CN110590941A

CN110590941A - 一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体及其制备方法

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Publication number: CN110590941A
Application number: CN201910953072.0A
Authority: CN
Inventors: 罗济冠; 常娓娓; 王学波; 刘宁; 郭春丽; 罗展; 李朝阳
Original assignee: Qingdao Sinder Pharmaceutical Co ltd; Shandong Sinder Technology Co ltd
Current assignee: Qingdao Sinder Pharmaceutical Co ltd; Shandong Sinder Technology Co ltd
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110590941B

Abstract

本发明公开了一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体及其制备方法，所述方法为：用预先制备新型番鸭腺病毒灭活疫苗免疫健康蛋鸡，当鸡蛋卵黄中抗体效价≥1:32时收集高免鸡蛋；从高免鸡蛋中分离卵黄，向卵黄中加入生理盐水加热灭活；将灭活卵黄液加入到pH值为4.0‑5.0的酸化生理盐水中静置3‑5h后离心分离；取上清液加入辛酸后静置4h，深滤后过滤液中加入甲醛并密封45‑75min；用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤，调节pH值为6.0‑7.0后再用0.22um微孔滤膜过滤，制得抗体。利用该方法制备的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体琼扩抗体效价均不低于1:32，1日龄雏番鸭接种抗体后，3批抗体接种组攻毒后，均能提供9/10以上的保护，利用本发明方法制备的抗体对新型番鸭腺病毒有很好的治疗效果。

Description

一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

禽腺病毒(avian adenovirus)是家禽常见的传染病病原之一。多数禽腺病毒可在健康禽体内存在并复制，不表现临床症状或者非常轻微的症状，但混合感染时腺病毒可成为条件性病原；有时禽腺病毒也可作为原发性病原，并可引起鸡、鸭、鹅等多种家禽或野禽的临床和病理症候群，包括心包积水、肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病等多种禽类的病症。

鸭(Anas platyrhynchos domestica)源腺病毒包括富AT腺病毒属的鸭源腺病毒A型(DAdV-A)和禽腺病毒属的鸭源腺病毒B型(DAdV-B)。DAdV-A即鸭腺病毒1型(Duckadenovirus type 1，DAdV-1)，又称为产蛋下降综合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)，主要引起蛋鸭产蛋量下降。DAdV-B又称为鸭腺病毒2型(DAdV-2)，该病毒1982年首次报道于法国，感染该病毒的番鸭(Cairna moschata)主要临床表现为消瘦、跛行，直到2014年才利用高通量测序技术获得全基因组序列，随后ICTV将其科学命名为DAdV-B。

近年来，广东、福建、安徽、浙江等番鸭饲养区流行一种以肝脏肿大、表面出血以及颜色变淡为特征的新发疫病，俗称番鸭“白肝病”。经病原的分离鉴定及病毒人工感染试验，初步表明该病病原为不同于DAdV-2的一种新型番鸭腺病毒，有专家将该病毒命名为鸭腺病毒3型(Duck adenovirus type 3，DAdV-3)，但该命名尚未被国际病毒分类委员会(ICTV)接受。通过对该新型番鸭腺病毒的流行病学调查，发现该病在我国几乎在所有番鸭养殖区域都有流行，给番鸭养殖业造成较大的经济损失。目前，国内外尚无有效预防和治疗该病的商品化抗体，研制安全有效的抗体迫在眉睫。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。

一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其中，按以下步骤进行：

用预先制备的新型番鸭腺病毒灭活疫苗免疫健康产蛋鸡，当所产鸡蛋卵黄中抗体效价≥1:32时收集高免鸡蛋；

从高免鸡蛋中分离卵黄，向卵黄中加入生理盐水搅拌均匀后通过加热灭活；

将灭活的卵黄液加入到pH值为4.0-5.0的酸化生理盐水中静置3-5h，之后离心分离；取上清液加入辛酸后静置4h，之后经深层过滤后向过滤液中加入甲醛溶液混匀，并密封45-75min；

先用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤，调节pH值为6.0-7.0后再用0.22um微孔滤膜过滤，制得新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体。

所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其中，所述新型番鸭腺病毒灭活疫苗采用番鸭新型腺病毒株作为灭活抗原制备得到，该病毒株于2019年7月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201952。

所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其中，健康产蛋鸡日龄100-150日龄，其中无禽白血病和禽流感感染，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其中，用预先制备的新型番鸭腺病毒灭活疫苗免疫健康产蛋鸡具体步骤如下：

基础免疫：每只鸡胸部肌肉注射疫苗0.5ml；

二次免疫：在基础免疫后14日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

三次免疫：在二次免疫后14日进行第3次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

维持免疫：当卵黄中新型番鸭腺病毒琼扩检测抗体效价1:64时，维持接种1次，每只鸡胸部肌肉注射疫苗1.0ml；

收蛋：三次强化免疫后10日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，新型番鸭腺病毒琼扩抗体效价≥1:32时，收集高免鸡蛋。

所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其中，高免鸡蛋分离卵黄前需要进行蛋壳消毒，具体步骤如下：将高免鸡蛋浸入42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15min，随后鸡蛋浸入95℃以上的水浴中消毒5秒钟，取出后晾干或吹干备用。

所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其中，从高免鸡蛋中分离卵黄，向卵黄中加入生理盐水搅拌均匀后通过加热灭活具体为：

手工或机械打蛋，充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；

将卵黄液加入巴氏灭菌罐中，加入生理盐水搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15min，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下。

所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其中，于酸化反应罐中加入相当于原卵黄体积4倍的生理盐水，用1mol/L HCL溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2-4℃，然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时，之后将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用。

所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其中，向上清液中加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温静置4h，之后采用K型多层板框实现深层过滤澄清，按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60min。

所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其中，用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤，加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8，再用0.22um微孔滤膜过滤，制得新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体。

一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体，其中，采用如上所述的方法制备而成。

有益效果

本发明提供一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体及其制备方法。本发明基于新型番鸭腺病毒疫苗实现新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备，利用该方法制备的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体琼扩抗体效价均不低于1:32，1日龄雏番鸭接种抗体后，3批抗体接种组攻毒后，均能提供9/10以上的保护，因此，利用本发明方法制备的抗体对新型番鸭腺病毒有很好的治疗效果。

附图说明

图1为本发明实施例5中免疫攻毒法效力检验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：新型番鸭腺病毒灭活疫苗的制备

1.1新型番鸭腺病毒GD MM株的分离与鉴定

1.1.1流行病学调查

自2014年以来，广东、福建、安徽等地区的雏番鸭出现了以肝脏肿大充血、表面有不同程度出血或坏死、质地变脆、肝脏颜色变浅黄化或变白等症状的传染性疾病。该病通常危害1月龄以下番鸭，发病率和死亡率呈现一定的日龄相关性。目前，几乎在所有番鸭养殖区域都有发现该病的流行。经临床调查和实验室检测，初步诊断为新型鸭腺病毒。2018年成功从广东茂名某番鸭场的20日龄发病番鸭群中分离出一株病毒。

1.1.2病毒分离：

选取发病症状典型的病死番鸭肝脏、脾脏、肾脏，胰腺等组织50-100g，用研钵研磨组织，按1∶5(w/v)比例加含双抗(含1000U青霉素/ml+1000ug链霉素/ml)的无菌PBS(0.1mol/L，pH值7.2)匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液经0.22um滤器过滤除菌，无菌检验合格后保存备用。将病毒过滤液接种12～13日龄番鸭胚，每胚0.2ml，36-37℃孵育，每日照胚2次，弃去24小时内死亡的番鸭胚，收获24-144小时死亡番鸭胚和144小时存活番鸭胚尿囊液，置2-8℃冷却12-24小时，收获番鸭胚尿囊液及绒毛尿囊膜。将分离得到的番鸭腺病毒经番鸭胚传3代，收获的病毒液置于-80℃冰箱保存。

1.1.3病毒的鉴定

血凝性鉴定：

分别无菌采集SPF鸡和鹅血液5ml，按照2015版《中国兽药典》方法分别制备成0.8％、1％和2％浓度的红细胞悬液，4℃保存备用。将收获的番鸭胚病毒液进行HA效价测定，检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。结果表明分离毒不能凝集SPF鸡、鸭、鹅红细胞，即使改变红细胞悬液的浓度，也不能使之凝集，红细胞对照成立。

理化特性检验：

病毒液分别经氯仿、乙醚、丙酮、盐酸(pH3)、氢氧化钠(pH10)、温度(60℃、1小时)处理后，接种LMH细胞，另设空白对照细胞，收毒后检测各组样品的病毒含量。结果：氯仿、丙酮、乙醚对分离毒GD MM的毒价影响较小、盐酸(pH3)和温度(60℃、1小时)不影响病毒效价，表明病毒没有脂质囊膜，对氯仿、丙酮、乙醚有较强抵抗力，且耐酸。而经氧化钠(pH10)处理后，接种LMH细胞，未产生细胞病变效应(CPE)，表明该病毒不耐碱。

PCR鉴定：

取分离株病毒培养液200ul，利用DNA提取试剂盒提取病毒DNA，根据NCBI上公布的鸭腺病毒Hexon基因序列设计PCR引物进行检测。

上游F：5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’

上游R：5’-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3’

PCR反应体系：总体积25ul

在0.5m1 PCR管中依次加入：10×Ex Taq Mix 12.5u1，上游引物(20pmol)1u1，下游引物(20pmol)1u1，DNA 2ul。

用灭菌去离子水8.5ul补足至总体积25u1，PCR反应在PTC-100基因扩增仪内进行。PCR反应参数：预变性条件为94℃，3分钟，变性条件为94℃，30秒，退火温度和时间为54℃，30秒，延伸温度为72℃延伸60秒，35个循环，最后72℃延伸10分钟。

对扩增的Hexon基因进行测序，经NCBI BLAST序列比对分析，分离毒株与GenBank数据库中公布的鸭腺病毒2型GR株(登录号：KJ469653.1)Hexon基因核苷酸同源性为76.6％。

1.1.3病毒致病性

对鸡的致病性：

将GD MM株病毒液通过静脉注射接种7日龄SPF鸡5只，1.0ml/只，观察14日，攻毒组和对照组SPF鸡均健活，无任何临床表现，攻毒后14日剖检，攻毒组和对照组均无明显临床症状。

对樱桃谷鸭的致病性：

将GD MM株病毒液经静脉注射接种2日龄雏鸭10只，1.0ml/只，攻毒后对照组鸭表现正常，攻毒组雏鸭出现精神萎靡，攻毒后7d死亡3只鸭子，剖检病死鸭肝脏肿大出血、肝脏颜色变浅，十二指肠出血，脾脏肿大出血，肾脏充血肿大，攻毒后14天对存活鸭子进行剖杀，肝脏出现肿大发黄，肾脏肿大充血的症状。

对雏番鸭的致病性：

将GD MM株以肌肉注射途径接种2日龄雏番鸭10只，1.0ml/只，雏番鸭在攻毒后24小时出现喜卧、缩脖、精神萎靡的临床症状，攻毒后36小时陆续出现鸭子死亡，直到攻毒后第5日攻毒组10日鸭子全部死亡，死亡率为100％，剖检病死亡雏番鸭，可见肝脏肿大表现为黄化的现象、质脆、出现不同程度的出血点或者出血斑，脾脏肿大、出血，胆囊肿大，胰腺出血，十二指肠出血，肾脏肿出血。

对35日龄番鸭的致病性：

将GD MM株以肌肉注射途径接种35日龄雏番鸭10只，2.0ml/只，番鸭在攻毒后24小时出现喜卧、精神萎靡的临床症状，攻毒后48小时陆续出现鸭子死亡，直到攻毒后第7天攻毒组10只鸭子死亡9只，死亡率为90％，剖检病死亡番鸭，可见肝脏肿大、出现不同程度的出血点或者出血斑，脾脏肿大、出血，胰腺出血，十二指肠出血，胆囊严重肿大，肾脏肿出血的临床症状与2日龄雏鸭攻毒症状一致。1日存活的番鸭进行剖杀，肝脏出现肿大出血，脾脏肿大出血，胆囊肿大，肾脏肿出血。

1.2番鸭新型腺病毒GD MM株毒种的制备

取番鸭新型腺病毒第3代胚毒尿囊液，经0.22μL滤器过滤后，按培养液3-5％的比例接种于长至单层弃掉原培养液的LMH细胞，37℃吸附1h后弃去病毒液，再加入无牛血清的DMEM/F12病毒维持液，37℃、5％CO₂条件下静置培养72-96h，收获病毒液。经LMH细胞传代繁毒F5-F9代，直至80％以上细胞出现病变，并且病变时间控制在72-96h内收获病毒液。测定该毒株5-9代的病毒含量，将同代次检验无菌的病毒液混合，定量分装，置于-80℃冰箱保存。将效价最高代次的毒用于疫苗的制备。由病毒含量测定结果规定疫苗用毒效价≥10^- ^6.5TCID₅₀/0.1ml。

1.3番鸭新型腺病毒GD MM株抗原的制备

LMH细胞培养：取长至致密单层的LMH细胞，倒掉原培养液，用无菌PBS洗涤细胞后，用0.25％胰酶进行消化，弃去胰酶液，加入适量含8％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基混匀细胞，细胞按1:4-1:5比例进行传代，37℃、5％CO₂条件下培养至细胞单层。

接毒：将上述长满单层的LMH细胞，弃掉原培养液，按终浓度1‰-1％的比例接种LMH细胞，置37℃5％CO₂条件下的培养箱继续培养72-96h。

收毒：接毒后，每日观察2次，记录细胞病变情况。当细胞病变达80％以上时收获病毒液，置-20℃保存。

1.4番鸭新型腺病毒GD MM株病毒液的灭活及半成品检验与疫苗的制备

1.4.1灭活：将GD MM株病毒液导入灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。4℃灭活36小时，如有剩余放2-8℃保存，不超过1个月。

1.4.2半成品检验

无菌检验，取灭活的病毒液，按2015年版《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

灭活检验，将灭活后的GD MM株病毒液作10倍稀释，接种已长满单层的LMH细胞(24孔细胞板)4孔，每孔0.2ml，补充维持液至2.0ml；同时设未接种灭活的病毒液作阴性对照，接种未灭活的病毒液作阳性对照，37℃、5％CO₂培养箱培养，观察168小时。将培养物收获反复冻融后盲传一代，继续培养120小时，观察未出现CPE，证明病毒灭活完全。

抗原琼扩效价测定，用直径3mm的金属打孔器按六角形图案打孔或用梅花形打孔器打孔。中心孔与外周孔距离为3mm。中心孔加满番鸭新型腺病毒阳性血清，周围孔加不同稀释度(原倍抗原、1∶2、1∶4、1∶8……)待检抗原。同时设立病毒阳性对照和阴性对照。置37℃恒温培养箱中倒置培养24-48小时，观察结果。

1.4.3灭活疫苗的制备

取灭活的抗原液与SEPPIC 71R油佐剂按3∶7比例进行乳化，先开动电机低速搅拌71R佐剂2分钟，同时徐徐加入抗原液，10000r/min，乳化15分钟，即成油乳剂灭活疫苗。

1.4.4分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2-8℃保存。

实施例2：高免鸡蛋的生产

2.1产蛋鸡应具有商品蛋鸡的生产性能。

2.1.1无禽白血病和禽流感感染按鸡群0.5％抽样采血，应全部为阴性。

2.1.2鸡白痢和鸡支原体按NY/T536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

2.1.3产蛋鸡的饲养管理鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口应设有消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康。

2.1.4鸡的疫病防治根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，按常规在饲料中添加抗菌药物防治细菌感染及添加抗球虫药预防球虫感染等。

2.1.5鸡的日龄100～150日龄。

实施例3：新型番鸭腺病毒灭活疫苗免疫

基础免疫：每只鸡胸部肌肉注射疫苗0.5ml；

维持免疫：当卵黄中新型番鸭腺病毒琼扩抗体效价1:64时，维持接种1次，每只鸡胸部肌肉注射疫苗1.0ml。

收蛋：三次强化免疫后10日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，新型番鸭腺病毒琼扩抗体效价≥1:32为合格，收集高免鸡蛋，4～8℃贮存，应不超过10日。

实施例4：抗体制造

4.1蛋壳消毒

将高免蛋浸入42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，蛋壳污染严重的，事先选出，单独消毒并用清水冲洗干净后，再浸泡消毒一次。随后，鸡蛋浸入95℃以上的水浴中消毒5秒钟，取出后晾干或吹干备用。

4.2分离蛋黄手工或机械打蛋，充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。

4.3灭活I

将蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入适量的注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下。

4.4酸化提取

于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/L HCL溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后，将灭活I的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时。

4.5离心分离将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用。

4.6灭活II 加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时。

4.7深滤用K型多层板框过滤澄清。

4.8灭活III 按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟。

4.9超滤除病毒用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒。

4.10调配总混加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8。

4.11除菌过滤将调配合格的抗体用0.22um微孔滤膜进行过滤除菌，无菌分装，100ml/瓶，即为新型番鸭腺病毒精致卵黄抗体。

实施例5：抗体检验

5.1纯净性按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，无细菌、支原体和外源病毒污染。

5.2辛酸及甲醛残留分别按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，应符合规定。

5.3安全性检验 5日龄健康雏番鸭10只，每只皮下注射1.0ml，观察14日，全部健活。

5.4效力检验

5.4.1抗体琼扩效价检测按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测抗体琼扩抗体效价，记录抗体结果。

5.4.2免疫攻毒法用1-3日龄雏番鸭20只，随机分成2组，每组10只，1组为接种抗体组，每只皮下注射抗体1.0ml，2组为攻毒对照组，每只皮下注射生理盐水1.0ml，接种抗体后24小时进行攻毒，每只番鸭肌肉注射新型番鸭腺病毒GD MM株0.5ml/只，连续观察14日，比较两组雏番鸭发病死亡情况。

如图1所示：3批新型番腺鸭病毒琼扩抗体效价均不低于1:32，1日龄雏番鸭接种抗体后，3批抗体接种组攻毒后，均能提供9/10以上的保护，而生理盐水对照组攻毒后10/10发病，9/10死亡，剖检病死番鸭以及攻毒后14天存活番鸭，均可见肝脏肿大、有出血点或出血斑、脾脏肿大出血、胆囊肿大、十二指肠出血、肾脏充血肿大等典型病变。

本发明基于新型番鸭腺病毒疫苗实现新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备，利用该方法制备的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体琼扩抗体效价均不低于1:32，1日龄雏番鸭接种抗体后，3批抗体接种组攻毒后，均能提供9/10以上的保护，因此，利用本发明方法制备的抗体对新型番鸭腺病毒有很好的治疗效果。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，按以下步骤进行：

2.根据权利要求1所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述新型番鸭腺病毒灭活疫苗采用番鸭新型腺病毒株作为灭活抗原制备得到，该病毒株于2019年7月30日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201952。

3.根据权利要求1所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，健康产蛋鸡日龄100-150日龄，其中无禽白血病和禽流感感染，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

4.如权利要求1所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，用预先制备的新型番鸭腺病毒灭活疫苗免疫健康产蛋鸡具体步骤如下：

基础免疫：每只鸡胸部肌肉注射疫苗0.5ml；

5.根据权利要求1所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，高免鸡蛋分离卵黄前需要进行蛋壳消毒，具体步骤如下：将高免鸡蛋浸入42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15min，随后鸡蛋浸入95℃以上的水浴中消毒5秒钟，取出后晾干或吹干备用。

6.根据权利要求1所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，从高免鸡蛋中分离卵黄，向卵黄中加入生理盐水搅拌均匀后通过加热灭活具体为：

手工或机械打蛋，充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；

将卵黄液加入巴氏灭菌罐中，加入等体积的生理盐水搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15min，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下。

7.根据权利要求1所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，于酸化反应罐中加入相当于原卵黄体积4倍的生理盐水，用1mol/L HCL溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2-4℃，然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时，之后将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用。

8.根据权利要求7所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，向上清液中加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温静置4h，之后采用K型多层板框实现深层过滤澄清，按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60min。

9.根据权利要求1所述的新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体的制备方法，其特征在于，用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤，加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8，再用0.22um微孔滤膜过滤，制得新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体。

10.一种新型番鸭腺病毒精制卵黄抗体，其特征在于，采用如权利1-9任一项所述的方法制备而成。