酸化還元反応の触媒機能を生起することが知られている。前記核酸素子において、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）にターゲットが結合していない状態で、前記ステムが形成されることにより、前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にターゲットが結合することにより、前記ステム形成が解除され、前記ポルフィリンと結合することが好ましい。具体的には、前記核酸素子において、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）にターゲットが結合していない状態で、前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄの形成が阻害され且つこれにより前記ポルフィリンとの結合が阻害され、前記結合核酸分子（Ａ）にＡＴＰまたはＡＭＰが結合することにより、前記Ｇ－ｔｅｔｒａｄを形成し且つ前記ポルフィリンと結合することが好ましい。
　前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ－メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
　前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、一本鎖である。前記触媒核酸分子（Ｄ）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１１塩基長であり、好ましくは１３塩基長であり、より好ましくは１５塩基長であり、上限は、例えば、６０塩基長であり、好ましくは３６塩基長であり、より好ましくは１８塩基長である。
　前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、ペルオキシダーゼ活性を有するＤＮＡとして、下記論文（１）～（４）等に開示されているＤＮＡｚｙｍｅが例示できる。
（１）Travascioら，　Chem.　Biol.,　1998年,　vol.5，　p.505-517
（２）Chengら,　Biochimistry,　2009年,　vol.48,　p.7817-7823
（３）Tellerら，　Anal.　Chem.,　2009年,　vol.81,　p.9114-9119
（４）Taoら,　Anal.　Chem.,　2009年,　vol.81,　p.2144-2149
　前記触媒核酸分子（Ｄ）は、具体例として、下記（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）または（ｄ４）のポリヌクレオチドを含むものがあげられる。前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記ポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。前記（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）または（ｄ４）のポリヌクレオチドを含む前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、触媒ＤＮＡ分子、ＤＮＡｚｙｍｅということもできる。
（ｄ１）配列番号１１～３１および６６～８５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ２）前記（ｄ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、且つ、前記酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
（ｄ３）前記（ｄ１）の前記塩基配列との同一性が５０％以上の塩基配列からなり、且つ、前記酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
（ｄ４）前記（ｄ１）の前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的な塩基配列からなり、且つ、前記酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
ＥＡＤ２（配列番号１１）
　　CTGGGAGGGAGGGAGGGA
ｃ－Ｍｙｃ（配列番号１２）
　　TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０５２７　（配列番号１３）
　　TGAGGGGAGGGAGGGCGGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０５７９（配列番号１４）
　　TGAGGGGTGGGAGGGAGGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０５８０（配列番号１５）
　　TGAGGGGTGGGAGGGACGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０５８３（配列番号１６）
　　TGAGGGGTGGGAGGGTGGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０５８４（配列番号１７）
　　TGAGGGGTGGGAGGGTCGGGAA
ｎｅｃｏ０５８４（配列番号１８）
　　GGGTGGGAGGGTCGGG
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０５８６（配列番号１９）
　　TGAGGGGTGGGAGGGGTGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０５８８（配列番号２０）
　　TGAGGGGTGGGAGGGGCGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０６０５（配列番号２１）
　　TGAGGGGTGGGTGGGCAGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０６０８（配列番号２２）
　　TGAGGGGTGGGTGGGCCGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０６２７（配列番号２３）
　　TGAGGGGTGGGCGGGAGGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０６３２（配列番号２４）
　　TGAGGGGTGGGCGGGTCGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０７０６（配列番号２５）
　　TGAGGGGCGGGAGGGATGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０７１１（配列番号２６）
　　TGAGGGGCGGGAGGGTGGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０７１２（配列番号２７）
　　TGAGGGGCGGGAGGGTCGGGAA
ｍ＿ＥＡＤ２－００３２（配列番号２８）
　　CTGGGTGGGCGGGCGGGA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０５２０（配列番号２９）
　　TGAGGGGAGGGAGGGTCGGGAA
ｍ＿ｃ－Ｍｙｃ－０７１４（配列番号３０）
　　TGAGGGGCGGGAGGGGTGGGAA
ｍ＿ＴＡ－０４２０（配列番号３１）
　　GGGCGGGAGGGAGGG
配列番号６６　GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG
配列番号６７　GTGGGTAGGGCGGGTTGG
配列番号６８　GGTTGGTGTGGTTGG
配列番号６９　GGGGTTGGGGTGTGGGGTTGGGG
配列番号７０　AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
配列番号７１　GGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGG
配列番号７２　GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG
配列番号７３　GTGGGTAGGGCGGTTGG
配列番号７４　CGAGGTGGGTGGGTGGGA
配列番号７５　CTGGGTGGGTGGGTGGGA
配列番号７６　CTGGGAGGGAGGGAGGGA
配列番号７７　CTGGGCGGGCGGGCGGGA
配列番号７８　CTGGGTTGGGTTGGGTTGGGA
配列番号７９　CTGGGGTGGGGTGGGGTGGGGA
配列番号８０　GGGCGGGCCGGGGGCGGG
配列番号８１　TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA
配列番号８２　CGGGCGGGCGCGAGGGAGGGG
配列番号８３　GGGAGGGAGAGGGGGCGGG
配列番号８４　GGGCGGGCGCGGGCGGG
配列番号８５　GGGTAGGGCGGGTTGGG
　前記（ｄ２）において、「１または複数」は、特に制限されず、前記（ｄ２）のポリヌクレオチドが、前記酸化還元反応の触媒機能を生起すればよい。前記置換された塩基の数は、前記塩基配列（ｄ１）において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記付加または挿入された塩基の数は、前記塩基配列（ｄ１）において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個または２個、特に好ましくは１個である。前記欠失された塩基の数は、前記塩基配列（ｄ１）において、例えば、１～５個であり、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは２個または１個、特に好ましくは１個である。
　前記（ｄ３）において、前記同一性は、前記塩基配列（ｄ１）に対して、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
　前記（ｄ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、前述と同様である。
　前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、前記（ｄ１）～（ｄ４）の例示には限定されず、前述のように、前記触媒機能を生起する核酸分子であればよい。
　前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、ヌクレオチド残基を含む分子であり、ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、前述と同様である。前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体のいずれか一種類のみを含んでもよいし、二種類以上を含んでもよいし、全てを含んでもよい。具体的に、前記核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＤＮＡでもよいし、リボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＲＮＡでもよいし、前者と後者とを含むキメラ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）でもよい。
　前記ヌクレオチドは、前記結合核酸分子（Ａ）における例示を援用できる。また、前記触媒核酸分子（Ｄ）は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）等の非ヌクレオチドを含んでもよい。
　本発明において、前記核酸素子は、前述のように、前記（Ｉ）、（II）、（II’）および（III）があげられる。以下に、これらの３つの形態について説明するが、特に示さない限り、各形態は、それぞれの説明を援用できる。
　前記核酸素子（Ｉ）は、前述のように、第１鎖と第２鎖とから構成される二本鎖の核酸素子である。前記第２鎖は、ブロック鎖ともいう。前記第１鎖（ｓｓ１）は、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結しており、前記第２鎖（ｓｓ２）は、ステム形成配列（ＳＡ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結している。前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的である。そして、ターゲットの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害される。前記触媒機能の阻害は、例えば、このステム形成で、前記触媒核酸分子がケージ化されて起こる。つまり、ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとれないことで、触媒機能が阻害される。他方、ターゲットの存在下、前記ターゲットと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される。前記触媒機能の生起は、例えば、ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子のケージ化が解除されて起こる。つまり、ステム形成の解除により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとることで、触媒機能が生起される。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。
　前記核酸素子（Ｉ）は、このように、ターゲットが非存在の場合、前記ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され（スイッチＯＦＦ）、ターゲットが存在の場合、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される（スイッチＯＮ）。前記核酸素子（Ｉ）は、具体的には、例えば、ターゲットの非存在下、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、ステムを形成し、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、ステムを形成し、前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、２つの前記ステムの間で内部ループを形成する。本発明において、「相補的」とは、例えば、アライメントする２つの領域間が、完全に相補であってもよいし、ステム形成可能な程度に相補であってもよい（以下、同様）。また、本発明において、「非相補的」とは、例えば、アライメントする２つの領域間が、完全に非相補であってもよいし、内部ループを形成可能な程度に非相補であってもよい（以下、同様）。
　前記ターゲットの非存在下における前記核酸素子（Ｉ）の状態を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）および（Ｂ）は、互いに、前記第１鎖（ｓｓ１）と前記第２鎖（ｓｓ２）の向きが逆となっている形態を示す。図１において、矢印は、５’側から３’側への方向を示す（以下、同様）。
　図１において、上側の鎖が、前記第１鎖（ｓｓ１）であり、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｌ１は、前記ループ形成配列（Ｌ１）、Ｄは、前記触媒核酸分子（Ｄ）を示し、下側の鎖が、前記第２鎖（ｓｓ２）であり、ＳＡは、前記ステム形成配列（ＳＡ）、Ｌ２は、前記ループ形成配列（Ｌ２）、ＳＤは、前記ステム形成配列（ＳＤ）を示す。図１に示すように、ターゲットが非存在下では、前記第１鎖（ｓｓ１）と前記第２鎖（ｓｓ２）との間で、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。具体的には、前記結合核酸分子（Ａ）の、ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）との間でステムが形成され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の、前記ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）との間でステムが形成され、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）との間で内部ループが形成される。そして、ターゲットが存在すると、前記結合核酸分子（Ａ）にターゲットが結合することによって、前記２つのステム形成が解除され、これによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒活性が生起される。
　前記核酸素子（Ｉ）において、前記各構成の方向は、特に制限されない。図１（Ａ）に示すように、前記第１鎖（ｓｓ１）は、例えば、５’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結し、前記第２鎖（ｓｓ２）は、３’側から、前記ステム形成配列（ＳＡ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結していることが好ましい。この場合、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）の３’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）の５’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。また、図１（Ｂ）に示すように、前記第１鎖（ｓｓ１）は、例えば、３’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結し、前記第２鎖（ｓｓ２）は、５’側から、前記ステム形成配列（ＳＡ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結してもよい。この場合、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）の５’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）の３’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。前記核酸素子（Ｉ）は、このように内部ループを形成することによって、優れた感度の検出が可能になると推測されるが、本発明は、この推測には制限されない。
　前記核酸素子（Ｉ）において、前記内部ループの長さは、特に制限されない。前記第１鎖（ｓｓ１）における前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ループ形成配列（Ｌ２）は、それぞれ、例えば、０～３０塩基長であり、好ましくは１～３０塩基長であり、より好ましくは１～１５塩基長であり、さらに好ましくは、１～６塩基長である。また、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）の長さは、例えば、同じでも、異なってもよい。後者の場合、長さの差は、特に制限されず、例えば、１～１０塩基、好ましくは１または２塩基、より好ましくは１塩基である。また、前記核酸素子（Ｉ）は、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記ループ形成配列（Ｌ２）のいずれか一方のみを有してもよい。前記核酸素子（Ｉ）は、このように内部ループを形成することによって、優れた感度の検出が可能になると推測されるが、本発明は、この推測には制限されない。
　前記核酸素子（Ｉ）において、前記各ステムの長さは、特に制限されない。前記ステムの長さは、例えば、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さで調節できる。前記ステム形成配列（ＳＡ）の長さは、例えば、０～６０塩基長であり、好ましくは０～１０塩基長であり、より好ましくは、１～６塩基長である。前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さは、例えば、０～３０塩基長、１～３０塩基長でありであり、好ましくは０～１０塩基長、１～１０塩基長でありであり、より好ましくは、１～６塩基長である。
　前記核酸素子（Ｉ）において、前記第１鎖（ｓｓ１）および前記第２鎖（ｓｓ２）の長さは、特に制限されない。前記第１鎖（ｓｓ１）の長さは、例えば、４０～２００塩基長であり、好ましくは４２～１００塩基長であり、より好ましくは、４５～６０塩基長である。前記第２鎖（ｓｓ２）の長さは、例えば、４～１２０塩基長であり、好ましくは５～２５塩基長であり、より好ましくは、１０～１５塩基長である。
　以下に、前記結合核酸分子（Ａ）として前記ＡＴＰ／ＡＭＰ結合核酸（Ａ）であるＡＴＰ／ＡＭＰアプタマーを使用した、前記核酸素子（Ｉ）の具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。まず、前記第１鎖（ｓｓ１）を、以下に例示する。下記配列において、５’側の下線部が、配列番号１のＡＴＰ／ＡＭＰアプタマー（図１においてＡ）、ポリｄＴが、前記ループ形成配列（図１においてＬ１）、３’側の下線部が、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅ（図１においてＤ）である。
　　AMP.neco.D0.A0　（配列番号２）
　　　　5’-CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTTTTTTTGGGTGGGAGGGTCGGG-3’
　つぎに、前記第１鎖（ｓｓ１）に対する第２鎖（ｓｓ２）を、以下に例示する。下記配列において、５’側の下線部が、前記第１鎖（ｓｓ１）のＤＮＡｚｙｍｅの５’側領域と相補な前記ステム形成配列（図１においてＳＤ）であり、ポリｄＴが、前記ループ形成配列（図１においてＬ２）であり、３’側の下線部が、前記第１鎖（ｓｓ１）のＡＴＰ／ＡＭＰアプタマーの３’側領域と相補な前記ステム形成配列（図１においてＳＡ）である。
AMP.neco.D5.A5　（配列番号３）
　　　　5’-CACCCTTTTTTTTCCTTC-3’
AMP.neco.D5.A6　（配列番号４）
　　　　5’-CACCCTTTTTTTTCCTTCC-3’
AMP.neco.D5.A7　（配列番号５）
　　　　5’-CACCCTTTTTTTTCCTTCCT-3’
AMP.neco.D5.A8　（配列番号６）
　　　　5’-CACCCTTTTTTTTCCTTCCTC-3’
AMP.neco.D6.A5　（配列番号７）
　　　　5’-CCACCCTTTTTTTTCCTTC-3’
AMP.neco.D6.A6       　（配列番号８）
　　　　5’-CCACCCTTTTTTTTCCTTCC-3’
AMP.neco.D6.A7　（配列番号９）
　　　　5’-CCACCCTTTTTTTTCCTTCCT-3’
AMP.neco.D6.A8       　（配列番号１０）
　　　　5’-CCACCCTTTTTTTTCCTTCCTC-3’
AMP.neco.D7.A5       　（配列番号３２）
　　　　5’-CCCACCCTTTTTTTTCCTTC-3’
AMP.neco.D7.A6       　（配列番号３３）
　　　　5’-CCCACCCTTTTTTTTCCTTCC-3’
AMP.neco.D7.A7　（配列番号３４）
　　　　5’-CCCACCCTTTTTTTTCCTTCCT-3’
AMP.neco.D7.A8       　（配列番号３５）
　　　　5’-CCCACCCTTTTTTTTCCTTCCTC-3’
AMP.neco.D8.A5       　（配列番号３６）
　　　　5’-TCCCACCCTTTTTTTTCCTTC-3’
AMP.neco.D8.A6　（配列番号３７）
　　　　5’-TCCCACCCTTTTTTTTCCTTCC-3’
AMP.neco.D8.A7       　（配列番号３８）
　　　　5’-TCCCACCCTTTTTTTTCCTTCCT-3’
AMP.neco.D8.A8　（配列番号３９）
　　　　5’-TCCCACCCTTTTTTTTCCTTCCTC-3’
　つぎに、前記核酸素子（II）は、前述のように、一本鎖の核酸素子であり、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）、ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結している。前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的である。
　そして、前記核酸素子（II）は、ターゲットの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害される。前記触媒機能の阻害は、例えば、このような自己会合によるステム形成で、前記触媒核酸分子がケージ化されて起こる。つまり、ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する構造をとれないことで、触媒機能が阻害される。他方、ターゲットの存在下、前記ターゲットと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される。前記触媒機能の生起は、例えば、自己会合によるステム形成が解除され、前記触媒核酸分子のケージ化が解除されて起こる。つまり、ステム形成の解除により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとることで、触媒機能が生起される。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。
　前記核酸素子（II）は、前記核酸素子（Ｉ）と同様に、ターゲットが非存在の場合、前記ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され（スイッチＯＦＦ）、ターゲットが存在の場合、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される（スイッチＯＮ）。前記核酸素子（II）は、具体的には、例えば、ターゲットの非存在下、前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、ステムを形成し、前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、ステムを形成し、前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、２つの前記ステムの間で内部ループを形成する。
　前記ターゲットの非存在下における前記核酸素子（II）の状態を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）および（Ｂ）は、互いに、向きが逆となっている形態を示す。
　図２において、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｌ１は、前記ループ形成配列（Ｌ１）、ＳＤは、前記ステム形成配列（ＳＤ）、Ｄは、前記触媒核酸分子（Ｄ）、Ｌ２は、前記ループ形成配列（Ｌ２）、ＳＡは、前記ステム形成配列（ＳＡ）を示す。図２に示すように、ターゲットが非存在下では、前記核酸素子（II）の自己アニーリングによって、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。具体的には、前記結合核酸分子（Ａ）の、ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）との間でステムが形成され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の、前記ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）との間でステムが形成され、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）との間で内部ループが形成される。そして、ターゲットが存在すると、前記結合核酸分子（Ａ）にターゲットが結合することによって、前記２つのステム形成が解除され、これによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒活性が生起される。
　前記核酸素子（II）において、前記各構成の方向は、特に制限されない。図２（Ｂ）に示すように、前記核酸素子（II）は、例えば、３’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）、前記ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結していることが好ましい。この場合、前記結合核酸分子（Ａ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。また、図２（Ａ）に示すように、前記核酸素子（II）は、例えば、５’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）、前記ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結してもよい。この場合、前記結合核酸分子（Ａ）の３’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）の３’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。
　前記核酸素子（II）において、前記内部ループの長さは、特に制限されない。前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）は、それぞれ、例えば、０～３０塩基長であり、好ましくは１～３０塩基長であり、より好ましくは、１～１５塩基長であり、さらに好ましくは、１～６塩基長である。また、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）の長さは、例えば、同じでも、異なってもよい。後者の場合、長さの差は、特に制限されず、例えば、１～１０塩基、好ましくは１または２塩基、より好ましくは１塩基である。また、前記核酸素子（II）は、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記ループ形成配列（Ｌ２）のいずれか一方のみを有してもよい。前記核酸素子（II）は、このように内部ループを形成することによって、優れた感度の検出が可能になると推測されるが、本発明は、この推測には制限されない。
　前記核酸素子（II）において、前記各ステムの長さは、特に制限されない。前記ステムの長さは、例えば、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さで調節できる。前記ステム形成配列（ＳＡ）の長さは、例えば、０～６０塩基長、１～６０塩基長であり、好ましくは１～１０塩基長であり、より好ましくは１～７塩基長である。前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さは、例えば、０～３０塩基長、１～３０塩基長であり、好ましくは０～１０塩基長、１～１０塩基長であり、より好ましくは、０～７塩基長、１～７塩基長である。
　前記核酸素子（II）の長さは、特に制限されない。前記核酸素子（II）の長さは、例えば、４０～１２０塩基長であり、好ましくは４５～１００塩基長であり、より好ましくは、５０～８０塩基長である。
　以下に、前記結合核酸分子（Ａ）として前記ＡＴＰ／ＡＭＰ結合核酸（Ａ）であるＡＴＰ／ＡＭＰアプタマーを使用した、前記核酸素子（II）の具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。下記配列において、５’側から３’側に向かって、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＡ）、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ２）、５’側の下線部が、配列番号１１（ＥＡＤ２）のＤＮＡｚｙｍｅ（Ｄ）、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＤ）、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）、３’側の下線部が、配列番号１のＡＴＰ／ＡＭＰアプタマー（Ａ）である。
AMP.D3.A2　（配列番号４０）
　5’-ggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D3.A3　（配列番号４１）
　5’-aggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D3.A4　（配列番号４２）
　5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D3.A5　（配列番号４３）
　5’-ccaggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A2　（配列番号４４）
　5’-ggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A3　（配列番号４５）
　5’-aggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A4　（配列番号４６）
　5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A5　（配列番号４７）
　5’-ccaggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A2　（配列番号４８）
　5’-ggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A3　（配列番号４９）
　5’-aggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A4　（配列番号５０）
　5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A5　（配列番号５１）
　5’-ccaggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCTGGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
　下記配列において、５’側から３’側に向かって、小文字配列が前記ステム形成配列（ＳＡ）、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ２）、５’側の下線部が、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅ（Ｄ）、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＤ）、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）、３’側の下線部が、配列番号１のＡＴＰ／ＡＭＰアプタマー（Ａ）である。
AMP.neco.D3.A2　（配列番号５２）
　5’-ggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A3　（配列番号５３）
　5’-aggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A4　（配列番号５４）
　5’-caggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A5　（配列番号５５）
　5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D4.A2　（配列番号５６）
　5’-ggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D4.A3　（配列番号５７）
　5’-aggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D4.A4　（配列番号５８）
　5’-caggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D4.A5　（配列番号５９）
　5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A2　（配列番号６０）
　5’-ggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A3　（配列番号６１）
　5’-aggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A4　（配列番号６２）
　5’-caggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A5　（配列番号６３）
　5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D6.A2　（配列番号６４）
　5’-ggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGccacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
　つぎに、前記核酸素子（II’）は、前記核酸素子（II）に対して、前記結合核酸分子（Ａ）と前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ステム形成配列（ＳＡ）と前記ステム形成配列（ＳＤ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、それぞれ入れ替わった位置関係にある一本鎖の核酸素子である。なお、前記核酸素子（II’）は、特に説明しない限り、前記核酸素子（II）の記載を援用できる。
　前記核酸素子（II’）は、前述のように、前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）、ステム形成配列（ＳＡ）、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結している。前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的である。
　そして、前記核酸素子（II’）は、ターゲットの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害される。前記触媒機能の阻害は、例えば、このような自己会合によるステム形成で、前記触媒核酸分子がケージ化されて起こる。つまり、ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとれないことで、触媒機能が阻害される。他方、ターゲットの存在下、前記ターゲットと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される。前記触媒機能の生起は、例えば、自己会合によるステム形成が解除され、前記触媒核酸分子のケージ化が解除されて起こる。つまり、ステム形成の解除により、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、触媒機能を生起する本来の構造をとることで、触媒機能が生起される。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。
　前記核酸素子（II’）は、前記核酸素子（II）と同様に、ターゲットが非存在の場合、前記ステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され（スイッチＯＦＦ）、ターゲットが存在の場合、前記ステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される（スイッチＯＮ）。前記核酸素子（II’）は、具体的には、例えば、ターゲットの非存在下、前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、ステムを形成し、前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、ステムを形成し、前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、２つの前記ステムの間で内部ループを形成する。
　前記ターゲットの非存在下における前記核酸素子（II’）の状態を、図３の模式図に示す。図３（Ａ）および（Ｂ）は、互いに、向きが逆となっている形態を示す。
　図３において、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｌ１は、前記ループ形成配列（Ｌ１）、Ｄは、前記触媒核酸分子（Ｄ）、Ｌ２は、前記ループ形成配列（Ｌ２）、ＳＡは、前記ステム形成配列（ＳＡ）、ＳＤは、前記ステム形成配列（ＳＤ）を示す。図３に示すように、ターゲットが非存在下では、前記核酸素子（II’）の自己アニーリングによって、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。具体的には、前記結合核酸分子（Ａ）の、ループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）との間でステムが形成され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の、前記ループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）との間でステムが形成され、前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）との間で内部ループが形成される。そして、ターゲットが存在すると、前記結合核酸分子（Ａ）にターゲットが結合することによって、前記２つのステム形成が解除され、これによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒活性が生起される。
　前記核酸素子（II’）において、前記各構成の方向は、特に制限されない。図３（Ｂ）に示すように、前記核酸素子（II’）は、例えば、３’側から、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）、前記ステム形成配列（ＳＡ）、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記ステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結していることが好ましい。この場合、前記結合核酸分子（Ａ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。また、図３（Ａ）に示すように、前記核酸素子（II’）は、例えば、５’側から、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）、前記ステム形成配列（ＳＡ）、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記ステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結してもよい。この場合、前記結合核酸分子（Ａ）の３’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）の３’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であることが好ましい。
　つぎに、前記核酸素子（III）は、前述のように、一本鎖の核酸素子であり、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結しており、前記介在配列（Ｉ）は、前記触媒核酸分子（Ｄ）および前記結合核酸分子（Ａ）と非相補的である。そして、ターゲットの非存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、他方、ターゲットの存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される。
　前記核酸素子（III）は、前記核酸素子（Ｉ）、（II）および（II’）と同様に、ターゲットが非存在の場合、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され（スイッチＯＦＦ）、ターゲットが存在の場合、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される（スイッチＯＮ）。
　前記ターゲットの非存在下における前記核酸素子（III）の状態を、図４の模式図に示す。図４において、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｉは、前記介在配列（Ｉ）、Ｄは、前記触媒核酸分子（Ｄ）を示す。図４（Ａ）および（Ｂ）は、互いに、向きが逆となっている形態を示す。
　前記核酸素子（III）について、ターゲットの非存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、ターゲットの存在下で、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起されるのは、例えば、以下の理由が推測される。なお、本発明は、これらの推測には制限されない。前記核酸素子（III）は、ターゲット非存在下において、前記触媒核酸分子（Ｄ）の一部と前記結合核酸分子（Ａ）の一部とが相互作用し、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、非Ｇカルテット構造を形成していると推測される。そして、ターゲットが存在すると、前記核酸素子（III）のメインフォームが、前記結合核酸素子（Ａ）の本来の構造、すなわちターゲットに結合する三次元構造に傾き、全体の構造変化が生じ、結果として、前記触媒核酸分子（Ｄ）がＧカルテット構造を形成し、その触媒機能が生起されると考えられる。
　前記核酸素子（III）において、前記各構成の方向は、特に制限されない。図４（Ａ）に示すように、前記核酸素子（III）は、例えば、５’側から、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結していることが好ましい。また、図４（Ｂ）に示すように、前記核酸素子（III）は、例えば、３’側から、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結してもよい。
　前記核酸素子（III）において、前記介在配列（Ｉ）の長さは、特に制限されない。前記介在配列（Ｉ）の長さは、例えば、例えば、０～３０塩基長、１～３０塩基長であり、好ましくは、０～２５塩基長、１～２５塩基長であり、より好ましくは、０～２０塩基長、１～２０塩基長であり、さらに好ましくは、０～１０塩基長、１～１０塩基長であり、特に好ましくは、０～８塩基長、１～８塩基長である。
　前記核酸素子（III）の長さは、特に制限されない。前記核酸素子（III）の長さは、例えば、３０～１２０塩基長であり、好ましくは３５～８０塩基長であり、より好ましくは、４０～６０塩基長である。
　以下に、前記結合核酸分子（Ａ）として前記ＡＴＰ／ＡＭＰ結合核酸（Ａ）であるＡＴＰ／ＡＭＰアプタマーを使用した、前記核酸素子（III）の具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。下記AMP.neco.D0.A0において、５’側の下線部が、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅ（図４においてＤ）であり、３’側の下線部が、配列番号１のＡＴＰ／ＡＭＰアプタマー（図４においてＡ）であり、両者間のポリｄＴが介在配列（図４においてＩ）である。
AMP.neco.D0.A0　（配列番号６５）
　　5’-GGGTGGGAGGGTCGGGTTTTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
　前記核酸素子（Ｉ）、（II）、（II’）および（III）において、各領域は、例えば、それぞれ、直接的な連結でも、間接的な連結でもよい。前記直接的な連結の場合、例えば、各領域がホスホジエステル結合により連結する。また、前記間接的な連結の場合、例えば、介在リンカーを介して、各領域が連結する。前記介在リンカーは、例えば、前述のようなヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドで構成される核酸分子があげられる。前記介在リンカーは、例えば、一本鎖が好ましい。
　本発明の核酸センサは、例えば、前記核酸素子のみからなるセンサでもよいし、さらに他の構成要素を含むセンサでもよい。本発明の核酸センサは、例えば、ＳＡを検出するためのデバイスということもできる。前記他の構成要素は、例えば、前記核酸素子を配置する基材があげられる。前記基材は、例えば、基板、ビーズ、チューブ等の容器等があげられる。前記他の構成要素は、この他に、例えば、リンカーがあげられる。前記リンカーは、例えば、前記核酸素子を前記基材に固定化する際、前記核酸素子と前記基材との連結に使用できる。前記核酸センサの前記基材への配置は、例えば、後述する本発明の分析用デバイスを参照できる。
　前記核酸素子において、前記リンカーとの連結部位は、特に制限されず、例えば、前記核酸素子のいずれかの末端が好ましい。前記二本鎖の核酸素子（Ｉ）は、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）および前記触媒核酸分子（Ｄ）を有する前記第１鎖（ｓｓ１）のいずれかの末端、および／または、前記第２鎖（ｓｓ２）のいずれかの末端が好ましい。前記一本鎖の核酸素子（II）、（II’）および（III）は、例えば、いずれかの末端が好ましい。この場合、前記リンカーは、末端リンカーともいう。前記リンカーは、例えば、前述のようなヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドで構成される核酸分子があげられる。前記末端リンカーは、例えば、一本鎖が好ましい。
　本発明の核酸センサは、例えば、前記核酸素子を遊離状態で使用してもよいし、前記核酸素子を固定化した状態で使用してもよい。後者の場合、例えば、前記基材に固定化し、デバイスとして使用できる。
　本発明の核酸センサの使用方法は、特に制限されず、以下のように、本発明のターゲットの分析方法に使用できる。
　本発明の分析方法は、前述のように、ターゲットの分析方法であり、前記本発明の核酸センサに、ターゲットを含む試料を接触させる接触工程、および、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
　前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、ターゲットを含む試料、ターゲットを含有するか否かが不明な試料のいずれでもよい。前記試料は、例えば、液体試料が好ましい。
　本発明の核酸センサとして、前記核酸素子を遊離状態で使用する際は、例えば、チューブ等の容器内で、前記核酸素子と前記試料とを接触させることが好ましい。また、本発明の核酸センサとして、前記核酸素子を前記基材に配置した状態で使用する際は、例えば、前記基材上の前記核酸素子に、前記試料を接触させることができる。
　前記検出工程は、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出することが好ましい。前記シグナルは、例えば、光学的シグナルおよび電気化学的シグナル等があげられる。前記光学的シグナルは、例えば、発色シグナル、発光シグナル、蛍光シグナル等があげられる。
　前記シグナルは、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により、基質から生成されることが好ましい。そこで、前記検出工程は、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に応じた基質の存在下で、行うことが好ましい。
　前記基質は、例えば、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質、発色、発光もしくは蛍光の基質であり、且つ、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光が消失する生成物を生成する基質、また、前記触媒機能によって、異なる発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質等があげられる。このような基質によれば、例えば、発色、発光もしくは蛍光の有無、または、発色、発光もしくは蛍光の変化や強度等をシグナルとして、目視で確認することにより、前記触媒機能を検出できる。また、例えば、吸光度、反射率、蛍光強度等をシグナルとして、光学的な手法で測定することにより、前記触媒機能を検出することもできる。前記触媒機能は、例えば、前述のような酸化還元反応の触媒機能があげられる。
　また、前記触媒核酸分子（Ｄ）が、前記酸化還元反応の触媒機能を有する場合、例えば、電子の授受が可能な基質があげられる。この場合、前記触媒核酸分子（Ｄ）により、例えば、前記基質から生成物が生成され、その過程において、電子の授受が生じる。この電子授受は、例えば、電極への印加により、電気シグナルとして、電気化学的に検出できる。前記電気シグナルの検出は、例えば、電流等のような、前記電気シグナルの強度を測定することにより行える。
　前記基質は、特に制限されず、例えば、過酸化水素、３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、１，２－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２’－Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ　Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）、３，３’－Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ　（ＤＡＢ）、３，３’－Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ　Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　Ｈｙｄｒａｔｅ（ＤＡＢ４ＨＣｌ）、３－Ａｍｉｎｏ－９－ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＡＥＣ）、４－Ｃｈｌｏｒｏ－１－ｎａｐｈｔｈｏｌ（４Ｃ１Ｎ）、２，４，６－Ｔｒｉｂｒｏｍｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ　Ａｃｉｄ、２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、４－Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、４－Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ルミノール等があげられる。
　前記検出工程において、前記基質は、例えば、前記核酸センサに前記試料を接触させる前に、予め、前記核酸センサに供給してもよいし、前記試料の接触と同時または前記試料を接触させた後、前記核酸センサに供給してもよい。前記基質は、例えば、液体に混合した基質液として、前記核酸センサに供給することが好ましい。前記基質を混合する液体は、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ等の緩衝液が好ましい。前記基質液における前記基質の濃度は、特に制限されず、例えば、０．１～５ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．５～２ｍｍｏｌ／Ｌである。また、前記基質液のｐＨは、例えば、６～９であり、好ましくは６．８～９である。
　前記検出工程において、前記触媒核酸分子（Ｄ）による反応条件は、特に制限されない。温度は、例えば、１５～３７℃であり、時間は、例えば、１０～９００秒である。
　また、前記検出工程において、前記基質の他に、例えば、ポルフィリンを共存させてもよい。公知のＤＮＡｚｙｍｅには、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することによって、さらに高い酸化還元活性を示すものがある。そこで、本発明においても、例えば、ポルフィリンを共存させて、前記触媒核酸分子（Ｄ）とポルフィリンとの複合体として、酸化還元活性を検出してもよい。前記ポルフェリンの供給は、特に制限されず、前記基質と同様に行うことができる。
　前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ－メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
　本発明の核酸センサによれば、前述のようにターゲットを検出できる。具体例として、例えば、前記ターゲットがＡＴＰまたはＡＭＰであり、前記結合核酸分子（Ａ）として前記ＡＴＰ／ＡＭＰ結合核酸分子（Ａ）を使用した前記核酸センサによれば、例えば、前述のように、ＡＴＰまたはＡＭＰの検出から、間接的に、対象物に残存する微生物が食品残渣等の汚れを検出できる。
（分析用デバイスおよびそれを用いた分析方法）
　本発明の分析用デバイスは、ターゲットの分析用デバイスであり、基材、核酸センサおよび検出部を含み、前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、前記核酸センサは、前記本発明の核酸センサであり、前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とする。
　本発明の分析用デバイスは、前記本発明の核酸センサを使用することが特徴であって、その他の構成に関しては何ら制限されない。特に説明しない限り、本発明の分析用デバイスは、例えば、前記本発明の核酸センサの説明を援用できる。
　本発明の分析用デバイスにおいて、前記核酸センサの配置方法は、特に制限されず、例えば、前記核酸センサにおける前記核酸素子が、前記基材に固定化されてもよいし、固定化されていなくてもよい。前者の場合、前記核酸素子は、例えば、前記基材に、直接的に固定化されてもよいし、間接的に固定化されてもよい。前記固定化は、例えば、化学的結合による連結が例示できる。前記間接的な固定化は、例えば、前記核酸素子が、リンカーを介して、前記基材に固定化される形態があげられる。前記リンカーは、例えば、前述の末端リンカーがあげられる。前記核酸素子の配置に関しては、例えば、前記本発明の核酸センサにおける説明を援用できる。
　前記核酸素子の固定化は、この他に、例えば、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記方法としては、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法があげられ、具体例として、米国特許５，４２４，１８６号明細書等を参照できる。また、前記固定化方法としては、例えば、前記基材上で前記核酸素子を合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許５，８０７，５２２号明細書、特表平１０－５０３８４１号公報等を参照できる。
　前記基材における前記核酸素子の配置部位は、特に制限されず、例えば、前記検出部に配置されている形態があげられる。
　本発明の分析用デバイスは、例えば、さらに、試薬部を有してもよい。前記試薬部は、例えば、前記検出部に配置してもよい。前記試薬部は、例えば、予め試薬が配置されてもよいし、使用時に試薬を供給してもよい。前記試薬としては、例えば、前述のような基質、前記ポルフィリン等があげられる。
　本発明の分析用デバイスにおいて、前記検出部は、前述のように、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部である。前記検出部は、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能として、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部であることが好ましい。前記シグナルは、前述のように、例えば、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能による、基質からのシグナルがあげられる。前記シグナルは、例えば、前述のような、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルがあげられる。
　前記シグナルが光学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、光学的シグナルの検出部であり、吸光度、反射率、蛍光強度等の検出部が例示できる。
　前記シグナルが前記電気化学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、電極系を有する。この場合、前記検出部は、例えば、前記基材の表面に、前記電極系を配置することによって形成できる。前記電極の配置方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法が採用でき、具体例は、蒸着法、スパッタリング法、スクリーン印刷法、メッキ法等の薄膜形成方法があげられる。前記電極は、例えば、前記基材に、直接配置してもよいし、間接的に配置してもよい。間接的な配置は、例えば、他の部材を介した配置があげられる。
　前記電極系は、例えば、作用極および対極を含んでもよいし、作用極、対極および参照極を含んでもよい。前記電極の材料は、特に制限されず、例えば、白金、銀、金、カーボン等があげられる。前記作用極および前記対極は、例えば、白金電極、銀電極、金電極、カーボン電極等があげられ、前記参照極は、例えば、銀／塩化銀の電極があげられる。前記銀／塩化銀の電極は、例えば、銀電極への塩化銀電極の積層により形成できる。
　本発明の分析用デバイスが、前記電極系を有する場合、前記核酸素子は、例えば、前記電極系に配置すること好ましく、前記電極の中でも前記作用極に配置することが好ましい。本発明の分析用デバイスが、前記電極系と前記試薬部とを有する場合、例えば、前記電極系の上に、前記試薬部を配置することが好ましい。
　本発明の分析用デバイスは、例えば、複数の検出部を備えてもよい。この場合、前記分析用デバイスは、例えば、前記基材の表面をマトリックスに分画し、各分画領域に、前述のような検出部を備えることが好ましい。本発明の分析用デバイスにおいて、１つの検出部に配置する核酸センサの数は、特に制限されない。
　前記基材は、特に制限されない。前記基材は、例えば、表面が絶縁性の基板が好ましい。前記基材は、例えば、絶縁材料からなる基板でもよいし、表面に絶縁材料からなる絶縁層を有する基材でもよい。前記絶縁材料は、特に制限されず、例えば、ガラス、セラミック、絶縁性プラスチック、紙等の公知の材料があげられる。前記絶縁性プラスチックは、特に制限されず、例えば、シリコーン樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、フッ素樹脂等があげられる。
　本発明の分析方法は、前述のように、ターゲットの分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、前記分析用デバイスの前記検出部において、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
　本発明の分析方法は、前記本発明の核酸センサを備える前記分析用デバイスを使用することが特徴であって、その他の条件は、何ら制限されない。本発明の分析方法は、例えば、前記本発明の核酸センサにおける分析方法の説明を援用できる。
（分析用試薬）
　本発明の分析用試薬は、前記本発明の分析用核酸センサを含むことを特徴とする。本発明の分析用試薬は、前記核酸センサを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
　本発明の分析用試薬は、例えば、前記核酸センサの他に、例えば、前記基質、前記ポルフェリン、前記緩衝液、および／または前記基材等の構成成分を含んでもよい。
　また、本発明の分析用試薬は、例えば、分析用キットであってもよい。この場合、例えば、前記核酸センサと、前述したその他の構成成分とを含み、それぞれ別個に収容されてもよい。前記分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
（実施例１）
　結合核酸分子（Ａ）としてＡＭＰアプタマー、触媒核酸分子（Ｄ）としてＥＡＤ２と備える一本鎖の前記核酸素子（II）を作製し、核酸センサとしての性能を確認した。
　前記核酸素子として、下記配列のＤＮＡを合成した（図２参照）。前記配列において、５’側から３’側に向かって、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＡ）であり、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ２）であり、５’側の下線部が、配列番号１１のＥＡＤ２（Ｄ）であり、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＤ）であり、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）であり、３’側の下線部が、配列番号１のＡＭＰアプタマー（Ａ）である。
AMP.D4.A4　（配列番号４６）
　5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D4.A5　（配列番号４７）
　5’-ccaggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.D5.A4　（配列番号５０）
　5’-caggTTTCTGGGAGGGAGGGAGGGAcccagTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
　エッペンドルフチューブに、下記組成の反応液１００μＬを調製し、２５℃で６０秒反応させた後、前記反応液について、吸光度の測定（波長４１５ｎｍ）を行った。測定は、吸光度測定装置（商品名ＴＥＣＡＮ　ｉｎｆｉｎｉｔｅ、ＴＥＣＡＮ社）を使用した。前記反応液において、前記ＤＮＡｚｙｍｅバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、０．０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００とした。基質は、ＡＢＴＳ（2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic　Acid　Ammonium　Salt)を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　同時に、ネガティブコントロールとして、前記核酸センサを除いた反応液（ＮＣ）についても、同様に反応を行った。また、ポジティブコントロールとして、前記核酸センサに代えて、前記配列番号１１のＥＡＤ２を使用した反応液（ＰＣ）についても、同様に反応を行った。
　ＥＡＤ２（配列番号１１）　CTGGGAGGGAGGGAGGGA
　これらの結果を図５に示す。図５は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図５に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰを含む反応液の吸光度は、ＡＭＰ無添加の反応液の吸光度に対して、有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定によって、ＡＭＰの有無および濃度を測定可能であると言え、具体的には１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰであっても検出可能であると言える。
（実施例２）
　前記実施例１における核酸素子ＡＭＰ．Ｄ４．Ａ５（配列番号４７）を核酸センサとして使用し、ＡＭＰ濃度を変化させて、測定を行った。
　反応液におけるＡＭＰ濃度を、所定濃度（０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、５００μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ）とし、反応時間を１７０秒とした以外は、前記実施例１と同様にして反応を行い、吸光度の測定を行った。ネガティブコントロール（ＮＣ）およびポジティブコントロール（ＰＣ）も、ＡＭＰ濃度以外は、前記実施例１と同様とした。
　これらの結果を図６に示す。図６は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図６のＮＣ、ＡＭＰ．Ｄ４．Ａ５およびＰＣにおいて、それぞれ５つのバーは、左から、ＡＭＰ濃度が、０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、５００μｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌの結果を示す。図６に示すように、ＤＮＡｚｙｍｅであるＥＡＤ２のみを使用したネガティブコントロール（ＮＣ）では、ＡＭＰの濃度に依存的な吸光度の増加は確認されなかった。これに対して、実施例の核酸センサを使用した場合、ＡＭＰ濃度に依存して、吸光度の増加が確認された。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定により、ＡＭＰの濃度を測定可能であると言える。
（実施例３）
　結合核酸分子（Ａ）としてＡＭＰアプタマー、触媒核酸分子（Ｄ）としてｎｅｃｏ０５８４を備える一本鎖の前記核酸素子（II）を作製し、核酸センサとしての性能を確認した。
　前記核酸素子として、下記配列のＤＮＡを合成した（図２参照）。前記配列において、５’側から３’側に向かって、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＡ）であり、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ２）であり、５’側の下線部が、配列番号１８のｎｅｃｏ０５８４（Ｄ）であり、小文字配列が、前記ステム形成配列（ＳＤ）であり、大文字のポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）であり、３’側の下線部が、配列番号１のＡＴＰまたはＡＭＰアプタマー（Ａ）である。
AMP.neco.D3.A3　（配列番号５３）
　5’-aggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A4　（配列番号５４）
　5’-caggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D3.A5　（配列番号５５）
　5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
AMP.neco.D5.A5　（配列番号６３）
　5’-ccaggTTTGGGTGGGAGGGTCGGGcacccTTTCCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3’
　前記核酸センサを使用した以外は、前記実施例と同様にして反応を行い、吸光度を測定した。同時に、ネガティブコントロールとして、前記核酸センサを除いた反応液（ＮＣ）についても、同様に反応を行った。また、ポジティブコントロールとして、前記核酸センサに代えて、前記配列番号１８のｎｅｃｏ０５４８を使用した反応液（ＰＣ）についても、同様に反応を行った。
ｎｅｃｏ０５８４（配列番号１８）　GGGTGGGAGGGTCGGG
　これらの結果を図７に示す。図７は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図７に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰを含む反応液の吸光度は、ＡＭＰ無添加の反応液の吸光度に対して、有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定によって、ＡＭＰの有無および濃度を測定可能であると言え、具体的には１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰであっても検出可能であると言える。
（実施例４）
　結合核酸分子（Ａ）としてＡＴＰまたはＡＭＰアプタマー、触媒核酸分子（Ｄ）としてＤＮＡｚｙｍｅとを備える二本鎖の前記核酸素子（Ｉ）を作製し、核酸センサとしての性能を確認した。
　前記第１鎖核酸（ｓｓ１）として、下記配列のＤＮＡを合成した（図１参照）。下記配列において、５’側の下線部が、配列番号１のＡＭＰアプタマー（Ａ）、ポリｄＴが、前記ループ形成配列（Ｌ１）、３’側の下線部が、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅ（Ｄ）とした。
AMP.neco.D0.A0　（配列番号２）
　5’-CCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTTTTTTTTGGGTGGGAGGGTCGGG-3’
　つぎに、前記第１鎖（ｓｓ１）に対する第２鎖（ｓｓ２）として、下記配列のＤＮＡを合成した（図１参照）。下記配列において、５’側の下線部が、前記第１鎖（ｓｓ１）のＤＮＡｚｙｍｅの５’側領域と相補な前記ステム形成配列（図１においてＳＤ）であり、ポリｄＴが、前記ループ形成配列（図１においてＬ２）であり、３’側の下線部が、前記第１鎖（ｓｓ１）のＡＭＰアプタマーの３’側領域と相補な前記ステム形成配列（図１においてＳＡ）とした。
AMP.neco.D7.A8　（配列番号３５）
　5’-CTCCTTCCTTTTTTTTCCCACCC-3’
　エッペンドルフチューブに、下記組成の反応液１００μＬを調製し、２５℃で６０秒反応させた後、前記反応液について、吸光度の測定（波長４１５ｎｍ）を行った。測定は、吸光度測定装置（商品名ＴＥＣＡＮ　ｉｎｆｉｎｉｔｅ、ＴＥＣＡＮ社）を使用した。前記反応液において、前記ＤＮＡｚｙｍｅバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００とした。基質は、ＡＢＴＳを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　同時に、ポジティブコントロールとして、前記核酸センサに代えて、配列番号１８（ｎｅｃｏ０５８４）のＤＮＡｚｙｍｅを使用した反応液（ＰＣ）について、同様に反応を行った。また、ネガティブコントロールとして、核酸センサを除いた反応液（ＮＣ）についても、同様に反応を行った。
　ｎｅｃｏ０５８４（配列番号１８）　GGGTGGGAGGGTCGGG
　これらの結果を図８に示す。図８は、前記反応液の吸光度を示すグラフである。図８に示すように、実施例の核酸センサを使用した結果、１ｍｍｏｌ／ＬのＡＭＰを含む反応液の吸光度は、ＡＭＰ無添加の反応液の吸光度に対して、有意差を示した。この結果から、実施例の核酸センサによれば、吸光度測定によって、ＡＭＰの有無および濃度を測定可能であると言え、具体的には１μｍｏｌ／ＬのＡＭＰであっても検出可能であると言える。
　以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０１２年３月２３日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／５７６３５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　本発明によれば、前記結合核酸分子（Ａ）とターゲットとが結合したか否かによって、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能のＯＮ－ＯＦＦをスイッチでき、且つ、その感度に優れる。このため、前記触媒核酸分子の触媒機能を検出することで、ターゲットの有無または量を、容易に検出可能である。また、本発明の分析用デバイスは、前述のように、前記核酸センサを使用することから、例えば、デバイスの小型化およびチップ化等も可能であり、多数の検体でも簡便な分析が可能となる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。

Claims (28)

  1. 触媒機能を生起する触媒核酸分子（Ｄ）と、ターゲットに結合する結合核酸分子（Ａ）とを有する下記（Ｉ）、（II）、（II’）または（III）の核酸素子を含むことを特徴とする、ターゲットの分析用核酸センサ。
    （Ｉ）第１鎖と第２鎖とから構成される二本鎖の核酸素子であり、
    前記第１鎖（ｓｓ１）は、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結しており、
    前記第２鎖（ｓｓ２）は、ステム形成配列（ＳＡ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結しており、
    前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
    前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、
    前記第１鎖（ｓｓ１）における前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的であり、
    ターゲットの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
    ターゲットの存在下、前記ターゲットと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
    （II）一本鎖の核酸素子であり、
    前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）、ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）およびステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結しており、
    前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
    前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、
    前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的であり、
    ターゲットの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
    ターゲットの存在下、前記ターゲットと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
    （II’）一本鎖の核酸素子であり、
    前記触媒核酸分子（Ｄ）、ループ形成配列（Ｌ２）、ステム形成配列（ＳＡ）、前記結合核酸分子（Ａ）、ループ形成配列（Ｌ１）およびステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結しており、
    前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的であり、
    前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
    前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、非相補的であり、
    ターゲットの非存在下、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成により、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
    ターゲットの存在下、前記ターゲットと前記結合核酸分子（Ａ）との結合により、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）における、それぞれのステム形成が解除され、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
    （III）一本鎖の核酸素子であり、
    前記触媒核酸分子（Ｄ）、介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結しており、
    前記介在配列（Ｉ）は、前記触媒核酸分子（Ｄ）および前記結合核酸分子（Ａ）と非相補的であり、
    ターゲットの非存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が阻害され、
    ターゲットの存在下、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が生起される核酸素子
  2. 前記核酸素子（Ｉ）は、
    ターゲットＰの非存在下、
    前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、ステムを形成し、
    前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、ステムを形成し、
    前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、２つの前記ステムの間で内部ループを形成する、請求項１記載の核酸センサ。
  3. 前記核酸素子（Ｉ）において、
    前記第１鎖（ｓｓ１）は、５’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）および前記触媒核酸分子（Ｄ）が、この順序で連結しており、
    前記第２鎖（ｓｓ２）は、３’側から、前記ステム形成配列（ＳＡ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＤ）が、この順序で連結しており、
    前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）の３’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
    前記第１鎖（ｓｓ１）における前記触媒核酸分子（Ｄ）の５’末端領域と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的である、請求項２記載の核酸センサ。
  4. 前記第１鎖（ｓｓ１）における前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ループ形成配列（Ｌ２）は、それぞれ、０～３０塩基長である、請求項２または３記載の核酸センサ。
  5. 前記第２鎖（ｓｓ２）において、前記ステム形成配列（ＳＡ）は、０～６０塩基長であり、前記ステム形成配列（ＳＤ）は、０～３０塩基長である、請求項２～４のいずれか一項に記載の核酸センサ。
  6. 前記核酸素子（II）または（II’）は、
    ターゲットの非存在下、
    前記結合核酸分子（Ａ）のループ形成配列（Ｌ１）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、ステムを形成し、
    前記触媒核酸分子（Ｄ）のループ形成配列（Ｌ２）側の末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、ステムを形成し、
    前記ループ形成配列（Ｌ１）と、前記ループ形成配列（Ｌ２）とが、２つの前記ステムの間で内部ループを形成する、請求項１記載の核酸センサ。
  7. 前記核酸素子（II）において、
    ３’側から、前記結合核酸分子（Ａ）、前記ループ形成配列（Ｌ１）、前記ステム形成配列（ＳＤ）、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記ループ形成配列（Ｌ２）および前記ステム形成配列（ＳＡ）が、この順序で連結しており、
    前記結合核酸分子（Ａ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＡ）とが、相補的であり、
    前記触媒核酸分子（Ｄ）の５’末端領域と、前記ステム形成配列（ＳＤ）とが、相補的である、請求項６記載の核酸センサ。
  8. 前記ループ形成配列（Ｌ１）と前記ループ形成配列（Ｌ２）は、それぞれ、０～３０塩基長である、請求項６または７記載の核酸センサ。
  9. 前記ステム形成配列（ＳＡ）は、０～６０塩基長であり、前記ステム形成配列（ＳＤ）は、０～３０塩基長である、請求項６～８のいずれか一項に記載の核酸センサ。
  10. 前記核酸素子（III）は、
    ５’側から、前記触媒核酸分子（Ｄ）、前記介在配列（Ｉ）および前記結合核酸分子（Ａ）が、この順序で連結している、請求項１記載の核酸センサ。
  11. 前記介在配列（Ｉ）は、０～３０塩基長である、請求項１０記載の核酸センサ。
  12. 前記結合核酸分子（Ａ）が、１８～６０塩基長である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸センサ。
  13. 前記結合核酸分子（Ａ）が、下記（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）または（ａ４）のポリヌクレオチドを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の核酸センサ。
    （ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ａ２）前記（ａ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、且つ、ターゲットに結合するポリヌクレオチド
    （ａ３）前記（ａ１）の前記塩基配列との同一性が５０％以上の塩基配列からなり、且つ、ターゲットに結合可能なポリヌクレオチド
    （ａ４）前記（ａ１）の前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的な塩基配列からなり、且つ、ターゲットに結合可能なポリヌクレオチド
  14. 前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能が、酸化還元反応の触媒機能である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸センサ。
  15. 前記触媒核酸分子（Ｄ）が、１５～３０塩基長である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸センサ。
  16. 前記触媒核酸分子（Ｄ）が、下記（ｄ１）、（ｄ２）、（ｄ３）または（ｄ４）のポリヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸センサ。
    （ｄ１）配列番号１１～３１および６６～８５のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｄ２）前記（ｄ１）の前記塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加および／または挿入された塩基配列からなり、且つ、酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
    （ｄ３）前記（ｄ１）の前記塩基配列との同一性が５０％以上の塩基配列からなり、且つ、酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
    （ｄ４）前記（ｄ１）の前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列に相補的な塩基配列からなり、且つ、酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
  17. 前記ターゲットが、ＡＴＰまたはＡＭＰである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の核酸センサ。
  18. 基材、核酸センサおよび検出部を含み、
    前記基材に、前記核酸センサおよび前記検出部が配置され、
    前記核酸センサは、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸センサであり、
    前記検出部は、前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出する検出部であることを特徴とするターゲットの分析用デバイス。
  19. 前記核酸センサが、リンカーを介して、前記基材に連結されている、請求項１８記載の分析用デバイス。
  20. 前記核酸センサが、前記検出部に配置されている、請求項１８または１９記載の分析用デバイス。
  21. 前記検出部は、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能により生成されるシグナルを検出する検出部である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
  22. 前記シグナルが、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルである、請求項２１記載の分析用デバイス。
  23. さらに、試薬部を有し、
    前記試薬部が、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質を含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の分析用デバイス。
  24. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のターゲットの分析用核酸センサに試料を接触させる接触工程、および、
    前記核酸センサにおける前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする、ターゲットの分析方法。
  25. 前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項２４記載の分析方法。
  26. 請求項１８～２３のいずれか一項に記載の分析用デバイスに試料を接触させる接触工程、および、
    前記分析用デバイスの前記検出部において、前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とするターゲットの分析方法。
  27. 前記触媒核酸分子（Ｄ）の触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、請求項２６記載の分析方法。
  28. 前記ターゲットが、ＡＴＰまたはＡＭＰである、請求項２７記載の分析方法。
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