CN110006868A - 提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于适配体后筛选技术领域和生物传感快速检测技术领域，具体涉及提升氧化石墨烯(GO)基适配体传感器响应性能的方法。本发明的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，包括以下步骤：根据原适配体二级结构设计截短适配体；监测截短适配体与靶标之间的相互作用及构型改变；测定靶标出现前后截短适配体与氧化石墨烯间的淬灭常数；从探针构型、结合强度以及吸脱附难易等方面综合分析判断，得到适用于氧化石墨烯平台的具有最佳响应性能的适配体，并以此构建氧化石墨烯基适配体传感平台。本发明构造了高性能的GO基适配体传感器，实现了对单个霉菌毒素以及多个霉菌毒素的快速灵敏检测。

Description

提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法
技术领域
本发明属于适配体后筛选技术领域和生物传感快速检测技术领域，具体涉及提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法。
背景技术
氧化石墨烯(GO)基适配体传感器是一类简单且易于使用的检测平台，通常采用荧光标记的核酸适配体(aptamer)作为探针、水溶性的GO作为探针吸附和荧光淬灭载体。在通常情况下，适配体探针被紧紧吸附在GO表面而荧光淬灭，当出现靶标时，靶标与探针间的特异性相互作用使适配体从GO表面脱附，从而产生显著的荧光输出信号。氧化石墨烯(GO)基适配体传感平台兼具适配体和GO的特点，具有操作简单、易于使用、响应快速、检测通量高等突出优点，非常适用于各种现场环境中的快速检测，因而在食品监测、环境分析、临床诊断、个人健康评测等领域具有良好的应用前景。
然而，这类GO基适配体传感器存在较低的灵敏度和较高信噪比的缺陷，这种缺陷在采用碱基数大于40的长链适配体作为探针构建适配体-GO传感平台时，表现得尤为突出，从而严重地制约了其实际应用。
现有技术通过剪切可去除适配体上的个别片段，根据适配体与靶标间的相互作用，即两者间解离常数Kd或亲和常数Ka的大小作为判据来实施适配体中冗余碱基的识别，从而剔除对结合靶标无关紧要的片段以提升适配体的响应检测性能。但是，由于GO-适配体复合平台的体系中同时存在靶标、适配体和GO，三者间相互作用关系复杂，单纯使用解离常数Kd或Ka无法对复合体系存在的冗余碱基进行有效的识别，所获得的最优截短序列并不一定最适于GO平台，据此所构建的GO基适配体传感器的响应性能通常提升有限。因此，建立适用于GO-适配体复合平台的适配体序列优化的综合性判断方法具有重要意义，同时也存在极大的挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于氧化石墨烯平台的具有最佳响应性能的适配体序列的筛选方法。
本发明的再一目的在于提供一种提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法。
根据本发明具体实施方式的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)设计剔除冗余碱基的截短适配体；
(2)监测步骤(1)得到的截短适配体与靶标之间的相互作用，选择构型变化较大且与靶标具有较大亲和力的截短适配体；
(3)测定靶标出现前，截短适配体与氧化石墨烯基的淬灭常数为Kp1；以及测定靶标出现后，适配体-靶标耦合物与氧化石墨烯基的淬灭常数为Kp2；
(4)计算Kp1/Kp2，选择具有最大Kp1/Kp2值的适配体为所述靶标的响应最佳的截短适配体；
(5)使用步骤(4)得到的截短适配体构造氧化石墨烯基适配体传感器。
根据本发明具体实施方式的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，配体靶标广泛，包括所有与氧化石墨烯吸附较弱的DNA、病毒、蛋白质、毒素、农药、维生素、细胞等，例如，黄曲霉毒素B1(AFB1)和/或赭曲霉毒素A(OTA)。
根据本发明具体实施方式的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，在步骤(2)中，利用圆二色谱法监测靶标加入前后截短适配体的构型改变程度。
根据本发明具体实施方式的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，步骤(3)中，利用荧光滴定法测定截短适配体与靶标的亲和力。
根据本发明具体实施方式的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，步骤(4)得到的响应性能强的适配体包括P-AFB1-40、P-OTA-36，其中，P-AFB1-40的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，P-OTA-36的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1：GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCTTCG C
SEQ ID No.2：GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA
根据本发明具体实施方式的筛选氧化石墨烯基适配体传感器的响应性能最佳的适配体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)监测适配体与靶标之间的相互作用，选择与靶标存在较强相互作用的适配体；
(2)测定步骤(1)得到的适配体与靶标的亲和力大小，选择具有较高亲和力的适配体作为候选序列；
(3)分别测定靶标出现前后候选适配体与氧化石墨烯间的淬灭常数Kp，其中，靶标出现前，适配体与氧化石墨烯基的淬灭常数为Kp1，靶标出现后，适配体/靶标耦合物与氧化石墨烯基的淬灭常数为Kp2；
(4)计算Kp1/Kp2，选择具有最大Kp1/Kp2值的适配体为所述靶标的响应最佳的适配体。
根据本发明具体实施方式的筛选氧化石墨烯基适配体传感器的响应性能最佳的适配体的方法，适配体靶标广泛，所有与氧化石墨烯吸附较弱的DNA、病毒、蛋白质、毒素、农药、维生素、细胞等，例如，黄曲霉毒素B1和/或赭曲霉毒素A。
根据本发明具体实施方式的筛选氧化石墨烯基适配体传感器的响应性能最佳的适配体的方法，在步骤(1)中，利用圆二色谱法监测靶标加入前后适配体的构型改变程度，选择构型发生改变的适配体。
根据本发明具体实施方式的筛选氧化石墨烯基适配体传感器的响应性能最佳的适配体的方法，步骤(1)中，利用荧光滴定法测定适配体与靶标的亲和力。
本发明的有益效果：
本发明发现长链适配体中的冗余碱基是导致GO-适配体复合传感平台响应性能差的主要原因，具体原因包括：其一，冗余碱基的存在降低了适配体与靶标的亲和力；其二，长链适配体常因冗余碱基的存在而呈现复杂的二级结构，从而降低了其与GO的结合效率，使背景信号过高；其三，冗余碱基的存在使靶标引起的探针构型应激改变程度降低，从而导致适配体-靶标结合物不能有效地从GO表面脱落；其四，当适配体链端存在冗余碱基片段时，这部分单链的存在使适配体-靶标结合物与GO间仍存在较强的相互作用。
本发明以SELEX技术获得的原适配体的模拟结构为参考，以其两个链端为起点逐步剔除冗余碱基获得不同长度的截短适配体链，通过测试其解离常数Kd值以及目标物出现前后适配体的构型改变程度，初步遴选出与靶标结合较强且构型变化较大的备选序列，进而通过荧光淬灭实验测定靶标出现前后候选适配体与氧化石墨烯间淬灭常数的比值(即Kp1/Kp2值)，并据此判断该适用于GO-适配体复合平台的最佳适配体碱基序列。
根据本发明的具体实施方式，基于对探针构型、结合强度以及吸脱附等方面的综合分析，有效识别裁剪P-AFB1-50、P-OTA-61中冗余碱基，进一步以裁剪后的最优化的适配体为探针，构造了高性能的GO基适配体传感器，实现了对单个霉菌毒素以及多个霉菌毒素的快速灵敏检测。
附图说明
图1显示实施例1中靶标AFB1出现前后截短适配体的圆二色谱图；
图2显示实施例1中截短适配体链的荧光滴定曲线；
图3显示实施例1中靶标AFB1出现前后截短适配体链与GO结合的淬灭常数(Kp)的测定曲线；
图4显示GO浓度的优化结果；
图5显示AFB1检测标准曲线图；
图6显示本发明的适配体/GO检测平台的选择性情况；
图7显示实施例2中靶标OTA出现前后系列截短适配体链构型监测的CD光谱图；
图8显示实施例2中系列截短适配体的荧光滴定曲线；
图9显示实施例2中OTA出现前后截短适配体与GO结合的淬灭常数(Kp)的测定曲线；
图10显示实施例2中检测OTA的标准曲线图；
图11显示构建双通道适配体/GO检测平台时的GO浓度的优化情况；
图12显示双通道适配体/GO检测平台用于AFB1和OTA的定性检测情况；
图13显示双通道适配体/GO检测平台用于AFB1和OTA的定量检测情况。
具体实施方式
实施例1适配体/GO检测平台检测AFB1
1.1适配体截短
将P-AFB1-50进行碱基剔除设计，得到系列截短适配体，分别为P-AFB1-50，P-AFB1-46，P-AFB1-40，P-AFB1-35，P-AFB1-31，P-AFB1-37，P-AFB1-34和P-AFB1-30，截短适配体序列如表1所示：
表1P-AFB1-50截短适配体序列
1.2CD方法监测靶标出现前后截短适配体的构型改变程度
在10mM Tris盐缓冲溶液(pH 8.0，120mM NaCl，20mM CaCl2，5mM KCl)中，分别测试AFB1(1.0μg mL-1)出现前后浓度为1.0μM的P-AFB1-50链的CD光谱图。如图1所示，P-AFB1-50适配体链在AFB1出现之后，CD光谱图在283nm处的正峰有明显的增强。因此，CD技术可以用来表征适配体链与AFB1之间的相互作用，且通过对CD信号强度变化进行定量，可以表征适配体与AFB1之间的结合强度与构型改变程度。
使用CD技术分别测定上述系列截短适配体P-AFB1-50，P-AFB1-46，P-AFB1-40，P-AFB1-35，P-AFB1-31，P-AFB1-37，P-AFB1-34和P-AFB1-30的构型改变程度。
如图1所示，P-AFB1-50，P-AFB1-46，P-AFB1-40，P-AFB1-35，P-AFB1-37和P-AFB1-34适配体链在AFB1出现之后，CD光谱图均发生变化，其中，谱图在283nm处的正峰有明显的增强，因此，将3’-端的15个碱基以及5’-端的6个碱基剔除之后，适配体仍然可以与AFB1结合并诱导适配体链构型改变，据此可初步判断3’-端的15个碱基以及5’-端的6个碱基为冗余碱基；另外，P-AFB1-40在AFB1出现之后，CD信号改变最为明显。
1.3荧光滴定法测定截短适配体与靶标的解离常数
将10mMα-环糊精和160nM AFB1在Tris盐缓冲溶液中混合10min，得到α-环糊精/AFB1体系，以P-AFB1-50为例进行截短适配体的荧光滴定实验。如图2所示，随着适配体浓度由0μM增大到6μM，体系荧光强度逐渐降低，结合Scatchard分析法可以得到适配体P-AFB1-50与AFB1的解离常数为169nM。
用上述荧光滴定法分别测定系列截短适配体的解离常数。如图2所示，随着碱基的剔除，P-AFB1-50，P-AFB1-46，P-AFB1-40，P-AFB1-35，P-AFB1-37和P-AFB1-34适配体链均保持了较强的亲和力，而P-AFB1-31和P-AFB1-30则失去了与AFB1的结合能力，说明3’-端的15个碱基以及5’-端的6个碱基为冗余碱基，与CD分析结果保持一致；其中P-AFB1-40和P-AFB1-35链对AFB1的亲和力较强。
1.4荧光淬灭实验测定AFB1出现前后候选截短适配体与GO间的淬灭常数
靶标出现前后适配体与GO的淬灭常数之间的比值，即自由的适配体链、适配体-靶标耦合物的淬灭常数比值，是决定适配体/GO平台检测性能的关键因素。
采取荧光淬灭滴定实验测试截短适配体在靶标出现前后与GO结合的Kp值。以P-AFB1-50适配体链为例，将100nM FAM标记的P-AFB1-50适配体与不同浓度的GO(0～14μgmL-1)混合孵育10min，进而使用荧光光谱仪测试其荧光光谱，记录荧光光谱峰位置520nm处的荧光强度，并以ln(F0/F)为纵坐标(F0为GO浓度为0时的荧光强度，F为不同浓度GO存在时测得的荧光强度)，[GO]为横坐标作图，进行线性拟合，得到适配体与GO间的淬灭常数Kp1。
将100nM FAM标记的P-AFB1-50与500ng mL-1AFB1在Tris盐缓冲中混合10min得到100nM FAM标记的适配体-AFB1耦合物，加入0～28μg mL-1不同浓度的GO混合孵育10min，采取上述手段得到相应的F0(F0为GO浓度为0时的荧光强度)和F(F为不同浓度GO存在时测得的荧光强度)，以ln(F0/F)为纵坐标，[GO]为横坐标作图，进行线性拟合可以得到适配体/AFB1耦合物与GO的淬灭常数Kp2。
使用上述方法分别测定一系列截短适配体的Kp1和Kp2值。如图3所示，随着P-AFB1-50末端单链碱基的剔除，Kp值逐渐降低，说明截短适配体链与GO结合能力逐渐下降；其中，P-AFB1-40具有较大的Kp1值，较小的Kp2值，即最大的Kp1/Kp2值，表明P-AFB1-40与GO结合能力较强，P-AFB1-40/AFB1耦合物更易从GO表面脱离，因此，P-AFB1-40为GO基适配体复合平台的最佳碱基序列。
综合分析探针构型、结合强度以及吸脱附三方面的影响因素，有效识别适配体的最佳碱基序列，结果见表2：
表2适配体/GO检测平台的截短适配体检测结果
如表2所示，P-AFB1-40和P-AFB1-35在AFB1出现之后均呈现出较为明显的CD信号的变化，且两条链均有最小的Kd值，与AFB1有较强的结合能力；根据靶标出现前后适配体与GO的淬灭常数比值，P-AFB1-40具有较大的Kp1值及较小的Kp2值，表明其不但与GO结合能力较强，而且P-AFB1-40/AFB1耦合物易从GO表面脱离，最大的Kp1/Kp2值意味着P-AFB1-40为GO基适配体复合平台的最佳碱基序列。
1.5最优截短适配体链构建适配体/GO平台并用于AFB1的实际检测
选择浓度梯度为5～30μg mL-1的GO，测定不同浓度GO下P-AFB1-40和P-AFB1-50体系的荧光淬灭率，结果如图4所示，适用于P-AFB1-40和P-AFB1-50体系GO的最佳浓度分别为16μg mL-1和12μg mL-1。
将FAM标记的浓度为100nM的P-AFB1-40、原始适配体链P-AFB1-50分别与浓度为16μg mL-1和12μg mL-1的GO混合3min，向混合溶液中加入0～150ng mL-1不同浓度的AFB1，10min后使用荧光光谱仪测试体系荧光光谱，并采集荧光光谱峰520nm处的数据作为荧光强度F。每个浓度重复测试3次。
如图5所示，截短适配体P-AFB1-40用于检测AFB1时信号强度可以达到背景水平的3倍以上，检测限为4.6ng mL-1(根据“3σ/b”规则计算检测限，其中σ是截距的标准偏差，b是回归直线的斜率)，而原始适配体链P-AFB1-50用于检测AFB1时信号强度很弱，没有达到背景信号水平的一倍，其检测限为29.32ng mL-1，明显偏高。
将FAM标记的浓度为100nM的P-AFB1-40与浓度为16μg mL-1的GO混合3min，向混合溶液中加入不同靶标，加入靶标分别为AFB1、ZEN、OTA和Acetamiprid，验证检测平台的选择性。结果如图6所示，当加入靶标为AFB1时，荧光强度明显增强，而加入其他靶标时，荧光强度基本不变，因此，本发明的适配体/GO检测平台的选择性良好。
在含1％白酒的Tris盐缓冲体系中，分别向适配体/GO体系(FAM标记的浓度为100nM的P-AFB1-40，16μg mL-1的GO)加入15ng/mL、40ng/mL及60ng/mL的AFB1，测定本发明适配体/GO检测平台的准确性，并与HPLC法测定结果进行对比，结果见表3：
表3适配体/GO检测平台对AFB1的回收率数据
结果如表3所示，本发明的适配体/GO平台对AFB1的回收率在94.5％～104.5％范围内，且与HPLC测试结果保持一致。
因此，本发明的适配体/GO平台灵敏，准确，可靠，适用于实际样品中AFB1的检测。
实施例2适配体/GO检测平台检测OTA
2.1序列截短
将P-OTA-61适配体进行碱基剔除设计，得到系列截短适配体，分别为P-OTA-61，P-OTA-48和P-OTA-36，截短适配体的序列见表4：
表4 P-OTA-61系列截短适配体碱基序列
2.2利用CD方法测试OTA出现前后上述截短适配体的构型改变程度
在10mM Tris盐缓冲溶液(pH 8.0，120mM NaCl，20mM CaCl2，5mM KCl)中，分别测试浓度为1.0μg mL-1OTA出现前后浓度为1.0μM的适配体链(P-OTA-61，P-OTA-48，P-OTA-36)的CD光谱图。
如图7所示，向原始适配体P-OTA-61溶液中加入OTA之后，未能引起CD信号的变化，说明P-OTA-61链因OTA诱导产生的构型改变程度微小。而经过碱基剔除得到的适配体P-OTA-48和P-OTA-36与OTA作用之后引起了CD信号的明显变化，在265nm处有一明显负峰，在290nm处有一明显正峰，说明截短适配体链与OTA作用之后形成了G-四链体特殊构型，且初步说明5’-端的21个碱基和3’-端的4个碱基为冗余碱基。
2.3使用荧光滴定手段测定截短适配体与OTA的解离常数Kd
向200nM OTA溶液中分别加入不同浓度的适配体链P-OTA-61，P-OTA-48和P-OTA-36(0～6.0μM)混合孵育10min，进而测试其荧光光谱，并记录峰位置435nm处数据作为荧光强度F用以绘制荧光滴定曲线。如图8所示，随着适配体浓度的增大，体系荧光强度逐渐降低，结合Scatchard分析法可以得到适配体P-OTA-61，P-OTA-48和P-OTA-36与AFB1的解离常数分别为90nM，426nM和132nM。结果表明，截短适配体P-OTA-48和P-OTA-36仍保持了较强的结合能力，说明5’-端的21个碱基和3’-端的4个碱基为冗余碱基，与CD表征结果一致。
2.4利用荧光淬灭实验测定OTA出现前后截短适配体与GO间的淬灭常数Kp
将100nM Texas red标记的P-OTA-61，P-OTA-48和P-OTA-36适配体链或者100nMTexas red标记的适配体-OTA耦合物与不同浓度的GO(0～3.0μg mL-1)混合孵育10min，进而测试其荧光光谱，记录峰位置620nm处的荧光强度作为F，并以ln(F0/F)为纵坐标，[GO]为横坐标作图，进行线性拟合，分别得到OTA出现前后适配体与GO间的Kp值。
结果如图9所示，随着碱基的逐渐剔除，Kp值逐渐增大，说明截短适配体链与GO结合能力逐渐增强，且OTA出现前后诱导的Kp值之间的差异(Kp1/Kp2值)逐渐增大，表明Kp1/Kp2值最大的P-OTA-36为GO基适配体复合平台的最佳碱基序列。
综合分析探针构型、结合强度以及吸脱附三方面的影响因素，有效识别适配体的最佳碱基序列，结果见表5：
表5 P-OTA-61适配体中冗余碱基的综合分析数据
结果如表5所示，P-OTA-36在OTA出现之后发生了更明显的构型改变，与P-OTA-61拥有相当的结合能力，而且P-OTA-36较P-OTA-61具有更大的Kp1/Kp2值。表明Kp1/Kp2值最大的P-OTA-36为GO基适配体复合平台的最佳碱基序列。
2.5对比P-OTA-61与P-OTA-36用于构建适配体/GO平台的性能
分别向100nM Texas red标记的适配体(P-OTA-61和P-OTA-36)溶液中加入GO溶液(4.0μg mL-1和5.0μg mL-1)混合3.0min，进而向混合溶液中加入不同浓度的OTA(0～2400ngmL-1)，10min后测试体系荧光光谱，并采集荧光光谱620nm处的数据作为荧光强度F。每个浓度重复测试3次。
结果如图10所示，随着OTA浓度的增大，P-OTA-36/GO体系荧光强度逐渐增大，而P-OTA-61/GO体系荧光强度几乎维持不变，无法实现OTA的检测。说明经过优化的截短适配体构造GO基传感平台时显示出更好的检测性能，验证了本发明提出的识别冗余碱基综合判据的普适性。
实施例3构建双通道适配体/GO荧光响应平台实现AFB1和OTA的同时检测
为了平衡不同性质适配体链与GO的相互作用，将60nM FAM标记的P-AFB1-40和180nM Texas red标记的P-OTA-36进行混合，然后向溶液中加入不同浓度的GO进行GO浓度的优化，混合3min后使用测试其荧光光谱。
如图11所示，随着GO浓度的增大，两通道发射波长处的荧光强度均逐渐下降，当GO浓度增大到16μg mL-1时，P-OTA-36-Texas red的淬灭效率达到95％，而P-AFB1-40-FAM的淬灭效率达到80％。因此，本实验选择16μg mL-1GO用于构建双通道适配体/GO复合平台用于靶标物的定性和定量检测。
向适配体/GO体系中加入相应的靶标物(1.0μg mL-1AFB1或4.0μg mL-1OTA)反应10min，然后使用荧光光谱仪采集荧光光谱。
如图12所示，当待测液中不存在靶标物时，两个通道的荧光信号均保持最低的状态。当待测液中存在OTA时，其诱导P-OTA-36-Texas red脱落至溶液中，发射红色荧光信号；当待测液中存在AFB1时，其诱导P-AFB1-40-FAM脱落至溶液中，发射绿色荧光信号；当AFB1与OTA同时存在时，两个通道的荧光信号均呈现“ON”的状态。因此，本工作构建的双通道适配体/GO复合平台实现了AFB1与OTA的定性检测。
为了实现AFB1与OTA的定量检测，本发明建立了检测两种靶标物的标准曲线。向上述构建的适配体/GO体系中加入不同浓度的相应靶标物(AFB1或者OTA)反应10min，然后使用荧光光谱仪采集荧光光谱。
如图13所示，520nm处的荧光强度随着AFB1浓度的增大而增大，且在0～60ngmL-1范围内呈现良好的线性关系，其检测限低至3.31ng mL-1。同样的，620nm处的荧光强度随着OTA浓度的增大而增大，在0～800ng mL-1范围内呈现良好的线性关系，其检测限低至15.17ngmL-1。因此，双通道适配体/GO复合平台实现了对AFB1与OTA的定量检测。
在含1％白酒的Tris盐缓冲体系中，向上述构建适配体/GO体系中分别加入不同浓度的靶标物，测定AFB1和OTA的回收率，结果见表6，
表6双通道适配体/GO检测平台检测实际样品中AFB1和OTA的回收率
结果如表6所示，AFB1和OTA的回收率为82.7％-112.6％，表明了此双通道适配体/GO荧光响应平台的灵敏性，准确性，适用于实际样品中多种毒素的同时检测。
序列表
<110> 北京师范大学
<120> 提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcc 46
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc 40
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgccc 35
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg t 31
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggcacgtgt tgtctctctg tgtctcgtgc ccttcgc 37
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacgtgttgt ctctctgtgt ctcgtgccct tcgc 34
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc 30
<210> 9
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggtggctgt aggtcagcat ctgatcgggt gtgggtggcg taaagggagc atcggacaac 60
g 61
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcagcatctg atcgggtgtg ggtggcgtaa agggagcatc ggacaacg 48
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

Claims (10)

1.提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)设计剔除冗余碱基的截短适配体；
(2)监测步骤(1)得到的截短适配体与靶标之间的相互作用，选择构型变化较大且与靶标具有较大亲和力的截短适配体作为备选序列；
(3)测定靶标出现前，备选截短适配体与氧化石墨烯基间的淬灭常数为Kp1；以及测定靶标出现后，适配体-靶标耦合物与氧化石墨烯间的淬灭常数为Kp2；
(4)计算Kp1/Kp2，选择具有最大Kp1/Kp2值的备选适配体作为适用于氧化石墨烯平台并对所述靶标具有最佳响应的适配体；
(5)使用步骤(4)得到的截短适配体构造氧化石墨烯基适配体传感器。
2.根据权利要求1所述的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，其特征在于，步骤(2)中的靶标为与氧化石墨烯吸附较弱的DNA、病毒、蛋白质、毒素、农药、维生素、细胞，优选黄曲霉毒素B1和/或赭曲霉毒素A。
3.根据权利要求1所述的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，其特征在于，在步骤(2)中，利用圆二色谱法监测靶标加入前后截短适配体的构型改变程度。
4.根据权利要求1所述的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，其特征在于，步骤(2)中，利用荧光滴定法测定截短适配体与靶标的亲和力。
5.根据权利要求1所述的提升氧化石墨烯基适配体传感器响应性能的方法，其特征在于，步骤(4)得到的响应最佳的适配体包括P-AFB1-40，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
6.具有最佳响应性能的氧化石墨烯基适配体传感器中的适配体的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)监测适配体与靶标之间的相互作用，选择构型变化较大且与靶标具有较大亲和力的适配体；
(2)测定靶标出现前，截短适配体与氧化石墨烯基的淬灭常数为Kp1；以及
测定靶标出现后，适配体-靶标耦合物与氧化石墨烯间的淬灭常数为Kp2；
(3)计算Kp1/Kp2，选择具有最大Kp1/Kp2值的适配体为所述靶标的响应最佳的适配体。
7.根据权利要求6所述的具有最佳响应性能的氧化石墨烯基适配体传感器的适配体的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中的靶标为黄曲霉毒素B1和/或赭曲霉毒素A。
8.根据权利要求6所述的具有最佳响应性能的氧化石墨烯基适配体传感器的适配体的筛选方法，其特征在于，在步骤(1)中，利用圆二色谱法监测靶标加入前后适配体的构型改变程度。
9.根据权利要求6所述的具有最佳响应性能的氧化石墨烯基适配体传感器的适配体的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，利用荧光滴定法测定适配体与靶标的亲和力。
10.根据权利要求6所述的具有最佳响应性能的氧化石墨烯基适配体传感器的适配体的筛选方法，其特征在于，步骤(3)得到的适配体包括P-AFB1-40，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
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