CN102584985A - 从鸡蛋清中提取卵传铁蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从鸡蛋清中提取卵传铁蛋白的方法。其特点是：确定使用截留分子量为70kDa的超滤膜从卵传铁蛋白粗酶液中直接提取卵传铁蛋白；所述卵传铁蛋白粗酶液是将鸡蛋清稀释，调pH值，搅拌，离心，保留上清液并进一步稀释获得。本发明具有工艺简单，提取周期短，易于过程放大等特点，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从鸡蛋清中提取纯化卵传铁蛋白的方法。
背景技术
卵传铁蛋白是一种酸性糖蛋白，约占鸡蛋清总蛋白含量的12-13％，同时又是铁结合性蛋白，在增强机体免疫能力(Biochemical Cell Biology 2007，85：150-155)，抗菌抗病毒，抗氧化等方面发挥着重要作用(Biochimica et Biophysica Acta-General subjects 2006，1760：347-355；International Journal ofBiological Macromolecules 2007，41：631-640)。基于它的多种功能，人们不断探索各种提取方法。自1950年Fraenkel-Conrat和Feeney采用硫酸铵沉淀法从鸡蛋清中首次分离出卵传铁蛋白以来(Archives ofBiochemistry 1950，29：101-113)，人们相继开发出多种提取卵传铁蛋白的方法。
目前，从鸡蛋清中提取卵传铁蛋白的主要方法有：硫酸铵沉淀法、乙醇沉淀法(PoultryScience 2008，87：1441-1450)、离子交换层析法和亲和层析法(The International Journal ofBiochemistry 1991，23：609-616；Journal ofChromatography.B 1995，664：201-210)等。然而这些技术均存在一定的局限性，其中，硫酸铵沉淀法和乙醇沉淀法获得的卵传铁蛋白纯度较低，而离子交换层析法和亲和层析法虽然能够获得较高纯度的卵传铁蛋白，但提取过程耗时较长，成本昂贵，且难于工业放大。
膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续操作、易于放大、无污染等优点。
超滤膜是指膜孔径在1-100nm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化(Food Chemistry2010，122：747-752)。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模(Journal of Membrane Science2010，352：231-238)。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单，易于放大的卵传铁蛋白超滤提取方法。
本发明采取的技术路线是：
(1)以鸡蛋清作为原料，加入等体积的0～0.5M的Tris-HCl缓冲溶液，调pH值4.0～7.0，0～10℃搅拌，离心取上清液，利用相同浓度的Tris-HCl缓冲溶液将上清液稀释10～40倍，得到卵传铁蛋白的粗酶液；
(2)利用截留分子量为70kDa的超滤膜超滤处理由步骤(1)获得的卵传铁蛋白的粗酶液，得到浓缩液，浓缩液脱水得到卵传铁蛋白。
本发明提取方法中，步骤(1)中的搅拌时间为30分钟以上；步骤(1)中的离心条件为：4℃，离心力大于1000g，离心时间大于10分钟；步骤(2)中的浓缩液脱水方式为冷冻干燥。
本发明具有操作简单，分离浓缩同步进行，且产品回收率高，利于工业放大等特点，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明。
实施例1，从鸡蛋清中提取卵传铁蛋白的方法，步骤：
(1)取鲜鸡蛋清200mL，加入等体积的100mM的Tris-HCl缓冲溶液，利用1M的盐酸调整溶液pH值为4.0，在4℃下搅拌1小时，2000g离心后取上清液约368mL；
(2)利用100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH4.0)，将步骤(1)获得的上清液(368mL)稀释至6.0L，用作卵传铁蛋白的粗酶液；
(3)利用截留分子量为70kDa的聚醚砜超滤膜包(0.09m2)，将步骤(2)获得的6.0L卵传铁蛋白粗酶液进行浓缩分离至截留液体积为200mL。超滤膜进料口和出料口的操作压力分别为：0.03MPa和0.07MPa，流速为：3.8L/h；
(4)将步骤(3)获得的200mL截留液冻干后，得到卵传铁蛋白约0.76g，产品经SDS-PAGE电泳分析后，分子量为78kDa，纯度高于89％。
实施例2，从鸡蛋清中提取卵传铁蛋白的方法，步骤：
(1)取鲜鸡蛋清300mL，加入等体积的10mM的Tris-HCl缓冲溶液，利用1M的盐酸调整溶液pH值为4.8，在4℃下搅拌5小时，3000g离心后取上清液约526mL；
(2)利用100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH4.8)，将步骤(1)获得的上清液(526mL)稀释至10.5L，用作卵传铁蛋白的粗酶液；
(3)利用截留分子量为70kDa的聚醚砜超滤膜包(0.09m2×2)，将步骤(2)获得的10.5L卵传铁蛋白粗酶液进行浓缩分离至截留液体积为260mL。超滤膜进料口和出料口的操作压力分别为：0.03MPa和0.07MPa，流速为：5.6L/h；
(4)将步骤(3)获得的260mL截留液冻干后，得到卵传铁蛋白约1.21g，产品经SDS-PAGE电泳分析后，纯度约为91.4％。
Claims (3)
1.从鸡蛋清中提取卵传铁蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)以鸡蛋清作为原料，加入等体积的0～0.5M的Tris-HCl缓冲溶液，调pH值4.0～7.0，0～10℃搅拌，离心取上清液，利用相同浓度的Tris-HCl缓冲溶液将上清液稀释10～40倍，得到卵传铁蛋白的粗酶液；
(2)利用截留分子量为70kDa的超滤膜超滤处理由步骤(1)获得的卵传铁蛋白的粗酶液，得到浓缩液，浓缩液脱水得到卵传铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的卵传铁蛋白的提取方法，其特征在于步骤(2)分离杂蛋白所用的超滤技术。
3.根据权利要求1或2所述的卵传铁蛋白的提取方法，其特征在于：所述用截留分子量为70kDa的超滤膜的组件形式为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜。
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| CN2012100607320A CN102584985A (zh) | 2012-03-09 | 2012-03-09 | 从鸡蛋清中提取卵传铁蛋白的方法 |
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO2016032352A1 (en) | 2014-08-28 | 2016-03-03 | Romvac Company Sa | Manufacture and use of modern ovotransferrin (otf-m) |
| CN112401157A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-26 | 苏州大学 | 一种保鲜蛋清结晶粉、制备及保鲜贮藏方法 |
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2012
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120718 |