CN1704430A

CN1704430A - 胸腺五肽的制备方法

Info

Publication number: CN1704430A
Application number: CN 200410022741
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王超; 丁文锋; 林刚
Original assignee: YIQIAO (HUNAN) PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: YIQIAO (HUNAN) PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2004-06-01
Filing date: 2004-06-01
Publication date: 2005-12-07
Anticipated expiration: 2024-06-01
Also published as: CN1308343C

Abstract

本发明提供了一种采用最小保护策略合成胸腺五肽Arg－Lys－Asp－Val－Tyr－OH的方法，所述方法采用侧链官能团未保护的Arg和Tyr为原料合成所述胸腺五肽。本发明的方法简单、快捷、成本低、原料易得并可形成规模。

Description

胸腺五肽的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽的制备方法。更具体地讲，本发明涉及精-赖-天-缬-酪五肽(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)的制备方法。

背景技术

胸腺五肽是人工合成的五肽活性片段，其序列对应于胸腺生成素的32至36位氨基酸残基(Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)，具有重要的药效(Goldstein G，Audhya TK.Thymopoietin to thymopentin：experimental studies.Surv Immunol Res.1985；4 Suppl1∶1-10.)。临床用于治疗各种恶性肿瘤、乙型肝炎、感染、自身免疫性疾病、II型糖尿病、更年期综合症以及年老体衰、免疫功能下降等。在恶性肿瘤和乙型肝炎治疗中的应用前景最好(Gonser S，Weber E，Folkers G.Peptides and polypeptides as modulators ofthe immune response：thymopentin--an example with unknown mode of action.Pharm ActaHelv.1999 Jun；73(6)：265-73.)。据中国抗肿瘤药物市场研究报告，胸腺五肽目前的年销售额约为6亿美元。到2006年，胸腺五肽的年销售额预计可达17亿美元(固相合成胸腺五肽的研究进展，王玲，魏浩，化工进展，2003年第2期)。

目前，国内外有数十家制药厂采用固相合成方法生产胸腺五肽供临床应用。少数制药厂采用正交保护的策略，液相合成胸腺五肽(IT1245230，Procedure for thepreparation of thymopentin，GOFFREDO MAURIZIO；MONTI FRANCESCO；SANNICOLO′FRANCESCO)。这些方法成本高，投料比一般在3～5倍，造成很大浪费。固相合成法还需要多肽固相合成仪，成本较高。此外，采用侧链保护的氨基酸价格昂贵，如侧链保护的酪氨酸在合成的最后需要经过剧烈的HF脱保护反应。由于HF的剧毒性，反应的危险性较大，必须具备专门的HF脱保护装置。而且由于这类脱保护装置的反应容器体积有限，每一次脱保护所得产品数量有限，因此限制了在产业上的应用。

因此，需要一种简单、快捷、成本低、原料易得和可形成规模的合成胸腺五肽的方法。

发明概述

本发明提供了一种采用最小保护策略合成胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH的方法，所述方法采用侧链官能团未保护的Arg和Tyr为原料，进行如下步骤的反应：

(1)在碱性条件下，使Tyr-OR与B-Val-OH在缩合剂存在下反应，得到B-Val-Tyr-OR二肽；

(2)采用脱保护试剂将(1)中制得的二肽的氨端脱保护，得到Val-Tyr-OR二肽；

(3)在碱性条件下，使(2)中制得的产物与B-Asp(-OR)-OH在缩合剂存在下反应，得到B-Asp(-OR)-Val-Tyr-OR三肽；

(4)采用脱保护试剂将(3)中制得的三肽的氨端脱保护，得到Asp(-OR)-Val-Tyr-OR三肽；

(5)在碱性条件下，使(4)中制得的产物与B-Lys(-Z)-OH在缩合剂存在下反应，得到B-Lys(-Z)-Asp(-OR)-Val-Tyr-OR四肽：

(6)采用脱保护试剂将(5)中制得的四肽的氨端脱保护，得到Lys(-Z)-Asp(-OR)-Val-Tyr-OR四肽；

(7)在碱性条件下，使(6)中制得的产物与Z-Arg-OH在缩合剂存在下反应，得到保护的Z-Arg-Lys(-Z)-Asp(-OR)-Val-Tyr-OR五肽；

(8)将(7)中制得的五肽链上天冬氨酸和酪氨酸的羧基保护基经皂化脱保护，得到Z-Arg-Lys(-Z)-Asp-Val-Tyr-OH五肽；

(9)将(8)中制得的五肽链上精氨酸和赖氨酸的氨基保护基经氢解脱保护，得到Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH五肽。

根据本发明的一个实施方案，将(9)中制得的产物经C18反相柱纯化脱盐，得到纯化产物。

相对于现有技术方法，本发明采用的侧链未保护的精氨酸和酪氨酸为原料，由于侧链不保护氨基酸的价格较为便宜，因此采用本保护路线的合成成本也较小，而且不需要最大保护路线的昂贵的HF脱保护的装置。

本发明方法在制备过程中通过选择合适的反应条件，有效地防止副反应发生，接肽反应的收率高于95％，最终皂化及氢解脱保护基的收率不低于90％，制得的产物经薄层层析测定为单点，并可形成100g级规模。

发明详述

尽管不希望受任何理论的限制，但是认为本发明是以下面的发现为基础：Arg和Tyr的侧链官能团在不加保护的情况下也不会对接肽反应造成负面影响。因此采用最小保护的策略，以侧链未经保护的Arg和Tyr为原料，与α氨基保护的Val-OH、α氨基保护的Asp(-侧链羧基保护基)-OH、α氨基保护的Lys(-侧链氨基保护基)-OH一起，逐步接肽，合成最小保护的胸腺五肽中间体Z-Arg-Lys(-Z)-Asp(-OR)-Val-Tyr-OR，经皂化和氢解合成胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。

本发明的一个合成方案如下所示：

Z-Arg-Ly(Cbz)-Asp(Obzl)-Val-Tyr-OMe→Z-Arg-Ly(Cbz)-Asp(Obzl)-Val-Tyr-OH→ Arg-Ly-Asp-Val-Tyr-OH

1.氨基酸原料

用于合成本发明的胸腺五肽的氨基酸原料为：Z-Arg-OH和Tyr-OR、B-Val-OH、B-Asp(-OR)-OH、B-Lys(-Z)-OH。其中各保护基Z、B、R的含义如下所述，并且在各化合物中出现时具有独立的含义。

本发明选用侧链官能团未加保护的精氨酸(Arg)和酪氨酸(Tyr)，即是对于Arg：

侧链上的胍基不加保护，和对Tyr：

侧链上的酚羟基不加保护。

缬氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)的α氨基可以按照本领域熟知的方法，采用本领域熟知的保护基团进行保护，即各原料中α氨基的保护基B可各自独立选自叔丁氧羰基(Boc)，联苯异丙氧羰基(Bpoc)，苄氧羰基(Cbz)及取代的苄氧羰基或芴甲氧羰基(Fmoc)等其它的烷氧羰基。优选均采用Boc-基团进行保护。

赖氨酸(Lys)侧链上的氨基：

按照本领域熟知的方法，采用本领域熟知的保护基团进行保护，即Lys中侧链氨基的保护基Z可选自苄氧羰基(Cbz)及取代的苄氧羰基、叔丁氧羰基(Boc)、联苯异丙氧羰基(Bpoc)或芴甲氧羰基(Fmoc)等其它的烷氧羰基。

精氨酸(Arg)的α氨基可以按照本领域熟知的方法，采用本领域熟知的保护基团进行保护，即Arg中α氨基的保护基Z可各自独立选自叔丁氧羰基(Boc)，联苯异丙氧羰基(Bpoc)，苄氧羰基(Cbz)及取代的苄氧羰基或芴甲氧羰基(Fmoc)等其它的烷氧羰基。优选精氨酸的α氨基和赖氨酸的侧链氨基采用相同的保护基保护，优选均采用苄氧羰基(Cbz)进行保护。

酪氨酸的α羧基可以按照本领域熟知的方法，采用本领域熟知的保护基团进行保护，即酪氨酸的α羧基的保护基R可选自甲酯(OMe)、乙酯(OEt)、叔丁酯、苄酯(OBzl)及取代苄酯等其它酯的形式。优选为甲酯。

天冬氨酸的侧链羧基：

可以按照本领域熟知的方法，采用本领域熟知的保护基团进行保护，即天冬氨酸的侧链羧基的保护基R可选自苄酯(Obzl)，甲酯(OMe)，乙酯(OEt)等其它酯的形式。优选为苄酯。

如上所述，用于本发明的氨基酸原料可按照本领域熟知的方法，采用本领域熟知的保护基团对各氨基酸进行保护制得，或可通过商业渠道购得。

2.接肽反应

本发明采用液相法，对用作原料的各氨基酸进行逐步接肽，合成最终产物。

接肽反应通常在溶剂中进行，所用的溶剂可选自四氢呋喃、重蒸的DMF、NMP等，优选使用四氢呋喃。

反应过程中pH值的控制较为关键。当pH低于7时，反应产物的纯度将降低，而pH高于11，将使产率降低。因此优选将pH控制在7-11，更优选在8-9的范围内。可采用有机碱调节反应体系中的pH值。有机碱可选自N-甲基吗啉(NMM)、三乙胺和DIEA(二异丙基乙基胺)等，优选使用NMM。

在反应中选用的缩合剂为本领域技术人员所熟知，可用的缩合剂选自DCC/HOBt、DIC、HBTU、BOP等，优选采用DCC/HOBt作为缩合剂。

反应温度可为0℃至室温。当在室温下进行反应时，反应时间短，但经薄层层析检测为多点，产物纯度下降，产率下降。而先在0℃下反应一段时间，优选2小时后，再于室温下反应，则得到经薄层层析检测为纯的产物。

3.氨基保护基团的脱保护

氨基保护基团的脱保护为本领域所熟知。在本发明的一个优选实施方案中，缬氨酸(Val)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)的α氨基均采用Boc为保护基，其脱保护可采用HCl/乙酸乙酯或TFA/二氯甲烷等脱保护试剂来实施。

采用TFA/二氯甲烷作为脱保护试剂时，虽然其对反应原料的溶解性较好，但得到的产物为粘稠状物质，而且TFA需减压蒸馏才能除去，因此后处理较为困难。

而HCl/乙酸乙酯中由于HCl为挥发性酸，得到的产物容易结晶，通过过滤后处理即可，因此较优选使用HCl/乙酸乙酯作为氨基保护基团的脱保护试剂。

在本发明的一个优选实施方案中，精氨酸的α氨基和赖氨酸的侧链氨基均采用苄氧羰基(Cbz)进行保护，其脱保护可采用氢解法，通过在溶液中，在披钯碳存在下，与氢气在室温下反应进行。

4.羧基保护基的脱保护

天冬氨酸的侧链羧基及合成的五肽中间体的羧端采用形成酯形成进行保护。这种保护基可在一定温度下缓慢滴加入碱进行皂化反应脱去。

反应中使用的溶剂可选自甲醇、乙醇等常用反应溶剂。

反应可在0℃至室温下进行。在室温下进行可缩短反应时间(由0℃下的约5小时缩至2小时)，但发生严重的消旋化，产生较多的包括消旋物在内的副产物。而当在0℃下进行时则得到经薄层层析检测为纯的化合物。因此优选在0℃下实施皂化反应。

5.精制

采用C18反相柱对粗产物纯化脱盐。纯化后，经HPLC检测纯度。

本发明的优选实施方式

下面通过非限定性实施例对本发明作进一步说明。

在本文中，所用试剂的缩写为：

DCC：二环己基碳二亚胺

HOBt：1-羟基苯并三氮唑

NMM：N-甲基吗啉

THF：四氢呋喃

实施例

1.Boc-Val-Tyr-OMe的制备

3.52g(15.2mmol)HCl·Tyr-OMe用20ml无水四氢呋喃溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉调节pH至7～8，冷却至0℃备用。

3.29g(15.2mmol)Boc-L-Val-OH，2.15g(16.0mmol)HOBt用无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入3.29g(16.0mmol)DCC，0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉维持PH8～9，室温搅拌10小时，氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)显示原料点消失。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用石油醚反复研磨，得到的粘稠状物质用250ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO₃水溶液(30ml×5)，饱和NaCl水溶液(30ml×1)，5％KHSO₄水溶液(30ml×5)，饱和NaCl水溶液(30ml×3)洗涤，有机层无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到淡黄色固体粉末5.64g(产率99.0％)。在乙酸乙酯/石油醚(1/3)与氯仿/甲醇(50/1)两种展开系统中均为单点，R_f值分别为0.40和0.25，该产物可直接用于下一步反应。取少量粗品采用乙酸乙酯/石油醚进行重结晶，得到结晶性粉末用于测定熔点和比旋度，测得熔点：152.9～154.2℃，[α]_D ²⁰＝-17°(C＝2MeOH)。

2.HCl·Val-Tyr-OMe的制备

5.64g(15mmol)Boc-Val-Tyr-OMe与20ml 4N HCL/乙酸乙酯溶液混合之后在室温搅拌2.5小时，溶液黄色澄清，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。减压旋干溶剂至无HCl，最后用石油醚反复研磨，得到黄色固体粉末4.49g(产率90.7％)。在氯仿/甲醇/三乙胺(20/1/0.2)展开系统中为单点，R_f＝0.28，[α]_D ²⁰＝+53°(C＝2 MeOH)。熔点：95.1～97.5℃。

3.Boc-Asp(Bzl)-Val-Tyr-OMe的制备

4.49g(13.6mmol)HCl·Val-Tyr-OMe用15ml无水四氢呋喃溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉调pH至7～8，冷却至0℃备用。

14.3g(14.3mmol)Boc-Asp(Obzl)-OH，1.93g(14.3mmol)HOBt用30ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入2.94g(14.3mmol)DCC，0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉维持pH8～9，室温搅拌12小时，氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)显示原料点消失。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用石油醚反复研磨，得到的固体加300ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO₃水溶液(30ml×3)，饱和NaCl水溶液(30ml×1)，5％KHSO4水溶液(30ml×3)，饱和NaCl水溶液(30ml×3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到7.83g粗品(产率96.4％)。在乙酸乙酯/石油醚(1/3)与氯仿/甲醇(50/1)两种展开系统中均为单点，R_f值分别为0.4和0.12，可直接用于下一步反应。取少量粗品采用乙酸乙酯/石油醚进行重结晶，得到结晶性粉末用于测定熔点和比旋度，测得熔点：148.3～149.3℃，[α]_D ²⁰＝-30°(C＝2MeOH)。

4.HCl·Asp(Bzl)-Val-Tyr-OMe的制备

7.83g(13.1mmol)Boc-Asp(Obzl)-Val-Tyr-OMe与4N HCL/乙酸乙酯溶液混合之后在室温搅拌3小时，TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失。减压旋干溶剂至无HCl，最后用石油醚反复研磨，得到淡黄色固体粉末6.82g(产率97.8％)。在氯仿/甲醇/三乙胺(20/1/0.2)展开系统中为单点，R_f＝0.33，熔点：102.4～105.6℃，[α]_D ²⁰＝+35°(C＝2MeOH)。

5.Boc-Lys(Z)-Asp(Bzl)-Val-Tyr-OMe的制备

6.82g(12.8mmol)HCl·Asp(Obzl)-Val-Tyr-OMe用35ml无水四氢呋喃溶解，得到的溶液用N-甲基吗啉调pH至7～8，冷却至0℃备用。

5.11g(13.4mmol)Boc-Lys(Cbz)-OH，1.81g(13.4mmol)HOBt用ml无水四氢呋喃溶解，冷至0℃，缓慢加入2.76g(13.4mmol)DCC，0℃搅拌5分钟。然后与上面的溶液混合，0℃搅拌2小时，用N-甲基吗啉维持pH8～9，室温搅拌12小时，氯仿/甲醇/乙酸(20/1/0.4)显示原料点消失。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用石油醚反复研磨，得到的固体加500ml乙酸乙酯溶解，分别用饱和NaHCO₃水溶液(50ml×3)，饱和NaCl水溶液(50ml×1)，5％KHSO₄水溶液(50ml×3)，饱和NaCl水溶液(50ml×3)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压旋干得到10.55g粗品(产率96.0％)。在乙酸乙酯/石油醚(3/1)与氯仿/甲醇(30/1)两种展开系统中均为单点，R_f值分别为0.38和0.27，可直接用于下一步反应。取少量粗品采用乙酸乙酯/石油醚进行重结晶，得到结晶性粉末用于测定熔点和比旋度，测得熔点：121.8～122.9℃，[α]_D ²⁰＝-22°(C＝2MeOH)。

6.HCl·Lys(Cbz)-Asp(Obzl)-Val-Tyr-OMe的制备

10.55g(12.3mmol)Boc-Lys(Cbz)-Asp(Obzl)-Val-Tyr-OMe与50ml 4N HCL/乙酸乙酯溶液混合之后在室温搅拌3小时，TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失。减压旋干溶剂至无HCl，最后用无水乙醚反复研磨，得到淡黄色固体粉末9.55g(产率97.7％)。在氯仿/甲醇/三乙胺(5/1/0.2)展开系统中为单点，R_f＝0.29，熔点：144.8～150.1℃，[α]_D ²⁰＝-15°(C＝2 MeOH)。

7. Z-Arg-Lys(Z)-Asp(Bzl)-Val-Tyr-OMe的制备

9.55g(12.02mmol)HCl·Lys(Cbz)-Asp(Obzl)-Val-Tyr-Ome用200ml无水THF溶解。0℃下滴入1.54ml NMM，调节pH值8～9。4.45g(14.42mmol)Z-Arg-OH及6.84g(18.03mmol)HBTU加入反应瓶，NMM调节PH至8～9，反应监控pH值的变化以维持PH8～9，每隔6小时TLC(氯仿/甲醇10∶1)监控

HCl·Lys(Cbz)-Asp(Obzl)-Val-Tyr-OMe的消失情况。大约48小时

HCl·Lys(Cbz)-Asp(Obzl)-Val-Tyr-OMe基本反应完全。反应液减压旋干，依次用石油醚(20ml×3)，无水乙醚(20ml×3)，乙酸乙酯(20ml×5)，饱和碳酸氢纳水溶液(50ml×5)，纯水(50ml×3)研磨泡洗。样品干燥后得淡黄色固体粉末11.08g(产率87.9％)。在氯仿/甲醇(9/1)展开系统中为单点，R_f＝0.31，熔点：115.5～118.7℃，[α]_D ²⁰＝-11°(C＝0.75 MeOH)。

8. Z-Arg-Lys(Z)-Asp-Val-Tyr-OH的制备

11.08g(10.57mmol)Z-Arg-Lys(Cbz)-Asp(Obzl)-Val-Tyr-OMe，用100ml CH₃OH溶解，0℃下缓慢滴入20ml 2N NaOH/H₂O，0℃搅拌3～4小时，氯仿/甲醇(10/1)显示原料点消失。反应液用KHSO₄/H₂O继续酸化至pH值7左右，出现大量白色沉淀，过滤，滤液旋干甲醇，又出现大量沉淀，过滤，合并沉淀，纯水(20ml×3)洗涤，干燥得淡黄色固体粉末8.54g(产率85.2％)。在氯仿/甲醇/H₂O(1/1/0.1)展开系统中R_f＝0.5，。熔点：148.8～153.2℃。[α]_D ²⁰＝-10°(C＝2 MeOH)。

9. H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH的制备

8.54g(9.00mmol)Z-Arg-Lys(Cbz)-Asp-Val-Tyr-OH，乙醇/水(1∶1)200ml溶解，加入5％Pd/C 1g，搅拌，通入氢气，室温下反应约5小时，氯仿/甲醇/H₂O(1/1/0.1)显示原料点消失，过滤，滤液减压旋干乙醇，然后冷冻干燥去掉水，得粗品8.20g。

10. H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH的精制

采用C18反相柱纯化脱盐。

粗品预处理：8.20g H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH粗品，蒸馏水溶解，过滤。

填料：C18，柱长1米，内径0.1米，

洗脱条件：梯度洗脱，流速1ml/min，先用1％HOAC水溶液洗脱，1小时后换为5％乙腈1％HOAC水溶液，1小时后再转换为15％乙腈1％HOAC水溶液。

收集样品：采用TLC茚三酮显色方法检测样品的流出情况，并根据HPLC检测数据收集主成分，合并洗脱液，冷冻干燥24小时后，再次加入蒸馏水溶解续冻干36小时得4.63g白色冻干粉末(产率75.6％)终产品胸腺五肽(H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)。[α]_D ²⁰＝°(C＝1冰醋酸)，HPLC检测纯度大于99％。

已经通过非限定性实施例对本发明作出了举例说明。但本领域的技术人员会理解，在没有偏离本发明的宗旨和范围下，可以对本发明作出各种修改、替换和变更。例如，也可采取“2+3”片断缩和的方案合成了胸腺五肽。首先分别合成Z-Arg-Lys(Z)-OH(I)和H-Asp(OR)-Val-Tyr-OR(II)，然后以HBTU为缩和剂合成出

Z-Arg-Lys(Z)-Asp(OR)-Val-Tyr-OR，再经皂化、氢解得到胸腺五肽。简明路线如方案2所示。

Claims

1.一种合成胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH的方法，所述方法采用侧链官能团未保护的Arg和Tyr为原料，进行如下步骤的反应：

(5)在碱性条件下，使(4)中制得的产物与B-Lys(-Z)-OH在缩合剂存在下反应，得到B-Lys(-Z)-Asp(-OR)-Val-Tyr-OR四肽；

2.权利要求1的方法，所述方法还包括将(9)中制得的产物经C18反相柱纯化脱盐，得到纯化产物。

3.权利要求1的方法，其中缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸的α氨基的保护基B为叔丁氧羰基，联苯异丙氧羰基，苄氧羰基及取代的苄氧羰基或芴甲氧羰基，精氨酸的α氨基和赖氨酸的侧链氨基的保护基Z为苄氧羰基及取代的苄氧羰基、叔丁氧羰基、联苯异丙氧羰基或芴甲氧羰基，酪氨酸的α羧基的保护基R为甲酯、乙酯、叔丁酯、苄酯及取代苄酯，天冬氨酸的侧链羧基的保护基R为苄酯，甲酯，乙酯。

4.权利要求3的方法，其中缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸的α氨基的保护基B为Boc-基团，精氨酸的α氨基和赖氨酸的侧链氨基的保护基Z为苄氧羰基，而酪氨酸的α羧基的保护基R为甲酯，天冬氨酸的侧链羧基的保护基R为苄酯。

5.权利要求1的方法，其中步骤(1)、(3)、(5)和(7)中的缩合步骤采用DCC/HOBt、HBTU、DIC、BOP为缩合剂。

6.权利要求5的方法，其中步骤(7)中的缩合步骤采用HBTU为缩合剂。

7.权利要求1的方法，其中在步骤(1)、(3)、(5)和(7)中将pH值至8-9。

8.权利要求1的方法，其中步骤(1)、(3)和(5)的反应先在0℃下进行，再于室温下进行。

9.权利要求1的方法，其中步骤(7)的反应在0℃下进行。

10.权利要求1的方法，其中步骤(2)、(4)和(6)中采用HCl/乙酸乙酯作为脱保护试剂。

11.权利要求1的方法，其中步骤(8)中在0℃下，采用氢氧化钠水溶液进行皂化脱保护。

12.权利要求1的方法，其中步骤(9)在室温及在披钯碳存在下，与氢气反应完成。