CN1289598A - 抗鸭传染性浆膜炎兽药及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于鸭传染性浆膜炎的预防和治疗的抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药及其制备方法。它是用鸭传染性浆膜炎病原菌(鸭疫里默氏杆菌)的灭活菌苗免疫产蛋母鸡,从鸡蛋黄中提取的一种蛋白质。它对鸭传染性浆膜炎具有特异性的预防和治疗作用及鸭疫里默氏杆菌不对它产生耐药性。鸭传染性浆膜炎病鸭用抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药治疗后,其体内不存在药物残留。该药物药效期长,使用成本低;并且治愈率高,存活数大。
Description
本发明涉及一种预防和治疗鸭传染性浆膜炎的抗鸭传染性浆膜炎兽药及其制备方法。
鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌引起的严重危害2-7周龄的小鸭的一种细菌性传染病，发病率高(5-90％)，死亡率高(1-80％)，即便没死的小鸭也会体重减轻，生长迟缓，给养鸭业造成严重的经济损失。该病呈世界性分布，在所有养鸭国家和地区流行，且危害严重。我国兽医专家郭玉璞于1982年在北京首次确认此病以来，现在全国许多省区(如四川、重庆、北京、上海、浙江等)都相继有本病的报道。
抗菌药物防治是当前防治鸭传染性浆膜炎的一项最重要的措施，但其存在许多不足：第一，由于鸭疫里默氏杆菌对抗菌药物易产生耐药性，各地分离的菌株对抗菌药物的敏感性不完全相同，甚至差别很大。
在生产实际中要想获得针对某一养鸭场或地区的鸭传染性浆膜炎具有很好疗效的药物，必须从该地区或该场的病死鸭中分离出病原(鸭疫里默氏杆菌)，再进行体外药物敏感性试验，但操作复杂、费时，在我国基层兽医工作中基本不能实现。第二，用药物治疗鸭传染性浆膜炎需要连续反复给药，治疗成本高，如用利高霉素治疗鸭传染性浆膜炎，每只鸭的药物费用在0．25-0．35元。第三，用抗菌药物预防和治疗鸭传染性浆膜炎，易造成药物残留，严重影响肉产品的质量，消费者长期食入这种有抗菌药物残留的肉品，会严重地危害人体健康。肉品中残留抗菌药对人体的危害主要表现在以下四个方面：残留的抗菌药物(如青霉素)可引起人的过敏反应，严重者可导致死亡；可造成人消化道中的菌群失调，严重影响胃肠道的消化吸收功能，甚至可出现难以治愈的伪膜性肠炎；产生耐药菌株；有的抗菌药经食品被消费者摄入后，严重影响人体的免疫功能，如氯霉素严重抑制白细胞的趋化性和影响抗体Fc段的结合功能等。因此，研究新的防治鸭传染性膜炎的药物很有必要。
本发明的目的之一是提供一种抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药，通过用鸭传染性浆膜炎病原菌(鸭疫里默氏杆菌)的灭活菌苗免疫产蛋母鸡，从鸡蛋黄中提取的一种蛋白质，将该蛋白质用于防治鸭传染性浆膜炎，来解决用抗菌药物防治鸭传染性浆膜炎存在的药物残留、易产生耐药菌株、需连续反复给药及成本高的问题。
本发明的目的之二是提供一种抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药的制备方法。
本发明的具体方案是：一种抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药及其制备方法，按如下步骤制得：
(1)、菌种准备及细菌的增殖
将真空冻干保存的鸭疫里默氏杆菌用生理盐水按1∶1稀释，接种巧克力营养琼脂，在含5％二氧化碳，37℃的培养箱中培养36-48小时，经纯度检验合格后，用生理盐水制成菌悬液接种巧克力营养琼脂，扩大培养，收集细菌；
(2)、制备灭活菌苗
将收集的细菌用生理盐水悬浮成菌悬浮，使每毫升含150-200亿个细菌，用终浓度0．3％甲醛在37℃下灭活24小时(其间振摇3-4次)，即为制苗用抗原；把灭活菌(抗原)悬浮与油佐剂(矿物油、司本、硬脂酸铝)按1∶3混合乳化制成油乳剂灭活菌苗，并进行菌苗的安全检验；
(3)、产蛋鸡的免疫
选25周龄左右的健康产蛋母鸡用安全检验合格的灭活菌苗进行免疫，免疫程序为：
第1次：每只鸡左右脚垫各注射0．15ml，颈部皮下0．2ml；
第2次：2周后每只鸡颈部皮下多点注射1．0ml；
第3次：2周后，每只鸡颈部皮下多点注射1．5ml；
(4)、高免蛋的收集
第3次免疫后14天，开始抽样测定高免鸡蛋黄中抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药效价，蛋黄与生理盐水按1∶3(V／V)稀释后，加入等体积三氯甲烷萃提，上清液琼扩效价≥1∶16即为合格，之后收集鸡蛋；
(5)、提取抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药，形成产品
A、蛋壳消毒：将鸡蛋浸入加热至42℃的0．1％新洁尔灭水溶液中消毒25-35分钟，取出凉干或吹干备用；
B、打蛋分离蛋黄：采用手工或机械打蛋，充分除去蛋清(白)，胚盘和系带，收集蛋黄；
C、萃提：先充分搅拌蛋黄呈均匀膏状，然后加入3倍左右的灭活生理盐水，再次充分搅拌混匀，使成为蛋黄液；在该蛋黄液中加入等体积的三氯甲烷，充分振荡混合，作用60分钟后以3500-4000rpm离心30分钟左右，收集离心管中的上清液；
D、加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度为0．05％加入甲醛，充分搅拌混合，密封30-60分钟后加入终浓度为0．02％左右的稳定剂吐温-20，混匀；
E、除菌过滤：用0．2-0．3um微孔滤膜过滤除菌，即为抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药；
(6)、效价、安全检验，形成产品
效价用1％琼脂(其中含8％Nacl)为载体的琼扩试验，检测用抗原为鸭疫里默氏杆菌脂多糖抗原，抗原含量为150-200mg／ml；用14日龄健康小鸭10只做安全性检验，每只小鸭腿部肌肉注射3．0ml(左右侧各1．5ml)后观察10天，无任何异常反应为合格。
本发明的最大贡献是用鸭传染性浆膜炎病原菌(鸭疫里默氏杆菌)的灭活菌苗免疫产蛋母鸡，从鸡蛋黄中提取的一种蛋白质，它对鸭传染性浆膜炎具有特异性的预防和治疗作用及鸭疫里默氏杆菌不对它产生耐药性。鸭传染性浆膜炎病鸭用抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药治疗后，其体内不存在药物残留。该药物药效期长，可达5-7天，一般患病鸭用药一次可治愈。使用成本低，每只病鸭的治疗成本在0．08-0．12元左右。因此，抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药在鸭传染性浆膜炎的防治中具有特效，无残留，不产生耐药性，药效期长，价格低的特点，是一种“绿色”药物，在兽医公共卫生学上有重要意义。
本发明经实验证明取得显著成功，完全达到了发明的目的。它不仅不产生耐药性，在体内不存在药物残留，该药物药效期长，使用成本低，而且，治愈率高，存活数大。
下面介绍用本发明兽药对鸭传染性膜炎的预防和治疗试验情况：
试验一：40O只14日龄小鸭，用不含抗菌药物的饲料饲喂，随机分成2组，每组2OO只；第l组试验鸭每只腿部肌注1．Oml抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药，第2组试验鸭每只腿部肌注1．0ml生理盐水；分别于注射后24小时，72小时，120小时及168小时从各组中随机抽取50只试验鸭用于攻毒试验，结果表明第1组试验鸭在24小时，72小时，12O小时攻毒后10O％存活，在168小时攻毒后存活率为12。0％(6／5O)；而第2组试验鸭在24小时，72小时，120小时及168小时攻毒后存活率为0。
试验二：用不含抗菌药物的饲料饲喂4O0只14日小鸭，随机分成4组，每组1O0只，在实验室条件下人工感染鸭传染性浆膜炎。第1、2、3组试验鸭分别在感染后12小时，24小时，36小时每只鸭腿部肌肉注射抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药1．Oml治疗，第4组为空白对照，其结果为：第1、2、3组的治愈比分别为98／1OO(98％)、85／92(92．4％)、49／7O(7O％)，第4组的存活数为O(O／1OO)。详见下表：
| 组别 | 治疗时间(h) | 治疗时发病数 | 治疗时死亡数 | 治疗数 | 治疗后死亡数 | 注射后存活数 | 治愈率 |
| 1 | 12 | 0/100 | 0 | 100 | 2 | 98 | 98/100 |
| 2 | 24 | 32/100 | 8 | 92 | 7 | 85 | 85/92 |
| 3 | 36 | 63/100 | 30 | 70 | 21 | 49 | 49/70 |
| 4 | - | - | - | - | - | - | - |
从上表可见，本发明兽药的另一特点是，治愈率高，存活数大。
本发明的一个较佳实施例：
1．菌种
用于制造本品的菌种为强毒力的鸭疫里默氏杆菌RA1株。
2．抗鸭传染性浆膜炎IgY制造及检验
2．1高免鸡蛋的产生
2．1．1产蛋鸡符合以下条件下的普通商品蛋鸡
2．1．1．1无禽流感感染，监测血清抗体，按0．5％抽样，应全部为阴性。
2．1．1．2按法定方法检疫鸡白痢和鸡支原体病，阳性率≤0．1％。
2．1．1．3产蛋鸡具有商品蛋鸡的良好生产性能。
2．1．1．4饲养管理鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。应距交通要道200米以上，进出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口应设消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施。实施全进全出制。鸡场饮水卫生达标。饲养员应健康。
2．1．1．5鸡群疫病防制无特殊要求。按科学免疫程序适时接种新城疫、马立克氏病、传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病、传染性鼻炎、减蛋综合征、大肠杆菌等疫苗。按常规在饲料中添加如土霉素等抗菌药物防制细菌感染及预防球虫感染的药物。
2．2抗原(免疫原)制备
2．2．1菌种准备及细菌的增殖
将真空冻干保存的鸭疫里默氏杆菌用生理盐水按1∶1稀释，接种巧克力营养琼脂，在含5％二氧化碳，37℃的培养箱中培养36-48小时，经纯度检验合格后，用生理盐水制成菌悬液接种巧克力营养琼脂，扩大培养，收集细菌。
2．2．2制备油乳剂苗
2．2．2．1抗原准备
将收集的细菌用生理盐水悬浮成菌悬浮，使每毫升含150-200亿个细菌，用终浓度0．3％甲醛在37℃下灭活24小时(其间振摇3-4次)，即为制苗用抗原。
2．2．2．2乳化
油相制备 取10号白油94份，司本-80 6份，硬脂酸铝2％，先将硬脂酸铝与少量白油混合加热熔化后，再补足白油及加入司本-80充分搅拌分装，在116℃，进行30分钟灭菌，最后在10℃左右冷藏备用。
水相制备 按抗原96份，吐温-80 4份配制。
乳化 按油相3份，水相1份配制，取油相加入高速组织捣碎机缸内，慢速搅拌，缓缓加入水相之后高速搅拌2-5分钟，在终止搅拌前加入1％的硫柳汞溶液，使之终浓度为万分之一。
2．2．2．3检验
物理性状 油乳剂抗原应为乳白色带粘滞性的均匀乳状液，经3500r／min离心30分钟，不分层为合格。
无菌检验 无细菌生长
安全检验 油乳剂抗原接种20-30日龄健康鸡30只，每只颈背部下皮注射3ml，设对照30只，同条件下饲养，观察15天，两组鸡均无异常判该抗原合格。
2．2．2．4保存
抗原应避光4℃保存，6个月内有效，不能冻结。
2．3免疫程序
25周龄左右的健康产蛋母鸡用油乳剂苗首免，免疫剂量为0．5ml／只(左右脚垫各0．15ml，颈部皮下0．2ml)，以后每隔2周颈部皮下分点注射1．0ml-1．5ml进行加强免疫，共加强免疫2次。
2．4高免蛋收集
第3次免疫后14天开始抽样测定高免鸡蛋黄中抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药效价，蛋黄与生理盐水按1∶3(V／V)稀释后，加入等体积三氯甲烷萃提，上清液琼扩效价≥1∶16即为合格，之后收集鸡蛋。2．5
抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药的制造
2．5．1蛋壳消毒：将鸡蛋浸入加热至42℃的0．1％新洁尔灭水溶液中消毒30分钟，取出凉干备用。
2．5．2打蛋分离蛋黄：采用手工或机械打蛋，充分除去蛋清(白蛋白)，胚盘和系带，收集蛋黄。
2．5．3萃提：先充分搅拌蛋黄呈均匀膏状，然后加入3倍左右的灭活生理盐水，再次充分搅拌混匀，使成为蛋黄液；在该蛋黄液中加入等体积的三氯甲烷，充分振荡混合，作用60分钟后以3500-4000rpm离心30分钟左右，收集离心管中的上清液。
2．5．4加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度为0．05％加入甲醛，充分搅拌混合，密封30-60分钟后加入终浓度为0．02％左右的稳定剂吐温-20，混匀。
2．5．5除菌过滤：用0．22um微孔滤膜过滤除菌，即为抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药。
2．6成品检验
无菌检验 应无细菌生长
效价测定 采用琼脂扩散试验检测：在浓度为8％氯化钠溶液中加入1g优质琼脂粉，加热融化后加入终浓度为0．01％硫柳汞防腐，浇制凝胶板，按中央1孔，外围6孔打孔，孔径3mm，间距4mm，加样量为15-20ul，加样后在37℃温度盒内孵育24小时，再在室温放置24-48小时；观察判定结果：与标准抗原形成白色沉淀线的最大稀释度即为抗鸭传染性浆膜炎IgY药的效价；成品中抗鸭传染性浆膜炎IgY药的效价应≥1∶16。
安全检验 18-22g健康小白鼠5只，各皮下注射本品0．5ml；2周龄健康小鸭10只，各皮下注射本品3．0ml。观察10天，小白鼠和小鸭均应全部健活。
Claims (3)
1．一种抗鸭传染性浆膜炎兽药及其制备方法，其特征在于按如下步骤制得：
(1)、菌种准备及细菌的增殖将真空冻干保存的鸭疫里默氏杆菌用生理盐水按1∶1稀释，接种巧克力营养琼脂，在含5％二氧化碳，37℃的培养箱中培养36-48小时，经纯度检验合格后，用生理盐水制成菌悬液接种巧克力营养琼脂，扩大培养，收集细菌；
(2)、制备灭活菌苗将收集的细菌用生理盐水悬浮成菌悬浮，使每毫升含150-200亿个细菌，用终浓度0．3％甲醛在37℃下灭活24小时(其间振摇3-4次)，即为制苗用抗原；把灭活菌(抗原)悬浮与油佐剂(矿物油、司本、硬脂酸铝)按1∶3混合乳化制成油乳剂灭活菌苗，并进行菌苗的安全检验；
(3)、产蛋鸡的免疫
选25周龄左右的健康产蛋母鸡用安全检验合格的灭活菌苗进行免疫，免疫程序为：
第1次：每只鸡左右脚垫各注射0．15ml，颈部皮下0．2ml；
第2次：2周后每只鸡颈部皮下多点注射1．0ml；
第3次：2周后，每只鸡颈部皮下多点注射1．5ml；
(4)、高免蛋的收集
第3次免疫后14天，开始抽样测定高免鸡蛋黄中抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药效价，蛋黄与生理盐水按1∶3(V／V)稀释后，加入等体积三氯甲烷萃提，上清液琼扩效价≥1∶16即为合格，之后收集鸡蛋；
(5)、提取抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药
A、蛋壳消毒：将鸡蛋浸入加热至42℃的0．1％新洁尔灭水溶液中消毒25-35分钟，取出凉干或吹干备用；
B、打蛋分离蛋黄：采用手工或机械打蛋，充分除去蛋清(白)，胚盘和系带，收集蛋黄；
C、萃提：先充分搅拌蛋黄呈均匀膏状，然后加入3倍左右的灭活生理盐水，再次充分搅拌混匀，使成为蛋黄液；在该蛋黄液中加入等体积的三氯甲烷，充分振荡混合，作用60分钟后以3500-4000rpm离心30分钟左右，收集离心管中的上清液；
D、加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度为0．05％加入甲醛，充分搅拌混合，密封30-60分钟后加入终浓度为0．02％左右的稳定剂吐温-20，混匀；
E、除菌过滤：用0．2-0．3um微孔滤膜过滤除菌，即为抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药；
(6)、效价、安全检验，形成产品
效价用1％琼脂(其中含8％Nacl)为载体的琼扩试验，检测用抗原为鸭疫里默氏杆菌脂多糖抗原，抗原含量为150-200mg／ml；
用14日龄健康小鸭10只做安全性检验，每只小鸭腿部肌肉注射3．0ml(左右侧各1．5ml)后观察10天，无任何异常反应为合格。
2，根据权利要求1所述的抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药的制备方法，其特征在于：制备灭活菌苗步骤中的乳化是指先分别制备油相和制备水相，再按1∶3混合乳化，其中：制备油相取10号白油94份，司本-806份，硬脂酸铝2％，先将硬脂酸铝与少量白油混合加热熔化后，再补足白油及加入司本-80充分搅拌分装，在116℃，进行30分钟灭菌，最后在10℃左右冷藏备用；制备水相按抗原96份，吐温-80 4份配制；乳化按油相3份，水相1份配制，取油相加入高速组织捣碎机缸内，慢速搅拌，缓缓加入水相之后高速搅拌2-5分钟，在终止搅拌前加入1％的硫柳汞溶液，使之终浓度为万分之一。
3．根据权利要求1所述的抗鸭传染性浆膜炎IgY兽药的制备方法，其特征在于：效价测定是指采用琼脂扩散试验检测：在浓度为8％氯化钠溶液中加入1g优质琼脂粉，加热融化后加入终浓度为0．01％硫柳汞防腐，浇制凝胶板，按中央1孔，外围6孔打孔，孔径3mm，间距4mm，加样量为15-20ul，加样后在37℃温度盒内孵育24小时，再在室温放置24-48小时；观察判定结果：与标准抗原形成白色沉淀线的最大稀释度即为抗鸭传染性浆膜炎IgY药的效价；成品中抗鸭传染性浆膜炎IgY药的效价应≥1∶16。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Applicant after: Li Jixiang Applicant before: Li Jixiang |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Jixiang Inventor after: Xu Gang Inventor after: Du Huamao Inventor after: Huang Wei Inventor before: Li Jixiang |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: LI JIXIANG TO: SICHUAN INSTITUTE OF ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY MEDICINE |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |