CN116063558A - 猪塞尼卡病毒合成肽疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗及其制备方法与应用；所述合成肽疫苗包括相串联的脂化T细胞辅助表位多肽和塞尼卡病毒主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽。本发明的优势包括：合成肽疫苗缺乏传染性病原体，保证绝对安全又可轻易从接种疫苗的动物中区分感染动物，在制备过程中没有释放的风险；合成肽疫苗含有准确的分子划分的免疫原，可以排除有害的序列抗原或其他病原体相关的分子，没有导致毒力的逆转，也没有遗传整合或重组的风险；抗原容易制备，易于合成和放大，对设备及制备环境要求低，疫苗成本相对较低；疫苗的免疫原性通过设计时的结构精细调节得到优化；合成肽疫苗抗原相对稳定，容易实现在简单条件下的运输和储存。

Description

猪塞尼卡病毒合成肽疫苗及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及合成肽疫苗技术领域，具体涉及一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及一种针对流行的猪塞尼卡病毒病的合成肽疫苗及其制备方法和与应用。
背景技术
塞尼卡病毒(Seneca valley virus,SVV)属于小RNA病毒科塞尼卡病毒属，也是该属的唯一成员。SVV首先在美国于2002年在细胞培养基污染物分离，最初被定义为溶瘤病毒，但后期证实其能够感染猪，引发猪的原发性水泡病。SVV感染引起猪的鼻吻、蹄部冠状带的水泡病变，同时伴有跛行、厌食和嗜睡等临床表现。与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等引起的临床症状无法区分。其传播特性与口蹄疫病毒类似，且与口蹄疫病毒存在混合感染，严重干扰了口蹄疫的防控。
SVV-001具有微小RNA病毒基因组的典型特征，具有标准的L-4-3-4布局，即先导蛋白(L)、P1(裂解VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白)、P2(裂解成2A、2B 和2C三种非结构蛋白)、P3(裂解成3A、3B、3C和3D四种非结构蛋白)。
目前在研的SVV疫苗多是传统的灭活疫苗或者是由原核表达的重组蛋白形成疫苗。但是灭活疫苗生产工艺中需要培养病毒，因此对安全等级要求高，生产成本也高；重组蛋白疫苗的抗原常以包涵体形式表达，导致后续产物纯化困难，表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性一般较低。因此猪塞尼卡病毒合成肽疫苗的研究开发显得尤为重要。
发明内容
为解决现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种针对猪塞尼卡病毒具有免疫保护效力的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗及其制备方法和与应用。
多肽疫苗是一种依靠短肽片段来设计高靶向诱导免疫反应，从而避免过敏或反应性序列。我们根据结构生物学分析认为位于SVV VP1蛋白G-H环(约183-213残基)中的B 细胞结合位点为一个主要表位，可在自然宿主和动物模型中诱导对该病毒的中和抗体。在感染过程中，T细胞的募集可导致病原体本身或受感染宿主细胞的迅速破坏和清除，从而阻止感染的传播。本发明中设计了一种脂化的T细胞辅助多肽连接B细胞抗原表位的抗原多肽序列，其电荷平衡几乎均匀，该脂肽包含三条连接到肽N端半胱氨酸的棕榈酸酰基链，是一类能够形成肽功能化超分子纳米结构的自组装分子。并且在不同的遗传背景下显示出良好的免疫原性。所以通过脂化的T细胞表位来提供T细胞和B淋巴细胞之间的充分合作，刺激动物体内抗体反应形成的合成肽是一种有吸引力的SVV候选疫苗，它们是高度纯净，结构明确，稳定和使用安全，并且由于它们可以模块化方法制备，并且可以合并融合不同的T细胞辅助多肽。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，包括脂化T细胞辅助表位多肽、塞尼卡毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽；所述脂化T细胞辅助表位多肽与 B细胞抗原表位多肽相串联。
所述脂化T细胞辅助表位多肽、塞尼卡毒株主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽是通过化学合成方法得到。所述脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽通过化学合成方法相串联。
作为本发明的一个实施方案，所述串联的方法具体包括将脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽通过至少两个赖氨酸相连接。优选的，赖氨酸含有两个氨基(ɑ- 氨基和ε-氨基)，所述串联的方法具体为将脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽通过ε-N-赖氨酸-赖氨酸相连接，ε-N-赖氨酸-赖氨酸代表N-末端的赖氨酸再连接其它分子时是连接在ε-氨基上。
作为本发明的一个实施方案，所述T细胞辅助表位多肽的T细胞辅助表位来源于破伤风梭菌表面抗原(1084-1099多肽序列)、恶性疟原虫的环孢孢子体外壳蛋白表面抗原(16-35多肽序列)或免疫球蛋白重链表面抗原(3-17多肽序列)。对T细胞辅助表位多肽人工组合突变优化及三棕榈酸酰基半胱氨酸脂化改造，引入了“Pam3C”，形成脂化T细胞辅助表位多肽。
所述脂化T细胞辅助表位多肽是棕榈酸脂化改造优化得到，其具体方法为：在人工组合突变优化的T细胞辅助表位多肽的N端连接三棕榈酸酰化半胱氨酸(Pam3Cys)对多肽脂化从而使抗原多肽形成水溶性两亲性化合物(如图1)，具有了两性离子特性，在较高浓度下诱发非特异性效应，使T辅助表位多肽产生更强的T细胞介导的免疫，特别是增强CD4+和CD8+的T细胞保护性抗体反应，并且防止疫苗肽立即降解，增强在动物体内的免疫应答时效。
作为本发明的一个实施方案，如下表1所示，经人工组合突变优化的T细胞辅助表位多肽包括Th1′、Th2′、Th3′中的一种；
表1.T细胞表位肽序列
T细胞表位代码 T细胞表位序列
Th1′(SEQ ID NO.1) VSIDKFRIFSKALNPK
Th2′(SEQ ID NO.2) EYLNKIQNSLSTEWSPASVT
Th3′(SEQ ID NO.3) LSEIKGVIVHRLEGV 
如下表2所示，脂化T细胞辅助表位多肽包括Th1、Th2、Th3中的一种；
表2.脂化T细胞表位肽序列
T细胞表位代码 T细胞表位序列
Th1 <![CDATA[Pam<sub>3</sub>CVSIDKFRIFSKALNPK]]>
Th2 <![CDATA[Pam<sub>3</sub>CEYLNKIQNSLSTEWSPASVT]]>
Th3 <![CDATA[Pam<sub>3</sub>CLSEIKGVIVHRLEGV   ]]>
所述塞尼卡毒株包括A型塞尼卡病毒；通过对塞尼卡病毒VP1蛋白的三维结构及高变异区的氨基酸序列比较得知，若想设计合成出能广泛覆盖VP1抗原位点的合成肽，必须包含该环状构造上更多的片段、考虑关键位点氨基酸的变异。本发明在前期豚鼠免疫实验发现，长的VP1多肽抗原免疫性能较强，VP1氨基酸序列中包含包含1个BC环、 1个CD环和1个GH环；而位于GH环(183～213位)的多肽序列免疫效力最强、并且相对保守，可刺激动物机体产生特异性免疫反应。根据NCBI中名称为SVA001的塞尼卡病毒基因序列分析，最终得到相应的包含G-H环序列为VP1中的174～218位氨基酸作为B细胞表位多肽。
SVA001 sequence:(SEQ ID NO.4)
STDNAETGVI EAGNTDTDFS GELAAPGSNH TNVKFLFDRS RLLNVIKVLE KDAVFPRPFPTQEGAQQDDG YFCLLTPRPT VASRPATRFG LYANPSGSGV LANTSLDFNF YSLACFTYFR SDLEVTVVSLEPDLEFAVGW FPSGSEYQAS SFVYDQLHVP FHFTGRTPRA FASKGGKVSF VLPWNSVSSV LPVRWGGASKLSSATRGLPA HADWGTIYAF VPRPNEKKST AVKHVAVYIR YKNARAWCPS MLPFRSYKQK MLM。
抗原-抗体复合物中多肽表位的精确构象对抗体的活性很重要。所以本发明采用了二硫键的共价侧链交联方法来限制肽表位，以构象相关的方式呈现肽疫苗。为此本发明将SVA001 VP1序列的183位P、212位A均由C取代形成二硫键从而提高了VP1的环状构造的稳定性，并且在肽链N-末端加入外源的T辅助表位，增强T细胞免疫。这种采用T细胞表位多肽与B细胞表位VP1主要抗原位点多肽的结合方式，使其作用范围扩大，对不同 MHC遗传背景的动物都能产生免疫刺激作用。同时在抗原多肽N末端引入三棕榈酸酰基半胱氨酸(Pam3Cys)形成脂化抗原增强序列的疏水性，从而减缓了抗原序列在动物体内酶作用下的降解速率，有效延长了免疫持续期。最终得到的脂化T+B细胞表位肽序列如下表3所示。
表3.脂化T+B细胞表位肽序列
Figure BDA0003834650210000041
作为本发明的一个实施方案，所述B细胞抗原表位序列为：
KGGKVSFVLCWNSVSSVLPVRWGGASKLSSATRGLPAHCDWGTIY(SEQ ID NO.5)。所述B细胞抗原表位序列的第10位C与第39位C形成二硫键，通过两个半胱氨酸形成环状结构。
作为本发明的一个实施方案，所述合成肽疫苗还包括免疫佐剂，脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位串联多肽与所述免疫佐剂混合形成油包水或水包油包水乳液疫苗。
作为一个实施方案，免疫油佐剂选择SEPPIC公司的ISA 50Vc形成油包水乳液疫苗；
作为一个实施方案，免疫油佐剂选择SEPPIC公司的ISA 206形成水包油包水乳液疫苗。
作为一个实施方案，所述串联多肽在疫苗中的剂量为10-50ug/ml。
本发明还涉及一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1、在固相载体上用化学合成的方法合成B细胞抗原表位多肽，然后继续连接至少两个赖氨酸，然后在多肽的最N端赖氨酸的ε-氨基上连接T细胞辅助表位多肽，再连接Fmoc-Pam2Cys–OH并脱除Fmoc后棕榈酰化N末端形成三链脂肽，最终得到连接在固相载体上的脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽；
S2、通过混合有机酸液将串联多肽从固相载体上切除下来，以醚类沉淀，洗涤得到脂化T细胞辅助表位混合多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽粗品；
S3、通过DMSO氧化脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽粗品上的氨基酸巯基环化形成分子内的二硫键(并以Ellman’s试剂检测巯基的残余量)；
S4、环化结束后，通过阳离子交换树脂去除溶液中的有机酸，收集流出液；
S5、使用色谱进行纯化；
S6、通过切向流膜包系统浓缩纯化溶液并以注射用水置换溶液去除有机溶剂，得到的水相浓缩液再过滤除菌；
S7、在剪切力作用下，将无菌液与油佐剂混合形成乳液，得到疫苗。
在一些实施例中，步骤S5中，使用氰基键合相通过反相高效液相色谱进行纯化，去除串联多肽中的小分子杂质，得到具有良好产率的纯目标产物有机溶液。
在一些实施例中，步骤S6中，通过0.22um的滤芯过滤除菌。
作为一个实施方案，步骤S1中，B细胞抗原表位多肽序列为： KGGKVSFVLCWNSVSSVLPVRWGGASKLSSATRGLPAHCDWGTIY。
作为一个实施方案，步骤S1中，T细胞辅助表位多肽包括Th1′、Th2′、Th3′中的一种；
Th1′的序列为：VSIDKFRIFSKALNPK；
Th2′的序列为：EYLNKIQNSLSTEWSPASVT；
Th3′的序列为：LSEIKGVIVHRLEGV。
本发明还涉及一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗的应用，用于制备预防和治疗猪塞尼卡病毒病的制剂或用于制备区分感染动物和被免疫动物的制剂的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
相较于在研的传统猪塞尼卡灭活疫苗或者是由原核表达的重组蛋白形成疫苗，本发明所述的合成肽疫苗具有以下优势(i)合成肽疫苗缺乏传染性病原体，这不仅保证绝对安全又可轻易从接种疫苗的动物中区分感染动物，在制备过程中没有释放的风险；(ii) 合成肽疫苗含有准确的分子划分的免疫原，可以排除有害的序列抗原或其他病原体相关的分子，没有导致毒力的逆转，也没有遗传整合或重组的风险；(iii)合成肽疫苗抗原容易制备，易于合成和放大，对设备及制备环境要求低，疫苗成本相对较低；(iv)合成肽疫苗的免疫原性可以通过设计时的结构精细调节得到优化；(v)合成肽疫苗抗原相对稳定，所以容易实现在简单条件下的运输和储存。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为三棕榈酸酰基半胱氨酸(Pam3C)脂化抗原多肽的合成示意图。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例1
一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗及其制备方法，包括如下步骤：
A、使用全自动合成肽合成仪，多肽抗原的合成是采用Merrifield固相合成法合成。采用25％哌啶对合成树脂进行去保护反应，运行全自动合成仪将Fmoc/tBu保护氨基酸和反应缩合剂加至反应器中进行耦合反应，当耦合反应完全后，用2.5％乙酰咪唑溶液执行乙酰化反应程序，终止错误序列的肽链生成。然后再次执行去保护反应去除肽树脂 N末端F-moc保护基，进入下一个反应循环。合成过程由合成序列C端至N端，以去保护反应、耦合反应、乙酰化反应为循环，依照设定的序列不断地重复进行；
步骤A的具体过程如下：
A1、制备B细胞抗原表位多肽：使用EST-150全自动合成肽合成仪，应用Merrifield固相合成法合成。起始采用Rink amide MBHA树脂作为合成用固相载体，以N-甲基2- 吡咯烷酮作为溶胀树脂溶剂及洗涤溶剂，采用25％哌啶对合成树脂进行去保护反应，运行全自动合成仪将Fmoc/tBu保护氨基酸和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷反应缩合剂和N,N-二异丙基乙胺碱性催化剂加至反应器中进行耦合反应，当每步耦合反应完全后，用2.5％乙酰咪唑溶液执行乙酰化反应程序，终止错误序列的肽链生成。然后再次执行25％哌啶去保护反应去除肽树脂N末端Fmoc保护基，进入下一个反应循环。合成过程由合成序列C端至N端，以去保护反应、耦合反应、乙酰化反应为循环，依照设定的序列不断地重复进行，由此得到B细胞抗原多肽SVA001 VP1(174～218) (Cys183-Cys212)。
A2、制备T细胞辅助表面多肽：
取出部分合成的B细胞抗原表位多肽树脂连接两个赖氨酸，具体是先连接一个Fmoc-Lys(Boc)-OH，脱除N端Fmoc后再连接一个Boc-Lys(Fmoc)-OH保护氨基酸，采用N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统进行耦合反应，以N-甲基2-吡咯烷酮洗涤后用2.5％乙酰咪唑溶液执行乙酰化反应程序，终止错误序列的肽链生成，再以 25％哌啶去除Boc-Lys(Fmoc)-OH的ε-氨基上的Fmoc从而暴露出ε-氨基，然后按照T 细胞辅助表位多肽的序列顺序继续合成，采用Fmoc/tBu保护氨基酸和N,N'-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑合成系统缩合。合成过程由T细胞辅助表位多肽序列C端至N 端，以去保护反应、耦合反应、乙酰化反应为循环。从而合成Th1′-ε-KK-(SVA001 VP1 (174～218))、Th2′-ε-KK-(SVA001 VP1(174～218))、Th3′-ε-KK-(SVA001 VP1 (174～218))。
A3、制备脂化的T细胞辅助表面多肽：
Pam3Cys脂化多肽制备方法为取出部分含Th1′-ε-KK-(SVA001 VP1(174～218))、Th2′-ε-KK-(SVA001 VP1(174～218))、Th3′-ε-KK-(SVA001 VP1(174～218))抗原表位多肽树脂与Fmoc-Pam2Cys–OH和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷反应缩合剂和N,N-二异丙基乙胺碱性催化剂进行耦合反应。耦合反应完全后，用2.5％乙酰咪唑溶液执行乙酰化反应程序，终止错误序列的肽链。然后再次执行25％哌啶去除半胱氨酸的N端Fmoc保护基并以棕榈酰氯(Pam-Cl)和吡啶催化形成棕榈酰化N末端形成三链脂肽，从而合成脂化的Th1-ε-KK-(SVA001 VP1(174～218))、脂化的Th2-ε-KK- (SVA001 VP1(174～218))、脂化的Th3-ε-KK-(SVA001 VP1(174～218))。
B、多肽与固相载体的分离：配制含90％三氟乙酸(TFA)、4％三异丙基硅烷、5％苯酚和1％注射用水的反应溶液，加入肽－树脂与其匀速搅拌反应4小时，然后用醚溶液沉淀获得肽树脂混合物，用砂芯漏斗分离多肽溶液与树脂颗粒；
C、环化反应：将多肽溶液以氨水溶液和醋酸溶液调整pH值至6.0～8.0，采用DMSO进行环化反应，使得SVA001 VP1(174～218)对应抗原多肽的(Cys183-Cys212)位点形成分子内二硫键，并以Ellman’s试剂检测巯基的残余量直至反应完成；
D、去盐纯化：环化的多肽溶液用强碱型阴离子交换树脂处理去除溶液中的盐及有机酸，收集流出液；
E、纯化：使用氰基键合相通过反相高效液相色谱进行纯化，采用Sepfocus 50DAC制备液相色谱系统，CN-HPLC 250mm×50mm,粒径10um，流速40ml/min，溶剂体系：溶液A:含1％TFA的水溶液，溶液B:含1％TFA的乙腈溶液，在3个柱体积内使B 的梯度25％-100％B，使目标抗原肽与杂质肽得到分离，通过分段收集去除抗原多肽中的杂质，得到具有良好产率的纯目标产物有机溶液。
F、浓缩：通过切向流膜包系统浓缩纯化液并以注射用水置换溶液去除有机溶剂，得到的抗原肽水溶液，并采用Lorry法测定抗原肽溶液浓度；
G、多肽的除菌：多肽经纯化浓缩处理后，在净化工作台内使用孔径为0.22μm的无菌过滤器对浓缩多肽进行过滤除菌，即可获得表4所示的无菌的抗原多肽1、2、3、4、 5、6、7。
表4.B细胞表位、T+B及脂化T+B细胞表位肽序列
Figure BDA0003834650210000081
实施例2
一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗及其制备方法，以Montanide ISA 50VC与实施例1中抗原多肽配制疫苗，具体包括如下步骤：
1、水相制备：使用灭菌处理过的注射用水分别将实施例1获得的融合抗原多肽1、2、3、4、5、6、7稀释至50μg/ml，并用孔径为0.22μm的滤器滤过。
2、油相制备：油相佐剂Montanide ISA 50VC在120℃下灭菌30分钟后放置至室温备用。
3、乳化：先将油相加入乳化罐内，然后以80～100r/min搅拌，同时缓慢加入水相，所加油相/水相的比例为1/1，加完后搅拌2分钟，再以8500r/min搅拌6分钟，使其乳化形成油包水乳剂，即得本发明的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，记为疫苗SVA001_A′V、 SVA001_B′V、SVA001_C′V、SVA001_AV、SVA001_BV、SVA001_CV、SVA001_VP1V。
实施例3
一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗及其制备方法，以Montanide ISA 206与实施例1中抗原多肽配制疫苗，具体包括如下步骤：
1、水相制备：使用灭菌处理过的注射用水分别将实施例1获得的融合抗原多肽1、2、3、4、5、6、7稀释至50μg/ml，并用孔径为0.22μm的滤器滤过。
2、油相制备：油相佐剂Montanide ISA 206在120℃下灭菌30分钟后放置至室温备用。
3、乳化：先将油相加入乳化罐内，然后以40～60r/min搅拌，同时缓慢加入水相，所加油相/水相的比例为1/1，加完后搅拌2分钟，再在31℃下以350r/min搅拌5分钟，使其乳化形成水包油包水乳剂，20℃恒温1hr，即得本发明的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，记为疫苗SVA001_A′V206、SVA001_B′V206、SVA001_C′V206、SVA001_AV206、 SVA001_BV206、SVA001_CV206、SVA001 VP1V206。
实施例4
一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗的应用，以实施例2中Montanide ISA 50Vc与抗原乳化疫苗免疫后在猪体内的抗体水平检测；
(1)筛选40只猪(体重40kg左右的健康架子猪，ELISA效价不高于1：8)，随机分为8组，其中1、2、3、4、5、6、7组为免疫组，每头猪分别免疫由25μg合成肽与佐剂乳化而成的疫苗即实施例2获得的疫苗SVA001_A′V、SVA001_B′V、 SVA001_C′V、SVA001_AV、SVA001_BV、SVA001_CV、SVA001_VP1V；第8组为对照组，每头猪免疫相同体积的PBS缓冲液。
(2)免疫操作过程如下表5所示。
表5：实施例4的免疫操作程序
Figure BDA0003834650210000091
(3)抗体水平检测。对采集的血清进行ELISA抗体检测。结果表明疫苗组免疫后抗体均有显著的提高，免疫原性良好，其中SVA001_AV组免疫原性最高、SVA001_VP1V 最低，而与SVA001_A′V组相比，SVA001_AV组具有更长的免疫持续期。具体如下表6、表7、表8、表9、表10、表11、表12和表13所示。
表6：SVA001_A′V抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000101
表7：SVA001_B′V抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000102
表8：SVA001_C′V抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000103
表9：SVA001_AV抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000104
表10：SVA001_BV抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000111
表11：SVA001_CV抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000112
表12：SVA001_VP1V抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000113
表13：PBS抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000114
实施例5
一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗的应用，以实施例3中Montanide ISA 206与抗原乳化疫苗免疫后在猪体内的抗体水平检测；
(1)筛选40只猪(体重40kg左右的健康架子猪，ELISA效价不高于1：8)，随机分为5组，其中1、2、3、4组为免疫组，每头猪分别免疫由25μg合成肽与佐剂乳化而成的疫苗即实施例3获得的疫苗SVA001_AV206、SVA001_BV206、SVA001_CV206、 SVA001_VP1V206；第5组为对照组，每头猪免疫相同体积的PBS缓冲液。
(2)免疫操作过程如下表14所示。
表14：实施例5的免疫操作程序
Figure BDA0003834650210000121
(3)抗体水平检测。对采集的血清进行ELISA抗体检测。结果表明疫苗组免疫后抗体均有显著的提高，免疫原性良好，其中SVA001_AV206组免疫原性最高、 SVA001_VP1V206最低，具体如下表15、表16、表17、表18和表19所示。
表15：SVA001_AV206抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000122
表16：SVA001_BV206抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000123
Figure BDA0003834650210000131
表17：SVA001_CV206抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000132
表18：SVA001_VP1V206抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000133
表19：PBS抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000134
实施例6
一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗的应用，不同抗原含量疫苗样品免疫后在猪体内的抗体水平检测。
(1)Montanide ISA 50Vc与实施例1中的SVA001_A抗原乳化配苗，根据抗原含量不同分为三组，如表20所示。
表20各组SVA001_A抗原含量表
Figure BDA0003834650210000141
(2)筛选32只猪(体重40kg左右的健康架子猪，ELISA效价不高于1：8)，随机分为5组，其中1、2、3组为免疫组，根据表16每头猪分别免疫1mL相应的疫苗；第4组为对照组，每头猪免疫相同体积的PBS缓冲液。
(3)免疫操作过程如下表21所示。
表21：实施例6的免疫操作程序
Figure BDA0003834650210000142
(4)抗体水平检测。对采集的血清进行ELISA抗体检测。结果表明疫苗组免疫后抗体均有显著的提高，免疫原性良好，其中SVA001_AV25组免疫原性显著高于 SVA001_AV10，但是与SVA001_AV50无显著差异，因此建议采用25ug SVA001_A抗原用于疫苗制备。具体如下表22、表23、表24和表25所示。
表22：SVA001_AV10抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000143
表23：SVA001_AV25抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000144
Figure BDA0003834650210000151
表24：SVA001_AV50抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000152
表25：PBS抗体效价检测结果
Figure BDA0003834650210000153
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，其特征在于，包括脂化T细胞辅助表位多肽、塞尼卡病毒主要结构蛋白VP1相关的B细胞抗原表位多肽，脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽相串联。
2.根据权利要求1所述的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，其特征在于，所述串联的方法具体包括将脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽通过至少两个赖氨酸相连接。
3.根据权利要求1所述的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，其特征在于，所述T细胞辅助表位多肽的T细胞辅助表位来源于破伤风梭菌表面抗原、恶性疟原虫的环孢孢子体外壳蛋白表面抗原或免疫球蛋白重链表面抗原；对T细胞辅助表位多肽人工组合突变优化及三棕榈酸酰基半胱氨酸脂化改造，引入了“Pam3C”，形成脂化T细胞辅助表位多肽。
4.根据权利要求3所述的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，其特征在于，脂化T细胞辅助表位多肽包括Th1、Th2、Th3中的一种；
Th1的序列为：Pam3CVSIDKFRIFSKALNPK；
Th2的序列为：Pam3CEYLNKIQNSLSTEWSPASVT；
Th3的序列为：Pam3CLSEIKGVIVHRLEGV。
5.根据权利要求1所述的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，其特征在于，所述B细胞抗原表位序列为：
KGGKVSFVLCWNSVSSVLPVRWGGASKLSSATRGLPAHCDWGTIY；
所述B细胞抗原表位序列的第10位C与第39位C形成二硫键，通过两个半胱氨酸形成环状结构。
6.根据权利要求1所述的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括免疫佐剂；脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位串联多肽与所述免疫佐剂混合形成油包水或水包油包水乳液疫苗。
7.根据权利要求6所述的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为ISA50V或ISA206；所述串联多肽在疫苗中的剂量为10-50ug/ml。
8.一种根据权利要求1-7中任一项所述的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、在固相载体上用化学合成的方法合成B细胞抗原表位多肽，然后继续连接至少两个赖氨酸，然后在多肽的最N端赖氨酸的ε-氨基上连接T细胞辅助表位多肽，再连接Fmoc-Pam2Cys–OH并脱除Fmoc后棕榈酰化N末端形成三棕榈酰化半胱氨酸脂肽，最终得到连接在固相载体上的脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽；
S2、通过混合有机酸液将串联多肽从固相载体上切除下来，以醚类沉淀，洗涤得到脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽粗品；
S3、通过DMSO氧化脂化T细胞辅助表位多肽与B细胞抗原表位多肽串联多肽粗品上的氨基酸巯基环化形成分子内的二硫键；
S4、环化结束后，通过阳离子交换树脂去除溶液中的有机酸，收集流出液；
S5、使用色谱进行纯化；
S6、通过切向流膜包系统浓缩纯化溶液并以注射用水置换溶液去除有机溶剂，得到的水相浓缩液再过滤除菌；
S7、在剪切力作用下，将无菌液与油佐剂混合形成乳液，得到疫苗。
9.根据权利要求8所述的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S1中，B细胞抗原表位多肽序列为：KGGKVSFVLCWNSVSSVLPVRWGGASKLSSATRGLPAHCDWGTIY；T细胞辅助表位多肽包括Th1′、Th2′、Th3′中的一种；
Th1′的序列为：VSIDKFRIFSKALNPK；
Th2′的序列为：EYLNKIQNSLSTEWSPASVT；
Th3′的序列为：LSEIKGVIVHRLEGV。
10.一种根据权利要求1-7中任一项所述的猪塞尼卡病毒合成肽疫苗的应用，其特征在于，用于制备预防和治疗猪塞尼卡病毒病的制剂或用于制备区分感染动物和被免疫动物的制剂。
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