JP7012299B2 - ペルオキシダーゼ活性増大アプタマー - Google Patents
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Description
ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2ggg [I]
で示されるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドから成り、ヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーを提供する。また、本発明は、配列番号21で示される塩基配列から成るアプタマーから成るヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性増大剤を提供する。さらに、本発明は、生体から採取された、ヘムタンパク質を含む被検試料中のペルオキシダーゼ活性を、上記本発明のアプタマーから成るヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性増大剤の存在下で測定することを含む、被検試料中のヘムタンパク質の定量方法を提供する。
ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2ggg [I]
で示される。ここで、nは、a、c、g又はt(RNAの場合にはu)である。
ggg(n)1-2ggg(n)1-6ggg(n)1-2ggg [II]
で示されるものが好ましく、さらには、式[III]:
gggngggnnggg(n)1-2ggg [III]
で示されるものが好ましい。
1. アプタマーの合成
下記表1に示す塩基配列から成るDNAアプタマーを、市販のDNA合成装置により化学合成した。なお、アプタマーはいずれも5'末端ビオチン修飾の配列を使用し、TBSバッファー(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, pH 7.4) 中にて95℃で10分間熱処理し、25℃まで徐冷することでフォールディングしてから実験に用いた。
TBS バッファーで終濃度2μMとなるように調製したアプタマー (Myo_1R04, 06, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 20, Myo7N24#07. 配列は表1参照) について、石英セル (光路長1 cm) を用い、J-720型円二色性分散計 (JASCO) にて波長220~320 nmにおけるCDスペクトル測定を行った。
(1) 配列依存性:96穴プレートに終濃度100 nMのミオグロビンまたはヘモグロビン50μL、終濃度100 nMのアプタマー (Myo1R06, 11, 13, 16, 19, 20, Myo7N24#07. 配列は表1参照) 50μLを添加し、室温にて1時間振とうした。その後ペルオキシダーゼ基質 (BM Chemiluminescence ELISA Substrate (POD), Roche) 100μLを添加し、10分後にプレートリーダーを用いて化学発光強度を測定した。なお、DNAなし (No DNA) の場合、またはpoly T (24 merまたは32 mer) を用いた場合についても同様の操作を行った。
(1) CDスペクトル測定によるアプタマーの構造評価
G4はグアニンが平面に4つ並ぶことで形成されるG-カルテットが平行に並ぶことで形成される。一般に、G-カルテットの形成に寄与するグアニンの並び方により、パラレル型とアンチパラレル型の二種類に大別されることが知られている。CDスペクトル測定において、260nmにおける正のピークと240nmにおける負のピークが観察されればパラレル型G4、290nmにおける正のピークと260nmにおける負のピークが観察されればアンチパラレル型G4が形成されていると考えられる (図1)。今回構造を評価した配列の中では、本発明の実施例になるMyo_1R06, 11, 13, 16, 19, 20, Myo7N24#07において260nmにおける正のピークと240nmにおける負のピークが観察された (図2)。従って、これらの配列はパラレル型G4を形成していると考えられる。一方、比較例になるMyo_1R04, 12, 14, 15では顕著なピークが観察されなかった (図3)。
(i) ミオグロビン及びヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性による化学発光シグナルが特に高かったのは、本発明の実施例になるMyo_1R06, 11, 13, 16, 19, 20及びMyo7N24#07を用いた場合であった (図4)。 (1)より、高いペルオキシダーゼ活性が確認されるのはパラレル型のG4を形成し得る配列であった。また、DNAなしの場合のペルオキシダーゼ活性に対して各アプタマー存在下でのペルオキシダーゼ活性の比を化学発光シグナルによって算出すると、ミオグロビンでは最大でその活性が13.7倍、ヘモグロビンでは7.5倍にも増感されていることが示された (表2、表3)。
TBSバッファーをリン酸バッファー(組成:10mM K2HPO4, KH2PO4, pH6.5)に変更したことを除き、実施例5(Myo_1R19)及び実施例6(Myo_1R20)と同じ操作を行った(終濃度100nMのミオグロビンのペルオキシダーゼ活性を測定(実施例8及び9))。また、31T (polyT(31mer))についてもリン酸バッファー中で同様に測定を行った(比較例7)。結果を下記表4及び図6に示す。
下記表5に示す塩基配列から成るDNAアプタマーを、実施例1~7と同様にして化学合成し、ミオグロビンのペルオキシダーゼ活性の増幅計数を測定した。結果を表5に示す。
上記実施例7のアプタマーMyo7N24#07(実施例19)、上記実施例10のアプタマーmPOD_2-01(実施例20)及びpolyT(24mer、配列番号24)(比較例8)について、酢酸バッファー(10mM CH3COOK/CH3COOH、pH3.5~5.5)又はリン酸バッファー(10mM K2HPO4/KH2PO4, pH5.5.0~8.0)中で、上記と同様にしてミオグロビンのペルオキシダーゼ活性の増幅計数を測定した。結果を図7に示す。
Claims (15)
- 塩基配列が式[I]:
ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2ggg [I]
で示されるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドから成り、ヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーから成るヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性増大剤。 - 前記式[I]が式[II]:
ggg(n)1-2ggg(n)1-6ggg(n)1-2ggg [II]
で示される請求項1記載のペルオキシダーゼ活性増大剤。 - 前記式[II]が式[III]:
gggngggnnggg(n)1-2ggg [III]
で示される請求項1記載のペルオキシダーゼ活性増大剤。 - 前記式[I]で示される塩基配列が、配列番号1~7のいずれかに示される塩基配列である請求項1記載のペルオキシダーゼ活性増大剤。
- 前記式[I]で示される塩基配列が、配列番号1~4のいずれかに示される塩基配列である請求項1記載のペルオキシダーゼ活性増大剤。
- 前記式[I]で示される塩基配列が、配列番号1又は2で示される塩基配列である請求項1記載のペルオキシダーゼ活性増大剤。
- 式[I]の一端又は両端にそれぞれ0個~10個のヌクレオチドが付加された請求項1記載のペルオキシダーゼ活性増大剤。
- 前記式[I]で示される塩基配列が、配列番号15~20、22及び23のいずれかに示される塩基配列である請求項1記載のペルオキシダーゼ活性増大剤。
- 配列番号21で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドから成り、ヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーから成るヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性増大剤。
- 配列番号21で示される塩基配列から成るポリヌクレオチドから成る請求項9記載のペルオキシダーゼ活性増大剤。
- 生体から採取された、ヘムタンパク質を含む被検試料中のペルオキシダーゼ活性を、請求項1~7のいずれか1項に記載のペルオキシダーゼ活性増大剤の存在下で測定することを含む、被検試料中のヘムタンパク質の定量方法。
- 前記ヘムタンパク質が、ミオグロビン又はヘモグロビンである請求項11記載の方法。
- 生体から採取された、ヘムタンパク質を含む被検試料中のペルオキシダーゼ活性を、請求項8~10のいずれか1項に記載のペルオキシダーゼ活性増大剤の存在下で測定することを含む、被検試料中のヘムタンパク質の定量方法。
- 前記ヘムタンパク質が、ミオグロビン又はヘモグロビンである請求項13記載の方法。
- ペルオキシダーゼ活性の測定を、リン酸バッファー又は酢酸バッファーの存在下で行う請求項10~14のいずれか1項に記載の方法。
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