CN113030216A - 一种检测17 β-雌二醇的电化学传感器及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于传感器领域，涉及聚合膜修饰电极与适配体传感器，特别是指一种检测17β‑雌二醇的电化学适配体传感器及其制备和使用方法。通过引入核酸适配体片段AF1和AF2，当目标物E2存在时AF1和AF2在电极表面结合成复合物，表现出完整适配体的功能，识别目标分子前后使得金纳米颗粒与电极表明的距离发生变化，从而获得电化学信号的改变，其检测限可实现20 fM（LSD）、0.77 fM（GCE）本申请的传感器设计方案构建于一次性、便携式、低成本的LSG上，这将便于传感器的商品化，为实现检测E2的便携式传感设备方面具有巨大的应用潜力。

Description

一种检测17 β-雌二醇的电化学传感器及其制备和使用方法
技术领域
本发明属于传感器领域，涉及聚合膜修饰电极与适配体传感器，特别是指一种检测17β-雌二醇的电化学适配体传感器及其制备和使用方法。
背景技术
17β-雌二醇（E2）是一种常见的干扰内分泌的甾醇类激素，绝大部分哺乳动物的主要雌激素是E2，其他重要的雌激素有雌三醇和雌酮。E2已广泛用于畜牧业以促进动物生长，增加瘦肉率和产奶量。肉类和牛奶等动物食品中残留的过量E2会导致女性的生育问题，增加患卵巢癌和乳腺癌的风险。同时该激素水平体内异常也会会导致其他健康问题，如骨骼脆弱、尿路感染、甚至抑郁。因此，建立一种简单、快速、灵敏的E2检测方法具有重要的意义。
适配体可应用于生物传感系统中来识别各种类型的目标物，从金属离子、小分子(包括毒素)到蛋白质，甚至整个细胞。小分子量的目标物，如甾醇类激素，可以使用适配体作为探针检测，这是由于在识别过程中引起了适配体构象的变化。适配体构象的变化可以用电化学方法检测，也可以用光学方法检测，比如荧光法和比色法。与其他检测方法相比，电化学适配体传感器因其灵敏度高、成本低、易于小型化而备受关注。金纳米粒子由于具有合成简单、便于功能化、良好的生物相容性、化学稳定性和优越的导电性能等优点，在电化学适配体传感器中被广泛用作指示剂。“劈开”的适配体系统通过独立的未功能化适配体片段的重新结合，有条件地恢复完整适配体的功能。适配体是识别和确定分子相互作用的新型识别工具，并有潜力为生物医学应用提供一种新的策略。
专利CN202010417581.4公开了一种17β-雌二醇电化学发光适配体传感器的制备方法及应用，该方法引入了E2适配体以构建新型ECL适配体传感器，以玻碳电极为载体构建了一种电化学发光适配体传感器，其检测限为1×10-15mol/L；然而玻碳电极作为传统电极，具有良好的稳定性、结果重现性，在基础研究领域一直有着广泛的应用。相对激光打印，玻碳电极体积较大，不具备柔韧性，难以实现便携式的传感检测，同时，激光打印电极表面具有石墨烯膜状结构，可直接使用也可以与多种纳米材料结合，对扩大其未来应对多种场景进行传感的可能具有更广泛的应用价值，激光打印石墨烯薄膜具有优良的导电性、表面积大、机械性能好等优点，无需进一步修饰即可直接用作电极。在LSG的所有应用中，电化学传感器备受关注，因为LSGE具有电子转移速率快、3D介孔网络结构以及对所研究生物标志物响应灵敏等优点。LSG的另一个优点是易于模式化，可设计成多种电极。所有这些特性表明，LSG柔性薄膜传感器具有作为一次性便携式电化学传感器的潜力，适用于研制便携式传感设备。
发明内容
本发明提出一种检测17 β-雌二醇的电化学适配体传感器及其制备和使用方法，通过引入核酸适配体片段AF1和AF2，当目标物E2存在时AF1和AF2在电极表面结合成复合物，表现出完整适配体的功能，识别目标分子前后使得金纳米颗粒与电极表明的距离发生变化，从而获得电化学信号的改变，其检测限可实现20 fM（LSD）、0.77 fM（GCE）；本申请的传感器设计方案构建于一次性、便携式、低成本的LSG上，这将便于传感器的商品化，为实现检测E2的便携式传感设备方面具有巨大的应用潜力。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种检测17β-雌二醇的电化学适配体传感器的制备方法，步骤如下：
（1）配制ADA的甲醇溶液，与甲醇钠的甲醇溶液反应至沉淀析出，经洗涤、真空干燥后得水溶性金刚烷羧酸钠盐；再将EDC、NHS和水溶性金刚烷羧酸钠盐的混合溶液加至AF1中，振荡过夜后，将形成的混合物离心洗涤得AF1- ADA探针；
（2）将HAuCl4水溶液在搅拌下加热至沸腾，然后加入柠檬酸钠溶液，回流煮沸15min，冷却至室温得到AuNPs溶液，然后再加入AF2溶液，搅拌24 h得AF2-AuNPs探针；
（3）将电极浸入含有0.01 M β-CD的 PBS溶液中，通过CV法将β-CD聚合到电极表面，得β-CD/电极；
（4）通过金刚烷和环糊精的主客体识别作用将步骤（1）的AF1-ADA探针组装到步骤（3）的β-CD/电极上，然后在含有相同浓度的ON1和AF2-AuNPs溶液中孵育45 min，形成AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs刚性双链结构，即为AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/电极电化学适配体传感器。
所述步骤（1）中ADA、甲醇钠的质量比为1:0.3；每1 OD AF1溶液中添加0.2- 0.6 gEDC、100-300 µL 0.1 M NHS及500 -1500µL金刚烷羧酸钠盐溶液，其中金刚烷羧酸钠盐溶液的浓度为0.5 M ；AF1的序列为5′-NH2-AAGGGATGCCGTTTGGG-3′。
所述步骤（2）中HAuCl4水溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为50:1，HAuCl4水溶液的质量体积比浓度为0.01%，柠檬酸钠溶液的质量体积比浓度为2%。
所述步骤（2）中AuNPs溶液与AF2溶液的体积比为1:9，其中AF2溶液的浓度为10 μM，AF2的序列为5’-CCCAAGTTCGGCATAGTG-SH-3’。
所述步骤（3）中电极为GCE或LSG；其中制作LSG电极的CO2激光的波长为10.6μm，激光速度为0.45 cm/s，功率为2.7 W，每英寸激光脉冲(PPI)为1000，透镜衬底距离为5.1cm；LSG电极上设有3个电极，其中工作电极的直径为2mm，银浆的参数为5000导电胶，稀释剂8260，60℃下固化30分钟；制作GCE依次采用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉处理，将电极表面打磨成镜面，用乙醇和去离子水清洗以去除残留的Al2O3粉末，最后在双蒸馏水中连续超声，室温下干燥。
所述步骤（3）中PBS溶液的参数为pH 7.4、0.1 M， CV法的条件为，扫速 20mv/s，电压 -1.0 ~ +1.0 V，圈数 10圈。
所述步骤（4）中ON1为DNA1，其核苷酸序列为5′-AAGCTTGGGCCATGCCCAGGAAGGACCCAAACGG-3′，DNA1和AF2-AuNPs的物质的量均为1×10-6 M。
上述方法制备的检测17β-雌二醇的电化学适配体传感器，包括用于主客体识别ADA标记的探针AF1-ADA、金纳米颗粒标记的探针AF2-AuNPs、ON1及β-CD修饰的电极；其中探针AF1-ADA、AF2-AuNPs与DNA1共同形成刚性双链结构AF1-ADA/ ON1/AF2-AuNPs，刚性双链结构AF1-ADA/ ON1/AF2-AuNPs通过用于主客体识别ADA标记的探针AF1-ADA与β-CD修饰的电极相结合，形成AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/电极传感器，即为电化学适配体传感器。
上述的电化学适配体传感器的使用方法， 步骤为：
a. 将构建好的AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/电极传感器浸泡于一系列浓度为1×10-14、1×10-13、1×10-12、1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6 M的17β-雌二醇和10 µM ON2组成的标准溶液中，在28 ℃下孵育20 min后取出并用PBS缓冲溶液清洗3次，得到17β-雌二醇电化学适配体传感器工作溶液；
b. 将步骤a得到的17β-雌二醇电化学适配体传感器工作溶液作为工作电极，电极上同时具有银参比电极和对电极，在0.1 M盐酸溶液中进行电化学DPV检测，根据所得的峰电流大小与E2的标准溶液之间的关系，绘制工作曲线；
c. 将待测样本稀释800 - 1100倍代替标准溶液，按照步骤a、b的操作进行检测，将检测出来的电流信号带入步骤b得到的工作曲线，即得到待测样本中17β-雌二醇的浓度。
检测原理为：将AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/电极浸在含有10 µM DNA 2(ON2)和不同浓度的E2的PBS (含5%乙醇)溶液中在28℃下孵育20 min，在此过程中，ON2与ON1杂交使得ON1释放, 促进E2与两段适配体特异性识别重新结合成茎环结构，这使得AuNPs更加接近电极表面；将AuNPs在+1.25 V条件下预氧化150 s，然后利用差分脉冲伏安法(DPV)在0.1 M 盐酸溶液中进行DPV扫描，脉冲幅度为50 mV，脉冲宽度为50 ms。DPV扫描电位从+0.6V到+0.2 V，使得AuCl4−还原产生电化学信号。在所有检测中，+0.44V处的DPV峰电流被看作分析信号。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明涉及便携式传感器制作与适配体传感技术领域，特别是指一种检测17β-雌二醇(E2)的便携式激光打印石墨烯电极(LSG)传感器的构建及其制备和使用方法。所述E2电化学传感器是通过金刚烷(ADA)标记的核酸适配体片段1（AF1）和金纳米颗粒标记的核酸适配体片段2（AF2）, 与E2特异性结合实现识别作用。以环糊精聚合膜修饰电极完成对AF1上ADA主客体作用实现探针分子的固定，以AF2上金纳米颗作为信号，用于检测。为实现高灵敏度，在该体系中引入了与AF1和AF2互补的DNA1序列，在识别目标时，加入与DNA2与DNA1杂交，使得AF1和AF2释放并实现与E2的结合，即得E2便携式电化学传感器。
2、本发明采用LSG或GCE，该电极表面的类石墨烯结构具有优良的导电性、表面积大、机械性能好等优点，并在制作过程中集工作电极、参比电极和对电极于一体，即可直接以整体做传感器，其中采用GCE最低检测限为0.7fM。
3、本发明其次还比较了GCE上有无DNA1、DNA2的两种传感平台，在检测E2前DNA1的存在，有助于在加入DNA2和E2后电极表面适配体片段的结合。在DNA1、DNA2存在时，对E2特异性结合获得了较大的电流响应，检测限可达20 fM。
4、本发明首次将β-CD电化学聚合在LSG表面，形成可以与ADA标记的AF1主客体识别的传感器，这种机制具有良好的固定探针分子的灵活性，便于在此基础上开发出更多的基于主客体识别的固定探针的传感器。此外，本发明将识别E2的核酸适配体“裁剪”成两个片段，其中AF1部分作为与电极链接的结点，AF2部分作为传感器的信号端，将电化学标记物AuNPs通过识别作用拉到电极表面，两个片段的结合使用克服了传感器设计环节中固定与识别的困难与矛盾，对拓宽基于适配体的生物传感器的应用具有潜在的广阔前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为制备方法（2）中β-CD/LSG聚合膜在打印电极表面的SEM形貌图
图2为便携式E2电化学传感器的制备过程图。
图3为β-CD修饰电极过程的CV曲线。
图4为GCE电极的交流阻抗图。
图5为E2传感器的工作曲线图。
图6为DNA 1与DNA2在传感器中的必要性验证。
图7为LSG电极制作及E2传感器设计示意图。
图8为LSG电极的交流阻抗图。
图9为便携式传感器的工作曲线图。
图10为传感器选择性测试图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种检测17β-雌二醇的便携式高灵敏的电化学适配体传感器的制备方法，步骤如下：
（1）探针的制备
1、AF1- ADA探针的制备
将0.5 g金刚烷羧酸溶解于甲醇中，用甲醇钠/甲醇为25% (w/w)的溶液处理至沉淀析出，用低温甲醇洗涤多次，真空干燥得到水溶性金刚烷羧酸钠盐。将含0.2 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、100 µL 0.1 M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和500µL金刚烷羧酸钠盐的混合溶液加入到1 OD AF1中。溶液震摇过夜，将形成的混合物离心洗涤多次，最终得到的AF1- ADA被分散在600 µL PBS (pH 7.4)溶液中。识别E2核酸适配体片段1的序列为AF1: 5′-NH2-AAG GGA TGC CGT TTG GG-3′；
2、AF2- AuNPs探针的制备
将100 mL 0.01% (w/v) HAuCl4水溶液在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入2 mL2% (w/v)柠檬酸钠，接着将混合溶液回流煮沸15 min，冷却至室温得到酒红色的AuNPs溶液。将50 μL、10 μM AF2溶液加入到450 μL AuNPs溶液中搅拌24 h得到AF2-AuNPs探针。识别E2核酸适配体片段2的序列为AF2: 5’-CCC AAG TTC GGC ATA GTG-SH-3’；
（2）β-CD修饰GCE电极的制备
a. 将直径为2.5-3.5 mm的玻碳电极（GCE）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉处理，将电极表面打磨成镜面，用乙醇和去离子水清洗以去除残留的Al2O3粉末，最后在双蒸馏水中连续超声，室温下干燥；
b. 将电极GCE浸在含有0.01 M β-CD的0.1 M PBS(pH 7.4)溶液中，采用CV法（图3），以20 mv/s的扫速在-1.0 ~ +1.0 V电压范围内连续循环10圈，制备好的β-CD/GCE备用；
（3）E2传感器的制备
传感器的制作过程如图1所示。
a. 将β-CD/GCE浸入AF1- ADA探针溶液10 min，然后与1.0 μM的DNA1（ON1）及AF2-AuNPs探针孵育45 min，得到E2传感器电极，记录为AF1-ADA/ON1/AF2-Au/β-CD/GCE。
b. 用a中制作电极与含有10 µM DNA2（ON2）溶液和不同浓度的E2孵育20 min后，用PBS缓冲溶液冲洗3次，即得E2适配体电化学传感器。DNA1的序列为: 5′-AAG CTT GGGCCA TGC CCA GGA AGG ACC CAA ACG G-3′，DNA2 :5′-CCG TTT GGG TCC TTC CTG GGC ATGGCC CAA GCT T-3′。
实施例2
一种检测17β-雌二醇的便携式高灵敏的电化学适配体传感器的制备方法，步骤如下：
（1）探针的制备
a. AF1- ADA探针的制备
将0.5 g金刚烷羧酸溶解于甲醇中，用甲醇钠/甲醇为25% (w/w)的溶液处理至沉淀析出，用低温甲醇洗涤多次，真空干燥得到水溶性金刚烷羧酸钠盐。将含0.2 g EDC、100µL 0.1 M NHS和500µL金刚烷羧酸钠盐的混合溶液加入到1 OD AF1中。溶液震摇过夜，将形成的混合物离心洗涤多次，最终得到的AF1- ADA被分散在600 µL PBS (pH 7.4)溶液中。识别E2核酸适配体片段1的序列为AF1: 5′-NH2-AAG GGA TGC CGT TTG GG-3′；
b. AF2- AuNPs探针的制备
将100 mL 0.01% (w/v) HAuCl4水溶液在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入2 mL2% (w/v)柠檬酸钠，接着将混合溶液回流煮沸15 min，冷却至室温得到酒红色的AuNPs溶液。将50 μL、10 μM AF2溶液加入到450 μL AuNPs溶液中搅拌24 h得到AF2-AuNPs探针。识别E2核酸适配体片段2的序列为AF2: 5’-CCC AAG TTC GGC ATA GTG-SH-3’；
（2）β-CD修饰GCE电极的制备
a. 将直径为2.5-3.5 mm的玻碳电极（GCE）依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉处理，将电极表面打磨成镜面，用乙醇和去离子水清洗以去除残留的Al2O3粉末，最后在双蒸馏水中连续超声，室温下干燥；
b. 将电极GCE浸在含有0.01 M β-CD的0.1 M PBS(pH 7.4)溶液中，采用CV法，以20 mv/s的扫速在-1.0 ~ +1.0 V电压范围内连续循环10圈，制备成β-CD/GCE备用；
（3）传感器的制备
a. 将β-CD/GCE浸入AF1- ADA探针溶液10 min，得到E2传感器电极，记录为AF1-ADA/β-CD/GCE；
b. 用a中制作电极与1.0 ~ 5.0 μMAF2-AuNPs探针和1.0 nM的E2孵育20 ~ 30min后，用PBS缓冲溶液冲洗3次，即得E2适配体电化学传感器。
实施例3
一种检测17β-雌二醇的便携式高灵敏的电化学适配体传感器的制备方法，步骤如下：
（1）探针的制备
a. AF1- ADA探针的制备
将0.5 g金刚烷羧酸溶解于甲醇中，用甲醇钠/甲醇为25% (w/w)的溶液处理至沉淀析出，用低温甲醇洗涤多次，真空干燥得到水溶性金刚烷羧酸钠盐。将含0.2 g EDC、100µL 0.1 M NHS和500µL金刚烷羧酸钠盐的混合溶液加入到1 OD AF1中。溶液震摇过夜，将形成的混合物离心洗涤多次，最终得到的AF1- ADA被分散在600 µL PBS (pH 7.4)溶液中。识别E2核酸适配体片段1的序列为AF1: 5′-NH2-AAG GGA TGC CGT TTG GG-3′；
b. AF2- AuNPs探针的制备
将100 mL 0.01% (w/v) HAuCl4水溶液在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入2 mL2% (w/v)柠檬酸钠，接着将混合溶液回流煮沸15 min，冷却至室温得到酒红色的AuNPs溶液。将50 μL、10 μM AF2溶液加入到450 μL AuNPs溶液中搅拌24 h得到AF2-AuNPs探针。识别E2核酸适配体片段2的序列为AF2: 5’-CCC AAG TTC GGC ATA GTG-SH-3’；
（2）β-CD修饰LSG电极的制备
LSG电极的制作参照发明内容（1）。将电极LSG浸在含有0.01 M β-CD的0.1 M PBS(pH 7.4)溶液中，采用CV法，以20 mv/s的扫速在-1.0 ~ +1.0 V电压范围内连续循环10圈，制备成β-CD/LSG备用；
本发明合成的β-CD/LSG聚合膜石墨烯电极材料料的形貌如图1所示。图1 显示出石墨烯电极的薄层、表面多皱纳米结构，同时可以看出β-CD均匀地分布在石墨烯薄层上，且呈现的网状分布。利用β-CD/LSG聚合膜复合石墨烯作为基底电极，一方面，网状的β-CD聚合膜通过其分子的空腔可以结合大量的客体分子ADA；另一方面，石墨烯的层状分布具有表面极大，可以承载更多的聚合膜沉积其上。
（3）传感器的制备
a. 便携式E2高灵敏传感器设计如图4所示。将β-CD/LSG浸入AF1- ADA探针溶液10min，然后与1.0 μM的DNA1（ON1）及AF2-AuNPs探针孵育45 min，得到E2传感器电极，记录为AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/LSG；
b. 用a中制作电极与含有10 µM DNA2（ON2）溶液和不同浓度的E2孵育20 min后，用PBS缓冲溶液冲洗3次，即得E2适配体电化学传感器。DNA1的序列为: 5′-AAG CTT GGGCCA TGC CCA GGA AGG ACC CAA ACG G-3′，DNA2 :5′-CCG TTT GGG TCC TTC CTG GGC ATGGCC CAA GCT T-3′。
实施例4
一种检测17β-雌二醇的便携式高灵敏的电化学适配体传感器的制备方法，步骤如下：
（1）探针的制备
a. AF1- ADA探针的制备
将0.5 g金刚烷羧酸溶解于甲醇中，用甲醇钠/甲醇为25% (w/w)的溶液处理至沉淀析出，用低温甲醇洗涤多次，真空干燥得到水溶性金刚烷羧酸钠盐。将含0.2 g EDC、100µL 0.1 M NHS和500µL金刚烷羧酸钠盐的混合溶液加入到1 OD AF1中。溶液震摇过夜，将形成的混合物离心洗涤多次，最终得到的AF1- ADA被分散在600 µL PBS (pH 7.4)溶液中。识别E2核酸适配体片段1的序列为AF1: 5′-NH2-AAG GGA TGC CGT TTG GG-3′；
b. AF2- AuNPs探针的制备
将100 mL 0.01% (w/v) HAuCl4水溶液在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入2 mL2% (w/v)柠檬酸钠，接着将混合溶液回流煮沸15 min，冷却至室温得到酒红色的AuNPs溶液。将50 μL、10 μM AF2溶液加入到450 μL AuNPs溶液中搅拌24 h得到AF2-AuNPs探针。识别E2核酸适配体片段2的序列为AF2: 5’-CCC AAG TTC GGC ATA GTG-SH-3’；
（2）β-CD修饰LSG电极的制备
LSG电极的制作参照发明内容（1）。将电极LSG浸在含有0.01 M β-CD的0.1 M PBS(pH 7.4)溶液中，采用CV法，以20 mv/s的扫速在-1.0 ~ +1.0 V电压范围内连续循环10圈，制备成β-CD/LSG备用；
（3）传感器的制备
a. 将β-CD/LSG浸入AF1- ADA探针溶液10 min，然后与1.0 μM的DNA1（ON1）及1.0μM的AF2-AuNPs探针孵育45min，得到E2传感器电极，记录为AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs /β-CD/LSG；
b. 用a中制作电极与含有10 µM DNA2（ON2）溶液和不同浓度牛奶样品孵育20 min后，用PBS缓冲溶液冲洗3次，既得E2适配体电化学传感器。DNA1的序列为: 5′-AAG CTT GGGCCA TGC CCA GGA AGG ACC CAA ACG G-3′；DNA2 :5′-CCG TTT GGG TCC TTC CTG GGC ATGGCC CAA GCT T-3′。
实施例5
一种检测17β-雌二醇的便携式高灵敏的电化学适配体传感器的制备方法，步骤如下：
（1）探针的制备
a. AF1- ADA探针的制备
将0.5 g金刚烷羧酸溶解于甲醇中，用甲醇钠/甲醇为25% (w/w)的溶液处理至沉淀析出，用低温甲醇洗涤多次，真空干燥得到水溶性金刚烷羧酸钠盐。将含0.2 g EDC、100µL 0.1 M NHS和500µL金刚烷羧酸钠盐的混合溶液加入到1 OD AF1中。溶液震摇过夜，将形成的混合物离心洗涤多次，最终得到的AF1- ADA被分散在600 µL PBS (pH 7.4)溶液中。识别E2核酸适配体片段1的序列为AF1: 5′-NH2-AAG GGA TGC CGT TTG GG-3′；
b. AF2- AuNPs探针的制备
将100 mL 0.01% (w/v) HAuCl4水溶液在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入2 mL2% (w/v)柠檬酸钠，接着将混合溶液回流煮沸15 min，冷却至室温得到酒红色的AuNPs溶液。将50 μL、10 μM AF2溶液加入到450 μL AuNPs溶液中搅拌24 h得到AF2-AuNPs探针。识别E2核酸适配体片段2的序列为AF2: 5’-CCC AAG TTC GGC ATA GTG-SH-3’；
（2）β-CD修饰LSG电极的制备
LSG电极的制作参照发明内容（1）。将电极LSG浸在含有0.01 M β-CD的0.1 M PBS(pH 7.4)溶液中，采用CV法，以20 mv/s的扫速在-1.0 ~ +1.0 V电压范围内连续循环10圈，制备成β-CD/LSG备用；
（3）传感器的制备
a. 将β-CD/LSG浸入AF1- ADA探针溶液 20 min，然后与5.0 μM的DNA1（ON1）及5.0 μM的AF2-AuNPs探针孵育 55 min，得到E2传感器电极，记录为AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/LSG；
b. 用a中制作电极与含有10 µM DNA2（ON2）溶液和不同浓度牛奶样品孵育20 min后，用PBS缓冲溶液冲洗3次，既得E2适配体电化学传感器。DNA1的序列为: 5′-AAG CTT GGGCCA TGC CCA GGA AGG ACC CAA ACG G-3′；DNA2 :5′-CCG TTT GGG TCC TTC CTG GGC ATGGCC CAA GCT T-3′。
实施效果例:生物传感器的性能检测
（1）β-CD聚合膜的制备
采用循环伏安法聚合β-CD膜在电极上，如图3所示。随着聚合过程的进行，CV曲线电流不断减小，表示β-CD在电极上的生成。
（2）GCE电极的电化学阻抗检测
实验采用电化学交流阻抗EIS表征电极的制备过程，在含有5mm的[Fe(CN)6]3-/4-的PBS缓冲溶液中对每一步组装进行验证，如图4所示。裸GCE电极(曲线a)的阻抗值很小，说明电子在玻碳电极表面的传递不受阻碍。当聚合膜β-CD修饰到电极上，其阻抗值从70.6 Ohm增加到557.7 Ohm(曲线b)，其原因是β-CD聚合膜导电性差，会阻碍电子在电极表面的传递。将AF1-ADA组装到β-CD/GCE上后，观察到阻抗值进一步增加到1500 Ohm（曲线c），这是因为AF1磷酸骨架带负电荷，对溶液中的[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-的排斥作用阻碍了电子在电极表面的传递。在AF1-ADA/β-CD/GCE 与DNA1和AF2-AuNPs作用后，阻抗值再度增加到3086Ohm（曲线d），证明电极上因为杂交作用负载了更多含有负电荷的磷酸骨架，阻碍了电子的传递过程。阻抗图可以表明适配体传感器的成功构建。
（3）E2在GCE电极的检测曲线
根据实施例1，检测本发明的核酸适配体传感器在不同浓度E2中电化学信号，绘制峰电流改变值与E2浓度的标准曲线图，具体检测步骤如下：
1）将AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/GCE传感器浸入一系列浓度(1 fM，10 fM,100fM,1 pM,10 pM,100 pM,1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM)的E2溶液中，培育20 min后，用0.1M PBS (pH=7.4)缓冲溶液清洗电极。
2）将传感器连接到电化学仪器设备上：在电解槽中加入0.1 M HCl溶液中进行检测，首先+1.25 V条件下预氧化150 s，然后进行DPV扫描，扫描电位从+0.6 V到+0.2 V，脉冲幅度为50 mV，脉冲宽度为50 ms。根据电位为+ 0.44 V的DPV峰电流电化学信号，如图5A，根据DPV信号与对应的E2浓度建立标准曲线。
根据E2浓度及所对应的电流信号，绘出如图5B的E2浓度与ΔI之间的线性相关关系图，线性回归方程为ΔI=17.834 + 0.896 log CE2（1 pM 至10 nM），线性相关关系为R2=0.998，检出限0.7 fM(S/N ≥3)。
（4）DNA 1与DNA2在传感器中的必要性验证
根据实施例2，对DNA1与DNA2在传感器中的必要性进行验证，如图6所示。AF1-ADA/β-CD/GCE与E2和AF2-Au孵育后，DPV峰电流为0.59 µA（黑色柱状图）, 由于E2作为目标物存在，促使AF1和AF2与之结合，导致电极上检测到AuNPs的电流信号。当采用有DNA1构建传感器时，以AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/GCE与E2孵育后，DPV电流为1.0 ± 0.03 µA（红色柱状图）。由此得出结论，传感器中加入DNA1和DNA2的传感器设计提供了更大的信号响应。
（5）LSG电极制作
根据实施例3，LSG电极的制作与传感器的设计过程示意图如图7所示。
（6）LSG电极的电化学阻抗检测
根据实施例3，实验采用电化学交流阻抗测试表征电极的制备过程，不同制备阶段的传感界面在5 mM的[Fe(CN)6]3-/4-溶液中测试，如图8所示。裸LSG电极(曲线a)的阻抗值很小，说明电子在石墨烯打印电极表面的传递不受阻碍。当聚合膜β-CD修饰到电极上，其阻抗值略有增加，其原因时β-CD聚合膜为电的不良导体，会阻碍电子在电极表面的传递。在β-CD/LSG结合了AF1-ADA之后（曲线c），阻抗值增加，这是因为AF1为负电荷的核酸骨架，对溶液中的[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-的排斥作用阻碍了电子在电极表面的传递。在AF1-ADA/β-CD/LSG 与DNA1和AF2-AuNPs作用后(曲线d)，阻抗值再度增加，证明电极上因为杂交作用负载了更多含有负电荷的磷酸骨架，阻碍了电子的传递过程。阻抗图可以表明适配体传感器的成功构建。
（7）标准曲线的绘制
检测本发明的核酸适配体传感器在不同浓度E2中电化学信号，绘制峰电流改变值与E2浓度的标准曲线图，具体检测步骤如下：
1）将AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/LSG传感器浸入一系列浓度(10 fM,100 fM,1pM,10 pM,100 pM,1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM)的E2溶液中，培育20 min后，用0.1 M PBS(pH=7.4)缓冲溶液清洗电极。
2）将传感器连接到电化学仪器设备上：在电解槽中加入0.1 M HCl溶液中进行检测，首先+1.25 V条件下预氧化150 s，然后进行DPV扫描，扫描电位从+0.6 V到+0.2 V，脉冲幅度为50 mV，脉冲宽度为50 ms。根据电位为+ 0.44 V的DPV峰电流电化学信号，根据DPV信号与对应的E2浓度建立标准曲线。
根据E2浓度及所对应的电流信号，绘出如图9的E2浓度与ΔI之间的线性相关关系图，线性回归方程为ΔI=16.724 + 0.916 log CE2（100 fM 至1 nM），线性相关关系为R2=0.9997，检出限20 fM(S/N ≥3)。
8) 重现性测试
采用11支不同的LSG电极检测1.0 nM的E2，根据结果显示，不同电极之间的相对标准偏差为3.05%，说明所制备的电极具有良好的重现性。
9) 选择性测试
对传感器的选择性进行了研究, 由于BPA具有相似的分子结构且BSA代表真实生物样本中的蛋白种类，因此选择BSA和BPA进行了干扰测试实验，如图10所示。将LSG电极依次和10 µM的BSA和BPA孵育，DPV峰电流分别是1.9 µA和1.3 µA,分别是10 fM E2的峰电流的40%和27% 。可见本发明所制备的传感器具有较好的选择性。
应用例：牛奶样品中E2的检测
AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/LSG在实际样品中检测E2是通过检测已知E2浓度的牛奶样品的传感性能来评估的。采用标准添加法，将200 pM、500 pM和1 nM E2加入到用PBS缓冲溶液（含5%乙醇）牛奶样品稀释1000倍的牛奶样品中。记录加入不同浓度E2前后的DPV信号。结果表明，未加标样品中E2的浓度为1.329 µM，加标浓度分别为180 pM、420 pM和0.95 nM，加标回收率分别为90%、84%和95%。这个结果说明本发明的一次性AF1-ADA/ON1/AF2-Au /LSG检测E2是一种很有前景的检测实际样品中E2的方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测17β-雌二醇的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）配制ADA的甲醇溶液，与甲醇钠的甲醇溶液反应至沉淀析出，经洗涤、真空干燥后得水溶性金刚烷羧酸钠盐；再将EDC、NHS和水溶性金刚烷羧酸钠盐的混合溶液加至AF1中，振荡过夜后，将形成的混合物离心洗涤得AF1- ADA探针；
（2）将HAuCl4水溶液在搅拌下加热至沸腾，然后加入柠檬酸钠溶液，回流煮沸15min，冷却至室温得到AuNPs溶液，然后再加入AF2溶液，搅拌24 h得AF2-AuNPs探针；
（3）将电极浸入含有0.01 M β-CD的 PBS溶液中，通过CV法将β-CD聚合到电极表面，得β-CD/电极；
（4）通过金刚烷和环糊精的主客体识别作用将步骤（1）的AF1-ADA探针组装到步骤（3）的β-CD/电极上，然后在含有相同浓度的ON1和AF2-AuNPs溶液中孵育45 min，形成AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs刚性双链结构，即为AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/电极电化学适配体传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中ADA、甲醇钠的质量比为1:0.3；每1 OD AF1溶液中添加0.2- 0.6 g EDC、100-300 µL 0.1 M NHS及500 -1500µL金刚烷羧酸钠盐溶液，其中金刚烷羧酸钠盐溶液的浓度为0.5 M ；AF1的序列为5′-NH2-AAGGGATGCCGTTTGGG-3′。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中HAuCl4水溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为50:1，HAuCl4水溶液的质量体积比浓度为0.01%，柠檬酸钠溶液的质量体积比浓度为2%。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中AuNPs溶液与AF2溶液的体积比为1:9，其中AF2溶液的浓度为10 μM，AF2的序列为5’-CCCAAGTTCGGCATAGTG-SH-3’。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中电极为GCE或LSG；其中制作LSG电极的CO2激光的波长为10.6μm，激光速度为0.45 cm/s，功率为2.7 W，每英寸激光脉冲(PPI)为1000，透镜衬底距离为5.1cm；LSG电极上设有3个电极，其中工作电极的直径为2mm，银浆的参数为5000导电胶，稀释剂8260，60℃下固化30分钟；制作GCE依次采用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉处理，将电极表面打磨成镜面，用乙醇和去离子水清洗以去除残留的Al2O3粉末，最后在双蒸馏水中连续超声，室温下干燥。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中PBS溶液的参数为pH7.4、0.1 M， CV法的条件为，扫速 20mv/s，电压 -1.0 ~ +1.0 V，圈数 10圈。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中ON1为DNA1，其核苷酸序列为5′-AAGCTTGGGCCATGCCCAGGAAGGACCCAAACGG-3′，DNA1和AF2-AuNPs的物质的量均为1×10-6 M。
8.权利要求7所述的方法制备的检测17β-雌二醇的电化学适配体传感器，其特征在于：包括用于主客体识别ADA标记的探针AF1-ADA、金纳米颗粒标记的探针AF2-AuNPs、ON1及β-CD修饰的电极；其中探针AF1-ADA、AF2-AuNPs与DNA1共同形成刚性双链结构AF1-ADA/ ON1/AF2-AuNPs，刚性双链结构AF1-ADA/ ON1/AF2-AuNPs通过用于主客体识别ADA标记的探针AF1-ADA与β-CD修饰的电极相结合，形成AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/电极传感器，即为电化学适配体传感器。
9.权利要求8所述的电化学适配体传感器的使用方法，其特征在于，步骤如下：
a. 将构建好的AF1-ADA/ON1/AF2-AuNPs/β-CD/电极传感器浸泡于一系列浓度为1×10-14、1×10-13、1×10-12、1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6 M的17β-雌二醇和10 µM ON2组成的标准溶液中，在28 ℃下孵育20 min后取出并用PBS缓冲溶液清洗3次，得到17β-雌二醇电化学适配体传感器工作溶液；
b. 将步骤a得到的17β-雌二醇电化学适配体传感器工作溶液作为工作电极，电极上同时具有银参比电极和对电极，在0.1 M盐酸溶液中进行电化学DPV检测，根据所得的峰电流大小与E2的标准溶液之间的关系，绘制工作曲线；
c. 将待测样本稀释800 - 1100倍代替标准溶液，按照步骤a、b的操作进行检测，将检测出来的电流信号带入步骤b得到的工作曲线，即得到待测样本中17β-雌二醇的浓度。
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