CN107115304A - 一种去壁灵芝孢子粉片剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种去壁灵芝孢子粉片剂,包括以下重量份的原料:破壁灵芝孢子粉水提物13~20份,山梨糖醇3~5份,聚维酮K30 0.8~1.2份;所述的去壁灵芝孢子粉片剂的制备方法,包括以下步骤:将破壁灵芝孢子粉水提物、山梨糖醇和聚维酮K30混合10~30min,将得到的混合物料进行制粒、整粒和干燥后得到颗粒料,将颗粒料压片,得到去壁灵芝孢子粉片。所述去壁灵芝孢子粉片剂有效成分的含量有了极大的提高,使得有效成分易吸收,能够有效增强机体免疫力,有抗辐射和抗肿瘤作用;去壁灵芝孢子粉片剂的剂型使得其携带和服用非常方便。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品技术领域,尤其涉及一种去壁灵芝孢子粉片剂及其制备方法。
背景技术
人类对健康的认识随着科技水平的发展而进一步深化,据世界卫生组织50多个国家医学专家研究发现,对各种疾病最好的治疗是预防。目前各种医院的检查只能对已经产生的疾病进行诊断,一旦确认有病,往往会因发现太晚而束手无策,即使通过现代医疗科技手段也难使病人恢复如初。《黄帝内经》有言:“上工治未病,不治已病,此之谓也”,治未病即采取相应的措施,防止疾病的发生发展,是我国传统医学的主要思想。任何疾病只要预防和保养在先,发病的机率就会很低,甚至可以完全避免。
灵芝孢子(Ganoderma lucidum spore)是灵芝在生长成熟期,从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子。它凝聚了灵芝的精华,富含灵芝多糖、三萜类、蛋白质、多肽、氨基酸、核苷类化合物、有机锗、微量元素和维生素等多种生物活性物质,具有增强免疫力、抗辐射、清除自由基等多种功能,且药性温和,无副作用,但灵芝孢子表面被坚硬的几丁质纤维素所包围,人体很难充分吸收。目前市面上破壁灵芝孢子粉多通过机械破碎方法获得,人体吸收依旧存在一定困难。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种易吸收、能够有效增强免疫力、携带和服用方便的去壁灵芝孢子粉片。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种去壁灵芝孢子粉片剂,包括以下重量份的原料:破壁灵芝孢子粉13~20份,山梨糖醇3~5份,聚维酮K300.8~1.2份;所述去壁灵芝孢子粉片剂中总多糖的含量为1.5~7.6%,总三萜的含量为0.9~4%。
优选的,所述破壁灵芝孢子粉水提物的粒径小于0.180mm。
优选的,所述破壁灵芝孢子粉水提物的得率为15~25%。
优选的,所述去壁灵芝孢子粉片剂单片片剂的质量为0.8~0.9g。
本发明还提供了所述去壁灵芝孢子粉片剂的制备方法,包括以下步骤:
1)将破壁灵芝孢子粉水提物、山梨糖醇和聚维酮K30混合10~30min,将得到的混合物料进行制粒、整粒和干燥后得到颗粒料;
2)将所述步骤1)得到的颗粒料压片,得到去壁灵芝孢子粉片。
优选的,所述制粒过程中过筛的目数为14~16目,所述整粒过程中过筛的目数为18~20目。
优选的,所述的破壁灵芝孢子粉水提物是由破壁灵芝孢子粉经过水提、浓缩、干燥和粉碎后获得。
优选的,所述水提包括三阶段,第一阶段水提的温度为25~30℃,时间为1~3h,第一阶段水提用水的质量为破壁灵芝孢子粉的10~15倍;第二和第三阶段水提的温度独立地为95~100℃,时间独立的为1~3h,第二阶段和第三阶段水提用水的质量独立为破壁灵芝孢子粉的8~12倍。
优选的,所述浓缩的真空度0.07~0.09Mpa,温度为60~70℃。
优选的,所述干燥为微波干燥,所述微波干燥的真空度为-0.08Mpa,温度为60~70℃。
本发明的有益效果:
本发明提供的去壁灵芝孢子粉片剂,包括破壁灵芝孢子粉水提物13~20份,山梨糖醇3~5份和聚维酮K300.8~1.2份;去壁灵芝孢子粉片剂中用破壁灵芝孢子粉水提物代替破壁灵芝孢子粉,使得片剂中有效成分总多糖的含量为1.5~7.6%,总三萜的含量为0.9~4%,相比现有技术中的灵芝孢子粉中有效成分的含量有了极大的提高,使得有效成分易吸收,能够有效增强机体免疫力;具有抗辐射和抗肿瘤作用,并且去壁灵芝孢子粉片剂的剂型使得其携带和服用非常方便。
附图说明
图1为去壁灵芝孢子粉片剂对斑马鱼人胃癌(SGC-7901)移植瘤的抑制作用表型图;
图2为去壁灵芝孢子粉片剂对斑马鱼人胃癌(SGC-7901)移植瘤的抑制作用图;
图3为去壁灵芝孢子片剂对斑马鱼人胃癌(SGC-7901)移植瘤的抑制作用图;
图4.为去壁灵芝孢子粉片剂对斑马鱼人淋巴癌(Ramos)移植瘤的抑制作用表型图;
图5为去壁灵芝孢子粉片剂对斑马鱼人淋巴癌(Ramos)移植瘤的抑制作用图;
图6为去壁灵芝孢子粉片剂对斑马鱼人淋巴癌(Ramos)移植瘤的抑制作用图;
图7为去壁灵芝孢子粉片剂对斑马鱼人肺腺癌(A549)移植瘤的抑制作用表型图;
图8为去壁灵芝孢子粉片剂对斑马鱼人肺腺癌(A549)移植瘤的抑制作用;
图9为去壁灵芝孢子粉片剂对斑马鱼人肺腺癌(A549)移植瘤的抑制作用图。
具体实施方式
本发明提供了一种去壁灵芝孢子粉片剂,包括以下重量份的原料:破壁灵芝孢子粉水提物13~20份,山梨糖醇3~5份,聚维酮K300.8~1.2份;所述去壁灵芝孢子粉片剂中总多糖的含量为1.5~7.6%,总三萜的含量为0.9~4%。
本发明提供的去壁灵芝孢子粉片剂包括13~20份破壁灵芝孢子粉水提物,优选的为14~18份,更优选的为15~17份。在本发明中,所述去壁灵芝孢子粉的粒径优选的小于0.180mm,更优选的为0.100~0.160mm。
在本发明中,所述破壁灵芝孢子粉水提物为片剂的主要有效成分,其中含有总多糖和总三萜,所述破壁灵芝孢子粉水提物优选的由破壁灵芝孢子粉经水提获得,制备获得的去壁灵芝孢子粉的得率优选的为15~25%,更优选的为18~22%。灵芝孢子壁壳有双层坚硬的壁壳,占整个灵芝孢子质量的60%左右,主要是由几丁质物质组成,耐酸碱,难以被人体吸收利用,而本发明中的破壁灵芝孢子粉水提物经过水提后,其中不含灵芝孢子壁壳,并且活性成分总多糖和总三萜的含量有极大的提高,去壁灵芝孢子粉中总多糖的含量为2~10g/100g,优选的为4~8g/100g,总三萜的含量为1.2~5g/100g,优选的为3~4.5g/100g。与破壁灵芝孢子粉相比,去壁灵芝孢子粉水提物中不含孢子壁壳成分,且活性成分总多糖和总三萜的含量提高了8~12倍,从而使去壁灵芝孢子粉片剂的有效成分更易吸收,能够有效增强机体免疫力。本发明提供的去壁灵芝孢子粉片剂中有效成分总多糖的含量优选的为1.5~7.6%,更优选的为3~7%;总三萜的含量优选的为0.9~4%,更优选的为2~3.5%。
以破壁灵芝孢子粉水提物的质量为基准,本发明中提供的去壁灵芝孢子粉片剂包括3~5份山梨糖醇,优选的为4份。在本发明中山梨糖醇作为片剂的保湿剂和甜味剂,一方面保持片剂中的水分,另一方面调节片剂的口感,使得去壁灵芝孢子粉片剂的口感更好。
以破壁灵芝孢子粉水提物的质量为基准,本发明提供的去壁灵芝孢子粉片剂包括0.8~1.2份聚维酮K30,优选的为0.9~1.1份。在本发明中聚维酮K30作为片剂的粘合剂,使得片剂中的各个组份粘合一起,利于成型。
本发明还提供了上述技术方案所述去壁灵芝孢子粉片剂的制备方法,包括以下步骤:
1)将去壁灵芝孢子粉、山梨糖醇和聚维酮K30混合10~30min,将得到的混合物料进行制粒、整粒和干燥后得到颗粒料;
2)将所述步骤1)得到的颗粒料压片,得到去壁灵芝孢子粉片。
本发明中,所述去壁灵芝孢子粉优选的由破壁灵芝孢子粉经过水提、浓缩、干燥和粉碎后获得。在本发明中,所述水提包括三阶段,具体为将破壁灵芝孢子粉与水混合进行第一阶段水提;将所述第一阶段水提得到的药渣与水混合进行第二阶段水提;将所述第二阶段得到的药渣与水混合进行第三阶段水提,将三阶段水提得到的药液合并,得到提取液。在本发明中,所述第一阶段水提的温度优选的为25~30℃,更优选的为26~28℃,所述第一阶段水提的时间优选为1~3h,更优选的为2h;在水提过程中,第一阶段水提用水的质量优选为破壁灵芝孢子粉的10~15倍;更优选的为12~14倍。本发明在完成第一阶段水提后收集第一阶段提取液;本发明对所述收集的方法没有特殊限定,采用本领域常规的收集方法即可,具体的在本发明实施例中可采用过滤或离心的方法收集。
本发明在收集第一阶段提取液后,进行第二阶段水提,第二阶段水提用水的质量优选为破壁灵芝孢子粉的8~12倍,更优选的为9~11倍;所述第二阶段水提的温度优选为95~100℃,更优选的为97~99℃;所述第二阶段水提的时间优选为1~3h,更优选的为2h。本发明在第二阶段水提完成后收集第二阶段水提液。
本发明在收集第二阶段提取液后,进行第三阶段水提,第三阶段水提用水的质量优选为破壁灵芝孢子粉的8~12倍,更优选的为9~11倍;所述第三阶段水提的温度优选为95~100℃,更优选的为97~99℃;所述第三阶段水提的时间优选为1~3h,更优选的为2h。本发明在第三阶段水提完成后收集第三阶段水提液。
本发明在完成三个阶段水提后,将第一阶段水提液、第二阶段水提液和第三阶段水提液合并获得灵芝孢子粉提取液;将所述灵芝孢子粉提取液浓缩后得到灵芝孢子粉浓缩液。在本发明中所述浓缩优选为减压浓缩,所述浓缩的真空度优选的为-0.07~-0.09Mpa,更优选的为-0008Mpa;所述减压浓缩的温度优选的为60~70℃,更优选的为62~68℃,最优选的为65℃;所述减压浓缩后的密度优选为1.05~1.15更优选的为1.08~1.12,最优选为1.10。
本发明在获得灵芝孢子粉浓缩液后,将所述灵芝孢子粉浓缩液干燥,获得干浸膏。在本发明中,所述干燥优选为微波干燥,所述微波干燥的真空度优选的为-0.08Mpa;所述微波干燥的温度优选为60~70℃,更优选为63~68℃,最优选为65℃。
本发明在获得干浸膏后,优选的对所述干浸膏进行粉碎,获得去壁灵芝孢子粉。在本发明中所述的粉碎采用本领域常规的粉碎方法即可,具体的在本发明实施例中采用粉碎机进行,收集筛下组分;所述粉碎的过程中过筛的目数优选的为60~100目,更优选的为80目。所述去壁灵芝孢子粉的得率优选的为15~25%,更优选的为18~22%,最优选的为20%。
本发明在获得去壁灵芝孢子粉后,将去壁灵芝孢子粉、山梨糖醇和聚维酮K30混合得到混合物料。本发明中所述的混合采用本领域常规的粉料混合方法,具体的在本发明实施例中采用搅拌混合的方法,所述混合的时间优选为10~30min,更优选的为15~25min。
本发明在得到混合物料后,对混合物料进行制粒、整粒和干燥后得到颗粒料;本发明对所述制粒、整粒和干燥没有特殊的限制,采用本领域常规的制粒、整粒和干燥的技术方案即可;在本发明中,所述制粒过程中过筛的目数优选为14~16目,所述整粒过程中过筛的目数优选为18~20目;所述的干燥以能够得到有效成片剂的颗粒料即可。
得到颗粒料后,本发明将所述颗粒料进行压片,得到去壁灵芝孢子粉片剂。本发明对所述压片的方法没有其他特殊要求,采用本领域常规的压片方法即可。在本发明中所述去壁灵芝孢子粉片单片片剂的质量优选为0.8~0.9g,更优选的为0.85g。
本发明所述的去壁灵芝孢子粉片作为保健品,在使用时,根据服用者的身体状态决定,具体的每天2次,每次3片。
下面结合实施例对本发明提供的去壁灵芝孢子粉片剂及其制备方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
去壁灵芝孢子粉片剂,原料按重量份计包括破壁灵芝孢子粉16.5份、山梨糖醇4.2份、聚维酮K301份。
将破壁灵芝孢子粉经过水提、浓缩、干燥和粉碎后获得破壁灵芝孢子粉水提物。第一阶段水提的温度优选的为27℃,所述第一阶段水提的时间为2h,第一阶段水提用水的质量优选为破壁灵芝孢子粉的12倍;本发明在完成第一阶段水提后收集第一阶段提取液;第二阶段水提用水的质量优选为破壁灵芝孢子粉的10倍,第二阶段水提的温度为99℃,时间为2h。本发明在第二阶段水提完成后收集第二阶段水提液。第三阶段水提用水的质量优选为破壁灵芝孢子粉的11倍,第三阶段水提的温度为98℃;第三阶段水提的时间为2h。将第一阶段提取液、第二阶段提取液和第三阶段提取液合并后减压浓缩,所述浓缩的真空度为-0.09Mpa,所述减压浓缩的温度65℃,减压浓缩后的密度为1.10
浓缩后进行微波干燥,真空度为-0.08Mpa,温度为65℃。干燥后进行粉碎获得去壁灵芝孢子粉;粉碎的过程中过筛的目数为80目。粉碎后得到4.125重量份的破壁灵芝孢子粉水提物,计算所述破壁灵芝孢子粉水提物的得率为25%。
本发明在获得破壁灵芝孢子粉水提物后,将破壁灵芝孢子粉水提物、山梨糖醇和聚维酮K30混合20min得到混合物料,对混合物料进行14目制粒、20目整粒和干燥后得到颗粒料;对颗粒料进行压片,得到去壁灵芝孢子粉片剂,去壁灵芝孢子粉片剂单片片剂的质量为0.85g。其中去壁灵芝孢子粉片剂的总多糖提取率达到2.8%,总三萜提取率达到1.38%,去壁灵芝孢子粉的提取率高于市面上常见破壁灵芝孢子粉。
实施例2
去壁灵芝孢子粉片剂,原料按重量份计包括破壁灵芝孢子粉18份、山梨糖醇4份、聚维酮K300.9份。
将破壁灵芝孢子粉经过水提、浓缩、干燥和粉碎后获得破壁灵芝孢子粉水提物。第一阶段水提的温度优选的为26℃,所述第一阶段水提的时间为2h,第一阶段水提用水的质量优选为破壁灵芝孢子粉的13倍;本发明在完成第一阶段水提后收集第一阶段提取液;第二阶段水提用水的质量优选为破壁灵芝孢子粉的9.5倍,第二阶段水提的温度为99℃,时间为2h。本发明在第二阶段水提完成后收集第二阶段水提液。第三阶段水提用水的质量优选为破壁灵芝孢子粉的10倍,第三阶段水提的温度为98℃;第三阶段水提的时间为2h。将第一阶段提取液、第二阶段提取液和第三阶段提取液合并后减压浓缩,所述浓缩的真空度为-0.08Mpa,所述减压浓缩的温度65℃,减压浓缩后的密度为1.11。
浓缩后进行微波干燥,真空度为-0.07Mpa,温度为65℃。干燥后进行粉碎获得去壁灵芝孢子粉;粉碎的过程中过筛的目数为80目。粉碎后获得3.6重量份的破壁灵芝孢子粉水提物,计算所述破壁灵芝孢子粉水提物的得率为20%。
本发明在获得破壁灵芝孢子粉水提物后,将破壁灵芝孢子粉水提物、山梨糖醇和聚维酮K30混合25min得到混合物料,对混合物料进行14目制粒、20目整粒和干燥后得到颗粒料;对颗粒料进行压片,得到去壁灵芝孢子粉片剂,去壁灵芝孢子粉片剂单片片剂的质量为0.85g。其中去壁灵芝孢子粉的总多糖提取率达到2.76%,总三萜提取率达到1.43%,去壁灵芝孢子粉的提取率高于市面上常见破壁灵芝孢子粉。
实施例3
实施例1中去壁灵芝孢子粉片剂的药效及毒性试验。
骨髓有核细胞实验
设置去壁灵芝孢子粉片剂(1.00g/kg)及阴性对照组,阴性对照组给予同等容积的去离子水。各组灌胃给样品,每天一次,连续20天,进行60Co-γ射线照射,照射后第3天进行骨髓有核细胞实验,结果见表1。
表1骨髓有核细胞实验结果
组别 | 动物数(只) | 溶血空斑数(个/106脾细胞) | 骨髓有核细胞数(107/ml) |
阴性对照组 | 10 | 95±28 | 1.47±0.31 |
实施例1 | 10 | 132±23 | 2.01±0.45 |
由表1可以看出,实施例1中的去壁灵芝孢子粉片剂能够显著增加溶血空斑数和骨髓有核细胞数,提高细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性,对辐射危害有辅助保护功能。
急性毒性试验:按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行急性毒性试验,雌、雄性小鼠急性经口MTD大于20000mg/kg·bw,根据急性毒性剂量分级标准,该样品属无毒级。
微核试验:按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行微核试验,设受试物2.5、5.0、10.0g/kg·bw 3个剂量组,对小鼠灌胃。受试物微核试验结果为阴性。
精子畸形试验:按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行精子畸形试验,设受试物2.5、5.0、10.0g/kg·bw 3个剂量组,对雄性小鼠灌胃。受试物精子畸形试验结果为阴性。
Ames试验:按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行Ames试验,采用平板掺入法,测试剂量为5000、1000、200、40和8μg/皿。受试物Ames试验结果为阴性。
大鼠30天喂养试验:按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行大鼠30天喂养试验,雌性设4.06、2.63、1.18g/kg·bw/d(相当于人体推荐量的122倍、79倍、35倍)三个剂量组,雄性设3.79、2.45、1.13g/kg·bw/d(相当于人体推荐量的114倍、74倍、34倍)三个剂量组。实验结果表明:去壁灵芝孢子粉片剂大鼠30天喂养试验各剂量组各项指标均未观察到有害作用。
由以上实施例可知,本发明所述去壁灵芝孢子粉片剂中有效成分总多糖的含量为1.5~7.6%,总三萜的含量为0.9~4%,相比现有技术中的灵芝孢子粉中有效成分的含量有了极大的提高,使得有效成分易吸收,安全无毒,能够有效增强机体免疫力;并且去壁灵芝孢子粉片剂的剂型使得其携带和服用非常方便。
灵芝孢子粉片剂药效试验
实验动物
1.野生型AB品系斑马鱼,以自然成对交配繁殖方式进行。共330尾,每实验组为30尾,年龄为受精后2天(330尾用于样品抗肺腺癌作用评价)。
2.野生型AB品系斑马鱼,以自然成对交配繁殖方式进行。共480尾,每实验组为30尾,年龄为受精后2天(330尾用于样品抗肺腺癌作用评价,150尾用于抗肺腺癌作用评价重复实验)。
3.野生型AB品系斑马鱼,以自然成对交配繁殖方式进行。共660尾,每实验组为30尾,年龄为受精后2天(330尾用于样品抗淋巴癌作用评价,330尾用于样品抗淋巴癌作用评价重复实验)。
饲养于28℃的养鱼用水中(水质:每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐,电导率为480~510μS/cm;pH为6.9~7.2;硬度为53.7~71.6mg/L CaCO3),实验动物使用许可证号为:SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
实验药物
样品去壁灵芝孢子粉,褐色粉末,批号为16042301,溶于超纯水中,常温干燥保存,由浙江寿仙谷医药股份有限公司,2016年05月10日接收。临用前用超纯水配制,现配现用。
硫酸长春新碱,白色粉末,LOT#K1306055,购于阿拉丁,阴凉柜保存。临用时用二甲基亚砜(DMSO)配制成5mM母液,最终工作液中DMSO浓度为0.1%。
顺铂,黄色粉末,LOT#K1520124,购于阿拉丁,阴凉柜保存。临用时用二甲基亚砜(DMSO)配制成50mM母液,最终工作液中DMSO浓度为0.1%。
仪器与试剂
电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100,Nikon公司);解剖显微镜(SZX7,OLYMPUS,Japan);与显微镜相连的相机(TK-C1481EC);精密电子天平(CP214,奥豪斯);6孔板(NestBiotech);甲基纤维素(Aladdin,Shanghai,China)。
实施例5
去壁灵芝孢子粉片剂抗胃癌作用评价
1.浓度组别
实验1组 模型对照组
实验2组 阳性对照药顺铂50μM
实验3组 样品28μg/mL
实验4组 样品83μg/mL
实验5组 样品250μg/mL
2.浓度确定依据
样品在35℃的MTC均为250μg/mL;根据项目方案,样品抗肿瘤评价浓度设置为:28μg/mL(1/9MTC)、83μg/mL(1/3MTC)和250μg/mL(MTC)。
3.模型制作
用红色荧光染料(CM-Dil)标记人胃癌(SGC-7901)细胞,以显微注射的方式移植到斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约200个细胞,建立斑马鱼人胃癌移植瘤模型。
4.实验方法
4.1确定最大耐受浓度(MTC)
随机选取野生型AB品系斑马鱼于六孔板中,分别水溶给予样品,浓度均分别为10、100、250、500、1000和2000μg/mL,同时设置正常对照组。供试品处理期间,每天对死亡的斑马鱼计数并移除死鱼;供试品处理斑马鱼2天后,观察记录斑马鱼的运动状态和死亡情况,确定供试品对斑马鱼的MTC。
4.2样品去壁灵芝孢子粉片剂抗胃癌作用评价
使用CM-Dil标记人胃癌(SGC-7901)细胞,以显微注射的方式移植到2dpf野生型AB品系斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约200个细胞,建立斑马鱼人胃癌(SGC-7901)移植模型;将注射了SGC-7901细胞的斑马鱼放置于35℃培养至3dpf。
在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼,随机分配至6孔板中,以水溶给药方法分别给予样品28、83和250μg/mL浓度,阳性对照药顺铂50μM浓度,同时设置模型对照组,每孔(浓度组)30尾斑马鱼,每孔容量为5mL。将各实验(浓度)组斑马鱼继续置于35℃培养,2天后,每个实验(浓度)组随机选10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片;利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析,计算癌细胞荧光强度,以荧光强度分别评价样品对斑马鱼胃癌(SGC-7901)移植瘤的抑制作用,并用以下公式计算肿瘤抑制作用。
根据移植瘤的生长抑制作用绘制浓度效应曲线;统计学分析采用方差分析和Dunnett’s T-检验,p<0.05为显著性差异;提供具有代表性的实验图谱。
特别说明:野生型AB系斑马鱼本身并不产生红色荧光,CM-Dil标记的细胞注射到斑马鱼卵黄囊后,在一定波长下能激发产生红色荧光,荧光强度总和与癌细胞的数量成正相关,荧光强度总和越大,癌细胞数量越多。
5.实验结果
5.1 MTC
根据表1,样品在500μg/mL到1000μg/mL浓度范围内斑马鱼均出现死亡;因此确定样品对斑马鱼的MTC为250μg/mL,评价实验浓度均选取28μg/mL(1/9MTC)、83μg/mL(1/3MTC)和250μg/mL(MTC)。
表1.供试品“浓度-死亡率”统计表
5.2样品去壁灵芝孢子粉片剂抗胃癌作用评价
阳性对照药顺铂在50μM浓度下斑马鱼人胃癌(SGC-7901)移植瘤细胞荧光强度值总和为256812像素,与模型对照组比较(408759像素)p<0.001,肿瘤抑制作用为37%,显示顺铂对斑马鱼人胃癌(SGC-7901)移植瘤的生长有明显抑制作用。
样品在28、83和250μg/mL的浓度下对斑马鱼人胃癌(SGC-7901)移植瘤细胞荧光强度值总和分别为202089、190268和149865像素,与模型对照组比较p<0.001&p<0.001&p<0.001,肿瘤抑制作用分别为51%、53%和63%。详见表2、图1、图2和图3。
表2.样品对斑马鱼人胃癌(SGC-7901)移植瘤的抑制作用(n=10)
注:与模型对照组比较,*p<0.05,***p<0.001
实施例6
去壁灵芝孢子粉片剂抗淋巴癌作用评价
1.浓度组别
实验1组 模型对照组
实验2组 阳性对照药长春新碱5μM
实验3组 样品28μg/mL
实验4组 样品83μg/mL
实验5组 样品250μg/mL
2.浓度确定依据
同实施例5。
3.模型制作
用红色荧光染料(CM-Dil)标记人淋巴癌(Ramos)细胞,以显微注射的方式移植到斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约200个细胞,建立斑马鱼人淋巴癌移植瘤模型。
4.实验方法
使用CM-Dil标记人淋巴癌(Ramos)细胞,以显微注射的方式移植到野生型AB品系2dpf斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约200个细胞,建立斑马鱼人淋巴癌移植模型;将注射了人淋巴癌细胞的斑马鱼放置于35℃培养至3dpf。
在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼,随机分配至6孔板中,以水溶给药方法分别给予样品1、3和9μg/mL浓度,阳性对照药长春新碱5μM浓度,同时设置模型对照组,每孔(浓度组)30尾斑马鱼,每孔容量为5mL。将各实验(浓度)组斑马鱼继续置于35℃培养,2天后,每个实验(浓度)组随机选10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片;利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析,计算癌细胞荧光强度,以荧光强度评价样品对斑马鱼人淋巴癌(Ramos)移植瘤的抑制作用,并用以下公式计算肿瘤抑制作用。
根据移植瘤的生长抑制作用绘制浓度效应曲线;统计学分析采用方差分析和Dunnett’s T-检验,p<0.05为显著性差异;提供具有代表性的实验图谱。
特别说明:野生型AB系斑马鱼本身并不产生红色荧光,CM-Dil标记的细胞注射到斑马鱼卵黄囊后,在一定波长下能激发产生红色荧光,荧光强度总和与癌细胞的数量成正相关,荧光强度总和越大,癌细胞数量越多(Li et al.2011)。
实验结果
阳性对照药长春新碱在5μM浓度下对斑马鱼人淋巴癌(Ramos)移植瘤细胞荧光强度为152159像素,与模型对照组比较(233644像素)p<0.001,肿瘤抑制作用为35%,显示长春新碱对斑马鱼人淋巴癌(Ramos)移植瘤的生长有明显抑制作用。
样品在1、3和9μg/mL的浓度下对斑马鱼人淋巴癌(Ramos)移植瘤细胞荧光强度值总和分别为213273、206096和146990像素,与模型对照组比较,1和3μg/mLp>0.05,肿瘤抑制作用分别为9%和12%;9μg/mL浓度组p<0.001,肿瘤抑制作用为37%。详见表3、图4、图5和图6。
表3.样品去壁灵芝孢子粉对斑马鱼人淋巴癌(Ramos)移植瘤的抑制作用(n=10)
注:与模型对照组比较,***p<0.001
实施例7
去壁灵芝孢子粉片剂抗肺腺癌作用评价
1.浓度组别
实验1组 模型对照组
实验2组 阳性对照药顺铂50μM
实验3组 样品28μg/mL
实验4组 样品83μg/mL
实验5组 样品250μg/mL
2.浓度确定依据
同实施例5。
3.模型制作
用红色荧光染料(CM-Dil)标记人肺腺癌(A549)细胞,以显微注射的方式移植到斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约200个细胞,建立斑马鱼人肺腺癌移植瘤模型。
4.试验方法
使用CM-Dil标记人肺腺癌(A549)细胞,以显微注射的方式移植到野生型AB品系2dpf斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约200个细胞,建立斑马鱼人肺腺癌(A549)移植模型;将注射了A549细胞的斑马鱼放置于35℃培养至3dpf。
在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼,随机分配至6孔板中,以水溶给药方法分别给予样品1、3和9μg/mL浓度,阳性对照药顺铂50μM浓度,同时设置模型对照组,每孔(浓度组)30尾斑马鱼,每孔容量为5mL。将各实验(浓度)组斑马鱼继续置于35℃培养,2天后,每个实验(浓度)组随机选10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片;利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析,计算癌细胞荧光强度,以荧光强度评价样品“3”号对斑马鱼肺腺癌(A549)移植瘤的抑制作用,并用以下公式计算肿瘤抑制作用。
根据移植瘤的生长抑制作用绘制浓度效应曲线;统计学分析采用方差分析和Dunnett’s T-检验,p<0.05为显著性差异;提供具有代表性的实验图谱。
特别说明:野生型AB系斑马鱼本身并不产生红色荧光,CM-Dil标记的细胞注射到斑马鱼卵黄囊后,在一定波长下能激发产生红色荧光,荧光强度总和与癌细胞的数量成正相关,荧光强度总和越大,癌细胞数量越多(Li et al.2011)。
实验结果
阳性对照药顺铂在50μM浓度下对斑马鱼人肺腺癌(A549)移植瘤细胞荧光强度值总和为211187像素,与模型对照组比较(297891像素)p<0.01,肿瘤抑制作用为29%,显示顺铂对斑马鱼人肺腺癌(A549)移植瘤的生长有明显抑制作用。
样品在1、3和9μg/mL浓度下对斑马鱼人肺腺癌(A549)移植瘤细胞荧光强度值总和分别为264348、265484和252527像素,与模型对照组比较,3个浓度组p均>0.05,肿瘤抑制作用分别为11%、11%和15%。详见表4、图7、图8和图9。
表4.样品去壁灵芝孢子粉对斑马鱼人肺腺癌(A549)移植瘤的抑制作用(n=10)
注:与模型对照组比较,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001
试验结果表明:本实验浓度条件下,本发明的去壁灵芝孢子粉片剂对斑马鱼人胃癌移植瘤、人肺腺癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤均有抑制作用,其中对斑马鱼人胃癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤的抑制作用较强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种去壁灵芝孢子粉片剂,其特征在于,包括以下重量份的原料:破壁灵芝孢子粉水提物13~20份,山梨糖醇3~5份,聚维酮K300.8~1.2份;
所述去壁灵芝孢子粉片剂中总多糖的质量含量为1.5~7.6%,总三萜的含量为0.9~4%。
2.根据权利要求1所述的去壁灵芝孢子粉片剂,其特征在于,所述破壁灵芝孢子粉水提物的粒径小于0.180mm。
3.根据权利要求1所述的去壁灵芝孢子粉片剂,其特征在于,所述破壁灵芝孢子粉水提物的得率为15~25%。
4.根据权利要求1所述的去壁灵芝孢子粉片剂,其特征在于,单片去壁灵芝孢子粉片剂的质量为0.8~0.9g。
5.权利要求1~4所述的去壁灵芝孢子粉片剂的制备方法,包括以下步骤:
1)将破壁灵芝孢子粉水提物、山梨糖醇和聚维酮K30混合10~30min,将得到的混合物料进行制粒、整粒和干燥后得到颗粒料;
2)将所述步骤1)得到的颗粒料压片,得到去壁灵芝孢子粉片。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述制粒过程中过筛的目数为14~16目,所述整粒过程中过筛的目数为18~20目。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述破壁灵芝孢子粉水提物是由破壁灵芝孢子粉经过水提、浓缩、干燥和粉碎后获得。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述水提包括三阶段,第一阶段水提的温度为25~30℃,时间为1~3h,第一阶段水提用水的质量为破壁灵芝孢子粉的10~15倍;第二和第三阶段水提的温度独立地为95~100℃,时间独立的为1~3h,第二阶段和第三阶段水提用水的质量独立为破壁灵芝孢子粉的8~12倍。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述浓缩的真空度-0.07~-0.09Mpa,温度为60~70℃。
10.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述干燥为微波干燥,所述微波干燥的真空度为-0.08Mpa,温度为60~70℃。
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