KR101613303B1 - 상처치료용 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상처치료 효능을 갖는 금은화 또는 인동 추출물을 제공하는 효과가 있고, 상기 금은화 또는 인동 추출물 중에서 선택된 하나의 추출물을 유효성분으로 함유하는 상처치료 조성물을 제공함으로써 아쿠아포린-3 단백질의 발현을 증가시킴으로써 상처치료 효능을 갖는 피부 외용제를 제공하여 부작용에 대한 우려 없이 안전하고 효과적으로 바를 수 있는 기능성 화장품 또는 의약품을 제공에 관한 것이다.

Description

상처치료용 피부 외용제 조성물{Composition of skin external for treating a wound}

본 발명은 인동 식물의 잎과 줄기 추출물을 유효성분으로 함유하는 상처조직의 재상피화를 촉진시키는 상처치료용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 우리 몸에서 가장 큰 기관으로서 최외각에 존재한다. 인체를 외부의 각종 위협으로부터 보호하는 기능을 하는 피부는 항상 다양한 외부자극과 접하기 때문에 다른 기관들에 비해 상처가 일어나기 쉽다. 신체에 발생하는 상처는 자연적인 일련의 치유과정을 거치게 되는데 이런 자연 치유 과정은 매우 복잡하며 정확한 기전에 대해서는 아직 정확히 모르는 상태이다. 창상의 치유는 염증단계, 상피화단계, 증식단계, 성숙단계로 구분할 수 있으며, 각각의 단계는 중첩되면서 연속적으로 진행된다. 이는 각 과정에서 나타나는 세포들, 세포들에 의해 유래되는 각종 인자들과 조직간의 복잡한 유기적인 상호작용으로 그 과정이 이루어지기 때문이다.

염증단계에는 상처부위로 면역세포들이 이동하여 성장인자와 염증반응유도 신호전달 물질들을 분비하기 위해 상처부위에 과립조직형성을 유도한다. 이러한 염증단계는 상처치료 과정에 꼭 필요한 단계로서 중대한 감염이 없는 상태에서는 염증단계가 일반적으로 짧게 일어난다(Korea Medical Book Publisher, 2002). 재상피화단계와 증식단계는 비슷한 시기에 일어나며 상처부위에 과립조직을 형성하는 단계이다. 재상피화단계와 증식단계에 형성된 과립조직들은 섬유아세포 및 염증성 세포와 함께 미성숙 콜라겐, 피브로넥틴 및 히알루론산 등의 세포외 기질 구성요소들로 이루어져 있고 이 과립조직들이 상처부분을 빠르게 채우고 조직적인 구조를 갖추게 된다. 이렇게 상처 표면이 과립조직들로 채워지고 표면이 각질형성세포에 의해 덮이면서 새로운 표피가 생성되고 상피층이 재건된다. 이러한 과정이 끝나면 세포들은 상처 가장자리 또는 남겨진 피부의 진피 잔여물에서 상처를 통하여 떠올라 상처표피(딱지) 아래와 살아있는 결합 조직위를 통하여 이동한다. 이렇게 재상피화가 완료되면 결합조직의 증가와 재편성을 통하여 상처 면적이 감소되는 일련의 과정들이 진행되고 이러한 과정이 상처치유의 일반적인 과정이다.

상기 기재한 상처치유의 과정에서 무엇보다 중요하게 여겨지는 것은 부작용이나 흉터 없이 상처를 빠르게 치료하는 것이며 이를 위해서는 염증의 억제와 성장인자들의 발현조절 그리고 각질형성세포의 세포주기 활성화를 통한 상처부위의 상피층 재건이 중요하게 여겨진다.

아쿠아포린(aquaporins)은 물의 출입이 이뤄지는 많은 조직에 존재하는 막관통단백질(major intrinsic protein family)로 체액의 분비와 재흡수 그리고 항상성을 조절한다고 알려져 있다. 포유동물에서는 13가지 종류가 알려져 있다. 이들 중 피부에서 발현하는 아쿠아포린-3 (aquaporin-3)은 물과 글리세롤 투과성이 뛰어나다. 최근 피부의 아쿠아포린-3의 발현과 각질세포의 증식, 분화, 이동 및 상처치유에 대한 상관관계에 대하여 보고되었다(Cong CAO et al., EGFR-mediated expression of aquaporin-3 is involved in human skin fibroblast migration. Biochem. J., (2006) 400, 225-234). 특히 세포의 이동은 층상위족(lamellipodia)의 끝부분에 삼투압에 의한 물의 유입 때문에 일어난다(Papadopoulos MC et al., Aquaporis and cell migration. Pfluqers arch., (2008) 456(4), 693-700).

현재 상처 치유제로서, 에피더말 성장인자(epidermal growth factor), 사이토카인(cytokine), 인터루킨(interluckin), 트랜스포밍 성장인자-β (transforming growth factor-beta) 등과 같은 펩타이드와 마데카솔(madecasol; 아시아티코사이드; asiaticoside) 등이 사용되어 오고 있으나, 펩타이드의 경우 값이 매우 비싸고, 또 불안정하여 상처 치유제로 널리 사용되지 못하고 있으며, 마데카솔의 경우 효과가 미약하고, 접촉성 피부염 같은 부작용을 유발하는 단점이 지적되어 부작용의 위험이 낮고 치료 효능 및 안전성이 높은 상처 치료제에 대한 요구가 여전히 존재한다.

따라서, 부작용이 적은 천연물을 이용하여 상처 치료효과를 갖는 소재 개발 연구가 많은 관심을 끌고 있다.

금은화(Lonicera japonica Flos)는 인동과의 식물인 Lonicera japonica Thunb.의 꽃봉오리로 은화, 쌍화, 인동화라고도 한다(전통의학연구소, 동양의학대사전, 서울: 성보사 (2000) 309). 이 약은 청열해독, 양산풍열하는 대표적인 약물로 옹종정창, 후비, 단독, 열독혈리, 풍열감모, 온병발열 등을 치료하는 효과 있어(전국한의과대학 공동표재편찬위원회, 본초학, 서울: 영림사 (2005) 242-243), 임상적으로 많은 감염성 질환, 외이도염, 화농증, 중이염과 같은 질환에 효과기 있으며, 바이러스성 결막염, 인플루엔자, 폐렴 등의 염증에 사용되고 있다(Dan Bensky, Andrew Gamble, Chinese herbal medicine, Materia Medica., Eastland Press, Incorporated, (1986) 85-86; Hyang KC, The pharmacology of Chinese herbs (2nd Ed.), CRC, (1998) 260, 388-389).

한편, 인동(Lonicera japonica Thumb.)은 인동과의 식물로 이뇨, 건위, 청열, 해소 및 소염제로 사용되고 있는 생약이다(이창복, 대한식물도감, 향문사, 서울 (1989); 지형준 등, 대한약전외한약(생약)규격집, 한국메디칼인텍스사, 서울 (1988) 87, 305). 또한, 사사의학, 광제비급 등의 한약서에서 인체 내, 외의 각종 염증질환인 옹저에 유용하게 사용된다는 기록이 있으며 민간에서는 오래전부터 소염, 진통활성이 알려져 감기와 같은 상기도 감염증, 편도선염 및 신경통 치료에 많이 사용되어왔다. 최근 인동의 이러한 소염, 진통활성이 실험동물 모델을 통하여 과학적으로 인증되어 있다(연변 조서민족의약연구소, 조선민족 사상의학, 여강출판사, 서울 (1991) 276; 이송진 등, 식물성 항염증제의 개발: 인동추출물에 대한 항염증 및 진통작용의 비교, 생약학회지 (1994) 25, 363-367; Lee SJ et al., antiinflammatory activity of Lonicera japonica. Phytother. Res. (1998) 12, 445-447).

한편, 천연물을 이용한 상처 치료용 외용제에 관한 종래 기술로는 대한민국 등록특허 제 10-1047644호에 포공영, 승마, 산약 또는 고본 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물이 개시되어 있을 뿐, 인동의 잎과 줄기의 추출물을 이용한 상처치료용 외용제에 관한 보고는 전무하다.

따라서 본 발명의 목적은 상처치료 효능을 갖는 인동 추출물의 아쿠아포린-3 단백질의 발현 증가에 의한 상처치료 효능을 갖는 피부 외용제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 금은화 또는 인동 추출물을 제조하는 단계와; 상기 단계에서 수득한 2종의 추출물을 각질화형성세포인 HaCaT 세포에 각각 처리하여 "긁힘 손상" 유도에서 긁힘 상처가 회복되는 효과와 아쿠아포린-3 단백질의 발현증가 효과를 확인하는 단계와; 상기 단계에서 상처회복 효과를 확인한 2종의 추출물의 피부 재생 효과를 확인하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 상처치료 효능을 갖는 금은화 또는 인동 추출물을 제공하는 효과가 있고, 상기 인동의 잎과 줄기 추출물 중에서 선택된 하나의 추출물을 유효성분으로 함유하는 상처치료 조성물을 제공함으로써 아쿠아포린-3 단백질의 발현을 증가시킴으로써 상처치료 효능을 갖는 피부 외용제를 제공하여 부작용에 대한 우려 없이 안전하고 효과적으로 바를 수 있는 기능성 화장품 또는 의약품을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명 금은화 추출물을 HaCaT 각질화형성세포에 처리한 다음 세포독성을 측정한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명 인동 추출물을 HaCaT 각질화형성세포에 처리한 다음 세포독성을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명 금은화 추출물을 HaCaT 각질화형성세포에 처리한 다음 아쿠아포린-3 단백질 발현량을 측정한 웨스턴블럿팅결과 사진도이다.
도 4는 본 발명 인동 추출물을 HaCaT 각질화형성세포에 처리한 다음 아쿠아포린-3 단백질 발현량을 측정한 웨스턴블럿팅결과 사진도이다.
도 5는 본 발명 금은화 또는 인동 추출물의 피부 재생 효과를 비교 실험한 결과 사진도이다.

이에, 본 발명자들은 세포 배양 상태에서의 상처치유 측정법(in vitro wound healing assay)을 수행하여 금은화 추출물 및 인동 추출물이 세포이동과 분열에 관련된 아쿠아포린-3 단백질의 발현을 증가시키고, 피부각질형성세포의 이동을 촉진시킴으로써 증식기로의 진행을 빠르게 도와주어 상처치료 효능 가짐을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따르면 상기 금은화 또는 인동 추출물은 물, 에탄올, 메탄올과 같은 친수성 유기용매 또는 이들의 혼합 용매에 의해 추출된 것일 수 있으며, 바람직하게는 80% 에탄올로 추출한 것이다. 또, 상기 추출물은 추출에 의해 수득되는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 수득되는 건조물 또는 추출액의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

본 발명 상처치료용 피부 외용제 조성물은 금은화 또는 인동 추출물 중에서 선택된 하나의 추출물을 그 유효량으로 포함하는 약제학적 조성물 형태로 제조할 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 무독성, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 희석액 또는 다른 활성성분을 포함할 수 있다.

또 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 부형제를 이용하여 공지의 방법으로 피부 외용제의 형태로 제제화될 수 있다

본 발명에 의한 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나 사용하기 전에 무균, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태가 되어 피부 외용제의 제형으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유화액의 형태로 되어 화장액, 크림 등으로 제형화될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다.

<실시예 1> 추출물의 제조

제조예 1: 금은화 추출물

자연건조한 금은화 꽃 100 g을 10배(W/V)의 80% 에탄올에 침지하고 하루동안 냉침 추출하여 그 추출액을 여과를 통하여 회수하고 추출액을 감압 농축하여 추출물을 제조하였다. 상기 추출물을 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 100 mg/mL로 용해시켜 본 발명의 상처치유 효과를 확인하기 위한 시료로 사용하였다.

제조예 2: 인동 추출물

자연건조한 인동의 잎과 줄기 100g을 10배(W/V)의 80% 에탄올에 침지하고 하루동안 냉침 추출하여 그 추출액을 여과를 통하여 회수하고 추출액을 감압 농축하여 추출물을 제조하였다. 상기 추출물을 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 100 mg/mL로 용해시켜 본 발명의 상처치유 효과를 확인하기 위한 시료로 사용하였다.

<실시예 2> 본 발명 금은화 또는 인동 추출물의 상처치료 효과검정

실험예 1: 세포독성 검정

세포독성 테스트는 Moseman의 방법(Moseman T. 1983. J Immuno Methods., (1983) 65, 55) 및 Skaper 등의 방법(Skaper SD, et al., Cell Culture, (1990) 2, 17-33)을 이용한 MTT (3-4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 측정법을 이용하여 수행하였다. 인간의 각질형성 세포 HaCaT는 10% (V/V) FBS, 페니실린 100 U/mL 및 스트렙토마이신 100 μg/mL의 항생제를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 실험실에서 37℃, 5% CO₂ 공급조건을 갖춘 동물세포 배양기에서 배양하였다. 상기 제조예 1 및 2를 통하여 수득한 금은화 또는 인동 추출물을 DMSO에 용해시켜 최종농도가 0, 1, 20, 50, 100 μg/mL로 각각 배양액에 첨가하고, 상기 배양액에서 세포를 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양이 끝난다음 MTT 용액(5 mg/mL)을 처리하여 4시간 더 배양 시킨 다음, 생성된 청색 결정인 포르마잔을 DMSO에 용해시킨 후 그것을 ELISA 판독기를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 발명 금은화 또는 인동의 세포에 대한 독성은 각각의 대조구의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타냈다.

HaCaT 각질화형성세포에서 금은화 및 인동 추출물의 세포독성을 조사하기 위하여 0,최종농도가 0, 1, 20, 50, 100 μg/mL 농도의 금은화 및 인동 추출물을 각각 처리하였을 때, 대조구인 DMSO만을 처리한 것과 비교하여 세포증식의 변화 정도를 계산하여 세포독성을 조사하였다.

실험결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 상기 제조예 1에 따라 제조한 금은화 추출물의 HaCaT 각질화형성세포에 대한 세포독성은 50 μg/mL에서도 세포 생존율이 77% 이상인 것으로 측정되었다.

도 2는 본 발명의 제조예 2에 따른 인동 추출물의 HaCaT 각질화형성세포에 대한 세포독성 효과를 보여준다. 고농도인 100 μg/mL에서도 세포 생존율이 95% 이상인 것으로 측정되어 상기 인동 추출물은 세포 독성이 없는 것으로 확인하였다.

실험예 2: 아쿠아포린-3 단배질발현 증가효과 검정

본 발명 금은화 또는 인동 추출물이 세포 이동에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3 단백질 발현을 증가시키는 효과를 알아보고자 다음과 같이 세포에 본 발명 금은화 또는 인동 추출물을 처리한 후 웨스턴 블럿팅을 통해 확인하였다.

인간의 각질화형성세포 HaCaT를 접종하여 24시간 후, 제조예 1의 금은화 추출물 50 μg/mL, 인동 추출물 100 μg/mL, 그리고 50 ng/mL의 EGF (epidermal growth factor)를 각각 첨가하여 DMEM 배지, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 24시간 배양 후 세포를 회수한 후 파쇄하여 단백질만을 추출하여 -40℃에 보관하였다. 추출된 단백질은 BCA assay를 통해 단백질을 정량하였다. 각각의 시료의 단백질량 30 μg로 희석한 후 12% SDS-겔에서 전기영동한 후 PVDF membrane으로 옮겼다. 1차 항체(rabbit anti-aquaporins-3 antibody)와 반응시킨 후 남은 항체를 세척하여 제거하고 2차 항체(rabbit HRP-coupled anti-IgG antibody)와 반응시켰다. 남은 항체를 제거한 후 항체와 반응하여 발색 반응을 일으키는 시약(peroxidase substrate and chromogen solution)을 첨가하였다. 발색된 밴드는 이미지 분석(BioRad, Universal Hood Ⅱ, USA )을 통해 측정하였다.

실험결과 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명 금은화 또는 인동 추출물을 HaCaT 각질화형성세포에 처리하였을 때 세포이동에 중요한 역할을 하는 아쿠아포린-3 발현이 대조군에 비해 증가하는 것을 확인할 수 있다.

실험예 3: 본 발명 금은화 또는 인동 추출물의 육안적 형태 분석을 통한 상처치료 효과 검정

세포배양용기 웰 당 2.5 × 10⁵ 농도로 준비된 HaCaT 세포를 분주한 다음 24시간 배양하여 세포 단일층을 형성시킨 후 배양배지를 제거한 다음 p1000 피펫 팁으로 "긁힘-손상"을 유도하였다. "긁힘-손상"이 유도된 상기 세포에 본 발명 금은화 또는 인동 추출물을 포함한 배양 배지를 세포에 첨가한 다음 24, 48시간 동안 배양했다.

본 발명에서는 시험관 내 상처치유 측정법(in vitro wound healing assay)을 이용하여 "긁힘-손상" 세포층에 금은화 50 μg/mL, 인동 추출물을 100 μg/mL 농도로 24시간, 48시간 각각 처리한 후 긁힘 상처가 회복되는 정도를 확인하였다. 대조군은 생약 한약재 추출물을 녹인 DMSO를 동일 함량 처리하였다.

실험결과, 도 5에 나타내 바와 같이, 대조군의 경우에는 시간의 경과에 따른 긁힌 면적이 거의 감소되지 않았으나, 본 발명 금은화 또는 인동 추출물을 처리한 세포의 "긁힘-손상"은 24시간, 48시간 후 회복되어 긁힌 면적이 감소되었음을 확인할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 상처치료 효능을 갖는 금은화 또는 인동 추출물을 제공하는 효과가 있고, 상기 금은화 또는 인동 추출물 중에서 선택된 하나의 추출물을 유효성분으로 함유하는 상처치료 조성물을 제공함으로써 아쿠아포린-3 단백질의 발현을 증가시킴으로써 상처치료 효능을 갖는 피부 외용제를 제공하여 부작용에 대한 우려 없이 안전하고 효과적으로 바를 수 있는 기능성 화장품 또는 의약품을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 화장품소재산업 또는 생물의약산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims (2)

1. 삭제
2. 자연건조된 인동식물(Lonicera japonica Thunb.)의 잎과 줄기를 10배(w/v)의 80% 에탄올에 1일간 냉침 추출 후 여과 회수하고 감압농축하여 수득한 인동추출물을 DMSO에 용해한 용액 50 ~ 100㎍/mL를 유효성분으로 함유하는 아쿠아포린-3 단백질의 발현을 증가시키는 기전을 갖는 것이 특징인 무독성 상처치료용 외용제 조성물.
   

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