CN105331625A - 一种纳米羟基磷灰石基因载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米羟基磷灰石基因载体及其制备方法。该基因载体包括作为载体本体的纳米羟基磷灰石，所述纳米羟基磷灰石表面被聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物。本发明通过改良载体的制备工艺制造出毒性较低、且体外转染率大于50％的HAP基因转染载体。本发明用PEI-PEG对HAP纳米颗粒进行有效的功能化修饰，可使修饰后的非病毒载体的体外转染率大幅度提高。
Description
技术领域
本发明属于复合材料技术领域，尤其涉及一种纳米羟基磷灰石基因载体及其制备方法。
背景技术
基因治疗是现代临床治疗学创新性的进展之一，其作用越来越重要。从理论上说，它将在很大程度上改变人类治疗疾病的传统方式，为治疗甚至治愈各种难治性疾病提供有效的方法。从目前对基因治疗的研究进展来看，基因治疗技术的四大要素(治疗基因、靶细胞、基因载体和基因转染途径)中，限制其向临床应用推广的重要瓶颈之一是缺乏理想的有选择性的、高效率且低毒的基因转染载体以协助目的基因进入靶组织中的靶细胞。基因载体的研究自然成为基因治疗研究中的热点。
基因载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体最大的优点是其在体内外的转染率很高，但制备复杂，靶向性差，可以引起宿主免疫反应以及基因突变致癌，严重的甚至导致死亡。虽然近年研发的病毒载体的毒副作用已有明显减轻，但上述两大隐患与病毒载体的异种蛋白质属性和对宿主基因组的插入方式有关，短期内仍无法彻底解决，这在很大程度上限制了其临床应用。目前常用于基因转染的非病毒载体主要有脂质体(liposome)、纳米载体(nanovector)和阳离子聚合物(cationicpolymer)，在纳米尺寸范围的脂质体和阳离子聚合物有时也被称为纳米载体。
①脂质体，是由可生物降解的磷脂组成的双分子层结构，与生物膜有较大的相似性和组织相容性，是目前最常用的非病毒载体，其代表有Lipofectin和Lipofectamine2000。脂质体在体内不够稳定且有一定毒性；体外转染率在非病毒载体中是较高的，但仍只有病毒载体的60％～70％左右，体内转染率更低。国内、外均有用阳离子脂质体向动物耳蜗转染目的基因的报道。
②阳离子聚合物，其表面有大量的分子基团，便于携带DNA分子。可分为人工合成和天然材料2大类：人工材料的代表是聚乙烯亚胺(PEI)和聚酰胺-胺型树枝状高聚物(polyamidoaminedendrimer,PAMAM-D)；天然材料有壳聚糖、胶原、藻酸盐等。阳离子聚合物也存在转染率低和轻度的细胞毒性问题。PEG作为水溶性高分子，不仅能改善其他高分子的水溶性，而且常用作纳米颗粒表面改性修饰剂，来改善其性能。
③纳米载体，一般是指载体粒径在纳米量级(1nm～100nm)范围内的非病毒载体。随着纳米颗粒尺寸变小，其表面原子占原子总数的比例会增高，即比表面积增大，粒子表面能也随之迅速增加，具有很高的化学活性，其理化性质也会与其本体产生很大的差别。经化学修饰的表面带正电荷的纳米颗粒可通过静电结合方式吸附表面带负电荷的基因DNA，并将其易被核酸酶攻击的位点封闭起来，达到携带、运送和保护DNA的目的。纳米颗粒制备和贮存方便、装载量大，能穿过组织间隙并被细胞吸收，可通过人体最小的毛细血管和血脑屏障，且无免疫原性和致瘤性，低毒或无毒。这些特性使其在药物和基因输送方面具有许多优越性。根据纳米载体的性质，可将其分为无机纳米载体和有机纳米载体两大类。无机载体如纳米羟基磷灰石(HAP)、金银单晶纳米、硅氧化物、铁氧化物和碳纳米管颗粒等，属狭义的纳米载体范畴；有机载体如脂质体、阳离子聚合物等，只要粒径在纳米尺度范围，也可叫做纳米载体。
HAP是人体骨质和牙齿的主要成分(Ca10(PO4)6(OH)2)，无毒、生物相容性好，已广泛用作人体各类植入材料。Zhu等以HAP作为基因载体将携带绿色荧光蛋白基因的质粒转染进肿瘤细胞。为寻找毒性更低、且具有达到使用要求的转染效率的基因载体，孙虹教授领导课题组进行了连续多年的实验研究，于2005年成功地应用HAP纳米载体将神经营养素3(NT-3)基因转染到活体豚鼠的耳蜗神经元内和体外培养的小鼠耳蜗螺旋神经节细胞中，并表达出基因产物NT-3，且其毒性小于脂质体。然而，虽然经过多次改良，其体外转染效率一直徘徊在15％～30％这种较低的水平，难以满足实际应用的需要。
发明内容
本发明旨在克服现有技术上述的不足，提供一种纳米羟基磷灰石基因载体及其制备方法
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述纳米羟基磷灰石基因载体包括作为载体本体的纳米羟基磷灰石，所述纳米羟基磷灰石表面被聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰。
其中，所述基因载体长度为50—80nm，直径为20—30nm，电荷在25—40mv。
上述纳米羟基磷灰石基因载体的方法是用聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰纳米羟基磷灰石：将聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶于极性溶剂(所述极性溶剂是可以溶解聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物的溶剂，如去离子水)，配成聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物浓度为50-150mg/mL的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液；将纳米羟基磷灰石粉末溶于极性溶剂(所述极性溶剂是可以溶解纳米羟基磷灰石粉末的溶剂，如去离子水)，配成纳米羟基磷灰石浓度为1-10mg/mL的纳米羟基磷灰石溶液；将聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液加入纳米羟基磷灰石溶液中，得到聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物质量浓度为2-8％的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物纳米羟基磷灰石混合溶液；将混合溶液振荡并超声分散后得到的悬浮体离心，将离心得到的沉淀再进行超声处理，得到纳米羟基磷灰石表面被聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰的纳米羟基磷灰石基因载体。
其中，制备聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物方法如下：
先制备单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑，然后通过单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑合成聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物。
单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑的合成路径如下：
具体是将单甲氧基聚乙二醇放入冷冻干燥机干燥过夜，往单甲氧基聚乙二醇中加入干燥的四氢呋喃溶解，得到溶液1，甲氧基聚乙二醇与四氢呋喃的重量体积比为[(1-10)：20]g/ml；在避光下往N，N’-羰基二咪唑(CDI)中加入四氢呋喃溶解，得到溶液2，N，N’-羰基二咪唑与四氢呋喃的重量体积比是[(0.8-1)：10]g/ml，在氮气保护下将溶液1加入到溶液2中，然后在氮气保护下，于55-65℃搅拌过夜，产物旋干液体后溶于去离子水，用二氯甲烷萃取后冷冻干燥即得单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑。
通过单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑合成聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物的路径如下：
具体是是将单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑溶于干燥后的三氯甲烷中，得到溶液3，单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑与三氯甲烷的重量体积比为[(0.15-0.25)：20]g/ml；将聚乙烯亚胺溶解于三氯甲烷中，得到溶液4，聚乙烯亚胺与三氯甲烷的重量体积比为[(0.1-2.5)：20]g/ml；将溶液3滴加到溶液4中，回流磁力搅拌过夜，产物旋去部分三氯甲烷液体(通常20ml液体旋去15ml左右三氯甲烷)，加入到冰乙醚中，得白色粘稠沉淀，离心，沉淀溶于二氯甲烷，再用乙醚沉淀，产物溶于去离子水，用透析袋将溶有产物的去离子水中透析45-50h，间断更换去离子水，冷冻干燥后得聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物。
另外，所述的纳米羟基磷灰石的制备方法如下：
称取每4.428gCa(NO3)2·4H2O粉末对应溶于125ml去离子水中，搅拌均匀制成浓度为0.15mmol/L的溶液；
称取每1.48g(NH4)2HPO4白色晶体，对应加入75ml去离子水，搅拌均匀配成浓度为0.15mmol/L的磷酸氢二氨水溶液；
向两种溶液中滴加浓氨水，分别调节PH值至10以上，将磷酸氢二氨水缓缓加入硝酸钙溶液，磁力搅拌器搅拌，滴加液体的同时，用浓氨水维持反应体系的pH在10-11；所得的白色悬浮液倒入高压反应釜中置于干燥箱中170℃反应3小时，待反应釜自然冷却之后，取出白色混悬液，置于高速离心机10000g离心5分钟，留下白色沉淀，加去离子水若干并搅拌混匀，再次同等速度离心5分钟，留白色沉淀，上述步骤重复两次；取水洗后的白色沉淀物，加无水乙醇混匀搅拌并分散，同上离心后弃上清留沉淀，重复2次，沉淀物自然干燥，磨成粉末，得到纳米羟基磷灰石。
上述聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物的合成，以及纳米羟基磷灰石的制备，均为现有技术。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过改良载体的制备工艺制造出毒性较低、且体外转染率大于50％的HAP基因转染载体。本发明用PEI-PEG对HAP纳米颗粒进行有效的功能化修饰，可使修饰后的非病毒载体的体外转染率大幅度提高。通过本发明基因载体而得到的PEI25K-PEG2K-HAP-DNA-PEI25K-PEG2K复合物的转染率已接近脂质体对照组的转染水平，基本具备了投入实际使用的可能性。
附图说明
图1是本发明合成得到的HAP粉末的XRD图；
图2是本发明合成得到的HAP粉末的红外吸收光谱；
图3是PEI-mPEG共聚物的红外谱图；
图4是PEI-PEG-HAP复合物的透射电镜照片；
图5是抽提质粒电泳结果图；
图6是纳米基因载体模式图；
图7是改良后的纳米载体基因复合物模式图。
具体实施方式
实施例1
所述纳米羟基磷灰石基因载体包括作为载体本体的纳米羟基磷灰石，所述纳米羟基磷灰石表面被聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰。所述基因载体长度为50—80nm，直径为20—30nm。
实施例2
制备实施例1所述纳米羟基磷灰石基因载体的方法包括如下步骤：
(1)单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑的制备：
合成路径如下：
具体为：
将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)放入冷冻干燥机干燥过夜，往单甲氧基聚乙二醇中加入干燥的四氢呋喃溶解，得到溶液1，甲氧基聚乙二醇与四氢呋喃的重量体积比为(1：20)g/ml；在避光下往N，N’-羰基二咪唑(CDI)中加入四氢呋喃溶解，得到溶液2，N，N’-羰基二咪唑与四氢呋喃的重量体积比是(0.9729：10)g/ml，在氮气保护下将溶液1缓慢加入到溶液2中，然后在氮气保护，60℃下，搅拌过夜，产物旋干液体后溶于去离子水，用二氯甲烷萃取三次，冷冻干燥即得单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑；
(2)聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇(PEI-mPEG)共聚物的合成：
合成路径如下：
具体为：
将单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑溶于干燥后的三氯甲烷中，得到溶液3，单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑与三氯甲烷的重量体积比为(1：20)g/ml；将聚乙烯亚胺溶解于三氯甲烷中，得到溶液4，聚乙烯亚胺与三氯甲烷的重量体积比为【(0.1-2.5)：20)】g/ml；将溶液3缓慢滴加到溶液4中，回流磁力搅拌过夜，产物旋去部分三氯甲烷液体(通常20ml液体旋去15ml左右三氯甲烷)，加入到冰乙醚中，得白色粘稠沉淀，离心，沉淀溶于二氯甲烷，再用乙醚沉淀，产物溶于去离子水，MW3500透析袋去离子水中透析48h，间断更换去离子水，冷冻干燥后得聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物；
(3)聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰的纳米羟基磷灰石的制备：
将冷冻干燥保存的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶于去离子水搅拌均匀，配置聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物浓度为50mg/mL的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液，超声分散5分钟；将纳米羟基磷灰石(HAP)粉末溶于去离子水，配成纳米羟基磷灰石浓度为10mg/mL的纳米羟基磷灰石溶液，超声分散30min，在不断搅拌下将将聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液缓慢加入纳米羟基磷灰石溶液中，得到聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物质量浓度为2％的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物纳米羟基磷灰石混合溶液，充分振荡后超声分散30分钟，使之分散成稳定的悬浮体，离心后沉淀去离子水洗三次后加同样体积去离子水，再超声30分钟，得到聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰的纳米羟基磷灰石基因载体。
步骤(1)中，所述的单甲氧基聚乙二醇的分子量为2000。
步骤(2)中，所述的聚乙烯亚胺的分子量为10000。
步骤(3)中，所述的纳米羟基磷灰石的制备方法如下：
称取每4.428gCa(NO3)2·4H2O粉末对应溶于125ml去离子水中，搅拌均匀制成浓度为0.15mmol/L的溶液；
称取每1.48g(NH4)2HPO4白色晶体，对应加入75ml去离子水，搅拌均匀配成浓度为0.15mmol/L的磷酸氢二氨水溶液；
向两种溶液中滴加浓氨水，分别调节PH值至10以上，将磷酸氢二氨水缓缓加入硝酸钙溶液，磁力搅拌器搅拌，滴加液体的同时，用浓氨水维持反应体系的pH在10-11；所得的白色悬浮液倒入高压反应釜中置于干燥箱中170℃反应3小时，待反应釜自然冷却之后，取出白色混悬液，置于高速离心机10000g离心5分钟，留下白色沉淀，加去离子水若干并搅拌混匀，再次同等速度离心5分钟，留白色沉淀，上述步骤重复两次；取水洗后的白色沉淀物，加无水乙醇混匀搅拌并分散，同上离心后弃上清留沉淀，重复2次，沉淀物自然干燥，磨成粉末，得到纳米羟基磷灰石。
实施例3
制备实施例1所述纳米羟基磷灰石基因载体的方法包括如下步骤：
(1)单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑的制备：
合成路径如下：
具体为：
将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)放入冷冻干燥机干燥过夜，往单甲氧基聚乙二醇中加入干燥的四氢呋喃溶解，得到溶液1，甲氧基聚乙二醇与四氢呋喃的重量体积比为(10：20)g/ml；在避光下往N，N’-羰基二咪唑(CDI)中加入四氢呋喃溶解，得到溶液2，N，N’-羰基二咪唑与四氢呋喃的重量体积比是(0.9729：10)g/ml，在氮气保护下将溶液1缓慢加入到溶液2中，然后在氮气保护，60℃下，搅拌过夜，产物旋干液体后溶于去离子水，用二氯甲烷萃取三次，冷冻干燥即得单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑；
(2)聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇(PEI-mPEG)共聚物的合成：
合成路径如下：
具体为：
将单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑溶于干燥后的三氯甲烷中，得到溶液3，单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑与三氯甲烷的重量体积比为(5：20)g/ml；将聚乙烯亚胺溶解于三氯甲烷中，得到溶液4，聚乙烯亚胺与三氯甲烷的重量体积比为【(0.1-2.5)：20)】g/ml；将溶液3缓慢滴加到溶液4中，回流磁力搅拌过夜，产物旋去部分三氯甲烷液体(通常20ml液体旋去15ml左右三氯甲烷)，加入到冰乙醚中，得白色粘稠沉淀，离心，沉淀溶于二氯甲烷，再用乙醚沉淀，产物溶于去离子水，MW3500透析袋去离子水中透析48h，间断更换去离子水，冷冻干燥后得聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物；
(3)聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰的纳米羟基磷灰石的制备：
将冷冻干燥保存的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶于去离子水搅拌均匀，配置聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物浓度为150mg/mL的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液，超声分散5分钟；将纳米羟基磷灰石(HAP)粉末溶于去离子水，配成纳米羟基磷灰石浓度为1mg/mL的纳米羟基磷灰石溶液，超声分散30min，在不断搅拌下将将聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液缓慢加入纳米羟基磷灰石溶液中，得到聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物质量浓度为8％的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物纳米羟基磷灰石混合溶液，充分振荡后超声分散30分钟，使之分散成稳定的悬浮体，离心后沉淀去离子水洗三次后加同样体积去离子水，再超声30分钟，得到聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰的纳米羟基磷灰石基因载体。
步骤(1)中，所述的单甲氧基聚乙二醇的分子量为2000。
步骤(2)中，所述的聚乙烯亚胺的分子量为1800。
步骤(3)中，所述的纳米羟基磷灰石的制备方法同实施例2。
实施例4
制备实施例1所述纳米羟基磷灰石基因载体的方法包括如下步骤：
(1)单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑的制备：
合成路径如下：
具体为：
将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)放入冷冻干燥机干燥过夜，往单甲氧基聚乙二醇中加入干燥的四氢呋喃溶解，得到溶液1，甲氧基聚乙二醇与四氢呋喃的重量体积比为(4：20)g/ml；在避光下往N，N’-羰基二咪唑(CDI)中加入四氢呋喃溶解，得到溶液2，N，N’-羰基二咪唑与四氢呋喃的重量体积比是(0.9729：10)g/ml，在氮气保护下将溶液1缓慢加入到溶液2中，然后在氮气保护，60℃下，搅拌过夜，产物旋干液体后溶于去离子水，用二氯甲烷萃取三次，冷冻干燥即得单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑；
(2)聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇(PEI-mPEG)共聚物的合成：
合成路径如下：
具体为：
将单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑溶于干燥后的三氯甲烷中，得到溶液3，单甲氧基聚乙二醇羰基咪唑与三氯甲烷的重量体积比为(2.1：20)g/ml；将聚乙烯亚胺溶解于三氯甲烷中，得到溶液4，聚乙烯亚胺与三氯甲烷的重量体积比为【(0.1-2.5)：20)】g/ml；将溶液3缓慢滴加到溶液4中，回流磁力搅拌过夜，产物旋去部分三氯甲烷液体(通常20ml液体旋去15ml左右三氯甲烷)，加入到冰乙醚中，得白色粘稠沉淀，离心，沉淀溶于二氯甲烷，再用乙醚沉淀，产物溶于去离子水，MW3500透析袋去离子水中透析48h，间断更换去离子水，冷冻干燥后得聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物；
(3)聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰的纳米羟基磷灰石的制备：
将冷冻干燥保存的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶于去离子水搅拌均匀，配置聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物浓度为100mg/mL的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液，超声分散5分钟；将纳米羟基磷灰石(HAP)粉末溶于去离子水，配成纳米羟基磷灰石浓度为5mg/mL的纳米羟基磷灰石溶液，超声分散30min，在不断搅拌下将将聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液缓慢加入纳米羟基磷灰石溶液中，得到聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物质量浓度为8％的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物纳米羟基磷灰石混合溶液，充分振荡后超声分散30分钟，使之分散成稳定的悬浮体，离心后沉淀去离子水洗三次后加同样体积去离子水，再超声30分钟，得到聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰的纳米羟基磷灰石基因载体。
步骤(1)中，所述的单甲氧基聚乙二醇的分子量为2000。
步骤(2)中，所述的聚乙烯亚胺的分子量为25000。
步骤(3)中，所述的纳米羟基磷灰石的制备方法同实施例2。
实施例5所述纳米羟基磷灰石基因载体表征及性能分析
一、HAP的表征
1.1X射线衍射分析：
取研磨后的沉淀物粉末，用X射线衍射仪对其进行分析，鉴定实验所得产物的物相。XRD分析在X射线衍射仪(D/Max2500PCRigaku，Japan)上进行，并采用摄入技术，选用Cu的Kα射线。射线管工作电压50kV，电流为300mA，扫描速度为4deg/min，θ-2θ扫描的角步长为0.05°(2θ)，测量范围为5°-80°。
1.2红外吸收光谱：
HAP样品研磨成细小颗粒，固体样品用KBr压片，扫描范围4000-400cm-1，分辨率4cm-1。
图1为本发明合成得到的HAP粉末的XRD图。晶体的特征峰在002晶面(2θ＝25.90°)，211晶面(2θ＝31.90°)，202晶面(2θ＝33.90°)，310晶面(2θ＝39.90°)，222晶面(2θ＝46.90°)，213晶面(2θ＝49.50°)，004晶面(2θ＝53.5°)，且其主要衍射峰均与标准PDF卡片JCPDs9-432上的HAP的特征衍射峰互相对应，说明我们合成的粉末是HAP。根据根据Seherrer公式可以计算出我们合成的HAP颗粒大小为70nm。
图2是本发明合成得到的HAP粉末的红外吸收光谱，3571cm-1处的吸峰是羟基(OH-)的伸缩振动峰,在3447cm-1处的宽峰和1639cm-1处的弥散峰都属于吸附水造成的；1089cm-1和1046cm-1处的吸收峰是磷酸基PO4 3-的非对称伸缩振动峰,961cm-1处的吸收峰对应磷酸基PO4 3-的对称伸缩振动峰,603cm-1和571cm-1处的吸收峰对应PO4 3-的弯曲振动峰。二、PEI-mPEG共聚物的表征：
2.1FT-IR分析
mPEG、mPEG羰基咪唑、PEI-mPEG样品分别采用KBr压片制备；PEI样品溶于CHCl3液中在KBr晶片上涂膜制备，各样品的FT-IR谱分析在PerkinEImer683型红外光谱仪上进行。
2.21H-NMR测定
以CDCl3为溶剂，将mPEG羰基咪唑、PEI-mPEG各样品完全溶解后，设定机器温度为26℃，在BruckerAM800型核磁共振仪上进行。
图3是PEI-mPEG共聚物的红外谱图，mPEG曲线中3000-3500cm-1的宽峰代表O-H的伸缩振动，2888cm-1峰代表亚甲基C-H伸缩振动，1352cm-1峰代表C-O醚键的吸收峰，说明mPEG中有(-CH2-CH2-)和-OH的存在。图PEG-CDI曲线与PEG曲线相比，于1763cm-1处出现羰基峰，图PEI-PEG曲线在1650cm-1处是羧基和PEI上伯氨基形成的-(C＝O)-NH-的酰胺键伸缩振动特征吸收峰，同时1763cm-1处的酯键峰消失，而3450cm-1处则是PEI上伯氨基(NH2-)与仲氨基(-NH-)的振动吸收峰，lll4cm-1是mPEG上(C-O-C)的振动吸收特征峰，2885cm-1是mPEG链节和PEI链节上(C-H)的伸缩振动吸收峰；由此可以确定合成产物为PEI-PEG。
mPEG图谱中δ3.4ppm处的吸收峰为CH3O-中甲基的(-CH3)质子的化学位移，δ3.65ppm，δ3.7ppm蜂均为mPEG中亚甲基(-CH2)质子的化学位移。mPEG-CDI与mPEG图谱相比，在δ7.07ppm(d,-CO-NCH＝CH-N-),δ7.45ppm(d,-CO-N-CH＝CH-N-),δ8.16ppm(s,-CO-N-CH＝N-)这三个位置上出现了羰基咪唑的亚甲基质子的化学位移，同时4.6ppm(t,-OCH2CH2-O(C＝O)-)出现了与酯键相邻的亚甲基质子的化学位移。PEI-PEG图谱与mPEG-CDI相比，羰基咪唑在δ7.07ppm、δ7.45ppm及δ8.16ppm三个位置的峰消失，在δ2.5-3.0ppm(m,-CH2CH2NH-)处出现PEI的亚甲基质子位移，δ4.2ppm(t,-OCH2CH2-O(C＝O)为右移与酯键相邻的亚甲基质子的化学位移。由氢谱核磁可进一步确认我们合成了PEI-PEG共聚物。
同时可计算PEI-PEG共聚物中聚乙烯亚胺单元(δ2.5-3.0ppm)峰面积和聚乙二醇单元δ3.65ppm中峰面积，两者之比就是共聚物中两组分的摩尔比。由表1可知，由1H-NMR所计算的不同的投料比所得到的PEI-PEG共聚物的产物成分与投料比很相近，说明此合成反应是一种可控反应，可通过改变反应物的投料比来获得不同组成的PEI-PEG共聚物。
表1PEI-PEG共聚物的组成及产率
三、PEI-PEG-HAP的表征：
3.1PEI-PEG-HAP复合物的粒径及电荷检测
将各种PEI-PEG-HAP或PEI-HAP溶液超声30分钟，设置Zetasizenanoseries90粒度分析仪的分散剂为水，入射激光波长A＝532nm，入射角度＝90°，温度为25℃，取1ml溶液按照标准操作进行粒径和zeta电位的检测，所得数值为3次测量的平均值。
3.2PEI-PEG-HAP复合物的电镜检查
取PEI25K-HAP及PEI25K-PEG2K-HAP溶液稀释成1mg/ml的溶液，于检测前一天以乙醇准备清洗铜网并晾干，在铜网上制备福尔马膜，待测样品超声分散30分钟后滴样在已制备好的的铜网膜上，用1％乙酸双氧铀复染10分钟，自然干燥，透射电镜拍照。
PEI以及PEI-PEG的-NH2基团能与HAP的各晶面以氢键的形式结合。研究表明在没有PEI的溶液体系中，HAP晶体表面会被一层水膜包覆，然而HAP晶体与PEI之间的相互作用力比HAP晶体与水分子之间的作用力更强，PEI加入以后易于吸附在HAP颗粒表面，尤其是在HAP晶体的(001)面，水分子的吸附将被PEI所取代。纳米HAP经过PEI的表面修饰后大都呈现良好的悬浮稳定性(各样品编号的意义见表2)，PEI1.8K-PEG2k及PEI25K-PEG5K修饰的样品在超声分散后能够有较好的分散性，但静置大约30分钟后出现大量沉淀。所有低浓度修饰样品的分散性较高浓度样品稍差，可在静置后出现少许沉淀，特别是经过PEG修饰的样品。这可能是因为PEI支链添加PEG后氨基减少，导致表面电荷降低，从而不能有效地发挥空间位阻作用以防止颗粒间的碰撞团聚，故不足以维持胶体稳定。HAP经不同浓度PEI修饰后，其纳米HAP凝胶在2％PEI浓度时，粒径为126.3nm，zeta电位34.4mv；而4％PEI修饰的HAP，粒径最小为90.3nm，电荷为35.7mv；当加大PEI浓度到8％时，其zeta电位亦增高至37.7mv，但其粒径没有减小反而增加至116.8nm，这可能是由于过多的PEI分子链的存在使它们之间相互接触的机会增多，易产生桥连使得颗粒聚沉。另一方面，PEI为聚电解质分散剂，其离解程度被相邻基团的离解所影响。PEI浓度增大阻碍了可离解基团的离解，使得表面电荷减少，Zeta电位降低，静电斥力减弱。本研究中曾经将PEI浓度增加至100％时发现纳米HAP溶液在超声后很快就完全沉淀，从而证实了只有当修饰物浓度在一个合适的范围时，纳米凝胶溶液才能保持一个最稳定的状态。我们检测了同为4％的浓度各种PEI-PEG修饰的HAP纳米溶液的粒径及zeta电位，同种PEI修饰，随着连接的PEG量增加，HAP溶液zeta电位逐渐降低，甚至电位降低至30mv以下，最终导致纳米颗粒团聚明显增加，稳定性降低，不能长时间保持稳定而出现沉淀。低分子量的PEI，如1.8kD的PEI，在连接少量PEG后即出现HAP溶液不均一，甚至有少许1000nm以上的颗粒出现。
由透射电镜照片可见，经表面修饰后的HAP分散性明显提高，较少团聚，单个HAP表面基本未受影响，大小维持在长度50-80nm，直径20-30nm(图4)。
表2经表面修饰的HAP编号
四、PEI-PEG-HAP-DNA载体基因复合物的性能研究
4.1实验方法及步骤
4.1.1pEGFP-N1质粒的获取和鉴定
4.1.1.1制备感受态细菌
1)取冷藏的LB液体培基4ml放入15ml离心管内，加入少许JM109大肠杆菌菌液，摇匀后放入恒温摇床，37℃，200rp培养过夜。
2)将过夜后的菌液放入冰水浴中30min，然后离心机3000g离心10min，底物为细菌，再加1.5ml0.1M氯化钙溶液吹打均匀，即成感受态细菌。
4.1.1.2细菌转化及保种
1)无菌操作台内，将100ul感受态菌液与3ugpEGFP-N1质粒轻轻摇匀，然后冰水浴30分钟，然后加入LB液体培养基450ul，混匀后放入摇床，设定37℃，200rpm振摇1小时，用三角接种器火烧冷却后蘸取少许菌液均匀接种在预先制备的固体LB培基的培养皿中，37℃细菌培养箱中培养过夜。
2)液体LB培基紫外照射后，200ml培基内加入100ul的卡那霉素，挑取培养皿中针尖大小的菌落，一瓶液体培养基中挑入一个菌落，电动摇床设置温度37℃，转速以200rpm振摇14小时。即可用于抽提质粒和保存菌种。
3)取300ul振摇过夜的的细菌，放入冻存管中，加150ul灭菌纯甘油，移液枪打散后-80℃冷冻保存。
4.1.1.3质粒抽提
按照OMEGA质粒抽提盒说明操作：
4.1.1.4质粒鉴定
1)先以移液枪取去离子水调定紫外分光光度计的Blank值。移液枪取上述质粒溶液2ul与98ul去离子水混匀，检测质粒的浓度和纯度指标。
2)称取0.35g琼脂糖溶于50ml1×TAE溶液中，微波炉中加热2分钟使琼脂糖颗粒溶解，加入5ul的Goldview核酸替代染料。混匀后缓缓倒入胶槽中，避光保存等其冷却凝固。
3)移液枪取提取的质粒溶液若干微升，1ul质粒加1ulloadingbuffer缓冲液混匀加入到电泳槽的孔中，另设一孔加入4ul的1KbDNAladdermarker作对照。设置电泳电压为120V，电泳45min后取出胶块，置入SYNGENE凝胶成像系统中照相检测。
4)另取摇菌后菌液300ul送上海生工生物工程公司测序，以通用引物测序1000bp，检测仪器为3730xlDNAAnalyzer，试剂为BigDyeterminatorv3.1。测序结果经Chromas2.3程序检查杂质和信号强度，之后在NCBI网站行blast检验，证实质粒正确性。
4.1.1.5质粒纯化
1)之前提取的质粒溶液中加1/10体积的3M的醋酸钠溶液和3倍体积的无水乙醇，-20摄氏度冰箱过夜。
2)第二天可见离心管底部有少许白色沉淀，将混合物在4℃下以14000g离心20min，弃上清，保留沉淀。在超净台中将离心管倒置放在滤纸上通风待其自然干燥，加入500ul75％乙醇，吹打均匀。
3)再将有混悬液的离心管14000g离心20min，弃上清。换离心管重复醇洗步骤一次。之后倒置于滤纸上30分钟待酒精完全挥发。
4)向有沉淀物的离心管内加入500ul消毒的去离子水，待沉淀完全溶解后将溶液转移至灭菌EP管中，密封，-20℃冷冻保存。
4.1.2MTT法测定载体的细胞毒性
4.1.2.1Hela细胞种96孔板
1)生长到融合率达80-90％的Hela细胞，吸取去培基，用2mLPBS缓冲液清洗细胞，并轻轻左右摇动，在培养瓶中加入1ml胰酶置入培养箱中消化1分钟。
2)显微镜白光下观察见细胞形态变圆，并从瓶壁上脱落，加入3mL新鲜培养基终止消化，巴氏管吹打均匀，使细胞完全分散。移液枪取10ul细胞悬液，用血细胞计数计数，计数5个中方格的细胞总数N，计算1ml中细胞总数为N×5×104/ml。
3)移液枪取200ul的细胞悬液移入消毒的玻璃瓶中，按细胞总数加入含血清的培养基稀释，使最终的细胞浓度在50000个/ml。
4)移液枪取细胞悬液种植到在96孔板中间的55个孔中，每孔液体总量200ul，剩余孔可加入同等量的PBS缓冲液或生理盐水。留取5孔做空白对照的调零孔。将96孔板放回培养箱中培养待第二天使用。
4.1.2.2MTT细胞毒性实验
1)将MTT粉末溶于PBS溶液中，终浓度为5mg/ml，用过滤器过滤除菌后避光保存于4℃冰箱。
2)取各种经表面修饰包裹的HAP溶液(修饰物浓度均为4％),HAP浓度为10mg/ml，将各种HAP溶液放入玻璃瓶中用高压灭菌法消毒。实验前将各HAP溶液超声分散10分钟，然后放入生物安全柜中紫外照射消毒。
3)96孔板在生物安全柜中用移液枪逐孔吸细胞取培养基，然后用PBS缓冲液逐孔清洗细胞，清洗两次，再每孔用移液枪准确加含1％胎牛血清的细胞培养基。
4)按照与之前类似的对半稀释的方法，获得500ug/ml，250ug/ml，125ug/ml,62.5ug/ml,31.25ug/ml的纳米HAP溶液，每种纳米颗粒种植5个细胞孔，每孔加药量20ul，混合均匀后将96孔板避光放入细胞培养箱。
5)培养24小时后，将96孔板取出，用移液枪小心吸取培养基，每吸一组孔更换枪头，然后用PBS缓冲液清洗细胞2次，每孔加180ul无血清培养基，再向每孔添加20ulMTT液，左右摇晃使其均匀，再将96孔板避光放入细胞培养箱培养4小时。
6)4小时后，避光将96孔板各孔的培基吸取160ul，不能碰到四壁及底壁，各孔加100ulDMSO溶液，用锡箔纸包裹放在摇床上50rpm振摇8分钟，可见96孔板中溶液变为紫色，将其置于酶标仪上读板，主波长490nm，参考波长633nm。调零后，每种药物作用下的细胞生存率(cellviability)为每孔的吸光值与阴性孔吸光值的比值。
CellViability＝试样的OD值/阴性对照OD值
4.2实验结果
4.2.1质粒鉴定结果
图5为质粒电泳结果,其中M孔为1kbDNAMarker，1-3孔是3次抽提的质粒，纯度1.8-1.9，质粒浓度在400-800ug/ml。4泳道为纯化后质粒的结果：纯化后的质粒浓度约1000ug/ml，纯度1.82。所有泳道中的样品均稀释到20ug/ml。
所提质粒送生工生物工程公司测序，以通用引物测序1000bp，仪器为3730xlDNAAnalyzer，试剂为BigDyeterminatorv3.1。所测质粒上传片段与基因库标准pEGFP-N1配对率为99％，可以证明质粒较纯，为所需质粒。
4.2.2各种HAP的MTT毒性试验
在各种修饰的HAP中，除PEI25K修饰的HAP相对毒性均较高外，其他修饰物在低浓度时(低于125ug/ml)毒性十分低，细胞的生存率高于80％，特别是接枝了3分子PEG的纳米载体，毒性最小。HAP的生物毒性较小，吴雄辉报道HAP浓度在500ug/ml时基本无细胞毒性。而据文献报道单独的PEI25k-PEG2K浓度在20ug/ml时细胞生存率约40％，在10ug/ml时细胞生存率在90％以上。所以本实验所用的纳米HAP复合物毒性主要来源于表面修饰的PEI或者PEI-PEG，而本实验所用的表面修饰剂浓度很低，最高也只有20ug/ml，故毒性较小。
五、纳米载体基因复合物的转染(图6为纳米基因载体模式图)
5.1实验方法及步骤
5.1.1Hela细胞的转染
1)生长密度达到70-80％的Hela细胞，吸去旧培基，用2mLPBS缓冲液清洗细胞，并轻轻左右摇动，移液枪将1ml胰酶加入细胞培养瓶中并使之均匀覆盖后置入培养箱中消化1分钟。
2)显微镜白光下观察见细胞形态皱缩变圆，并从瓶壁上脱落，加入3mL含血清培养基终止消化，巴氏管吹打均匀，使细胞完全分散。移液枪取10ul细胞悬液，用细胞计数板计数，计数5个中方格的细胞总数N，计算1ml中细胞总数为N×5×104/ml。
3)按照每孔10000-20000的细胞量将Hela细胞种于24孔板上，每孔溶液总量为0.5ml。
4)待细胞融合率达70-80％时进行转染,巴氏吸管吸去培养基，用PBS缓冲液洗细胞2次，移液枪取液向每孔加入1ml无血清DMEM培基。同时，2个EP管各加入500ul无血清DMEM培基，将4ul的脂质体2000与0.8ug的质粒分别加入到两个EP管中，静置5分钟后两者混合，再静置25分钟后加入到24孔板中。
5)消毒过的纳米PEI-HAP或PEI-PEG-HAP溶液取25ug超声分散10分钟后加入2ug质粒，混合均匀，静置5-10分钟，将混合液再超声分散10分钟，将超声后的混合液加入24孔板中，使培基总量达到1ml。移液枪向空白孔中加入1ml培基做阴性对照，脂质体做阳性对照。
6)转染7小时后，巴氏管吸去各孔中的培基，更换新巴氏管向每孔中加入0.5ml含血清培养基，再将24孔板继续放入培养箱中培养。
7)24孔板培养24-48小时，吸去旧培养基，以PBS缓冲液轻轻漂洗细胞，每孔加200ul的4％多聚甲醛静置5-10min，紫外光照射下在倒置荧光显微镜下观察EGFP的表达，取5个视野的平均值计算转染率(转染率＝暗视野下荧光数目/明视野下细胞数目)。
5.1.2原代神经组织转染
5.1.2.1试验动物的选取
3-5天的新生SpragueDawley大鼠10只，雌雄不限，购于湘雅实验动物中心。
5.1.2.2实验前准备
(1)盖玻片处理：盖玻片用75％酒精浸泡过夜，再用无水乙醇溶液清洗，高温高压消毒后烘干备用。前期配制的0.06％的鼠尾胶原溶液以0.22um过滤膜过滤除菌，取100ul鼠尾胶原液滴在已消毒烘干的盖玻片上，在无菌柜中通风促进其干燥，待其干燥后，用PBS缓冲液浸泡30分钟后取出，干燥后备用。
(2)DMEM/F12高糖培养基基配置：取新购的DMEM/F12500ml高糖培养基，加入胰岛素使终浓度为10μg/ml,再加入将青霉素15万U，3g葡萄糖，以及N2supplement，使终浓度为30ul/ml，冷藏备用。
5.1.2.3取材
乳鼠螺旋神经元以及囊斑取材培养均在无菌柜中进行，实验前先将游丝镊、剪刀高压消毒灭菌干燥处理。
(1)选择新出生后3天的SD大鼠，作实验对象，75％酒精喷洒其头部。
(2)用剪刀快速断头，剪开头盖骨，取出脑组织，暴露听泡，并以游丝镊断离颞骨取出耳蜗并立即浸入D-Hank'S液中。
(3)在10倍解剖显微镜下先分离出囊斑组织，并剥离囊斑表面的白膜，从耳蜗底部开始去除蜗壳，暴露膜迷路，从内听道抽出听神经纤维束，再用游丝镊分离去除螺旋韧带及血管纹，在基底膜内侧分离去除基底膜，保留含有螺旋神经节的呈絮状的蜗轴螺旋管及，D-Hank'S溶液洗涤3次。
(4)盖玻片上滴加200ul的DMEM/F12培养基使其完全覆盖住盖玻片，然后将其放入培养皿中，用游丝镊将蜗轴螺旋管及囊斑组织分成1mm3大小组织块置于玻片上，用移液枪小心添加500ul培基至培养皿中，使液体刚刚浸没组织块，同时又不会使其漂移。培养皿放入细胞培养箱中培养。
(5)5小时后再向培养皿种添加500ul培基，12小时后更换500μl新培基并同时取出500ul旧培基。每日更换一半培养基。
5.1.2.4原代神经组织的基因转染
取在Hela细胞中转染效率最高的PEI25K-PEG2K-HAP纳米载体进行转染。取25ugPEI25K-PEG2K-HAP溶液超声10分钟，加入2ug质粒DNA，混合均匀，静置5-10分钟，将混合液再超声分散10分钟，将超声后的混合液用移液枪轻轻加入含无血清无抗生素添加剂的DMEM/F12培养基的培养皿中并混匀，培养皿中含有培养了24小时的大鼠耳蜗神经节细胞，将培养板移入CO2培养箱，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养7小时，移液枪吸取培基，更换完全DMEM/F12培养基，继续培养24小时后，取出盖玻片，用4％福尔马林的PBS中固定10min,荧光显微镜观察紫外光照射下绿色荧光蛋白报道基因EGFP-N1表达质粒在细胞中的瞬时表达，并计算转染率(转染率＝暗视野下荧光数目/明视野下细胞数目)
5.1.3改良转染方法对293细胞的转染
改良转染方法是将前文所述的PEI-PEG-HAP-DNA或PEI-HAP-DNA载体基因复合物超声分散处理后，表面再覆盖修饰一层PEI或PEI-PEG，使其形成一个双层包被的新载体基因复合物(图7)。
1)生长密度达70-80％的293细胞，吸取去除旧培基，用2mLPBS缓冲液清洗细胞，并轻轻左右摇动，在培养瓶(培养瓶预先加0.2ml多聚赖氨酸，待干燥后再使用)中加入1ml胰酶置入培养箱中消化1分钟。
2)显微镜白光下观察见细胞形态皱缩变圆，并从瓶壁上脱落，加入3mL含血清培养基终止消化，巴氏管吹打均匀，使细胞完全分散。移液枪取10ul细胞悬液，用细胞计数板计数，计数5个中方格的细胞总数N，计算1ml中细胞总数为N×5×104/ml。
3)按照10000-20000/ml的细胞数将293细胞种于24孔板上(24孔板预先加多聚赖氨酸处理，待干燥后再使用)，每孔溶液总量为0.5ml。
4)待细胞密度达70-80％时进行转染。巴氏吸管弃去培养基，用PBS缓冲液洗细胞2次，移液枪取液向每孔加入1ml无血清DMEM培基。同时，2个EP管各加入500ul无血清DMEM培基，将4ul的脂质体2000与0.8ug的质粒分别加入到两个EP管中，静置5分钟后两者混合，再静置25分钟后加入到24孔板中。
5)消毒过的纳米PEI-HA或PEI-PEG-HAP溶液取25ug超声10分钟后加入2ug质粒，混合均匀，静置5-10分钟，将混合液再超声分散10分钟，再加入1.25ul及2.5ulPEI25k或PEI25k-PEG2k溶液，形成新的载体基因复合物，混匀后再超声10分钟，移液枪吸取超声后的悬浮HAP加入24孔板中，使培基总量达到1ml。移液枪向空白孔中加入1ml培基做阴性对照，，脂质体做阳性对照。
6)转染7小时后，巴氏管吸取各孔中的培基，更换新巴氏管向每孔中加入0.5ml含血清培养基，再将24孔板继续放入培养箱中培养。
7)培养24-48小时后，吸去培养基后，以PBS缓冲液轻轻漂洗细胞，每孔加200ul的4％多聚甲醛固定5-10分钟，紫外光照射下在倒置荧光显微镜下观察EGFP的表达，取5个视野的平均值计算转染率(转染率＝暗视野下荧光数目/明视野下细胞数目)。
5.2实验结果
5.2.1Hela细胞基因转染
为了检测HAP纳米载体复合物的转染功能，以携带增强型绿色荧光蛋白基因的质粒即EGFP-N1来检测6种HAP纳米颗粒在体外的转染效率。取2#、5#、8#、11#、14#、17#号纳米载体复合物各25ug，超声分散后加入2ugDNA，再将载体基因复合物的悬浮溶液加入到Hela细胞中，药物培养7小时后换液，继续培养24小时，用4％福尔马林液固定5-10分钟，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的瞬时表达。488nm紫外激发光下观察绿色荧光蛋白产生的情况，分别记录每个转染细胞培养孔中央和四周5个视野内明视野和暗视野所观察到的细胞数，按转染率＝暗视野所见发强绿色荧光的细胞数/明视野所见细胞数，计算转染率。
在6种纳米中以5#号纳米HAP即PEI25K-PEG2k-HAP转染效率最高，达到85％，2#纳米即PEI25K-HAP转染率也接近此水平达到80％，8#纳米即PEI25K-3PEG2k-HAP转染效率约为65％，17#纳米载体PEI25K-5PEG2k-HAP转染率则较低约48％，11#号纳米即PEI10K-HAP转染率约为56％，14#纳米载体即PEI10K-PEG2k-HAP转染效率约63％。脂质体阳性对照转染率较高，约83％，与5#及2#纳米载体接近。
5.2.2原代神经细胞转染
本研究选用在Hela细胞中转染效率最好的5#纳米载体转染大鼠耳蜗螺旋神经节组织及囊斑组织，发现其在耳蜗螺旋神经节组织中转染率约34.6％，而在囊斑组织中转染率约为11.4％，而且绿色荧光大多出现在胞核周围的胞浆中，胞核内则很少或没有发现绿色荧光。
5.2.3改良转染方法对293细胞的转染
5.2.3.1同一HAP不同外裹物的基因转染
以PEI25K-HAP为母核，结合DNA后以不同的PEI或PEI-PEG来外裹，形成新的纳米载体基因复合物。各种新型纳米载体复合物在293细胞中都有较好的转染效率，外裹物不同转染效率也不同。随着接枝物PEG的增多，转染效率逐渐升高，而且增加外裹物PEI25k-3PEG2k的浓度，转染效率也有小幅度升高，最高的为25ugPEI25k-HAP+2ugDNA+2.5ugPEI25k-3PEG2k，转染率为43.4％。
5.2.3.2不同浓度外裹物对基因转染的影响
前期预实验中发现PEI25k-PEG2k修饰的纳米HAP转染效率最高，因此以PEI25k-PEG2k-HAP为母核，PEI25k-PEG2k为外裹物，研究不同浓度的外裹物对转染效率的影响，分别以0.63ug、1.25ug、2.5ug的PEI25k-PEG2K来包裹基因载体复合物，发现外裹物的浓度对转染率影响并不明显，最高的为25ugPEI25k-PEG2K-HAP+2ugDNA+1.25ugPEI25k-PEG2K，转染率61.5％，与脂质体对照组的转染率69.3％接近。用其余两种浓度包裹时转染率也较高。
5.2.3.3表面修饰物的基因转染
本研究对照研究了PEI25K、PEI25K-PEG2k、PEI25K-3PEG2k以及空白组的转染率，每组均以N/P比为10的量加入2ugDNA进行转染,结果除了空白组，其余几种对照组均有转染表达，其中PEI25K-3PEG2k最高为36.3％，PEI25k可能因为毒性较大，转染率仅8.4％，PEI25K-PEG2k转染率则有31.2％。空白组未见荧光。
Claims (4)
1.一种纳米羟基磷灰石基因载体，其特征在于，所述基因载体包括作为载体本体的纳米羟基磷灰石，所述纳米羟基磷灰石表面被聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述基因载体长度为50—80nm，直径为20—30nm，电荷在25—40mv。
3.制备如权利要求1或2所述纳米羟基磷灰石基因载体的方法，其特征在于，所述方法是用聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰纳米羟基磷灰石：将聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶于极性溶剂，配成聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物浓度为50-150mg/mL的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液；将纳米羟基磷灰石粉末溶于极性溶剂，配成纳米羟基磷灰石浓度为1-10mg/mL的纳米羟基磷灰石溶液；将聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液加入纳米羟基磷灰石溶液中，得到聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物质量浓度为2-8％的聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物纳米羟基磷灰石混合溶液；将混合液经分散、离心后得到的沉淀进行超声处理，得到纳米羟基磷灰石表面被聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰的纳米羟基磷灰石基因载体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述极性溶剂为去离子水。
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