CN103649741A - 评价核酸分子的氧化还原活性的方法和具有氧化还原活性的核酸分子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够容易地评价核酸分子的氧化还原活性的新技术。本发明的评价方法的特征在于,包括:检测步骤,使用以电化学方式检测氧化还原反应的装置,电化学地检测由作为评价对象的核酸分子催化的对底物的氧化还原反应;和评价步骤,由所述氧化还原反应的检测结果评价所述核酸分子的氧化还原活性。作为所述装置,使用具有具备检测部的基板、所述检测部具有电极系统、所述基板上配置有所述作为评价对象的核酸分子的装置。本发明中,优选在所述基板上配置成为所述评价对象的多种核酸分子,利用一个装置对多种核酸分子进行评价。
Description
技术领域
本发明涉及评价核酸分子的氧化还原活性的方法和具有氧化还原活性的核酸分子。
背景技术
在临床医疗、食品、环境等各种领域中,需要进行靶物质的检测。上述靶物质的检测一般利用与上述靶物质的相互作用,其中,使用与上述靶物质特异性结合的抗体的方法得到广泛应用。该方法中,例如,使靶物质与用过氧化物酶等氧化还原酶标记化的抗体结合。然后,使用显色底物,利用上述标记化抗体中的上述酶进行显色反应,并对其显色进行检测。通过上述显色的检测,间接地进行上述靶物质的分析、例如定性分析和定量分析。
但是,上述抗体是通过对动物进行免疫而获得的,因此,针对毒性靶物质和低分子靶物质获得特异性抗原是极其困难的。因此,近年来,与靶物质结合的核酸、即所谓的核酸适体(以下称为适体)受到关注。上述适体能够在试管内获得,因此,对于例如毒性靶物质和低分子靶物质也能够获得适体。而且,尝试了在将这样的适体代替上述抗体用于靶物质的检测时并用显示出与过氧化物酶同样的催化活性的脱氧核酶(DNAzyme)。一般来说,上述脱氧核酶为具有富含鸟嘌呤的结构基序、呈G-四链体结构、通过与氯高铁血红素结合形成复合体而发挥过氧化物酶的催化功能的DNA。
上述靶物质的检测中,具体而言,利用将单链适体与单链脱氧核酶连接而成的单链核酸元件(非专利文献1)。在不存在靶物质的情况下, 上述单链核酸元件通过自退火形成茎结构,由于上述茎结构而使上述脱氧核酶成为不能呈G-四链体的结构。因此,在不存在靶物质的条件下,上述单链核酸元件中的上述脱氧核酶不能与氯高铁血红素结合,不能发挥催化功能。另一方面,在靶物质存在下,上述靶物质与上述适体结合,由此使上述单链核酸元件消除了上述茎结构。因此,在靶物质存在下,上述单链核酸元件中的上述脱氧核酶形成G-四链体,与氯高铁血红素结合,由此发挥上述催化功能。因此,通过使针对氧化还原活性的显色底物共存,在存在上述靶物质时发生显色反应,在不存在上述靶物质时不发生显色反应。因此,通过显色反应的检测,能够进行靶物质的分析。而且,不需要对靶物质进行标记,因此,能够以包含低分子在内的广泛靶物质作为对象直接进行检测。
如此,上述单链核酸元件需要通过上述适体的立体结构来控制上述脱氧核酶的活性。因此,例如,期望根据所使用的适体的序列来组合活性容易控制的脱氧核酶。
但是,被报道的脱氧核酶的数量有限。因此,确定与规定的适体的组合时,不得不从有限的脱氧核酶中选择,根据靶物质来构建精度更优的核酸元件受到限制。另外,为了能够进行灵敏度更优的检测,需要显示高氧化还原活性的脱氧核酶。
因此,尝试了获得新的脱氧核酶,但脱氧核酶的筛选中,只能针对候选核酸分子一个一个地确认其活性,其操作极其繁琐。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Teller等,Anal.Chem.,2009年,vol.81,p.9114-9119
发明内容
发明所要解决的问题
因此,本发明目的在于提供能够容易地评价核酸分子的氧化还原活性的新技术。
用于解决问题的方法
本发明的评价方法为评价核酸分子的氧化还原活性的方法,其特征在于,包括:检测步骤,使用以电化学方式检测氧化还原反应的装置,电化学地检测由作为评价对象的核酸分子催化的对底物的氧化还原反应、和评价步骤,由上述氧化还原反应的检测结果评价上述核酸分子的氧化还原活性,并且,上述装置具有具备检测部的基板,上述检测部具有电极系统,上述基板上配置有上述作为评价对象的核酸分子。
本发明的核酸分子为具有氧化还原活性的核酸分子,其特征在于,含有选自由序列号1~132组成的组中的至少一个多核苷酸。
发明效果
根据本发明的评价方法,能够针对作为评价对象的核酸分子容易地评价氧化还原活性的有无及其强度。另外,根据本发明的评价方法,例如,还能够同时对多种核酸分子进行评价,因此能够高效地筛选目的核酸分子。如上所述,具有氧化还原活性的核酸分子例如能够代替过氧化物酶等酶来使用,因此,在临床医疗、食品、环境等各种领域中有用。
附图说明
图1是表示本发明的实施例1中在pH、电极上的间隔区长度和过氧化氢浓度不同的条件下由脱氧核酶产生的电信号的图,(A)为pH7.4的结果,(B)为pH8.0的结果,(C)为pH8.5的结果,(D)为pH9.0的结果。
图2是表示本发明的实施例1中的由脱氧核酶产生的电信号的图,(A)是表示相同的微阵列的第一次电信号测定与第二次电信号测定的重 复性的图,(B)是表示相同的间隔区长度的脱氧核酶间的重复性的图。
图3是表示本发明的实施例1中的由各脱氧核酶产生的电信号值与其频率的关系的图。
图4是表示本发明的实施例2中的由脱氧核酶产生的电信号的图,(A)是表示相同的微阵列的第一次电信号测定与第二次电信号测定的重复性的图,(B)是表示相同的微阵列的第二次电信号测定与第三次电信号测定的重复性的图,(C)是表示相同的微阵列的第一次电信号测定与第三次电信号测定的重复性的图。
图5是表示本发明的实施例2中的由各脱氧核酶产生的电信号值与其频率的关系的图,(A)表示c-Myc的结果,(B)表示SA的结果,(C)表示EAD2的结果,(D)表示TA的结果。
图6是表示本发明的实施例3中的由各脱氧核酶产生的电信号值的图。
具体实施方式
1.评价方法
如上所述,本发明的评价方法的特征在于,包括:检测步骤,使用以电化学方式检测氧化还原反应的装置,电化学地检测由作为评价对象的核酸分子催化的对底物的氧化还原反应、和
评价步骤,由上述氧化还原反应的检测结果评价上述核酸分子的氧化还原活性,
上述装置具有具备检测部的基板,
上述检测部具有电极系统,
上述基板上配置有上述作为评价对象的核酸分子。
上述作为评价对象的核酸分子例如可以为一种,优选为多种。后者的情况下,例如,通过在上述基板上配置多种核酸分子,能够使用一个基板对上述多种核酸分子进行评价。
上述作为评价对象的核酸分子例如为含有核苷酸残基的分子。上 述核酸分子例如可以为仅由核苷酸残基构成的分子,也可以为含有核苷酸残基的分子。上述核苷酸例如为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和它们的衍生物。上述核酸分子例如可以仅含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和它们的衍生物中的任意一种,也可以含有二种以上,也可以全部含有。具体而言,上述核酸分子例如可以为含有核糖核苷酸和/或其衍生物的RNA,也可以为含有脱氧核糖核苷酸和/或其衍生物的DNA,也可以为含有前者和后者的嵌合体(DNA/RNA)。上述核酸分子可以为单链,也可以为双链,优选单链。在上述核酸分子为单链的情况下,上述核酸分子可以列举例如:单链DNA、单链RNA、单链嵌合体(DNA/RNA)等,在上述核酸分子为双链的情况下,上述核酸分子可以列举例如:双链DNA、双链RNA、DNA-RNA的双链、双链的嵌合体(DNA/RNA)等。上述核酸分子的长度没有特别限制,例如为11~80个碱基长。
对于上述核苷酸而言,作为碱基,可以含有例如天然碱基(非人工碱基)、非天然碱基(人工碱基)。上述天然碱基可以列举例如:A、C、G、T、U和它们的修饰碱基。上述修饰可以列举例如:甲基化、氟化、氨基化、硫化等。上述非天然碱基可以列举例如:2’-氟嘧啶、2’-O-甲基嘧啶等,作为具体例,可以列举:2’-氟尿嘧啶、2’-氨基尿嘧啶、2’-O-甲基尿嘧啶、2-硫尿嘧啶等。上述核苷酸例如可以为修饰后的核苷酸,上述修饰核苷酸可以列举例如:2’-甲基化-尿嘧啶核苷酸残基、2’-甲基化-胞嘧啶核苷酸残基、2’-氟化-尿嘧啶核苷酸残基、2’-氟化-胞嘧啶核苷酸残基、2’-氨基化-尿嘧啶核苷酸残基、2’-氨基化-胞嘧啶核苷酸残基、2’-硫化-尿嘧啶核苷酸残基、2’-硫化-胞嘧啶核苷酸残基等。上述核酸分子可以包含例如PNA(肽核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid,锁核苷酸)等。
本发明中,上述氧化还原反应只要是例如在从底物生成产物的过程中、在两种底物之间发生电子的授受的反应即可。上述氧化还原反应的种类没有特别限制。催化上述氧化还原反应的活性可以列举例如 与酶同样的活性,具体而言,可以列举例如与过氧化物酶同样的活性(以下称为过氧化物酶样活性)等。上述过氧化物酶活性可以列举例如来源于辣根的过氧化物酶(HRP)活性。在上述作为评价对象的核酸分子为DNA且具有上述氧化还原活性的情况下,上述DNA可以称为例如DNA酶或脱氧核酶,另外,在上述核酸分子为RNA且具有上述氧化还原活性的情况下,上述RNA可以称为例如RNA酶或核酶(RNAzyme)。
本发明中,上述装置的上述检测部只要能够检测由上述作为评价对象的核酸分子所催化的氧化还原反应产生的电信号即可。如上所述,上述检测部具有上述电极系统。上述电极系统例如可以包含工作电极和对电极,也可以包含工作电极、对电极和参比电极。上述电极的材料没有特别限制,可以列举例如:铂、银、金、碳等。上述工作电极和上述对电极可以列举例如:铂电极、银电极、金电极、碳电极等,上述参比电极可以列举例如:银/氯化银电极等。上述银/氯化银电极例如可以通过向银电极上层叠氯化银电极而形成。
上述检测部例如可以通过在上述基板的表面上配置上述电极而形成。上述电极的配置方法没有特别限制,可以采用例如公知的方法,具体例可以列举蒸镀法、溅射法、丝网印刷法、电镀法等薄膜形成方法。上述电极例如可以直接配置在上述基板上,也可以间接地配置在上述基板上。间接的配置可以列举例如隔着其他部件的配置。
上述基板没有特别限制,例如优选表面为绝缘性的基板。上述基板例如可以为包含绝缘材料的基板或由上述绝缘材料构成的基板,也可以为表面具有包含绝缘材料的绝缘层或由上述绝缘材料构成的绝缘层的基板。上述绝缘材料没有特别限制,可以列举例如:玻璃、陶瓷、绝缘性塑料、纸等公知的材料。上述绝缘性塑料没有特别限制,可以列举例如:有机硅树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂、氟树脂等。
如上所述,上述作为评价对象的核酸分子可以为一种,但优选为 多种,具体而言,优选在上述基板上配置上述多种核酸分子。上述装置例如优选在上述基板上配置有上述多种核酸分子的微阵列。上述多种核酸分子例如优选在上述基板上配置成矩阵状。另外,为了能够根据其种类分别检测由上述核酸分子产生的氧化还原反应,上述装置例如优选具有多个检测部,并且在各检测部分别配置有不同种类的上述核酸分子。具体而言,上述装置例如可以如下形成,即通过将上述基板的表面划分成矩阵、在各划分区域形成如上所述的电极系统作为检测部并在各检测部配置上述核酸分子。另外,也可以通过使用市售的电化学检测系微阵列,使上述作为评价对象的核酸分子与上述阵列上的探针结合来作为上述评价用装置使用。上述市售的微阵列可以列举例如商品名为CombiMatrix ElectraSense microarray的微阵列(CombiMatrix公司)等。
如上所述,上述作为评价对象的核酸分子只要配置在上述基板上即可,优选固定到上述基板上。上述核酸分子例如可以直接地配置在上述基板上,也可以间接地配置在上述基板上。具体而言,上述核酸分子例如优选配置在上述基板中的上述检测部上,更优选配置在上述检测部中的上述电极上,优选配置在上述电极中的上述工作电极上。上述核酸分子例如可以直接地配置在上述检测部或上述电极上,也可以间接地配置在上述检测部或上述电极上。以下,若无特别说明,则“上述核酸分子向上述基板的配置或固定化”也包含向上述基板中的上述检测部或上述检测部中的上述电极的配置或固定化的含义。
上述核酸分子的配置方法没有特别限制,可以采用公知的核酸固定化方法。上述固定化方法可以列举例如将预先准备的核酸分子固定到上述基板上、优选固定到上述检测部上、更优选固定到上述电极上的方法。该方法例如为利用光刻法的方法,作为具体例,可以参考美国专利5424186号说明书等。另外,上述固定化方法可以列举例如在上述基板上、优选在上述检测部上、更优选在上述电极上合成核酸的方法。该方法可以列举例如所谓的斑点法(spot method),作为具体例, 可以参考美国专利5807522号说明书、日本特表平10-503841号公报等。
上述核酸分子例如可以以5’末端侧或3’末端侧中的任意一个末端侧固定在上述基板上。
上述核酸分子例如优选通过连接区配置在上述基板上。上述连接区例如优选含有核苷酸残基。上述连接区例如可以仅由核苷酸残基构成,也可以含有核苷酸残基。上述核苷酸如前所述。上述连接区的长度没有特别限制,例如为1~60个碱基长,优选为6~60个碱基长,更优选为20~30个碱基长。连接区例如也称为间隔区。
上述装置中,上述作为评价对象的核酸分子例如可以为连接有适体的状态。以下,将上述作为评价对象的核酸分子与上述适体连接而成的物质称为核酸元件。上述适体没有特别限制,例如为能够与特定的靶物质结合的适体。上述适体例如优选为含有核苷酸残基作为构成成分的核酸分子。上述核苷酸没有特别限制,如前所述。上述能够与靶物质结合的适体例如可以通过公知的SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,指数富集配体系统进化)法等来制造。上述适体例如可以为单链,也可以为双链,优选为单链。
上述核酸分子与上述适体例如可以直接结合,也可以间接地结合。后者的情况下,上述两者例如可以通过连接区而结合。上述核酸分子与上述适体例如可以一者的5’末端与另一者的3’末端连接,也可以两者的5’末端之间或3’末端之间连接。
在上述核酸分子上连接有上述适体的情况下,例如优选上述核酸分子的一个末端与上述基板结合、另一个末端与上述适体结合。如上所述,上述基板与上述核酸分子之间、上述核酸分子与上述适体之间例如可以分别通过连接区而结合。对于上述核酸分子与上述适体而言,例如优选单链核酸分子与单链适体连接。上述两者连接而成的上述核 酸元件例如可以通过自退火形成茎结构和/或环结构。
关于本发明的评价方法,作为第一实施方式,例示使用配置有上述作为评价对象的核酸分子的装置的方法,作为第二实施方式,例示使用配置有结合有上述适体的上述作为评价对象的核酸分子的装置、即配置有上述核酸元件的装置的方法。本发明不限于这些实施方式。
(第一实施方式)
本发明的第一实施方式中,如上所述,使用在上述基板上配置有上述作为评价对象的核酸分子的装置。
首先,在上述检测步骤中,例如,在上述底物的存在下,电化学地检测由上述核酸分子催化的氧化还原反应。在上述核酸分子具有上述氧化还原活性的情况下,通过上述核酸分子,例如,从上述底物生成产物,在该过程中发生电子的授受。该电子授受例如可以通过施加到电极上而以电信号的形式在上述装置的上述检测部中电化学地进行检测。上述电信号的检测例如可以通过测定电流等上述电信号的强度来进行。
上述底物例如可以在上述检测步骤中从外部向上述装置中的上述核酸分子供给。
上述底物没有特别限制,可以列举例如:过氧化氢、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、1,2-苯二胺(OPD)、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、3,3’-二氨基联苯胺(DAB)、3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB4HCl)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、4-氯-1-萘酚(4C1N)、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸、2,4-二氯苯酚、4-氨基安替比林、4-氨基安替比林盐酸盐、鲁米诺等。
上述检测步骤中,除了上述底物以外,例如可以共存有卟啉。公 知的脱氧核酶中存在例如通过与卟啉形成复合物而显示出更高的氧化还原活性的脱氧核酶。因此,本发明中,例如,也可以通过共存卟啉来检测作为与卟啉的复合物的氧化还原活性。
上述卟啉没有特别限制,可以列举例如未取代的卟啉、其衍生物。上述衍生物可以列举例如取代的卟啉以及与金属元素形成络合物而得到的金属卟啉等。上述取代的卟啉可以列举例如N-甲基中卟啉等。上述金属卟啉可以列举例如作为三价铁络合物的氯高铁血红素等。上述卟啉例如优选上述金属卟啉,更优选为氯高铁血红素。
上述检测步骤中,进行上述氧化还原反应的条件没有特别限制。pH例如为7.4~9.0,优选为7.4~8.5,更优选为7.4。上述pH例如优选利用缓冲液进行控制,例如,可以使用显示上述pH的Tris-HCl等缓冲液。上述底物例如优选混合在缓冲液中以底物溶液的形式添加到上述核酸分子中。上述底物溶液中的上述底物的浓度没有特别限制,例如为10~200mmol/L,优选为20~100mmol/L,更优选为40~60mmol/L,特别优选为50mmol/L。
接着,基于上述检测步骤中的检测结果,在上述评价步骤中,评价上述核酸分子的氧化还原活性。上述评价步骤例如可以评价氧化还原活性的有无,也可以评价上述氧化还原活性的强度。后者的情况下,例如可以以任意的核酸分子的氧化还原活性为基准来评价相对活性的强度,上述任意的核酸分子例如优选显示氧化还原活性的核酸分子。
(第二实施方式)
本发明的第二实施方式中,如上所述,使用在上述基板上配置有结合有上述适体的上述作为评价对象的核酸分子的装置。若无特别说明,则与上述第一实施方式同样。
首先,在上述检测步骤中,例如,在上述底物和上述靶物质的存 在下,电化学地检测由上述核酸分子催化的氧化还原反应。上述检测步骤特别优选包括在存在上述底物且不存在上述靶物质的条件下检测上述氧化还原反应的步骤和在上述底物和上述靶物质的存在下检测上述氧化还原反应的步骤。对于不存在上述靶物质的条件下的检测与存在上述靶物质的条件下的检测,先进行哪种检测都可以。例如,不需要使与上述适体结合的靶物质脱离,因此,优选先进行不存在上述靶物质的条件下的检测。
进行不存在上述靶物质的条件下的检测与存在上述靶物质的条件下的检测的原因如下。靶物质的检测中,在使用能够与上述靶物质结合的适体和具有氧化还原活性的核酸分子的情况下,期望上述具有氧化还原活性的核酸分子例如仅在存在靶物质的条件下显示活性,在不存在靶物质的条件下不显示活性。这是因为如果在不存在靶物质的条件下显示活性,则在靶物质检测中会得到假阳性的结果。因此,在不存在上述靶物质的条件下有无氧化还原活性和在上述靶物质存在下有无氧化还原活性,对于在使用上述适体的靶物质检测中确立电化学方法非常重要。
另外,在上述核酸分子在不存在上述靶物质的条件下不显示活性、在上述靶物质存在下显示活性的情况下,可以认为在上述核酸分子与上述适体之间成立例如以下所述的结构上的关系。适体通常通过识别靶物质并结合而使其立体结构发生变化。因此,不存在靶物质的条件下的适体的立体结构使与其结合的上述核酸分子呈活性关闭的结构,另一方面,如果通过与靶物质的结合而变化的上述适体的立体结构使上述核酸分子的活性的抑制被解除,则仅在靶物质存在的条件下,上述核酸分子的活性开启。
在上述检测步骤中,上述底物和上述靶物质例如可以从外部向上述装置中的上述核酸分子供给。上述底物与上述靶物质的添加顺序没有特别限制,例如,可以在添加一者后添加另一者,也可以同时添加 两者。另外,可以与上述第一实施方式同样地共存有上述卟啉。
上述底物没有特别限制,与前述同样。上述靶物质与上述适体没有特别限制,可以使用期望的靶物质和能够与其结合的适体。
接着,在上述评价步骤中,基于上述检测步骤中的检测结果,评价上述核酸分子的氧化还原活性。上述评价步骤中,例如,可以评价氧化还原活性的有无,也可以评价上述氧化还原活性的强度。后者的情况下,例如,可以以任意的核酸分子的氧化还原活性为基准来评价相对活性的强度,上述任意的核酸分子例如优选显示氧化还原活性的核酸分子。
上述评价步骤中,例如优选对于在不存在上述靶物质的条件下不显示上述氧化还原活性的核酸分子,评价在上述靶物质存在下的上述氧化还原活性。上述评价步骤中,例如,可以评价氧化还原活性的有无,也可以评价上述氧化还原活性的强度。后者的情况下,例如,可以以显示氧化还原活性的任意的核酸分子的氧化还原活性为基准来评价相对活性的强度。
2.筛选方法
如上所述,本发明的筛选方法为一种具有氧化还原活性的核酸分子的筛选方法,其特征在于,根据上述本发明的评价方法,使用装置对作为评价对象的核酸分子的氧化还原活性进行评价,筛选具有氧化还原活性的核酸分子。
本发明的筛选方法的特征为根据上述本发明的评价方法评价上述作为评价对象的核酸分子的氧化还原活性,其他步骤和条件没有任何限制。
本发明中,基于上述氧化还原活性的评价结果。例如可以选择显 示氧化还原活性的核酸分子,进而可以选择显示相对强的氧化还原活性的核酸分子作为目的核酸分子。另外,如上所述,例如也可以选择在不存在上述靶物质的条件下不显示活性、在上述靶物质存在下显示活性的核酸分子作为目的核酸分子。
3.具有氧化还原活性的核酸分子
本发明的具有氧化还原活性的核酸分子的特征在于,包含选自由下述(a)~(d)组成的组中的至少一个多核苷酸。
(a)由序列号1~132中任意一个碱基序列构成的多核苷酸;
(b)由上述(a)中任意一个碱基序列中缺失、取代、插入和/或添加1个或多个碱基后的碱基序列构成且具有氧化还原活性的多核苷酸;
(c)由相对于上述(a)中任意一个碱基序列具有80%以上的同一性的碱基序列构成且具有氧化还原活性的多核苷酸;
(d)由在严格条件下与由上述(a)中任意一个碱基序列构成的多核苷酸杂交的多核苷酸的互补碱基序列构成且具有氧化还原活性的多核苷酸。
本发明的核酸分子例如可以为由上述(a)~(d)中的任意一个多核苷酸构成的分子,也可以为含有上述多核苷酸的分子。后者的情况下,例如,如后所述,本发明的核酸分子可以含有2个以上的上述(a)~(d)中的多核苷酸。上述2个以上的多核苷酸可以为相同的序列,也可以为不同的序列。另外,后者的情况下,本发明的核酸分子可以进一步具有例如连接区和/或附加序列等。本发明的核酸分子也称为脱氧核酶。
上述(a)的多核苷酸为由上述序列号1~132中的任意一个碱基序列构成的多核苷酸。
表1
序列号: | 名称 | 序列 |
1 | c0984 | TGAGGGCCGGGTGGGTCGGGAA |
2 | c0568 | TGAGGGGAGGGCGGGTCGGGAA |
3 | c0067 | TGAGGGATGGGAGGGAGGGGAA |
4 | c0192 | TGAGGGAGGGGCGGGCCGGGAA |
5 | c0524 | TGAGGGGAGGGAGGGGCGGGAA |
6 | c0451 | TGAGGGTCGGGAGGGAGGGGAA |
7 | c0541 | TGAGGGGAGGGTGGGCAGGGAA |
8 | c0629 | TGAGGGGTGGGCGGGTAGGGAA |
9 | c0184 | TGAGGGAGGGGCGGGTCGGGAA |
10 | c0760 | TGAGGGGCGGGCGGGTCGGGAA |
11 | c0728 | TGAGGGGCGGGTGGGTCGGGAA |
12 | e0064 | CTGGGCGGGCGGGCGGGA |
13 | c0719 | TGAGGGGCGGGAGGGCGGGGAA |
14 | c0531 | TGAGGGGAGGGTGGGAGGGGAA |
15 | c0711 | TGAGGGGCGGGAGGGTGGGGAA |
16 | c0096 | TGAGGGATGGGTGGGCCGGGAA |
17 | c0595 | TGAGGGGTGGGTGGGAGGGGAA |
18 | c0335 | TGAGGGTTGGGAGGGCGGGGAA |
19 | c0456 | TGAGGGTCGGGAGGGTCGGGAA |
20 | c0756 | TGAGGGGCGGGCGGGACGGGAA |
21 | c0717 | TGAGGGGCGGGAGGGCAGGGAA |
22 | c0712 | TGAGGGGCGGGAGGGTCGGGAA |
23 | c0562 | TGAGGGGAGGGCGGGATGGGAA |
24 | c0713 | TGAGGGGCGGGAGGGGAGGGAA |
25 | c0735 | TGAGGGGCGGGTGGGCGGGGAA |
26 | e0021 | CTGGGTGGGTGGGAGGGA |
27 | c0607 | TGAGGGGTGGGTGGGCGGGGAA |
28 | c0722 | TGAGGGGCGGGTGGGATGGGAA |
29 | c0600 | TGAGGGGTGGGTGGGTCGGGAA |
30 | e0032 | CTGGGTGGGCGGGCGGGA |
31 | c0544 | TGAGGGGAGGGTGGGCCGGGAA |
32 | c0455 | TGAGGGTCGGGAGGGTGGGGAA |
33 | c0605 | TGAGGGGTGGGTGGGCAGGGAA |
34 | c0718 | TGAGGGGCGGGAGGGCTGGGAA |
35 | c0586 | TGAGGGGTGGGAGGGGTGGGAA |
36 | c0344 | TGAGGGTTGGGTGGGTCGGGAA |
37 | c0152 | TGAGGGAGGGGTGGGTCGGGAA |
38 | c0630 | TGAGGGGTGGGCGGGTTGGGAA |
39 | c0632 | TGAGGGGTGGGCGGGTCGGGAA |
40 | c0626 | TGAGGGGTGGGCGGGATGGGAA |
表2
序列号: | 名称 | 序列 |
41 | c0762 | TGAGGGGCGGGCGGGGTGGGAA |
42 | c0707 | TGAGGGGCGGGAGGGAGGGGAA |
43 | c0759 | TGAGGGGCGGGCGGGTGGGGAA |
44 | c0543 | TGAGGGGAGGGTGGGCGGGGAA |
45 | c0637 | TGAGGGGTGGGCGGGCAGGGAA |
46 | c0606 | TGAGGGGTGGGTGGGCTGGGAA |
47 | c0895 | TGAGGGCTGGGCGGGCGGGGAA |
48 | c0753 | TGAGGGGCGGGCGGGAAGGGAA |
49 | c0625 | TGAGGGGTGGGCGGGAAGGGAA |
50 | c0584 | TGAGGGGTGGGAGGGTCGGGAA |
51 | c0567 | TGAGGGGAGGGCGGGTGGGGAA |
52 | c0599 | TGAGGGGTGGGTGGGTGGGGAA |
53 | c0520 | TGAGGGGAGGGAGGGTCGGGAA |
54 | c0636 | TGAGGGGTGGGCGGGGCGGGAA |
55 | c0627 | TGAGGGGTGGGCGGGAGGGGAA |
56 | c0519 | TGAGGGGAGGGAGGGTGGGGAA |
57 | c0343 | TGAGGGTTGGGTGGGTGGGGAA |
58 | c0628 | TGAGGGGTGGGCGGGACGGGAA |
59 | c0383 | TGAGGGTTGGGCGGGCGGGGAA |
60 | c0856 | TGAGGGCTGGGTGGGTCGGGAA |
61 | c0709 | TGAGGGGCGGGAGGGTAGGGAA |
62 | c0574 | TGAGGGGAGGGCGGGCTGGGAA |
63 | c0842 | TGAGGGCTGGGAGGGGTGGGAA |
64 | c0638 | TGAGGGGTGGGCGGGCTGGGAA |
65 | c0583 | TGAGGGGTGGGAGGGTGGGGAA |
66 | c0472 | TGAGGGTCGGGTGGGTCGGGAA |
67 | c0463 | TGAGGGTCGGGAGGGCGGGGAA |
68 | e0018 | CTGGGTGGGAGGGTGGGA |
69 | c0736 | TGAGGGGCGGGTGGGCCGGGAA |
70 | c0604 | TGAGGGGTGGGTGGGGCGGGAA |
71 | c0591 | TGAGGGGTGGGAGGGCGGGGAA |
72 | c0792 | TGAGGGCAGGGTGGGTCGGGAA |
73 | c0515 | TGAGGGGAGGGAGGGAGGGGAA |
74 | c0564 | TGAGGGGAGGGCGGGACGGGAA |
75 | c0199 | TGAGGGACGGGAGGGTGGGGAA |
76 | c0579 | TGAGGGGTGGGAGGGAGGGGAA |
77 | c0714 | TGAGGGGCGGGAGGGGTGGGAA |
78 | c0967 | TGAGGGCCGGGAGGGTGGGGAA |
79 | c0727 | TGAGGGGCGGGTGGGTGGGGAA |
80 | c0328 | TGAGGGTTGGGAGGGTCGGGAA |
表3
序列号: | 名称 | 序列 |
81 | c0499 | TGAGGGTCGGGCGGGAGGGGAA |
82 | c0708 | TGAGGGGCGGGAGGGACGGGAA |
83 | c0608 | TGAGGGGTGGGTGGGCCGGGAA |
84 | c0535 | TGAGGGGAGGGTGGGTGGGGAA |
85 | c0596 | TGAGGGGTGGGTGGGACGGGAA |
86 | e0024 | CTGGGTGGGTGGGCGGGA |
87 | c0160 | TGAGGGAGGGGTGGGCCGGGAA |
88 | c0710 | TGAGGGGCGGGAGGGTTGGGAA |
89 | c0592 | TGAGGGGTGGGAGGGCCGGGAA |
90 | c0706 | TGAGGGGCGGGAGGGATGGGAA |
91 | c0528 | TGAGGGGAGGGAGGGCCGGGAA |
92 | c0563 | TGAGGGGAGGGCGGGAGGGGAA |
93 | c0723 | TGAGGGGCGGGTGGGAGGGGAA |
94 | c0211 | TGAGGGACGGGTGGGAGGGGAA |
95 | c0179 | TGAGGGAGGGGCGGGAGGGGAA |
96 | c0634 | TGAGGGGTGGGCGGGGTGGGAA |
97 | c0588 | TGAGGGGTGGGAGGGGCGGGAA |
98 | c0467 | TGAGGGTCGGGTGGGAGGGGAA |
99 | c0589 | TGAGGGGTGGGAGGGCAGGGAA |
100 | c0716 | TGAGGGGCGGGAGGGGCGGGAA |
101 | c0522 | TGAGGGGAGGGAGGGGTGGGAA |
102 | c0724 | TGAGGGGCGGGTGGGACGGGAA |
103 | c0516 | TGAGGGGAGGGAGGGACGGGAA |
104 | c0582 | TGAGGGGTGGGAGGGTTGGGAA |
105 | c0580 | TGAGGGGTGGGAGGGACGGGAA |
106 | c0581 | TGAGGGGTGGGAGGGTAGGGAA |
107 | c0590 | TGAGGGGTGGGAGGGCTGGGAA |
108 | c0527 | TGAGGGGAGGGAGGGCGGGGAA |
109 | c0532 | TGAGGGGAGGGTGGGACGGGAA |
110 | e0013 | CTGGGAGGGCGGGAGGGA |
111 | e0052 | CTGGGCGGGAGGGCGGGA |
112 | c0730 | TGAGGGGCGGGTGGGGTGGGAA |
113 | c0521 | TGAGGGGAGGGAGGGGAGGGAA |
114 | e0050 | CTGGGCGGGAGGGTGGGA |
115 | c0540 | TGAGGGGAGGGTGGGGCGGGAA |
116 | c0915 | TGAGGGCGGGGTGGGAGGGGAA |
117 | c0570 | TGAGGGGAGGGCGGGGTGGGAA |
118 | c0734 | TGAGGGGCGGGTGGGCTGGGAA |
119 | t1011 | GGGTGGGAAGGGAGG |
120 | c0764 | TGAGGGGCGGGCGGGGCGGGAA |
表4
序列号: | 名称 | 序列 |
123 | t1113 | GGGAGGGACGGGAGG |
124 | c0900 | TGAGGGCGGGGAGGGACGGGAA |
125 | c0899 | TGAGGGCGGGGAGGGAGGGGAA |
126 | c0766 | TGAGGGGCGGGCGGGCTGGGAA |
127 | c0573 | TGAGGGGAGGGCGGGCAGGGAA |
128 | t0420 | GGGCGGGAGGGAGGG |
129 | t1102 | GCGAGGAAGGGTGGG |
130 | c0602 | TGAGGGGTGGGTGGGGTGGGAA |
131 | c0585 | TGAGGGGTGGGAGGGGAGGGAA |
132 | c0536 | TGAGGGGAGGGTGGGTCGGGAA |
上述(b)中,“1个或多个”例如只要在上述(b)的多核苷酸具有氧化还原活性的范围内即可。上述“1个或多个”在上述(a)的任意一个碱基序列中例如为1~5个,优选为1~3个,更优选为1个或2个。
上述(c)中,“同一性”例如只要在上述(c)的多核苷酸具有氧化还原活性的范围内即可。上述同一性例如为80%以上、85%以上,优选为90%以上,更优选为95%以上、96%以上、97%以上,进一步优选为98%以上,特别优选为99%以上。上述同一性可以使用例如BLAST、FASTA等分析软件利用默认的参数来计算(以下同样)。
上述(d)中,“能够杂交的多核苷酸”例如为与上述(a)的多核苷酸完全或部分地互补的多核苷酸。上述杂交例如可以通过各种杂交分析来检测。上述杂交分析没有特别限制,例如,也可以采用Sambrook等编的《分子克隆实验指南第二版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual2nd Ed.)》[(冷泉港实验室出版社(1989)]等中记载的方法。
上述(d)中,“严格条件”例如可以为低严格条件、中严格条件、高严格条件中的任意一种条件。“低严格条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、32℃的条件。“中严格条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS、50%甲酰 胺、50℃的条件。本领域技术人员可以通过适当选择例如温度、盐浓度、探针的浓度和长度、离子强度、时间等条件来设定严格度的程度。“严格条件”也可以采用例如上述的Sambrook等编的《分子克隆实验指南第二版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual2nd Ed.)》[(冷泉港实验室出版社(1989)]等中记载的条件。
上述多核苷酸的构成单元例如为核苷酸残基。本发明的核酸分子可以列举例如仅由脱氧核糖核苷酸残基构成的DNA、含有1个或多个核糖核苷酸残基的DNA等。后者的情况下,“1个或多个”没有特别限制,例如在上述多核苷酸中例如为1~3个,优选为1个或2个。
本发明的核酸分子中,上述多核苷酸优选为单链多核苷酸。上述单链多核苷酸例如优选能够通过自退火形成茎结构和环结构。上述多核苷酸例如优选能够形成茎环结构、内环结构和/或凸出结构等。
本发明的核酸分子例如可以为双链多核苷酸。在本发明的核酸分子为双链多核苷酸的情况下,例如,上述双链多核苷酸中一个单链多核苷酸为上述任意一个多核苷酸,另一个单链多核苷酸没有限制。上述另一个单链多核苷酸可以列举例如由与上述的任意一个多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸。在本发明的核酸分子为双链多核苷酸的情况下,例如优选在使用之前通过变性等使上述双链多核苷酸解离成单链多核苷酸。另外,解离得到的上述单链多核苷酸例如可以如上所述形成茎结构和环结构。
本发明中,“能够形成茎结构和环结构”例如包括实际形成了茎结构和环结构以及即使未形成茎结构和环结构、根据条件也能够形成茎结构和环结构的情况。“能够形成茎结构和环结构”例如包括通过实验得到确认的情况和通过计算机等的模拟进行预测的情况这两种情况。
本发明的核酸分子具有氧化还原活性,因此,例如,可以作为氧化还原酶的替代品使用,而且也可以应用于如上所述的利用适体的靶物质的检测。
实施例
(实施例1)
A.条件考察
检测作为评价对象的核酸分子的氧化还原反应时,对其条件进行考察。
(1)多核苷酸的固定化
如下所示,通过间隔区将已知的多核苷酸固定到市售的电化学检测型微阵列(商品名CombiMatrix ElectraSense microarray,CombiMatrix 公司制造)的电极上。
上述已知的多核苷酸使用作为脱氧核酶的EAD2(序列号133)(参考Cheng,X.,et al.(2009)Biochemistry,48,7817-7823.)。另外,作为阴性对照,使用与链霉亲和素结合的DNA适体SA(序列号134)。
EAD2(序列号133)
CTGGGAGGGAGGGAGGGA
SA(序列号134)
CCGACGCACCGATCGCAGGTTCGG
上述间隔区的长度设定为0个碱基长(无间隔区)、8个碱基长、16个碱基长、24个碱基长。上述间隔区的序列设定为poly(dT)。
上述固定化通过使上述间隔区的3’末端结合在1个上述微阵列的电极上、并且使上述已知多核苷酸的3’末端与上述间隔区的5’末端结合来进行。另外,将上述间隔区的长度不同的4种EAD2(dT0、dT8、dT16、dT24)和上述间隔区的长度不同的4种SA(dT0、dT8、dT16、dT24) 各250个随机地固定到上述微阵列上。
(2)氧化还原反应的检测
向上述微阵列中添加过氧化氢作为底物,以电流的形式测定由氧化还原反应产生的电信号。测定使用测定装置(产品名ElectraSense Reader,CombiMatrix公司)(以下同样)。上述过氧化氢以形成规定浓度(0、1、2、4、8mmol/L)的方式添加到各种缓冲液中,并且作为底物溶液而添加。上述缓冲液使用Tris缓冲液(pH7.4)、Tris缓冲液(pH8.0)、Tris缓冲液(pH8.5)、Tris缓冲液(pH9.0),添加过氧化氢后的pH分别调节为括号内的值。
将它们的结果示于图1中。图1是表示各条件下的电信号的图。图1中,(A)为pH7.4的结果,(B)为pH8.0的结果,(C)为pH8.5的结果,(D)为pH9.0的结果,分别表示各种过氧化氢浓度和间隔区长度的条件下的结果。另外,各图中,纵轴的值表示EAD2的电信号(S)与阴性对照的电信号(背景:BG)的信号比(S/BG)。如图1(A)所示,在pH7.4、过氧化氢浓度2mmol/L、间隔区长度为24个碱基长的条件下,得到最高的值。
B.重复性
在与上述“A.条件考察”相同的条件下,对于上述间隔区的长度不同的4种EAD2(dT0、dT8、dT16、dT24)各250个,进行氧化还原反应的测定。
将其结果示于图2中。图2(A)是针对各EAD2和各SA,将第一次测定值与第二次测定值作图而得到的图。测定值为由上述测定装置得到的与电流相当的信号测定值(以下同样)。横轴为第一次信号测定值,纵轴表示第二次信号测定值。图2(B)是表示各EAD2的间隔区长度的信号值的对数的图。图2(A)的图中,一并示出皮尔森积矩相关系数的显著性检验的结果。图2(A)的相关系数R=0.9981756。图2(B)中,关 于各间隔区长度的标准偏差,dT0为0.09954021,dT8为0.09435911,dT16为0.08528754,dT24为0.1027817。如图2(A)和(B)所示,对4种EAD2各250个进行测定的结果是,分别显示出非常高的重复性。
C.正态性
对于上述“A.条件考察”中的上述间隔区的长度不同的4种EAD2(dT0、dT8、dT16、dT24)各250个的测定结果和上述间隔区的长度不同的4种SA(dT0、dT8、dT16、dT24)各250个的测定结果,确认是否遵从正态分布。另外,通过Kolmoforov-Smirnov检验求出P值。
将它们的结果示于图3中。图3是针对各EAD2和各SA表示信号值与其频率的关系的图。如图3所示,可以确认各EAD2和各SA的250个信号的分布遵从正态分布。
(实施例2)
将由不同序列构成的多种多核苷酸固定到微阵列芯片上,进行氧化还原反应的测定。
A.重复性
如下所示,通过由24个碱基长的poly(dT)构成的间隔区将多种多核苷酸固定到市售的微阵列芯片(商品名CustomArray(注册商标)12K,CombiMatrix公司制造)中的电极上。
对于上述多核苷酸,使用作为脱氧核酶的EAD2(序列号133)、适体SA(序列号134)、作为转录因子c-Myc基因的启动子区的部分序列的c-Myc(序列号135)和作为针对凝血酶的适体的TA(序列号136)。
EAD2(序列号133)
CTGGGAGGGAGGGAGGGA
SA(序列号134)
CCGACGCACCGATCGCAGGTTCGG
c-Myc(序列号135)
TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA
TA(序列号136)
GGTTGGTGTGGTTGG
此外,也同样地使用对上述EAD2(序列号133)、c-Myc(序列号135)和TA(序列号136)的序列进行改变后的改变多核苷酸。准备64种对EAD2进行改变而得到的改变EAD2,1024种对c-Myc进行改变而得到的改变c-Myc,1232种对TA进行改变而得到的改变TA。
上述固定化通过使上述间隔区的3’末端结合在1个上述微阵列的电极上、并且使上述已知多核苷酸或上述改变多核苷酸的3’末端与上述间隔区的5’末端结合来进行。另外,将作为氧化还原活性的对照的EAD2、c-Myc和TA各100个、改变多核苷酸各5个随机地固定到上述微阵列芯片上。
然后,使用该相同的微阵列芯片在相同条件下进行3次氧化还原反应的测定。具体而言,添加含有2mmol/L的过氧化氢的Tris缓冲液(pH7.4),以电流的形式测定由氧化还原反应产生的电信号。
将该结果示于图4中。图4中,(A)是将第一次测定值与第二次测定值作图而得到的图,(B)是将第二次测定值与第三次测定值作图而得到的图,(C)是将第一次测定值与第三次测定值作图而得到的图。另外,各图中一并示出皮尔森积矩相关系数的显著性检验的结果。如图4所示,在同一阵列内,显示出非常高的重复性。
B.正态性
基于上述“A.重复性”中得到的测定结果,在图5(A)~(D)的图中示出(A)100个c-Myc的信号值与其频率的关系、(B)100个SA的信号值与其频率的关系、(C)100个EAD2的信号值与其频率的关系、(D)100 个TA的信号值与其频率的关系。任意一个图中均可以确认信号的分布遵从正态分布。
(实施例3)
使用上述实施例2的微阵列芯片,筛选具有高氧化还原活性的新的脱氧核酶。
由上述实施例2中的3次测定结果确认了比EAD2显示更高活性的改变多核苷酸。将该结果示于图6中。图6是表示作为氧化还原活性的对照的SA、EAD2、c-Myc和TA以及显示氧化还原活性的15种改变多核苷酸的信号值的图。如图6所示,这些改变多核苷酸显示出比EAD2更高的氧化还原活性。另外,通过T检验确认完毕这15种改变多核苷酸的信号值相对于EAD2具有显著差异。这15种改变多核苷酸的序列如下所示。
表5
序列号: | 名称 | 序列 |
15 | c0711 | TGAGGGGCGGGAGGGTGGGGAA |
22 | c0712 | TGAGGGGCGGGAGGGTCGGGAA |
30 | e0032 | CTGGGTGGGCGGGCGGGA |
33 | c0605 | TGAGGGGTGGGTGGGCAGGGAA |
35 | c0586 | TGAGGGGTGGGAGGGGTGGGAA |
39 | c0632 | TGAGGGGTGGGCGGGTCGGGAA |
50 | c0584 | TGAGGGGTGGGAGGGTCGGGAA |
55 | c0627 | TGAGGGGTGGGCGGGAGGGGAA |
65 | c0583 | TGAGGGGTGGGAGGGTGGGGAA |
76 | c0579 | TGAGGGGTGGGAGGGAGGGGAA |
83 | c0608 | TGAGGGGTGGGTGGGCCGGGAA |
90 | c0706 | TGAGGGGCGGGAGGGATGGGAA |
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以上,参考实施方式对本申请发明进行了说明,但本申请发明并不限定于上述实施方式。对于本申请发明的构成和细节,可以在本申请发明的范围内进行本领域技术人员能够理解的各种变更。
该申请要求以2011年7月4日提出的日本申请特愿2011-148562为基础的优先权,将其全部公开内容并入本说明书中。
产业上的可利用性
根据本发明,能够针对作为评价对象的核酸分子容易地评价氧化还原活性的有无及其强度。另外,根据这样的本发明的评价方法,例如,还能够同时对多种核酸分子进行评价,能够高效地进行目的核酸分子的筛选。如上所述,具有氧化还原活性的核酸分子例如可以代替过氧化物酶等酶来使用,因此在临床医疗、食品、环境等各种领域中有用。
Claims (9)
1.一种评价核酸分子的氧化还原活性的方法,其特征在于,包括:
检测步骤,使用以电化学方式检测氧化还原反应的装置,电化学地检测由作为评价对象的核酸分子催化的对底物的氧化还原反应、和
评价步骤,由所述氧化还原反应的检测结果评价所述核酸分子的氧化还原活性,
所述装置具有具备检测部的基板,
所述检测部具有电极系统,
所述基板上配置有所述作为评价对象的核酸分子。
2.如权利要求1所述的评价方法,其中,所述作为评价对象的核酸分子为多种核酸分子。
3.如权利要求2所述的评价方法,其中,所述基板为配置有所述多种核酸分子的微阵列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的评价方法,其中,所述检测步骤为在所述底物的存在下检测由所述核酸分子催化的氧化还原反应的步骤。
5.如权利要求1至4中任一项所述的评价方法,其中,所述作为评价对象的核酸分子上结合有能够与靶物质结合的核酸适体。
6.如权利要求5所述的评价方法,其中,所述检测步骤为在所述底物和所述靶物质的存在下检测由所述核酸分子催化的氧化还原反应的步骤。
7.如权利要求5或6所述的评价方法,其中,
所述检测步骤包括在存在所述底物且不存在所述靶物质的条件下检测所述氧化还原反应的步骤和在所述底物和所述靶物质的存在下检测所述氧化还原反应的步骤,
所述评价步骤中,对于在不存在所述靶物质的条件下不显示所述氧化还原活性的核酸分子,评价在所述靶物质存在下的所述氧化还原活性。
8.一种具有氧化还原活性的核酸分子的筛选方法,其特征在于,根据权利要求1至7中任一项所述的评价方法,使用装置对作为评价对象的核酸分子的氧化还原活性进行评价,筛选具有氧化还原活性的核酸分子。
9.一种具有氧化还原活性的核酸分子,其特征在于,包含选自由序列号1~132组成的组中的至少一个多核苷酸。
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