JP6281953B2 - 核酸分子の酸化還元活性を評価する方法および酸化還元活性を有する核酸分子 - Google Patents

核酸分子の酸化還元活性を評価する方法および酸化還元活性を有する核酸分子 Download PDF

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Description

本発明は、核酸分子の酸化還元活性を評価する方法および酸化還元活性を有する核酸分子に関する。
臨床医療、食品、環境等の様々な分野において、ターゲットの検出が必要とされている。前記ターゲットの検出は、一般的に、前記ターゲットとの相互作用が利用されており、中でも、前記ターゲットに特異的に結合する抗体を用いた手法が汎用されている。この方法では、例えば、ペルオキシダーゼ等の酸化還元酵素で標識化した抗体にターゲットを結合させる。そして、発色基質を用いて、前記標識化抗体における前記酵素により発色反応を行い、その発色を検出する。前記発色の検出により、間接的に、前記ターゲットの分析、例えば、定性分析および定量分析が行われている。
しかしながら、前記抗体は、動物への免疫によって取得されるため、毒性のターゲットおよび低分子のターゲットに対して特異的な抗原を取得することが極めて困難である。そこで、近年、ターゲットに結合する核酸、いわゆる核酸アプタマー（以下、アプタマーという）が注目されている。前記アプタマーは、試験管内で取得できることから、例えば、毒性のターゲットおよび低分子のターゲットに対しても、アプタマーを取得可能である。そして、このようなアプタマーを、前記抗体に代えて、ターゲットの検出に使用するにあたって、ペルオキシダーゼと同様の触媒活性を示すＤＮＡｚｙｍｅの併用が試みられている。前記ＤＮＡｚｙｍｅは、一般に、グアニンリッチな構造モチーフを有し、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造をとり、ヘミンと結合して複合体を形成することによって、ペルオキシダーゼの触媒機能を生起するＤＮＡである。
前記ターゲットの検出においては、具体的に、一本鎖のアプタマーと一本鎖のＤＮＡｚｙｍｅとを連結した一本鎖核酸素子が利用されている（非特許文献１）。前記一本鎖核酸素子は、ターゲット非存在下、自己アニーリングによりステム構造を形成しており、前記ステム構造によって、前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘをとることができない構造となっている。このため、ターゲット非存在下、前記一本鎖核酸素子における前記ＤＮＡｚｙｍｅは、ヘミンと結合できず、触媒機能を生起できない。他方、前記一本鎖核酸素子は、ターゲット存在下、前記アプタマーに前記ターゲットが結合することにより、前記ステム構造が解消される。このため、ターゲット存在下、前記一本鎖核酸素子における前記ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘを形成し、ヘミンと結合することによって、前記触媒機能を生起する。したがって、酸化還元活性に対する発色基質を共存させることで、前記ターゲットが存在すれば発色反応が生じ、前記ターゲットが存在しなければ発色反応が生じないこととなる。このため、発色反応の検出によって、ターゲットの分析が可能となる。さらに、ターゲットを標識する必要がないため、低分子を含む幅広いターゲットを対象にした直接検出が可能となる。
このように、前記一本鎖核酸素子は、前記アプタマーの立体構造により、前記ＤＮＡｚｙｍｅの活性を制御する必要がある。このため、例えば、使用するアプタマーの配列に応じて、活性が制御され易いＤＮＡｚｙｍｅを組み合わせることが望ましい。
しかしながら、報告されているＤＮＡｚｙｍｅの数は限られている。このため、所定のアプタマーとの組合せを決定するにも、限られたＤＮＡｚｙｍｅから選択せざるを得ず、ターゲットに応じて、より精度に優れる核酸素子を構築することに限界がある。また、より感度に優れた検出を可能とするために、高い酸化還元活性を示すＤＮＡｚｙｍｅが求められている。
このため、新たなＤＮＡｚｙｍｅの取得が試みられているが、ＤＮＡｚｙｍｅのスクリーニングは、候補となる核酸分子について、一つ一つその活性を確認するしかなく、その操作は極めて煩雑である。
Ｔｅｌｌｅｒら， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．， ２００９年， ｖｏｌ．８１， ｐ．９１１４−９１１９
そこで、本発明は、核酸分子の酸化還元活性を容易に評価可能な新たな技術を提供することを目的とする。
本発明の評価方法は、核酸分子の酸化還元活性を評価する方法であって、酸化還元反応を電気化学的に検出するデバイスを用いて、評価対象の核酸分子により触媒される、基質に対する酸化還元反応を、電気化学的に検出する検出工程と、前記酸化還元反応の検出結果から、前記核酸分子の酸化還元活性を評価する評価工程とを含み、
前記デバイスが、検出部を備える基板を有し、前記検出部が、電極系を有し、前記基板上に、前記評価対象の核酸分子が配置されていることを特徴とする。
本発明の核酸分子は、酸化還元活性を有する核酸分子であって、配列番号１〜１３２からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
本発明の評価方法によれば、評価対象の核酸分子について、容易に酸化還元活性の有無およびその強度を評価できる。また、本発明の評価方法によれば、例えば、同時に複数種類の核酸分子についても、評価できるため、効率良く目的の核酸分子をスクリーニングできる。酸化還元活性を有する核酸分子は、前述のように、例えば、ペルオキシダーゼ等の酵素に代えて使用できるため、臨床医療、食品、環境等の様々な分野で有用である。
図１は、本発明の実施例１における、ｐＨ、電極上のスペーサー長および過酸化水素濃度が異なる条件下における、ＤＮＡｚｙｍｅによる電気シグナルを示すグラフであり、（Ａ）は、ｐＨ７．４の結果、（Ｂ）は、ｐＨ８．０の結果、（Ｃ）は、ｐＨ８．５の結果、（Ｄ）は、ｐＨ９．０の結果である。 図２は、本発明の実施例１における、ＤＮＡｚｙｍｅによる電気シグナルを示すグラフであり、（Ａ）は、同じマイクロアレイによる１回目の電気シグナル測定と２回目の電気シグナル測定との再現性を示すグラフであり、（Ｂ）は、同じスペーサー長のＤＮＡｚｙｍｅ間における再現性を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例１における、各ＤＮＡｚｙｍｅによる電気シグナル値とその頻度との関係を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例２における、ＤＮＡｚｙｍｅによる電気シグナルを示すグラフであり、（Ａ）は、同じマイクロアレイによる１回目の電気シグナル測定と２回目の電気シグナル測定との再現性を示すグラフであり、（Ｂ）は、同じマイクロアレイによる２回目の電気シグナル測定と３回目の電気シグナル測定との再現性を示すグラフであり、（Ｃ）は、同じマイクロアレイによる１回目の電気シグナル測定と３回目の電気シグナル測定との再現性を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例２における、各ＤＮＡｚｙｍｅによる電気シグナル値とその頻度との関係を示すグラフであり、（Ａ）は、ｃ−Ｍｙｃの結果、（Ｂ）は、ＳＡの結果、（Ｃ）は、ＥＡＤ２の結果、（Ｄ）は、ＴＡの結果を示す。 図６は、本発明の実施例３における、各ＤＮＡｚｙｍｅによる電気シグナル値を示すグラフである。
１．評価方法
本発明の評価方法は、前述のように、酸化還元反応を電気化学的に検出するデバイスを用いて、評価対象の核酸分子により触媒される、基質に対する酸化還元反応を、電気化学的に検出する検出工程と、
前記酸化還元反応の検出結果から、前記核酸分子の酸化還元活性を評価する評価工程とを含み、
前記デバイスが、検出部を備える基板を有し、
前記検出部が、電極系を有し、
前記基板上に、前記評価対象の核酸分子が配置されていることを特徴とする。
前記評価対象の核酸分子は、例えば、１種類でもよいが、複数種類であることが好ましい。後者の場合、例えば、前記基板上に、複数種類の核酸分子を配置することで、一つの基板を用いて、前記複数種類の核酸分子を評価できる。
前記評価対象の核酸分子は、例えば、ヌクレオチド残基を含む分子である。前記核酸分子は、例えば、ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。前記核酸分子は、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体のいずれか一種類のみを含んでもよいし、二種類以上を含んでもよいし、全てを含んでもよい。具体的に、前記核酸分子は、例えば、リボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＤＮＡでもよいし、前者と後者とを含むキメラ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）でもよい。前記核酸分子は、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよいが、一本鎖が好ましい。前記核酸分子が一本鎖の場合、前記核酸分子は、例えば、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖キメラ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）等があげられ、前記核酸分子が二本鎖の場合、前記核酸分子は、例えば、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡの二本鎖、二本鎖のキメラ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）等があげられる。前記核酸分子の長さは、特に制限されず、例えば、１１〜８０塩基長である。
前記ヌクレオチドは、塩基として、例えば、天然塩基（非人工塩基）、非天然塩基（人工塩基）を含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、修飾されたヌクレオチドでもよく、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。前記核酸分子は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等を含んでもよい。
本発明において、前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間に電子の授受を生じる反応であればよい。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応を触媒する活性は、例えば、酵素と同様の活性があげられ、具体的には、例えば、ペルオキシダーゼと同様の活性（以下、ペルオキシダーゼ様活性という）等があげられる。前記ペルオキシダーゼ活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性があげられる。前記評価対象の核酸分子がＤＮＡであり、前記酸化還元活性を有する場合、前記ＤＮＡは、例えば、ＤＮＡエンザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅと呼ぶことができ、また、前記核酸分子がＲＮＡであり、前記酸化還元活性を有する場合、前記ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡエンザイムまたはＲＮＡｚｙｍｅと呼ぶことができる。
本発明において、前記デバイスの前記検出部は、前記評価対象の核酸分子が触媒する酸化還元反応によって発生する電気シグナルを検出できればよい。前記検出部は、前述のように、前記電極系を有する。前記電極系は、例えば、作用極と対極とを含んでもよいし、作用極と対極と参照極とを含んでもよい。前記電極の材料は、特に制限されず、例えば、白金、銀、金、カーボン等があげられる。前記作用極および前記対極は、例えば、白金電極、銀電極、金電極、カーボン電極等があげられ、前記参照極は、例えば、銀／塩化銀の電極等があげられる。前記銀／塩化銀の電極は、例えば、銀電極への塩化銀電極の積層により形成できる。
前記検出部は、例えば、前記基板の表面に、前記電極を配置することによって形成できる。前記電極の配置方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法が採用でき、具体例は、蒸着法、スパッタリング法、スクリーン印刷法、メッキ法等の薄膜形成方法があげられる。前記電極は、例えば、前記基板に、直接配置してもよいし、間接的に配置してもよい。間接的な配置は、例えば、他の部材を介した配置があげられる。
前記基板は、特に制限されず、例えば、表面が絶縁性の基板が好ましい。前記基板は、例えば、絶縁材料を含む基板または前記絶縁材料からなる基板でもよいし、表面に絶縁材料を含む絶縁層または前記絶縁材料からなる絶縁層を有する基板でもよい。前記絶縁材料は、特に制限されず、例えば、ガラス、セラミック、絶縁性プラスチック、紙等の公知の材料があげられる。前記絶縁性プラスチックは、特に制限されず、例えば、シリコーン樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂、フッ素樹脂等があげられる。
前記評価対象の核酸分子は、前述のように、１種類でもよいが、複数種類が好ましく、具体的には、前記複数種類の核酸分子を、前記基板上に配置することが好ましい。前記デバイスは、例えば、前記基板上に、前記複数の核酸分子が配置されたマイクロアレイが好ましい。前記複数種類の核酸分子は、例えば、前記基板上に、マトリクス状に配置することが好ましい。また、前記核酸分子による酸化還元反応を、その種類ごとに検出できるように、前記デバイスは、例えば、複数の検出部を有し、各検出部に、異なる種類の前記核酸分子が、それぞれ配置されていることが好ましい。具体的に、前記デバイスは、例えば、前記基板の表面をマトリクスに分画し、各分画領域に、前述のような電極系を形成して検出部とし、各検出部に前記核酸分子を配置することで形成できる。また、市販の電気化学検出系マイクロアレイを用い、前記アレイ上のプローブに、前記評価対象の核酸分子を結合させることで、前記評価用のデバイスとして使用することもできる。前記市販のマイクロアレイは、例えば、商品名ＣｏｍｂｉＭａｔｒｉｘ ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＣｏｍｂｉＭａｔｒｉｘ社）等があげられる。
前記評価対象の核酸分子は、前述のように、前記基板上に配置すればよく、前記基板に固定化することが好ましい。前記核酸分子は、例えば、前記基板の上に、直接的に配置してもよいし、間接的に配置してもよい。具体的に、前記核酸分子は、例えば、前記基板における前記検出部の上に配置することが好ましく、前記検出部における前記電極の上に配置することがより好ましく、前記電極の中でも前記作用極の上に配置することが好ましい。前記核酸分子は、例えば、前記検出部または前記電極に、直接的に配置してもよいし、間接的に配置してもよい。以下、「前記核酸分子の前記基板への配置または固定化」は、特に示さない限り、前記基板における前記検出部または前記検出部における前記電極への配置もしくは固定化の意味も含む。
前記核酸分子の配置方法は、特に制限されず、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記固定化方法は、例えば、予め準備した核酸分子を、前記基板上に、好ましくは前記検出部上に、より好ましくは前記電極上に、固定化する方法があげられる。この方法は、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法であり、具体例として、米国特許５，４２４，１８６号明細書等を参照できる。また、前記固定化方法は、例えば、前記基板上で、好ましくは前記検出部上で、より好ましくは前記電極上で、核酸を合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許５，８０７，５２２号明細書、特表平１０−５０３８４１号公報等を参照できる。
前記核酸分子は、例えば、５’末端側または３’末端側のいずれかにおいて、前記基板上に固定化されてもよい。
前記核酸分子は、例えば、リンカーを介して、前記基板上に配置されていることが好ましい。前記リンカーは、例えば、ヌクレオチド残基を含むことが好ましい。前記リンカーは、例えば、ヌクレオチド残基のみからなってもよいし、ヌクレオチド残基を含んでもよい。前記ヌクレオチドは、前述の通りである。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜６０塩基長であり、好ましくは６〜６０塩基長であり、より好ましくは２０〜３０塩基長である。リンカーは、例えば、スペーサーともいう。
前記デバイスにおいて、前記評価対象の核酸分子は、例えば、アプタマーが連結している状態でもよい。以下、前記評価対象の核酸分子と前記アプタマーとが連結したものを、核酸素子という。前記アプタマーは、特に制限されず、例えば、特定のターゲットに結合可能なアプタマーである。前記アプタマーは、例えば、構成成分としてヌクレオチド残基を含む核酸分子であることが好ましい。前記ヌクレオチドは、特に制限されず、前述の通りである。前記ターゲットに結合可能なアプタマーは、例えば、公知のＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法等により、製造できる。前記アプタマーは、例えば、一本鎖でも二本鎖でもよく、一本鎖が好ましい。
前記核酸分子と前記アプタマーとは、例えば、直接結合してもよいし、間接的に結合してもよい。後者の場合、前記両者は、例えば、リンカーを介して結合してもよい。前記核酸分子と前記アプタマーとは、例えば、一方の５’末端と他方の３’末端とが連結してもよいし、両方の５’末端同士または３’末端同士が連結してもよい。
前記核酸分子に前記アプタマーが連結している場合、例えば、前記核酸分子は、一方の末端が、前記基板に結合し、他方の末端が、前記アプタマーに結合していることが好ましい。前述のように、前記基板と前記核酸分子との間、前記核酸分子と前記アプタマーとの間は、例えば、それぞれ、リンカーを介して結合してもよい。前記核酸分子と前記アプタマーとは、例えば、一本鎖の核酸分子と一本鎖のアプタマーとが連結していることが好ましい。前記両者が連結した前記核酸素子は、例えば、自己アニーリングによりステム構造および／またはループ構造を形成してもよい。
本発明の評価方法について、第１実施形態として、前記評価対象の核酸分子が配置されたデバイスを用いた方法を例示し、第２実施形態として、前記アプタマーが結合している前記評価対象の核酸分子が配置されたデバイス、すなわち、前記核酸素子が配置されたデバイスを用いた方法を例示する。本発明は、これらの実施形態には制限されない。
（第１実施形態）
本発明の第１実施形態においては、前述のように、前記基板上に、前記評価対象の核酸分子を配置したデバイスを使用する。
まず、前記検出工程において、例えば、前記基質の存在下、前記核酸分子により触媒される酸化還元反応を、電気化学的に検出する。前記核酸分子が前記酸化還元活性を有する場合、前記核酸分子により、例えば、前記基質から生成物が生成され、その過程において、電子の授受が生じる。この電子授受は、例えば、電極への印加により、電気シグナルとして、前記デバイスの前記検出部において、電気化学的に検出できる。前記電気シグナルの検出は、例えば、電流等のような、前記電気シグナルの強度を測定することにより行える。
前記基質は、例えば、前記検出工程において、前記デバイスにおける前記核酸分子に、外部から供給できる。
前記基質は、特に制限されず、例えば、過酸化水素、３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、１，２−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）、２，２’−Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ （ＤＡＢ）、３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｈｙｄｒａｔｅ（ＤＡＢ４ＨＣｌ）、３−Ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＡＥＣ）、４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ（４Ｃ１Ｎ）、２，４，６−Ｔｒｉｂｒｏｍｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ、２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ルミノール等があげられる。
前記検出工程において、前記基質の他に、例えば、ポルフィリンを共存させてもよい。公知のＤＮＡｚｙｍｅには、例えば、ポルフィリンと複合体を形成することによって、さらに高い酸化還元活性を示すものがある。そこで、本発明においても、例えば、ポルフィリンを共存させて、ポルフィリンとの複合体としての酸化還元活性を検出してもよい。
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。
前記検出工程において、前記酸化還元反応を行う条件は、特に制限されない。ｐＨは、例えば、７．４〜９．０であり、好ましくは７．４〜８．５であり、より好ましく７．４である。前記ｐＨは、例えば、緩衝液により制御することが好ましく、例えば、前述のｐＨを示す、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液が使用できる。前記基質は、例えば、緩衝液に混合し、基質溶液として前記核酸分子に添加することが好ましい。前記基質溶液における前記基質の濃度は、特に制限されず、例えば、１０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは２０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは４０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌである。
つぎに、前記検出工程における検出結果に基づいて、前記評価工程において、前記核酸分子の酸化還元活性を評価する。前記評価工程は、例えば、酸化還元活性の有無を評価してもよいし、前記酸化還元活性の強さを評価してもよい。後者の場合、例えば、任意の核酸分子の酸化還元活性を基準として、相対的な活性の強さを評価でき、前記任意の核酸分子は、例えば、酸化還元活性を示すものが好ましい。
（第２実施形態）
本発明の第２実施形態においては、前述のように、前記基板上に、前記アプタマーが結合された前記評価対象の核酸分子を配置したデバイスを使用する。特に示さない限りは、前記第１実施形態と同様である。
まず、前記検出工程において、例えば、前記基質および前記ターゲットの存在下、前記核酸分子により触媒される酸化還元反応を、電気化学的に検出する。前記検出工程は、前記基質の存在下且つ前記ターゲットの非存在下で、前記酸化還元反応を検出する工程と、前記基質および前記ターゲットの存在下で、前記酸化還元反応を検出する工程とを含むことが、特に好ましい。前記ターゲット非存在下での検出と、前記ターゲット存在下での検出は、いずれを先に行ってもよい。例えば、前記アプタマーに結合したターゲットを、脱離する必要がないことから、前記ターゲット非存在下での検出を先に行うことが好ましい。
前記ターゲット非存在下での検出と前記ターゲット存在下での検出とを行うのは、以下の理由による。ターゲットの検出において、前記ターゲットに結合可能なアプタマーおよび酸化還元活性を有する核酸分子を使用する場合、前記酸化還元活性を有する核酸分子は、例えば、ターゲットが存在する場合にのみ活性を示し、ターゲットが存在しない場合には活性を示さないことが望まれる。ターゲット非存在下で活性を示すと、ターゲット検出において、擬陽性の結果が得られるためである。したがって、前記ターゲット非存在下における酸化還元活性の有無と、前記ターゲット存在下における酸化還元活性の有無は、前記アプタマーを用いたターゲット検出において、電気化学的な手法を確立するために重要である。
なお、前記核酸分子が、前記ターゲット非存在下で活性を示さず、前記ターゲット存在下で活性を示す場合、前記核酸分子と前記アプタマーとの間で、例えば、以下のような構造上の関係が成立していると考えられる。アプタマーは、通常、ターゲットを認識して結合することにより、その立体構造が変化する。このため、ターゲット非存在下でのアプタマーの立体構造により、これと結合している前記核酸分子が、活性がスイッチＯＦＦされた構造をとり、他方、ターゲットへの結合で変化した前記アプタマーの立体構造により、前記核酸分子の活性の抑制が解除されれば、ターゲットが存在する場合のみ、前記核酸分子の活性がスイッチＯＮされることとなる。
前記基質および前記ターゲットは、例えば、前記検出工程において、前記デバイスにおける前記核酸分子に、外部から供給できる。前記基質と前記ターゲットとの添加順序は、特に制限されず、例えば、一方を添加した後に他方を添加してもよいし、両方を同時に添加してもよい。また、前記第１実施形態と同様に、前記ポルフィリンを共存させてもよい。
前記基質は、特に制限されず、前述と同様である。前記ターゲットと前記アプタマーとは、特に制限されず、所望のターゲットとそれに結合可能なアプタマーとが使用できる。
つぎに、前記評価工程において、前記検出工程における検出結果に基づいて、前記核酸分子の酸化還元活性を評価する。前記評価工程においては、例えば、酸化還元活性の有無を評価してもよいし、前記酸化還元活性の強さを評価してもよい。後者の場合、例えば、任意の核酸分子の酸化還元活性を基準として、相対的な活性の強さを評価でき、前記任意の核酸分子は、例えば、酸化還元活性を示すものが好ましい。
前記評価工程は、例えば、前記ターゲット非存在下で前記酸化還元活性を示さない核酸分子について、前記ターゲット存在下における前記酸化還元活性を評価することが好ましい。前記評価工程においては、例えば、酸化還元活性の有無を評価してもよいし、前記酸化還元活性の強さを評価してもよい。後者の場合、例えば、酸化還元活性を示す任意の核酸分子の酸化還元活性を基準として、相対的な活性の強さを評価できる。
２．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、前述のように、前記本発明の評価方法により、デバイスを用いて評価対象の核酸分子の酸化還元活性を評価し、酸化還元活性を有する核酸分子をスクリーニングすることを特徴とする、酸化還元活性を有する核酸分子のスクリーニング方法である。
本発明のスクリーニング方法は、前記本発明の評価方法により、前記評価対象の核酸分子の酸化還元活性を評価することが特徴であり、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明においては、前記酸化還元活性の評価結果に基づいて、例えば、酸化還元活性を示す核酸分子を選択でき、さらに、相対的に強い酸化還元活性を示す核酸分子を、目的の核酸分子として選択できる。また、前述のように、例えば、前記ターゲット非存在下で活性を示さず、前記ターゲットの存在下で活性を示す核酸分子を、目的の核酸分子として選択することもできる。
３．酸化還元活性を有する核酸分子
本発明の酸化還元活性を有する核酸分子は、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１〜１３２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、酸化還元活性を有するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、酸化還元活性を有するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、酸化還元活性を有するポリヌクレオチド
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。本発明の核酸分子は、ＤＮＡｚｙｍｅともいう。
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前記配列番号１〜１３２のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、酸化還元活性を有する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜５個、好ましくは、１〜３個、より好ましくは１個または２個である。
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、酸化還元活性を有する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜３個、好ましくは１または２個である。
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドでもよい。本発明の核酸分子が二本鎖ポリヌクレオチドの場合、例えば、前記二本鎖ポリヌクレオチドのうち、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記いずれかのポリヌクレオチドであり、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述したいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖ポリヌクレオチドの場合、例えば、使用に先立って、変性等により、前記二本鎖ポリヌクレオチドを、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成してもよい。
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」は、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」は、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
本発明の核酸分子は、酸化還元活性を有することから、例えば、酸化還元酵素の代替品として使用でき、また、前述のようなアプタマーによるターゲットの検出にも応用できる。
（実施例１）
Ａ．条件検討
評価対象の核酸分子の酸化還元反応を検出するにあたって、その条件を検討した。
（１）ポリヌクレオチドの固定化
以下に示すように、市販の電気化学検出型マイクロアレイ（商品名ＣｏｍｂｉＭａｔｒｉｘ ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、ＣｏｍｂｉＭａｔｒｉｘ社製）における電極上に、スペーサーを介して、既知のポリヌクレオチドを固定化した。
前記既知のポリヌクレオチドは、ＤＮＡｚｙｍｅとして、ＥＡＤ２（配列番号１３３）（Ｃｈｅｎｇ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４８， ７８１７−７８２３．参照）を使用した。また、ネガティブコントロールとして、ストレプトアビジンに結合するＤＮＡアプタマーＳＡ（配列番号１３４）を使用した。
ＥＡＤ２（配列番号１３３）
CTGGGAGGGAGGGAGGGA
ＳＡ（配列番号１３４）
CCGACGCACCGATCGCAGGTTCGG
前記スペーサーの長さは、０塩基長（スペーサーなし）、８塩基長、１６塩基長、２４塩基長とした。前記スペーサーの配列は、ポリｄＴとした。
前記固定化は、１個の前記マイクロアレイの電極に、前記スペーサーの３’末端を結合させ、前記スペーサーの５’末端に、前記既知ポリヌクレオチドの３’末端を結合させることで行った。なお、前記スペーサーの長さが異なる４種類のＥＡＤ２（ｄＴ０、ｄＴ８、ｄＴ１６、ｄＴ２４）および前記スペーサーの長さが異なる４種類のＳＡ（ｄＴ０、ｄＴ８、ｄＴ１６、ｄＴ２４）は、それぞれ２５０個ずつ、ランダムに前記マイクロアレイに固定化した。
（２）酸化還元反応の検出
前記マイクロアレイに、基質として過酸化水素を添加し、酸化還元反応により生じる電気シグナルを電流として測定した。測定は、測定装置（製品名ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ Ｒｅａｄｅｒ、ＣｏｍｂｉＭａｔｒｉｘ社）を使用した（以下、同様）。前記過酸化水素は、所定濃度（０、１、２、４、８ｍｍｏｌ／Ｌ）となるように各種緩衝液に添加し、基質溶液として添加した。前記緩衝液は、トリス緩衝液（ｐＨ７．４）、トリス緩衝液（ｐＨ８．０）、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）、トリス緩衝液（ｐＨ９．０）を使用し、それぞれ、過酸化水素添加後のｐＨが、かっこ内の値となるように調整した。
これらの結果を図１に示す。図１は、各条件における電気シグナルを示すグラフである。図１において、（Ａ）は、ｐＨ７．４の結果、（Ｂ）は、ｐＨ８．０の結果、（Ｃ）は、ｐＨ８．５の結果、（Ｄ）は、ｐＨ９．０の結果であり、それぞれ、過酸化水素濃度およびスペーサーの長さの条件ごとの結果を示す。また、各図において、縦軸の値は、ＥＡＤ２の電気シグナル（Ｓ）とネガティブコントロールの電気シグナル（バックグラウンド：ＢＧ）とのシグナル比（Ｓ／ＢＧ）を示す。図１（Ａ）に示すように、ｐＨ７．４、過酸化水素濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ、スペーサー長さ２４塩基長の条件において、最も高い値が得られた。
Ｂ．再現性
前記「Ａ．条件検討」と同じ条件で、前記スペーサーの長さが異なる４種類のＥＡＤ２（ｄＴ０、ｄＴ８、ｄＴ１６、ｄＴ２４）各２５０個について、酸化還元反応の測定を行った。
この結果を、図２に示す。図２（Ａ）は、各ＥＡＤ２および各ＳＡについて、１回目の測定値と２回目の測定値とをプロットしたグラフである。測定値は、前記測定装置から得られる、電流に相当するシグナル測定値である（以下、同様）。横軸は、１回目のシグナル測定値であり、縦軸は、２回目のシグナル測定値を示す。図２（Ｂ）は、各ＥＡＤ２のスペーサー長ごとのシグナル値の対数を示すグラフである。図２（Ａ）のグラフについて、ピアソンの積率相関係数の無相関検定の結果をあわせて示す。図２（Ａ）の相関係数は、Ｒ＝０．９９８１７５６であった。図２（Ｂ）において、各スペーサー長の標準偏差は、ｄＴ０が０．０９９５４０２１、ｄＴ８が０．０９４３５９１１、ｄＴ１６が０．０８５２８７５４、ｄＴ２４が０．１０２７８１７であった。図２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、４種類のＥＡＤ２を、それぞれ２５０個測定した結果、それぞれ、非常に高い再現性を示した。
Ｃ．正規性
前記「Ａ．条件検討」における、前記スペーサーの長さが異なる４種類のＥＡＤ２（ｄＴ０、ｄＴ８、ｄＴ１６、ｄＴ２４）各２５０個の測定結果、および、前記スペーサーの長さが異なる４種類のＳＡ（ｄＴ０、ｄＴ８、ｄＴ１６、ｄＴ２４）各２５０個の測定結果について、正規分布に従っているか否かを確認した。また、Ｋｏｌｍｏｆｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定によりＰ値を求めた。
これらの結果を図３に示す。図３は、各ＥＡＤ２および各ＳＡについて、シグナル値とその頻度との関係を示すグラフである。図３に示すように、各ＥＡＤ２および各ＳＡの２５０個のシグナルの分布は、正規分布に従っていることが確認できた。
（実施例２）
異なる配列からなる複数のポリヌクレオチドをマイクロアレイチップに固定化し、酸化還元反応の測定を行った。
Ａ．再現性
以下に示すように、市販のマイクロアレイチップ（商品名ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ（登録商標）１２Ｋ、ＣｏｍｂｉＭａｔｒｉｘ社製）における電極上に、２４塩基長のポリｄＴからなるスペーサーを介して、複数のポリヌクレオチドを固定化した。
前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡｚｙｍｅとして、ＥＡＤ２（配列番号１３３）、アプタマーＳＡ（配列番号１３４）、転写因子ｃ−Ｍｙｃ遺伝子のプロモータ領域の部分配列であるｃ−Ｍｙｃ（配列番号１３５）およびトロンビンに対するアプタマーであるＴＡ（配列番号１３６）を使用した。
ＥＡＤ２（配列番号１３３）
CTGGGAGGGAGGGAGGGA
ＳＡ（配列番号１３４）
CCGACGCACCGATCGCAGGTTCGG
ｃ−Ｍｙｃ（配列番号１３５）
TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA
ＴＡ（配列番号１３６）
GGTTGGTGTGGTTGG
さらに、前記ＥＡＤ２（配列番号１３３）、ｃ−Ｍｙｃ（配列番号１３５）およびＴＡ（配列番号１３６）の配列を改変した改変ポリヌクレオチドも、同様に使用した。ＥＡＤ２を改変した改変ＥＡＤ２は、６４種類、ｃ−Ｍｙｃを改変した改変ｃ−Ｍｙｃは、１０２４種類、ＴＡを改変した改変ＴＡは、１２３２種類準備した。
前記固定化は、１個の前記マイクロアレイの電極に、前記スペーサーの３’末端を結合させ、前記スペーサーの５’末端に、前記既知ポリヌクレオチドまたは前記改変ポリヌクレオチドの３’末端を結合させることで行った。なお、酸化還元活性のコントロールとなるＥＡＤ２、ｃ−ＭｙｃおよびＴＡは、それぞれ１００個ずつ、改変ポリヌクレオチドは、それぞれ５個ずつ、ランダムに前記マイクロアレイチップに固定化した。
そして、この同じマイクロアレイチップを用いて、３回、同条件で酸化還元反応の測定を行った。具体的には、２ｍｍｏｌ／Ｌの過酸化水素を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）を添加し、酸化還元反応により生じる電気シグナルを電流として測定した。
この結果を、図４に示す。図４において、（Ａ）は、１回目の測定値と２回目の測定値とをプロットしたグラフであり、（Ｂ）は、２回目の測定値と３回目の測定値とをプロットしたグラフであり、（Ｃ）は、１回目の測定値と３回目の測定値とをプロットしたグラフである。また、各グラフについて、ピアソンの積率相関係数の無相関検定の結果をあわせて示す。図４に示すように、同一アレイ内において、非常に高い再現性を示した。
Ｂ．正規性
前記「Ａ．再現性」において得られた測定結果に基づいて、図５（Ａ）〜（Ｄ）のグラフに、（Ａ）ｃ−Ｍｙｃ １００個のシグナル値とその頻度との関係、（Ｂ）ＳＡ １００個のシグナル値とその頻度との関係、（Ｃ）ＥＡＤ２ １００個のシグナル値とその頻度との関係、（Ｄ）ＴＡ １００個のシグナル値とその頻度との関係を示した。いずれにおいても、シグナルの分布は、正規分布に従っていることが確認できた。
（実施例３）
前記実施例２のマイクロアレイチップを用いて、高い酸化還元活性を有する新たなＤＮＡｚｙｍｅをスクリーニングした。
前記実施例２における３回の測定結果から、ＥＡＤ２よりも高活性を示す改変ポリヌクレオチドが確認された。この結果を、図６に示す。図６は、酸化還元活性のコントロールとなるＳＡ、ＥＡＤ２、ｃ−ＭｙｃおよびＴＡ、ならびに、酸化還元活性を示した１５種類の改変ポリヌクレオチドのシグナル値を示すグラフである。図６に示すように、これらの改変ポリヌクレオチドは、ＥＡＤ２よりも高い酸化還元活性を示した。なお、これらの１５種類の改変ポリヌクレオチドのシグナル値は、Ｔ検定により、ＥＡＤ２に対した有意であることを確認済みである。これらの１５種類の改変ポリヌクレオチドの配列を以下に示す。
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
この出願は、２０１１年７月４日に出願された日本出願特願２０１１−１４８５６２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
本発明によれば、評価対象の核酸分子について、容易に酸化還元活性の有無およびその強度を評価できる。また、このような本発明の評価方法によれば、例えば、同時に複数の核酸分子についても、評価を行うことができ、効率良く目的の核酸分子のスクリーニングを行うことができる。酸化還元活性を有する核酸分子は、前述のように、例えば、ペルオキシダーゼ等の酵素に代えて使用できるため、臨床医療、食品、環境等の様々な分野で有用である。

Claims (2)

  1. 配列番号２、７、８、１０、１１、１３−１５、１７、２０−２３、２５、２７−２９、３１、３３、３４、３８−４０、４２−４６、４８−５３、５５、５６、５８、６１、６２、６５、６９、７１、７４、７６、７９、８２−８５、８８−９３、９９、１０２−１０９、１１８、１２６、１２７、および１３２からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする酸化還元活性を有するＤＮＡｚｙｍｅ。
  2. 配列番号１５、２２、３３、３５、３９、５０、５５、６５、７６、８３、９０、９７、１０５および１０８からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする酸化還元活性を有する核酸分子。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2657702A4 (en) * 2010-12-24 2014-12-03 Nec Solution Innovators Ltd ANALYSIS DEVICE AND ANALYSIS PROCEDURE
JP5959026B2 (ja) * 2012-07-27 2016-08-02 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 メラミンの分析用核酸センサ、分析用デバイスおよび分析方法
WO2014136560A1 (ja) * 2013-03-08 2014-09-12 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 核酸素子候補分子、および、これを用いたターゲット分析用核酸素子のスクリーニング方法
JP6338191B2 (ja) * 2013-07-01 2018-06-06 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 属性推定システム
WO2015012060A1 (ja) * 2013-07-23 2015-01-29 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ターゲット分析用センサ、ターゲット分析用デバイス、および、これを用いたターゲットの分析方法
WO2015151350A1 (ja) * 2014-03-31 2015-10-08 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 卵アレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
WO2017188426A1 (ja) * 2016-04-28 2017-11-02 国立大学法人東京農工大学 ペルオキシダーゼ活性増大アプタマー
JP7012299B2 (ja) * 2016-04-28 2022-01-28 国立大学法人東京農工大学 ペルオキシダーゼ活性増大アプタマー

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US6287765B1 (en) * 1998-05-20 2001-09-11 Molecular Machines, Inc. Methods for detecting and identifying single molecules
US20040106190A1 (en) * 2002-12-03 2004-06-03 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Flow-through assay devices
CN1553188A (zh) * 2003-06-06 2004-12-08 克 宋 微阵列信号放大方法
WO2005042785A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-12 North Carolina State University Electrochemical detection of nucleic acid hybridization
KR20070044813A (ko) 2004-04-26 2007-04-30 아케믹스 코포레이션 이뮤노글로불린 ｅ에 대한 핵산 리간드 및 아토피성 질환치료제로서의 이의 용도
CN100575954C (zh) 2005-06-23 2009-12-30 中国科学院生态环境研究中心 一种光电化学检测核酸的方法
WO2007047986A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and system for delivering nucleic acid into a target cell
US8569468B2 (en) 2006-09-14 2013-10-29 The Regents Of The University Of California Nanoplasmonic molecular ruler for nuclease activity and DNA footprinting
CN104651381A (zh) 2008-01-03 2015-05-27 巴斯夫酶有限责任公司 转移酶和氧化还原酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法
JP2010011791A (ja) 2008-07-03 2010-01-21 Toshiba Corp 複数核酸の検出方法
WO2010142037A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 The University Of Western Ontario An electrochemical method and apparatus of identifying the presence of a target

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