CN114324283A - 一种艾叶腺毛和非腺毛观察、计数的荧光显微制片技术 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种艾叶腺毛和非腺毛观察、计数的荧光显微制片技术，涉及植物显微鉴定技术领域。本发明通过荧光染色，利用腺毛和非腺毛自发荧光的差异，可以清晰观察到腺毛和非腺毛的分布情况，并分别完成腺毛和非腺毛的观察计数。本发明所述计数方法技术取样量少，节约试剂，成本低，极易操作，成功率高，很容易达到令人满意的实验目的，解决了长期困扰研究者的这一重大科学问题。
Description
技术领域
本发明属于植物显微鉴定技术领域，具体涉及一种艾叶腺毛和非腺毛观察、计数的荧光显微制片技术。
背景技术
艾(Artemisia argyi)为菊科(Compositae)蒿属(Artemisia)植物。艾品种繁多，几遍全国。不同的生存环境孕育出了丰富的艾种资源，湖北省蕲春县的“蕲艾”，河南省汤阴县的“北艾”，河北省安国市的“祁艾”，浙江省宁波市的“海艾”都是最具有代表性的品种。夏季花未开时采摘植物艾的叶，除去杂质，晒干，可得中药材艾叶。艾叶晒干捣碎得“艾绒”，艾绒主要供艾灸用。腺毛是艾叶挥发油的主要来源，非腺毛为艾绒主要组成部分。因而腺毛和非腺毛的数量直接关系到艾叶和艾绒的鉴定和质量评价，对艾叶腺毛和非腺毛的数量和分布特点进行研究可以为艾叶的高质量生产、质量控制提供实验数据和理论指导。
当前，艾叶显微观察研究多采用普通光学显微镜和扫描电子显微镜，但由于艾叶下表面密被厚重的非腺毛，普通光学显微镜和扫描电子显微镜都无法进行有效观察。进而，研究者开始把目光转向了荧光显微镜，以期解决当前面临的难题。然而由于T型非腺毛密集分布，其顶细胞又极长(长达2000μm)，相互交错缠绕，似乎只有通过观察T型非腺毛的柄部，才能作到有效观察和计数；另外，受叶绿素等自发荧光所产生背景的影响，腺毛在荧光显微镜下观察起来也较为困难；同时，由于非腺毛顶细胞自发荧光的干扰，也影响了腺毛的观察，导致无法观察艾叶下表面上腺毛和非腺毛的分布情况并完成计数。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种艾叶腺毛和非腺毛观察、计数的荧光显微制片技术，方法简单易行，可高效去除背景色，并对艾叶的目标部位进行特殊染色，方便腺毛和非腺毛的准确计数。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种艾叶腺毛和非腺毛的计数方法，包括以下步骤：(1)将艾叶在盐酸溶液中浸泡后清洗和晾干，切取部分叶片并在水封片后，在落射荧光显微镜下对荧光显色的腺毛进行计数；
(2)将所述部分叶片置于丙二醇中浸泡12～24h，利用小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液染色5～10min，再转移至甲苯胺蓝O的PBS溶液中染色1～5min，清洗和水封片，在落射荧光显微镜下对荧光显色的非腺毛柄部进行计数。
优选的，步骤(1)所述浸泡前还包括对新鲜的成熟艾叶进行表面清洗。
优选的，所述浸泡用的盐酸溶液浓度为25～35％。
优选的，所述浸泡的时间为2～8min。
优选的，步骤(1)中切取5～10mm见方的叶片制片。
优选的，步骤(1)中，利用所述落射荧光显微镜的绿光或蓝光激发荧光。
优选的，步骤(2)中所述小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液进行染色时，所述小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液的质量浓度均为0.1％～0.5％，所述染色的温度为60～70℃，染色的时间为5～15min。
优选的，步骤(2)中甲苯胺蓝O的PBS溶液中，甲苯胺蓝O溶液的质量浓度为0.2％～0.5％。
优选的，步骤(2)中，利用所述落射荧光显微镜的蓝光激发荧光。
本发明还提供了上述计数方法在艾叶鉴定和质量评价中的应用。
有益效果：本发明提供了一种艾叶腺毛和非腺毛的计数方法，通过荧光染色，利用腺毛和非腺毛自发荧光的差异，可以清晰观察到腺毛和非腺毛的分布情况，并分别完成腺毛和非腺毛的观察计数，具体地：盐酸浸泡处理使叶片变黑，从而避免叶肉组织自发荧光的影响，改变了观察腺毛时的背景，此时仅能观察到腺毛发出强烈的荧光(非腺毛荧光与腺毛不同，基于背景原因，不影响观察)，很容易观察到腺毛的分布并完成计数。用丙二醇处理叶片后，腺毛中的自发荧光物质溶解而进入丙二醇，避免在观察非腺毛时腺毛自发荧光的干扰，再次改变了显微观察的背景，非腺毛的柄部由于木栓化而自发荧光，经过小檗碱或吖啶黄088染色后荧光加强，可以发出较强的荧光；然后再用甲苯胺蓝处理小块叶片，可进一步降低非腺毛柄部以外部分的荧光干扰，因此可以清晰观察到非腺毛柄部的荧光，从而实现对非腺毛分布情况的观察并完成计数。本发明所述计数方法取样量少，节约试剂，成本低，极易操作，成功率高，很容易达到令人满意的实验目的，解决了长期困扰研究者的这一重大科学问题。
附图说明
图1为落射荧光显微镜下的艾叶上表面腺毛荧光显色图；
图2为落射荧光显微镜下的艾叶下表面腺毛荧光显色图；
图3为落射荧光显微镜下的艾叶上表面非腺毛荧光显色图；
图4为落射荧光显微镜下的艾叶下表面非腺毛荧光显色图。
具体实施方式
本发明提供了一种艾叶腺毛和非腺毛的计数方法，包括以下步骤：(1)将艾叶在盐酸溶液中浸泡后清洗和晾干，切取部分叶片并在水封片后，在落射荧光显微镜下对荧光显色的腺毛进行计数；
(2)将所述部分叶片置于丙二醇中浸泡12～24h，利用小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液染色5～10min，再转移至甲苯胺蓝O的PBS溶液中染色1～5min，清洗和水封片，在落射荧光显微镜下对荧光显色的非腺毛柄部进行计数。
本发明将艾叶在盐酸溶液中浸泡后清洗和晾干，切取部分叶片并在水封片后，在落射荧光显微镜下对荧光显色的腺毛进行计数。本发明所述艾叶优选新鲜的成熟艾叶，确保无病变现象。本发明在利用所述盐酸溶液浸泡前，优选还包括对所述艾叶进行表面清洗，更优选包括用蒸馏水清洗叶片表面以除去叶表面的灰尘等杂质，并晾干表面的水分。本发明利用盐酸溶液对所述艾叶进行浸泡，所述盐酸溶液的浓度优选为25～35％，所述浸泡的时间优选为2～8min。本发明在所述浸泡后优选利用清水进行冲洗并晾干。本发明所述盐酸浸泡可使叶片变黑，从而避免叶肉组织自发荧光的影响，一方面可改变荧光观察条件下的背景，另一方面还能保证清晰看到腺毛而避免非腺毛荧光干扰。
本发明优选切取5～10mm见方的叶片进行制片，更优选地包括分别将上表面或下表面朝上放在载玻片上，滴加一滴蒸馏水，盖上盖玻片，使用落射荧光显微镜在蓝光或绿光激发下腺毛均可发出耀眼的荧光，对上表面和下表面的腺毛分别进行观察摄像并完成计数。
本发明将腺毛计数后的部分叶片置于丙二醇中浸泡12～24h，利用小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液染色5～10min，再转移至甲苯胺蓝O的PBS溶液中染色1～5min，清洗和水封片，在落射荧光显微镜下对荧光显色的非腺毛柄部进行计数。
本发明所述丙二醇的体积优选为5～10mL，所述体积的丙二醇可除去腺毛中的荧光物质，避免影响非腺毛的荧光染色观察，避免在观察非腺毛时腺毛自发荧光的干扰，再次改变了显微观察的背景，非腺毛的柄部由于木栓化而自发荧光。
本发明在丙二醇处理后，进行连续的两步染色，首先利用小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液染色5～10min，再转移至甲苯胺蓝O的PBS溶液中染色1～5min，利用所述小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液进行染色时，所述小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液中小檗碱或吖啶黄088的质量浓度优选均为0.1％～0.5％，所述染色的温度优选为60～70℃，染色的时间优选为5～15min。本发明经过小檗碱或吖啶黄088染色后荧光加强，可以发出较强的荧光。
本发明利用甲苯胺蓝O的PBS溶液再次染色1～5min，所述甲苯胺蓝O的PBS溶液的溶剂优选为磷酸盐缓冲液(pH＝4.0)，所述甲苯胺蓝O溶液的质量浓度优选为0.2％～0.5％。本发明利用所述甲苯胺蓝O的PBS溶液处理小块叶片，可进一步降低非腺毛柄部以外部分的荧光干扰，可以清晰观察到非腺毛柄部的荧光，从而实现对非腺毛分布情况的观察并完成计数。在本发明中，优选用镊子将小块叶片从甲苯胺蓝O中取出，在培养皿中用蒸馏水漂洗1～2min；将漂洗好的小块叶片转移至载玻片上，盖上盖玻片，轻轻压平，使用落射荧光显微镜蓝光激发对上表面和下表面非腺毛分别进行观察，可以看到非腺毛的柄部发出亮蓝色的荧光，对上表面和下表面分别进行观察摄像，可容易的完成对非腺毛的观察和计数。
本发明还提供了上述计数方法在艾叶鉴定和质量评价中的应用。
在本发明中，腺毛是艾叶挥发油的主要来源，非腺毛为艾绒主要组成部分。因而腺毛和非腺毛的数量直接关系到艾叶和艾绒的鉴定和质量评价，对艾叶腺毛和非腺毛的数量和分布特点进行研究可以为艾叶的高质量生产、质量控制提供实验数据和理论指导，因此利用本发明所述计数方法进行计数后，根据腺毛的和非腺毛的有无、密度和分布特点可将艾叶及其伪品和代用品相区别，对艾叶可对于艾叶的真伪和品质进行鉴定和评价提供重要的参考资料。
下面结合实施例对本发明提供的一种艾叶腺毛和非腺毛观察、计数的荧光显微制片技术进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.从艾植株上取下新鲜的成熟叶片，确保无病变现象。
2.用蒸馏水清洗叶片表面以除去叶表面的灰尘等杂质，晾干表面的水分。
3.然后将其浸于浓度为30％的浓盐酸中浸泡5min。取出叶片，用清水冲洗，将其晾干。
4.取上述叶片，并在其上剪取8mm见方的小块叶片，分别上表面或下表面朝上放在载玻片上，滴加一滴蒸馏水，盖上盖玻片，使用落射荧光显微镜在蓝光或绿光激发下腺毛均可发出耀眼的荧光，对上表面和下表面的腺毛分别进行观察摄像并完成计数(图1和图2)。
5.取一称量瓶，加入5ml丙二醇备用。
6.完成对腺毛观察计数后，打开盖玻片，用镊子将小块叶片转移至上述准备好的丙二醇中，盖上称量瓶的盖子，浸泡12h。
7.用镊子从丙二醇中取出处理好的小块叶片，转入另一个称量瓶，加入3ml质量浓度为0.1％的小檗碱溶液，温度控制在65℃范围内，加热5min。
8.再取一称量瓶，倒入3ml用pH为4.0的磷酸盐缓冲液配置质量浓度为0.2％～0.5％的甲苯胺蓝O。
9.用镊子将小块叶片从小檗碱中取出，转移至甲苯胺蓝O中染色2min。
10.紧接着，用镊子将小块叶片从甲苯胺蓝O中取出，在培养皿中用蒸馏水漂洗2min。
11.最后，将漂洗好的小块叶片转移至载玻片上，盖上盖玻片，轻轻压平，使用落射荧光显微镜蓝光激发对上表面和下表面非腺毛分别进行观察，可以看到非腺毛的柄部发出亮蓝色的荧光，对上表面和下表面分别进行观察摄像，可容易的完成对非腺毛的观察和计数(图3和图4)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种艾叶腺毛和非腺毛的计数方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将艾叶在盐酸溶液中浸泡后清洗和晾干，切取部分叶片并在水封片后，在落射荧光显微镜下对荧光显色的腺毛进行计数；
(2)将所述部分叶片置于丙二醇中浸泡12～24h，利用小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液染色5～10min，再转移至甲苯胺蓝O的PBS溶液中染色1～5min，清洗和水封片，在落射荧光显微镜下对荧光显色的非腺毛柄部进行计数。
2.根据权利要求1所述计数方法，其特征在于，步骤(1)所述浸泡前还包括对新鲜的成熟艾叶进行表面清洗。
3.根据权利要求1或2所述计数方法，其特征在于，所述浸泡用的盐酸溶液浓度为25～35％。
4.根据权利要求3所述计数方法，其特征在于，所述浸泡的时间为2～8min。
5.根据权利要求1所述计数方法，其特征在于，步骤(1)中切取5～10mm见方的叶片制片。
6.根据权利要求1所述计数方法，其特征在于，步骤(1)中，利用所述落射荧光显微镜的绿光或蓝光激发荧光。
7.根据权利要求1所述计数方法，其特征在于，步骤(2)中所述小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液进行染色时，所述小檗碱的水溶液或吖啶黄088的水溶液的质量浓度均为0.1％～0.5％，所述染色的温度为60～70℃，染色的时间为5～15min。
8.根据权利要求1所述计数方法，其特征在于，步骤(2)中甲苯胺蓝O的PBS溶液中，甲苯胺蓝O溶液的质量浓度为0.2％～0.5％。
9.根据权利要求1所述计数方法，其特征在于，步骤(2)中，利用所述落射荧光显微镜的蓝光激发荧光。
10.权利要求1～9任一项所述计数方法在艾叶鉴定和质量评价中的应用。
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