CN116399892A - 一种利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法。本发明方法包括以下步骤：(1)选叶片中待测区域，剪取样本，浸于醛类固定液中固定浸泡；(2)经乙醇溶液梯度脱水，乙酸异戊酯置换后，利用临界点干燥仪进行干燥；(3)使用胶带粘除非腺毛；(4)然后喷金，于扫描电子显微镜下观察。采用本发明方法，使艾纳香腺毛的观察和分布密度统计能够简单、高效、准确地完成。采用本发明方法，不仅很好地解决了叶片不平整的问题，而且还完全解决了非腺毛遮挡干扰视野的问题。
Description
技术领域
本发明涉及植物观测领域，特别涉及一种利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法。
背景技术
艾纳香是一种芳香药用植物，其香气的主要来源器官是叶，且叶片表面覆盖有大量非腺毛和腺毛，其中，腺毛是艾纳香重要分泌结构，与艾纳香的香气释放、生物抗性和芳香物质积累具有密切关联，因此观察艾纳香叶腺毛的形态和分布密度具有重要的生产实践和研究意义。但是，艾纳香的叶片表面覆盖的非腺毛又长又密，且叶片呈波浪起伏，以上两方面的干扰导致长期以来无法准确、充分地观察艾纳香的腺毛形态和密度。旧有的观察艾纳香表皮毛的技术存在根本性的缺陷。首先，针对非腺毛对腺毛遮挡和干扰的问题，旧技术在阴凉处通风一段时间，使非腺毛干枯收缩。该方法中，非腺毛虽然收缩，但依然存在，仍然对腺毛观察和统计造成严重干扰。在非腺毛的密度很大、完全覆盖的情况下，即使非腺毛收缩了，仍然遮挡视野，无法看见腺毛；其次，针对艾纳香叶片波浪起伏，普通透镜的景深小于叶片起伏范围，造成部分视野不清晰，无法完整统计视野内腺毛密度的问题，旧技术先阴干叶片后利用压环对叶片进行压平，阴干过程不仅会加剧皱缩，增加压平的难度，而且干燥后艾纳香叶片高度脆化的特点，使叶片在强行压平的过程中破碎，无法得到完全清晰的视野。
具体地，CN105466931A公开一种辅助评估艾纳香质量的便携装置及快速评估艾纳香质量的方法，具体公开“先将叶片在阴凉处通风一段时间，叶片表面的非腺毛干枯收缩”，在阴凉处通风一段时间，使非腺毛干枯收缩，非腺毛虽然收缩、变小，但依然存在，仍然对腺毛观察和统计造成严重干扰。在非腺毛的密度很大的情况下，完全覆盖的情况下，即使非腺毛干燥收缩了，仍然覆盖，无法看见腺毛，无法对腺毛计数。CN205608304U公开一种评估艾纳香属植物表皮毛的便携设备，因为取得的图像是横切面，只能从横截面观察表皮毛，缺乏叶片面积数据，所以无法计算和记录腺毛密度。刘若菡等发表论文“基于场发射扫描电镜的4种唇形科植物腺毛形态观察研究”，是利用常规扫描电镜方法观察对薄荷、藿香、留兰香、东风菜叶片表面腺毛，该方法观察植物的腺毛都没有被大量非腺毛覆盖，也没有叶片起伏、干燥后易碎的问题，因此不需要特殊操作，此外，从论文结果照片中可发现其样品中的表皮细胞均发生了皱缩变形，未能很好地展示细胞原始形态，该方法不适用于非腺毛遮挡、叶片起伏且干燥后脆而易碎的艾纳香叶片。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，更加清楚观察叶片腺毛，并有效计算和记录腺毛密度。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，包括以下步骤：
(1)选艾纳香叶片中部叶脉附近区域，剪取样本，浸于醛类固定液中固定浸泡；
(2)经乙醇溶液梯度脱水，乙酸异戊酯置换后再利用临界点干燥仪进行干燥，利用液态二氧化碳置换样品中乙酸异戊酯，再将二氧化碳从液态、临界态变为气体，从被干燥样品中释放出来，达到干燥的效果；
(3)使用胶带粘除非腺毛；
(4)然后喷金，于扫描电子显微镜下观察。
进一步的，所述样本尺寸为(0.4～1.2)×(0.4～1.2)cm。
进一步的，所述固定浸泡时间为20～30h，优选24h。
进一步的，所述醛类固定液为FAA固定液或多聚甲醛固定液。
进一步的，所述FAA固定液为50％～70％FAA固定液。
进一步的，所述多聚甲醛固定液为1％～8％多聚甲醛固定液。
进一步的，所述乙醇溶液的溶度为70v/v％～100v/v％。
进一步的，所述梯度脱水时间为7～14小时。
进一步的，所述梯度脱水乙醇溶液溶度依次为70v/v％、80v/v％、85v/v％、90v/v％、95v/v％、100v/v％(第1次)、100v/v％(第2次)，每个浓度各1～2小时。
进一步的，控制临界点干燥仪干燥的放气速度≤2ml/s，所述临界点干燥仪干燥处理时间为2～4小时，优选3～4小时，更优选3小时。控制放气速度，使样品温和缓慢地干燥，避免表皮细胞、非腺毛和腺毛等精细结构中的液态二氧化碳从液态变为气态时过快，因为表面张力而导致表面结构受破坏。
进一步的，所述使用胶带粘除非腺毛，具体操作为：选用透明胶带，拇指与食指各捏住胶带黏性面的一端，使胶带的黏性面呈Ω形状向外展开，以凸出部分靠近并粘除非腺毛。该方法的特点在于胶带的黏性面呈Ω形状靠近样品时，手的力量传导至样品的过程中有胶带形成的弹性弧形的缓冲，因此可以更精细、柔和地控制粘贴力度。常规方法是直接用手指按着胶带的光滑面，使黏性面压向样品，这种操作方法容易损坏样品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)采用本发明方法，采用“先固定、慢脱水，再粘毛，后喷金、扫描电镜”操作方法，极大优化了艾纳香腺毛的观察效果，使得艾纳香腺毛分布密度统计能够简单、高效、准确地完成。采用本发明方法，不仅很好地解决了艾纳香叶片不平整的问题，而且还完全解决了艾纳香非腺毛遮挡干扰视野的问题，同时克服光学显微镜景深过浅和常规扫描电镜操作流程造成的组织变形的问题。
(2)本发明通过实施梯度酒精浸泡，再利用临界点干燥仪干燥的方式，对材料充分脱水干燥，使非腺毛充分、完全地干燥并脆化。改变旧方法简单的“先将叶片在阴凉处通风一段时间，叶片表面的非腺毛干枯收缩”，该旧方法阴干目的在于使非腺毛收缩，降低遮挡度；本发明充分干燥的目的在于使非腺毛脆化，便于完全脱除，同时剩余的结构又不变形皱缩，可以很好地展示腺毛和其他表皮细胞的形态。
(3)本发明利用脱水后非腺毛又脆又长，易扯断的特点，在充分脱水后，在干燥环境中，立刻利用胶带轻轻粘除非腺毛，剩下非腺毛的残基，并露出短小的腺毛，极大提高艾纳香腺毛的观察效果。
附图说明
图1本发明实施例使用胶带粘除非腺毛处理前后的扫描电子显微镜图；
图2本发明实施例1以及对比例1方法观察艾纳香腺毛的扫描电子显微镜图。
图3不同固定方式对观察效果的影响(扫描电子显微镜图)；
图4不同脱水方式对观察效果的影响(扫描电子显微镜图)；
图5使用以及未使用胶带进行脱毛对观察效果的影响(扫描电子显微镜图)。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例使用70％FAA固定液、4％多聚甲醛固定液均为市售产品。
本发明实施例使用临界点干燥仪的品牌型号为Quorum K850。
实施例1
一种利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法
先固定、慢脱水，再粘毛，后喷金、扫描电镜。
一、具体操作：
(1)采集新鲜艾纳香叶片，选叶片中部叶脉附近区域，剪取1×1cm面积方块，浸于70v/v％FAA固定液中固定24小时；
(2)经乙醇溶液梯度脱水(v/v＝70％，80％，85％，90％，95％，100％，100％)各个浓度分别脱水1小时，其中第2次100％浓度使用新的无水乙醇溶液，经乙酸异戊酯置换1h后，再利用临界点干燥仪进行干燥3小时，控制放气速度≤2ml/s，使样品在注液浸泡时有机溶剂得以充分置换，在净化处理时进排气实现动平衡；同时避免表皮细胞、非腺毛和腺毛等精细结构中的液态二氧化碳过渡从液态变为气态时过快，因为表面张力而导致表面结构受破坏；
(3)使用胶带粘除非腺毛，具体操作为：选用透明胶带，拇指与食指各捏住胶带黏性面的一端，使胶带的黏性面呈Ω形状向外展开，以凸出部分靠近并粘除非腺毛，该方法的特点在于胶带的黏性面呈Ω形状靠近样品时，手的力量传导至样品的过程中有胶带形成的弧形的缓冲，因此可以更精细地控制粘贴力度。常规方法是直接用手指按着胶带的光滑面，使黏性面压向样品，这种操作方法容易损坏样品。
(4)然后喷金，于扫描电子显微镜下观察，统计腺毛数量。
艾纳香叶片的非腺毛密度大，容易遮挡腺毛，本发明在喷金之前增加脱毛步骤，即用胶带轻柔地反复多次粘贴、撕拉叶片表面，粘除非腺毛，暴露出腺毛，即可观察和统计腺毛数量，结合同一视野的面积，即可统计腺毛密度＝腺毛数量/面积。
如图1所示，图1A：扫描电镜下非腺毛遮挡；图1B：脱毛操作方法示意图；图1C：扫描电镜下脱毛后暴露出全视野清晰的所有腺毛；图1D：扫描电镜下非腺毛遮挡；图1E、图F：扫描电镜下脱毛后暴露出清晰、形态完好的腺毛。
对比例1-光学体式显微镜观察方法
采集新鲜艾纳香叶片，先阴干后压环压平(参见CN 105466931 A)，采用光学体式显微镜直接拍摄。
具体操作：将艾纳香叶片在阴凉通风处晾10h，将晾后的艾纳香叶片置于切割环上，并往上套入透镜固定筒，使艾纳香叶片位于在透镜和压环之间。
二、观察结果
本发明方法的观察效果，与光学体式显微镜观察方法的进行对比结果如下表1：
表1本发明方法与光学体式显微镜观察方法的观察效果
本发明不仅很好地解决了叶片不平整的问题，而且还完全解决了非腺毛遮挡干扰视野的问题，该技术只需在常规扫描电镜样品处理流程基础上减慢干燥速度并增加一个胶带粘除非腺毛的步骤，就可以达到很好的观察效果，所需胶带简单易得。因此本技术使艾纳香腺毛的观察和分布密度统计能够简单、高效、准确地完成。
另外，叶片剪取尺寸为(0.4～1.2)×(0.4～1.2)cm，使用固定液固定时间为20～30h，经乙酸异戊酯置换1～48h，梯度乙醇溶液脱水每个浓度脱水时间为1～2h，干燥时间为2～4h，在实施例1的基础上，在上述范围内调整，均能实现本发明的目的。
对比研究例
采集同一批次的新鲜艾纳香叶片，分别对固定方式、干燥方式、脱毛对观察效果影响进行研究。
1、固定的影响(使用扫描电子显微镜)
对比研究例1-1：阴干后进行快速脱水，未使用胶带粘除非腺毛，喷金后，使用扫描电子显微镜直接拍摄；其他处理与实施例1相同。
对比研究例1-2：经70％FAA固定液固定后进行快速脱水，未使用胶带粘除非腺毛，喷金后，使用扫描电子显微镜直接拍摄；其他处理与实施例1相同。
对比研究例1-3：经4％多聚甲醛固定液固定后进行快速脱水，未使用胶带粘除非腺毛，喷金后，使用扫描电子显微镜直接拍摄；其他处理与实施例1相同。
上述快速脱水的具体操作：经乙醇溶液梯度脱水(v/v＝70％，80％，85％，90％，95％，100％)各个浓度分别脱水15分钟。
表2研究不同固定方式结合快速脱水对观察效果的影响结果
如图3所示，其中，图3A可看出阴干后进行常规的快速脱水使非腺毛严重变形，且非腺毛密度大时，遮挡视野，导致看不到腺毛；
图3B可看出虽然经过FAA固定，虽然可以识别腺毛，但是常规的快速脱水仍使非腺毛、腺毛和表皮都严重变形，不能很好地展示组织和细胞原始的形态；图3D可看出虽然经过FAA固定，但是进行常规的快速脱水使组织严重变形，且非腺毛密度大时，遮挡视野，导致看不到腺毛；
图3C可看出虽然经过4％多聚甲醛固定，但是常规的快速脱水仍使非腺毛、腺毛和表皮都严重变形，不能很好地展示组织和细胞原始的形态。
2、脱水速度的影响(使用扫描电子显微镜)
对比研究例2-1：经70％FAA固定液固定后，进行快速脱水，即经乙醇溶液梯度脱水(v/v＝70％，80％，85％，90％，95％，100％)各个浓度分别脱水15分钟，利用临界点干燥仪快速干燥30分钟，放气速度≥10ml/s，未使用胶带粘除非腺毛，喷金后，使用扫描电子显微镜直接拍摄；其他处理与实施例1相同。
对比研究例2-2：经4％多聚甲醛固定液固定后，按照实施例1进行缓慢梯度脱水以及临界点干燥仪缓慢干燥，未使用胶带粘除非腺毛，喷金后，使用扫描电子显微镜直接拍摄；其他处理与实施例1相同。
对比研究例2-3：经70％FAA固定液固定后，按照实施例1进行缓慢梯度脱水以及临界点干燥仪缓慢干燥，未使用胶带粘除非腺毛，喷金后，使用扫描电子显微镜直接拍摄；其他处理与实施例1相同。
表3研究脱水速度对观察效果的影响结果
如图4所示，其中，
图4A可看出即使FAA固定，但是快速脱水仍导致组织皱缩；
图4B可看出4％多聚甲醛固定且缓慢脱水后，组织形态保持完好；
图4C可看出FAA固定且缓慢脱水后，组织形态保持完好；
图4D可看出FAA固定且缓慢脱水后，组织形态保持完好，但是当非腺毛密度大的时候，由于遮挡，看不到腺毛，所以无法对腺毛进行观察和统计。
3、使用胶带进行脱毛的影响
对比研究例3-1：没有使用胶带粘除非腺毛，其他处理与实施例1相同。
对比研究例3-2：与实施例1相同。
表4研究使用胶带对观察效果的影响结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选叶片中待测区域，剪取样本，浸于醛类固定液中固定浸泡；
(2)经梯度乙醇溶液脱水，乙酸异戊酯置换后，使用临界点干燥仪干燥；
(3)使用胶带粘除非腺毛；
(4)然后喷金，于扫描电子显微镜下观察。
2.根据权利要求1所述的利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，所述样本尺寸为(0.4～1.2)×(0.4～1.2)cm。
3.根据权利要求1所述的利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，所述固定浸泡时间为20～30h。
4.根据权利要求1或3所述的利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，所述醛类固定液为FAA固定液或多聚甲醛固定液。
5.根据权利要求1所述的利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，所述乙醇溶液的溶度为70v/v％～100v/v％。
6.根据权利要求1或5所述的利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，所述梯度脱水时间为7～14小时。
7.根据权利要求1所述的利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，所述梯度乙醇溶液的溶度依次为70v/v％、80v/v％、85v/v％、90v/v％、95v/v％、100v/v％、100v/v％，即100v/v％脱水2次，每个浓度各1～2小时。
8.根据权利要求1所述的利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，控制临界点干燥仪的放气速度≤2ml/s。
9.根据权利要求1或8所述的利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，所述临界点干燥仪干燥处理时间为2～4小时。
10.根据权利要求1所述的利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法，其特征在于，所述使用胶带粘除非腺毛的具体操作为：选用透明胶带，拇指与食指各捏住胶带黏性面的一端，使胶带的黏性面呈Ω形状向外展开，以凸出部分靠近并粘除非腺毛。
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| CN202310327886.XA CN116399892A (zh) | 2023-03-29 | 2023-03-29 | 一种利用扫描电镜观察艾纳香腺毛的方法 |
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| CN (1) | CN116399892A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114324283A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-12 | 河南中医药大学 | 一种艾叶腺毛和非腺毛观察、计数的荧光显微制片技术 |
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2023
- 2023-03-29 CN CN202310327886.XA patent/CN116399892A/zh active Pending
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| CN114324283A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-12 | 河南中医药大学 | 一种艾叶腺毛和非腺毛观察、计数的荧光显微制片技术 |
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