CN1274689C - 一种植物提取物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物的提取物，及这种提取物的提取方法和这种提取物的应用。本发明的提取物是生长于我国西藏南河谷地区的多年生矮豆科灌木，砂生槐的提取物，特别是砂生槐的亲脂性总生物碱。本发明的亲脂性总生物碱中包括脱去提取物中的部分脂类杂质成分后的产物。本发明的应用是指用砂生槐提取物作为制备癌症治疗药物的应用，或者作为制备杀灭绦虫的药物的应用，或者作为制备前述药物的原料应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物的提取物，及这种提取物的提取方法和这种提取物的应用。
背景技术
提取一些特有植物中有效成分，以得到具有临床治疗应用的提取物是一件极有意义的工作。
砂生槐(Sophora Moorcroftiana)是在我国西藏南河谷地区分布的特有的多年生矮豆科灌木，是一种可在高寒和贫脊地区生长的植物，具有耐干旱、耐干暖、抗风沙，以及极强的适应性和很好的防风固沙，保持水土等生态功能。现阶段砂生槐多作生态植物用于对沙漠化土地的恢复和改良。根据中国药典记载，砂生槐具有清热利湿，驱风杀虫之效，可治疗肠炎痢疾等症。据中国医学百科全书·藏药学记载：砂生槐果实味苦性凉，入肝经，可用作催吐和消炎解毒之用，但在现有文献中记载中砂生槐的应用均是与其它植物药配合共同使用。另据《自然资源学报》1993，8(5)和《自然资源学报》1992，7(4)李玉祥、许毓英等人的文章披露，砂生槐的果实蛋白质含量高达29.42～30.60％，仅次于大豆，17种氨基酸的含量为23.22～24.53％，有较高的营养价值，因此建议用其作为一种蛋白质类的营养物质使用。
在现有文献中尚未发现对砂生槐的进一步研究，特别是对砂生槐提取物、提取方法及其提取物应用的报道。
发明内容
本发明涉及一种植物提取物，以及这种植物提取物的提取方法和其应用。
本发明的提取物是砂生槐提取物，特别是砂生槐的亲脂性总生物碱。本发明的亲脂性总生物碱中包括脱去提取物中的部分脂类杂质成分后的产物。
本发明的砂生槐提取物的提取方法，是将经分拣的砂生槐成熟果实粉碎，将经上处理的砂生槐果实粉用盐酸水溶液少量多次浸泡。将浸泡液合并收集，用三氯甲烷萃取部分脂类成分，再将回收的液体用氨水调pH值＝10～11，静止24小时后用氯仿多次萃取，得白色或黄白色的固体状生物总碱。
或者，将收集自然群落中成熟的砂生槐果实种子，分离出虫害果实和杂质后进行粉碎，将其置入乙醇中，或者置入60～80％的乙醇水溶液中，用回流或室温渗漏，提取液蒸去酒精后在所得的胶质中加入2％左右的稀酸水溶液提取生物碱，所得液体用乙醚、氯仿洗涤，再对水相用氨水、碳酸钠或石灰水溶液进行碱化，游离出的生物碱分别再用乙醚、氯仿提取、纯化，再将提取液进行蒸馏浓缩，得白色或黄白色的固体状生物总碱。
或者，将收集自然群落中成熟的砂生槐果实种子，分离出虫害果实和杂质后进行粉碎，再将先用少量碱水拌匀至湿润为止，将其加入苯或氯仿或二氯乙烷进行浸泡或渗漏，再将所得液体用盐酸水溶液处理三至五次。收集并合并所得盐酸水溶液，将所得液体用三氯甲烷萃取脂类成分，再将回收的液体用氨水调pH值＝10～11，静止24小时后再用氯仿多次萃取，再进行蒸馏浓缩，得白色或黄白色的固体状生物总碱。
本发明的应用是将砂生槐提取物作为制备癌症治疗药物的应用，或者作为制备癌症治疗药物原料的应用。
本发明的另一种应用是将砂生槐提取物作为制备杀灭绦虫药物的应用，或者作为制备杀灭绦虫药物的原料的应用。
本发明可以使砂生槐这一生态植物具有更大的经济价值，提供一种新的抗癌药物，和一种有效的杀灭绦虫的药物，或者提供前述药物的生产原料。
附图说明
图1为SGC-7901细胞的阴性对照组培养24小时后的荧光显微镜形态图。图2为SGC-7901细胞加入0.6mg·ml-1的砂生槐提取物的药物组经培养24小时后的荧光显微镜形态图。图3是是SGC-7901细胞培养48小时琼脂凝胶电泳图，其中的A为阴性对照组，B为加入0.6mg·ml-1的砂生槐提取物的药物组，而C为为加入10.6mg·ml-1、1.2mg·ml-1.2mg·ml-1的砂生槐提取物的药物组。
具体实施方式
以下提供砂生槐提取物的几种提取方法及相关实验的实例。
砂生槐提取物的提取方法1
收集自然群落中成熟的砂生槐果实种子，将分离出虫害果实和杂质的种子粉碎，过40目筛，备用。
将经上处理的砂生槐果实粉用15倍体积的0.5％盐酸水溶液少量多次浸泡。例如首次浸泡2天，第二次浸泡1天，第三次浸泡12小时，第四次浸泡6小时。将浸泡液合并收集，浸泡液用生物碱通用试剂检查，生物反应呈阴性或弱阳性。将浸泡液用三氯甲烷萃取脂类成分，再将回收的液体用氨水调pH值＝10～11，静止24小时后用氯仿多次萃取，得白色或黄白色的固体状生物总碱。
砂生槐提取物的提取方法2
收集自然群落中成熟的砂生槐果实种子，将分离出虫害果实和杂质的种子粉碎，过40目筛，备用。
将经上处理的砂生槐果实粉置入乙醇中，或者置入60～80％的乙醇水溶液中，用回流或室温渗漏，提取液蒸去酒精后在所得的胶质中加入2％左右的稀酸水溶液提取生物碱，所得液体用乙醚、氯仿洗涤，再对水相用氨水、碳酸钠或石灰水溶液进行碱化，游离出的生物碱分别再用乙醚、氯仿提取、纯化，再将提取液进行蒸馏浓缩，得白色或黄白色的固体状生物总碱。
砂生槐提取物的提取方法3
收集自然群落中成熟的砂生槐果实种子，将分离出虫害果实和杂质的种子粉碎，过40目筛，备用。
将经上处理的砂生槐果实粉先用少量碱水拌匀至湿润为止，将其加入苯或氯仿或二氯乙烷进行浸泡或渗漏，再将所得液体用1～2％的盐酸水溶液处理三至五次，每次所用的盐酸水溶液为有机溶剂量的1/10～1/5。收集并合并所得盐酸水溶液，再将所得液体用三氯甲烷萃取脂类成分，再将回收的液体用氨水调pH值＝10～11，静止24小时后再用氯仿多次萃取，得白色或黄白色的固体状生物总碱。
砂生槐提取物抑制肿瘤细胞增殖的实验
细胞系：上皮型低分化人肺腺癌细胞(GLC-83)，上皮型人肺腺癌细胞(SPC-A-1)和人胃癌SGC-7901。
试验药物：将砂生槐提取物用DMSD配成70.4mg·ml-1。
细胞培养：上皮型低分化人肺腺癌细胞(GLC-83)，上皮型人肺腺癌细胞(SPC-A-1)和人胃癌SGC-7901细胞株培养于RPMI-1640完全细胞培养液中，培养液中含10％灭活小牛血清、L-谷氨酰胺2mmol·ml-1、青霉素和链霉素各100U·L-1。
实验：将生长于RPML-1640完全培养液中的指数生长细胞，以1.5×105·ml-1的浓度接种于96孔塑料培养板，每孔100μl。以不加药物仅加入0.1％DMSO的试验组为阴性对照组；药物实验组分为四组，各组所加的砂生槐浓度分别为0.6mg·ml-1、1.2mg·ml-1、2.4mg·ml-1、4.8mg·ml-1。另设调零组，即不加药物，而仅以RPML-1640全培养液代替细胞。再将以上的阴性对照组、药物组和调零组置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱培养24小时、48小时和72小时，实验终止前4小时在每个实验孔中加入MTT液10μl，孵育结束时弃去上层清液，所余物加入DMSO150μl，再用振荡器摇匀，用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定各孔的OD值。实验重复三次，按下式求出抑制率：
抑制率(％)＝(对照组OD平均值-实验组OD平均值)/对照组OD平均值×100％
砂生槐提取物对肺癌细胞GLC-82增殖实验结果见表1，砂生槐提取物对
肺、癌细胞SPC-A-1增殖实验结果见表2，砂生槐提取物对胃癌细胞SGC-7901增殖实验结果见表3。
在对胃癌细胞SGC-7901的实验中发现，砂生槐提取物能有效地诱导癌细胞凋亡。经荧光显微镜观察可见癌细胞凋亡的形态特征，如细胞皱缩、细胞膜起泡、细胞核碎裂和凋亡小体形成，参见图1至图2。经对用砂生槐提取物处理的胃癌细胞的电泳实验表明，受试细胞出现明显的生化特征的“DNA Ladder”，而对照组(即0.1％DMSO组)则无此特征出现，参见图3。经砂生槐处理24小时后，对受试细胞进行的流式细胞仪测定中还可见，在G1峰前出现了凋亡峰，凋亡细胞为12.9～16.0％，而对照组细胞的G1峰前却无此现象。这表明砂生槐提取诱导细胞凋亡，产生抗癌的作用。因此砂生槐可以作为一种抗癌的药物，或者作为抗癌药物的原料应用。
砂生槐提取物用于杀灭细粒棘球绦虫原头蚴的实验：
1、仪器与试剂
CO2细胞培养箱，倒置显微镜，显微成像系统，DMSO。
2、药物
将砂生槐提取物用DMSO配成300mg·ml-1储液(DMSO终浓度小于0.1％)，经灭菌后在-20℃冰箱保存，实验时用细胞培养液稀释。
3、细胞培养液
20％的小牛血清的RPMI-1640细胞培养液，其内再加入500U·ml-1青霉素和500U·ml-1链霉素。
4、实验用原头蚴
用常规方法从屠宰的原头蚴羊肝包囊中无菌采集囊液，再用含青霉素和链霉素各500U·ml-1的灭菌生理盐水反复冲洗原头蚴。经冲洗后用0.03％的亚甲基蓝染色进行镜检表明原头蚴存活率达95％以上。
5、实验方法及数据处理
在每个培养瓶中取原头蚴0.3ml(2.0×104个·ml-1)接种于4.7ml的1640培养液中，培养24小时后分为对照组(不加药组)，加药实验组四组(药物终浓度分别为0.75mg·ml-1、1.50mg·ml-1、3.00mg·ml-1和6.00mg·ml-1)和在培养液中仅加入阿苯达唑20μ·ml-1阳性药物的对照组，每组各设三个培养瓶。将各实验培养瓶置入37℃、5％的饱和湿度的培养箱中培养，再分别於1天、3天、5天和7天在倒置显微镜下观察原头蚴的活动情况。同时吸取100μl的培养液于载玻片上，用0.03％的亚甲基蓝染色1分钟加盖玻片后在显微镜下观察。实验判断的标准为：若2/3以上的虫体(包括2/3)着色或虫体不活动即判断为虫死亡。计数200个原头蚴死亡率，并用显微成像系统照相，按下式计算并校正虫体死亡率：
死亡率＝(药物组死亡率-对照组死亡率)/(100-对照组死亡率)×100％
对以上采集的数据用SPSS软件(8.0)统计处理各剂量组原头蚴在体外培养不同时间的死亡率。
6、实验结果
A、光镜检查结果
在光学显微镜下可见，在药物作用下，原头蚴多呈处翻型，其吸盘变形，顶突已经破坏，外表粗糙起泡、肿胀，虫体结构模糊，钙粒减少或消失，小钩发生脱落或排列不整齐。而对照组的原头蚴结构则正常。
B、杀灭效果
实验组中的原头蚴的死亡率见表4。经双因素分析，各药物实验组的原头蚴死亡率与阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.005)，而且药物实验组中浓度为1.50mg·ml-1～6.00mg·ml-1的与加入阿苯达唑的阳性药物对照组相比较亦有统计学意义(P＜0.01)。实验说明砂生槐提取物能有效杀灭原头蚴，而且其作用效果强于现使用的阿苯达唑药物。因此砂生槐提取物是一种极有前途的杀灭绦虫的药物，或者药物的原料。
(以下接后页)
Claims (5)
1、一种植物提取物，其特征是该提取物为砂生槐脱去脂类成分的亲脂性总生物碱。
2、权利要求1所述的植物提取物的提取方法，其特征是将经分拣的砂生槐成熟果实粉碎，再用含酸水溶液浸泡，所得浸泡液用三氯甲烷脱脂，再用碱调pH值至10～11，静置后滤出清液，将清液用氯仿萃取，再将萃液蒸馏浓缩。
3、权利要求1所述的植物提取物的提取方法，其特征是将经分拣的砂生槐成熟果实粉碎，将其加入苯或氯仿或二氯乙烷进行浸泡或渗漏，再将所得液体用1～2％的盐酸水溶液处理三至五次，每次所用的盐酸水溶液为有机溶剂量的1/10～1/5，收集并合并所得盐酸水溶液，再将所得液体用三氯甲烷萃取脂类成分，再将回收的液体用氨水调pH值＝10～11，静止24小时后再用氯仿多次萃取后，再将提取液进行蒸馏浓缩。
4、权利要求1所述的一种植物提取物的应用，其特征是作为制备癌症治疗药物的应用。
5、根据权利要求1所述的一种植物提取物的应用，其特征是作为制备杀灭绦虫药物的应用。
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