CN105705658A - 随时间检测疾病中的突变 - Google Patents

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Abstract

提供了随时间监测患者中的与癌症相关的基因突变的方法。还提供了为受试者选择和/或应用治疗或疗法的方法。

Description

随时间检测疾病中的突变
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年10月19日提交的美国临时申请号61/893,216、2014年4月8日提交的美国临时申请号61/977,085、2014年4月9日提交的美国临时申请号61/977,609和2014年8月21日提交的美国临时申请号62,040,363的权益，其全部被以引用的方式全文并入本文。
发明背景
(1)发明领域
大体上，本发明涉及癌症突变。更具体地，本发明提供了用于随时间监测癌症突变的方法，其可用于评价治疗选择。
(2)相关技术的描述
癌性组织中的核酸、循环细胞和存在于体液中的无细胞(cf)核酸可辅助鉴定和选择患有与此类遗传改变相关的癌症或其他疾病的个体。参见，例如，Spindler等人,2012；Benesova等人,2013；Dawson等人,2013；Forshew等人,2012；Shaw等人,2012。一些数据表明，血液中突变DNA的量与肿瘤负荷相关联并可用于鉴定抗性突变的出现(Forshew等人,2012；Murtaza等人,2013；Dawson等人,2013；Diaz等人,2012；Misale等人,2012；Diehl等人,2008)。但是，尚不知道对血液或尿液中的cfDNA的定量或半定量测量是否足够准确地反映肿瘤负荷以在做治疗决策时利用。
对通过随时间监测肿瘤负荷确定治疗的有效性的另外的非侵入性方法存在需求。本发明解决了该需求。
发明简述
本发明部分地基于以下发现：在治疗的过程中，可以通过在不同时间点测量尿液或血液中的cfDNA来监测癌症治疗。
因此，在一些实施方案中，提供了用于随时间监测患者中与癌症相关的基因突变的方法。所述方法包括：
(a)从患者获得体液的样品；
(b)定量或半定量地确定样品中的无细胞DNA(cfDNA)中的突变的量；和
(c)在较后的时间重复(a)和(b)。
还提供了为受试者选择和/或应用治疗或疗法的方法。所述方法包括通过以上方法监测基因突变，以及基于检测选择和/或应用治疗或疗法。
附图简述
图1示出了针对靶基因序列中的28-30bp足迹的示例性两步测定设计。
图2是显示用于BRAFV600E突变的鉴定的阳性对照和阴性对照的实验结果的图。
图3是显示治疗前、治疗期间和治疗后对转移性黑素瘤患者的BRAFV600E监测的结果的图。未观察到明显的疾病复发。
图4是显示治疗前、治疗期间和治疗后对转移性结肠直肠癌患者的BRAFV600E监测的结果的图。观察到疾病的复发。
图5是显示治疗前和治疗期间对患有阑尾癌患者的BRAFV600E监测的结果的图。
图6是显示治疗期间对转移性非小细胞肺癌患者的BRAFV600E监测的结果的图。观察到对该疗法的抗性。
图7是显示对未受治疗的转移性非小细胞肺癌患者的BRAFV600E监测的结果的图。观察到疾病进展。
图8是显示在晚期结肠直肠癌患者的尿液、血浆和组织样品之间KRAS状态的高度一致性的实验结果的示意图。
图9是显示监测与对转移性癌症患者的治疗或疗法的响应有关的包含BRAFV600E突变的cfDNA的实验结果的示意图。ctDNA表示存在于cfDNA中的“循环肿瘤DNA”。
发明详述
如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意欲也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。另外，“或”的使用意欲包括“和/或”，除非上下文另有明确说明。
如本文使用的，术语“样品”指可能包含对于其的分析物测定是期望的分析物的任何事物。在许多情况中，所述分析物是cf核酸分子，例如编码BRAF的全部或部分的DNA或cDNA分子。所述样品可以是生物样品，例如生物流体或生物组织。生物流体的实例包括尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊液、泪液、黏液、羊水等。包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织的生物组织通常是特定类型的细胞连同其细胞间质的聚集体，所述细胞间质形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一。生物组织的实例还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和单独的一个或更多个细胞。
如本文使用的，“患者”包括哺乳动物。所述哺乳动物可为例如任何哺乳动物，例如人类、灵长类、鸟类、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。在很多情况中，所述哺乳动物是人类。
本发明部分地基于以下发现：可通过在治疗的过程中在不同的时间点测量尿液或血液中的cfDNA来准确地监测与癌症和其他疾病有关的基因突变。在实施例中展示了该发现的有效性，其中在治疗的不同时间点对尿液和血液中cfDNA中的突变的定量测量与如通过射线照相术测量评估的肿瘤负荷以及如通过失效时间对疗法评价的治疗响应相关联。此类测量可用于评价治疗选择。
因此，在一些实施方案中，提供了用于随时间监测患者中的基因突变的方法，所述方法包括：
(a)从患者获得体液的样品；
(b)定量或半定量地确定样品中的DNA中的突变的量；和
(c)在较后的时间重复(a)和(b)。
在多种实施方案中，基因突变与癌症相关。
在这些方法中，预期具有DNA的任何体液可被利用。体液的非限制性实例包括但不限于外周血、血清、血浆、尿液、淋巴液、羊水和脑脊液。在某些特定的实施方案、诸如实施例中例证的那些实施方案中，所述体液是血清、血浆或尿液。
在一些情况中，所述方法被定量地进行，以使得基因改变的量被定量地确定，并可以与另一测量值定量地比较。在其他情况中，所述方法半定量地进行，以使得基因改变的量被确定，并随后与另一测量值简单地比较，以确定相对于彼此的相对升高或降低。
这些方法不狭窄地局限于任何特定癌症中的任何特定的基因突变，因为与任何癌症相关的任何突变将被预期通过这些方法被准确地监测。此类基因的非限制性实例是APC、BRAF、CDK4、CTNNB1、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER3、PDGFR1、PDGFR2、AKT1、雌激素受体、雄激素受体、EZH2、FLT3、HER2、IDH1、IDH2、JAK2、KIT、KRAS、c-Myc、NOTCH1、NRAS、PIK3CA、PTEN、p53、pl6或Rbl基因。在一些实施方案中，突变位于BRAF基因或KRAS基因中。这些基因中的示例性突变是BRAFV600E和KRAS突变G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V和G13D。
对于多种人类肿瘤，已经报道了与BRAFV600E的关联，包括黑素瘤(-50％)(Davies等人,2002；Curtin等人,2005)、乳头状甲状腺癌(-40％)(Puxeddu等人,2004)、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(57％)(Badalian-Very等人,2010)和多种实体瘤(以较低的频率)(Davies等人,2002；Brose等人,2002；Tie等人,2011)。
丝氨酸/苏氨酸激酶RAF家族的成员，BRAF蛋白是在调节细胞存活、增殖和分化中发挥重要作用的RAS-RAF-MAPK信号转导通路的一部分(Keshet和Seger,2010)。BRAF突变组成性地激活MEK-ERK通路，引起增强的细胞增殖、存活以及最终的致瘤性转化(Wellbrock和Hurlstone,2010；Niault和Baccarini,2010)。所有的BRAF突变的毛细胞白血病(HCL)病例携带V600E模拟磷取代(phospho-mimeticsubstitution)，其出现于BRAF活化片段中并以组成性的方式显著增强其激酶活性(Wan等人,2004)。
在许多情况中，BRAF突变是BRAFV600E突变，其中在SEQIDNO:2的位置或氨基酸残基600处谷氨酸(Glu或E)取代了缬氨酸(Val或V)残基。可选地，或另外地，BRAF突变为在SEQIDNO:l的位置1860处腺嘌呤(A)取代了胸腺嘧啶(T)核苷酸。
智人v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1，BRAF由以下mRNA序列(NM_004333、SEQIDNO:1)编码(其中编码序列被加粗并且氨基酸残基600的编码序列被加下划线并放大)：
智人v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1，BRAF由以下氨基酸序列(NM_004324、SEQIDNO:2)编码(其中氨基酸残基600被加粗并被加下划线和放大)：
癌症的非限制性实例包括但不限于，肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑或神经系统癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道良性肿瘤癌(gastrointestinalcarcinoidcancer)、胃肠道间质癌、霍奇金病、肠癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、大肠癌、喉癌、下咽癌、喉和下咽癌、白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、非-HCL淋巴恶性肿瘤(毛细胞变异、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、脾弥漫性红髓小B-细胞淋巴瘤(SDRPSBCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病、低级淋巴瘤、系统性肥大细胞增生症或不可分类的脾淋巴瘤/白血病(SLLU))、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺良性肿瘤癌、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、鼻腔癌、鼻窦癌、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、成人软组织肉瘤、皮肤癌、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤、胃癌、小肠癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(WaldenstromMacroglobulinemia)和威尔姆氏肿瘤(WilmsTumor)。
非-HCL淋巴恶性肿瘤的非限制性实例包括但不限于毛细胞变异(HCL-v)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、脾弥漫性红髓小B-细胞淋巴瘤(SDRPSBCL)、不可分类的脾淋巴瘤/白血病(SLLU)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病、低级淋巴瘤、系统性肥大细胞增生症和不可分类的脾淋巴瘤/白血病(SLLU)。
在本文描述的方法的多种实施方案中，患者是人。患者可为任何年龄，包括但不限于婴儿、幼儿、儿童、未成年人、成人、老年人(seniors)和老人(elderly)个体。
在本文描述的任何方法中，突变可通过本领域中已知的任何方法来确定或定量。非限制性实例包括MALDI-TOF、HR-熔解、双脱氧测序、单分子测序、使用探针、焦磷酸测序、第二代高通量测序、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM或利用聚合酶链式反应(PCR)的方法，所述利用聚合酶链式反应(PCR)的方法例如数字PCR、定量-PCR或等位基因特异性PCR(其中引物或探针与可变的基因序列互补)。在一些实施方案中，PCR是液滴数字PCR(dropletdigitalPCR)，例如，如在实施例中所描述的。在这些方法的一些中，突变与野生型序列一起被定量，以确定突变的序列的百分比。在其他方法中，只定量突变。
在许多实施方案中，DNA是无细胞DNA(“cfDNA”)。在一些实施方案中，所扩增或检测的DNA分子是基因组DNA。在其他实施方案中，所扩增或检测的分子是cDNA。
技术人员能确定用于PCR扩增用于本文描述的任何方法的任何突变序列的可用引物。在一些实施方案中，PCR扩增少于约50个核苷酸的序列，例如，如在美国专利申请公开US/2010/0068711中所描述的。在其他实施方案中，使用抑制野生型形式的基因的扩增的阻断寡核苷酸进行PCR，例如，如在图1中所示的(还参见以下实施例1)或如在美国专利8,623,603或美国临时专利申请号62/039,905中所描述的。在许多实施方案中，如本领域已知的，一个或更多个引物包含外源或异源序列(诸如接头或“标签”序列)，以使得得到的扩增分子具有非天然存在的序列。
对于cf核酸中存在基因改变(突变)的检测限值可通过评价来自一个或更多个阴性对照(例如，来自健康对照受试者或经验证的细胞系)和多个患者样品的数据来确定。任选地，这些限值可部分地基于以下来确定：最小化假阴性的百分比比最小化假阳性更重要。针对BRAFV600E的一组非限制性阈值被如下定义：在cf核酸的样品中突变低于约0.05％则确定无突变存在或只有野生型；约0.05％至约0.107％的范围作为“界线”，并且大于约0.107％作为检出突变。在其他实施方案中，突变的无检出指定阈值被设定为相对于相应的野生型序列低于约0.1％、低于约0.15％、低于约0.2％、低于约0.3％、低于约0.4％、低于约0.5％、低于约0.6％、低于约0.7％、低于约0.8％、低于约0.9％或低于约1％的突变检出。
还可根据任何标准，包括假阳性和假阴性的期望的相对量，来设定界线指定(borderlinedesignation)。
当然，纳入另外的患者样品可导致对于每一类别确定不同的阈值，或者可选地消除“界线”类别。期望的假阴性比假阳性的量也将对阈值具有影响。
这些方法的“获得”和“确定”步骤可根据需要重复很多次以获得足以辅助确定治疗选择或正被应用的治疗的有效性的数据。在一些实施方案中，每周、每月、每两个月、每三个月、每四个月或以那些时间点之间的任何间隔进行这些步骤。
在一些实施方案中，患者之前未经历过针对基因中该突变的测试。在那些情况中，所述方法被用来确定癌症中是否涉及特定的突变，以及靶向具有该突变的基因的产物的药物是否有效。例如，当BRAFV600E突变存在时，可用BRAF抑制剂诸如威罗菲尼、索拉菲尼或达拉菲尼治疗患者。
在一些实施方案中，患者之前已被测试并确定了突变，并且随后的测试是为了评价疾病的进展和/或治疗的有效性。在一些情况中，所述检测可鉴定对治疗或疗法的无响应性，并且所述选择和/或应用包括不同的治疗或疗法。在其他情况中，所述检测可鉴定对治疗或疗法的响应性，并且所述选择和/或应用包括继续相同的治疗或疗法。在另外的实施方案中，所述监测是对患者、例如被认为“无病”而有复发的可能性的受过治疗的患者的监视。
因此，这些方法可被用于确认保持针对多种疾病包括癌症的已公开的治疗或疗法；或改变针对所述疾病的治疗或疗法。在该背景下，本文还提供了为受试者选择和/或应用治疗或疗法的方法。所述方法包括通过上述方法监测基因突变，以及基于检测选择和/或应用治疗或疗法。
在这些方法的一些实施方案中，所述监测鉴定对治疗或疗法的低响应性或无响应性，并且所述选择和/或应用包括不同的治疗或疗法。在其他实施方案中，所述监测鉴定有效的治疗或疗法，并且所述选择和/或应用包括继续相同的治疗或疗法。在另外的实施方案中，监测鉴定突变的消除，并且选择和/或应用包括中止治疗。
在改变治疗或疗法的范围内，作为非限制性实例，本公开内容包括增加所述治疗或疗法；任选地达到终止所述治疗或疗法的程度地减少所述治疗或疗法；通过开始另一种治疗或疗法而终止所述治疗或疗法；以及调整所述治疗或疗法。调整所述治疗或疗法的非限制性实例包括减少或增加该疗法，任选地与一种或更多种另外的治疗或疗法联合；或维持所述治疗或疗法，同时增加一种或更多种另外的治疗或疗法。
在一些情况中，无细胞(cf)核酸的观察值鉴定在治疗或疗法开始后包含突变的cf核酸的水平的升高。伴随升高，观察值可达到拐点，在此处水平降低或继续升高。拐点的存在可用于确定对治疗或疗法的响应性，所述治疗或疗法可以被保持或缩减。水平连续降低至与治疗或疗法开始前相同或更低的水平是对响应性的进一步确认。
拐点不存在表明对该治疗或疗法的抗性，并且所以随后可终止施用该治疗或疗法，或向该患者施用针对该疾病或紊乱的至少一种另外的治疗或疗法，减少用该治疗或疗法治疗该受试者并向该受试者施用针对该疾病或紊乱的至少一种另外的治疗或疗法。
在其他情况中，在拐点和水平降低之后，可观察到另外的拐点。这可表明对该治疗或疗法的抗性的发展，并且随后终止施用该治疗或疗法，或向该受试者施用针对该疾病或病症的至少一种另外的治疗或疗法，或减少用该疗法治疗受试者并向该受试者施用针对该疾病或紊乱的至少一种另外的疗法。
在一些方面，对突变的监测通过确定肿瘤负荷，例如通过射线照相术、计算机断层成像(CT)扫描、正电子发射断层成像(PET)、或PET/CT扫描，并比较所确定的突变的量与肿瘤负荷来完成。这用于确定被监测的突变事实上是否是该肿瘤的驱动因素，或者证实被监测的突变事实上是该肿瘤的驱动因素。
在其他方面，在一次、多于一次或所有的突变监测次数中，不将所确定的突变的量与肿瘤负荷比较。考虑到本文描述的突变监测程序的可靠性，不需要在每个时间点进行肿瘤负荷评价，从而为患者节省了肿瘤负荷评价。
在另外的方面，所述监测包括评价与失效时间参数(即，已知针对该突变的治疗在一定的有效时间之后失效)相关的突变。在这些方面，所述监测可辅助更准确地预测失效将何时发生，例如何时突变的浓度增加得超过之前的评估值。
本公开内容的治疗和疗法包括所有方式的癌症疗法。这些方式的非限制性实例包括放射疗法、化疗、激素疗法、免疫疗法和外科手术。放射疗法的非限制性实例包括外粒子束放射治疗，诸如用光子(γ射线)、电子或质子；立体定向放射疗法，诸如针对小的靶用单个高剂量或多个分次剂量；短距离放射疗法；和系统性放射性同位素。
化学疗法的非限制性实例包括细胞毒性药物；抗代谢物，诸如叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂和嘧啶拮抗剂；生物反应调节剂，诸如干扰素；DNA损伤剂，诸如博莱霉素；DNA烷基化和交联剂，诸如亚硝基脲和苯达莫司汀；酶活性物质，诸如天门冬酰胺酶；激素拮抗剂，诸如氟维司群和它莫西芬；芳香化酶抑制剂；单克隆抗体；抗生素诸如丝裂霉素；铂复合物诸如顺铂和卡铂；蛋白酶体抑制剂诸如硼替佐米；纺锤体毒素诸如紫杉烷类或长春花或其任一种的衍生物；拓扑异构酶I和II抑制剂，诸如蒽环类、喜树碱类和鬼臼毒素类；酪氨酸激酶抑制剂；抗血管发生药物和信号转导抑制剂。
激素疗法的非限制性实例包括激素拮抗剂疗法、激素消融(hormoneablation)、比卡鲁胺、恩杂鲁胺、它莫西芬、来曲唑、阿比特龙、强的松或其他糖皮质类固醇。免疫疗法的非限制性实例包括抗癌疫苗和经修饰的淋巴细胞。
在一些情况中，治疗或疗法的保持或改变在在这些方式中的一种内。在其他情况中，治疗或疗法的保持或改变在这些方式中的两种或更多种之间。当然，有经验的临床医师清楚对于给定的紊乱或疾病(诸如特定的癌症或肿瘤类型)的公知的和被认可的治疗和疗法，并且因此治疗或疗法的保持或改变可在对于该疾病或紊乱来说已知的那些方式内。
本公开内容的一部分还提供了用于实施所公开的方法的试剂盒。所述试剂盒可包括选择性地与BRAF突变结合的特异性结合试剂，和用于进行本文描述的方法的说明书。
本领域技术人员可参考详细描述本文论述的已知技术或等同技术的常规参考教科书。这些教科书包括Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.(2005)；Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual(第3版),ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork(2000)；Coligan等人,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,N.Y.；Enna等人,CurrentProtocolsinPharmacology,JohnWiley&Sons,N.Y.；Fingl等人,ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(1975),Remington′sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,PA,第18版(1990)。当然，在实施或使用本公开内容的方面时也可以参考这些教科书。
在以下实例中描述了优选的实施方案。经思考如本文公开的发明的说明和实践，在本文权利要求的范围内的其他实施方案对本领域技术人员来说是明显的。意图说明书与实施例一起被认为仅是示例性的，本发明的范围和精神由实施例之后的权利要求表明。
实施例
实施例1材料和方法
在以下实施例中使用以下方法。
患者尿液样品
前瞻性地招募总计27名患有已转移的癌症的患者，其肿瘤样品先前已由有CLIA资质的实验室测试BRAF(20名患者)和KRAS(7名患者)中的突变。
在基线(baseline)和疗法期间和疗法后获取单个或多个连续的尿液样品(90-110ml或24小时尿液收集物)用于cfDNA突变分析。
两步测定设计
针对靶突变基因序列中的28-30个碱基对的足迹开发两步测定设计。该测定设计(及本领域中已知的其他测定)可用于扩增不同组织或体液中的任何大小的序列，例如少于400、少于300、少于200、少于150bp、少于100bp、少于50bp、少于40bp、少于35bp或少于30bp。
图1概述了所述测定设计，其包括第一预扩增步骤，以增加样品中存在的靶突变基因序列相对于野生型基因序列的拷贝数。所述预扩增在与野生型序列(而非突变序列)互补的野生型(非突变的)抑制性“WT阻断物”寡核苷酸的存在下进行，以减少野生型DNA的扩增。用在5′末端包含接头(或“标签”)的引物进行预扩增以促进第二步中的扩增。
第二步是对于定量、液滴数字PCR的用与在第一步中使用的引物的末端上的标签互补的引物和与突变序列互补的TaqMan(报告子)探针寡核苷酸进行的另外的扩增。
测定开发
使用具有单独的突变(BRAFV600E、KRASG12D或KRASG12V)的细胞系作为阳性对照。使用被证实为野生型BRAF和KRAS的细胞系作为阴性对照。参见图2。
通过使用分类树评价来自50名健康对照和39名患者样品的数据来确定突变检出的阈值。对最小化假阴性的百分比给予比最小化假阳性更高的重要性。
定义对于BRAFV600E的一组非限制性阈值：<0.05％为无检出或野生型；0.05％至0.107％的范围为“界线”，并且>0.107％为检出突变。使用每个样品KRASG12突变的计数作为非限制性手段来证实CLIA-鉴定的G12健康(野生型)和G12突变样品：<234个突变片段为野生型；并且489-2825个突变片段为检出突变。
实施例2.cfDNA中的BRAFV600E突变
首先在19名患有癌症、被CLIA实验室鉴定为具有BRAFV600E突变的患者的尿液样品中评价两步测定的灵敏度。如表1中所显示的，CLIAV600E与尿液cfDNAV600E突变和“界线”的一致率为95％。
表1
*在患者中，对于随时间推移的数个连续的尿液收集物，示出了具有最高突变分数的样品。
对于基线尿液样品(治疗前)和任何评估点的尿液样品，观察到组织中存在BRAFV600E突变(由CLIA实验室)与尿液cfDNAV600E突变的进一步的一致性。在表2和表3中提供了那些结果。
表2.BRAFV600E组织(CLIA)与基准尿液cfDNA的一致性
表3.BRAFV600E组织(CLIA)与任意评估点的尿液cfDNA的一致性
另外，如表4中所显示的，具有BRAFV600E突变的cfDNA与其在来自癌症晚期患者的组织样品中的存在相关联。在具有结肠直肠癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、卵巢癌、黑素瘤、乳头状甲状腺癌和其他癌症的患者的尿液中检测到BRAFV600E突变。所公开的V600E测定被证明与组织活检相比的高度一致性(在测试的任何时间点，在尿液中88％被检出；33名受试者中的29名)
表4.
实施例3.cfDNA中的KRASG12D突变
还在来自患有癌症、由CLIA实验室鉴定为具有KRASG12D突变的7名患者的尿液样品中评价两步测定的灵敏度。如表5中所显示的，CLIAG12D与尿液cfDNAG12D突变的一致率为100％。
针对KRAS突变，按照本文所描述的，与匹配的组织样品比较，评价已存档3-5年、来自20名晚期和未接受治疗的结肠直肠癌患者的匹配的尿液和血浆样品。结果示于图8中，图8表明所有三种样品类型之间的高度一致性。
实施例3.cfDNA突变的纵向评价
如以上所描述的，在3名患者中随时间获取多个尿液样品。患者患有转移性黑素瘤(用BRAF抑制剂和化学疗法治疗)、转移性结肠直肠癌(用BRAF抑制剂和抗-EGFR抗体治疗)和阑尾癌(用BRAF抑制剂和激酶抑制剂治疗)。
在图3中示出了黑素瘤患者的结果。在患者的初始样品中观察到37.9％的信号，之后开始疗法。随后的四个样品具有0.08％、0.83％、0.17％和0.04％的值。治疗终止后，观察到的尿液cfDNA中的BRAFV600E突变的水平保持低水平。
在图4中示出了结肠直肠癌患者的结果。在患者的初始样品中观察到1.49％的信号，之后开始疗法。随后的四个样品具有0.09％、0.00％、0.00％和0.00％的值。治疗终止后，观察到的尿液cfDNA中的BRAFV600E突变的水平保持低水平，并且随后开始升高。
在图5中示出了阑尾癌患者的结果。在患者的初始样品中观察到3.43％的信号，该信号与疗法同时出现。随后的两个样品具有0.45％和0.02％的值。
在患有转移性非小细胞肺癌的第四名和第五名患者中，在一名患者的治疗期间观察到对BRAF抑制剂的抗性(图6)。在尿液cfDNA中BRAFV600E突变的升高与未受治疗的患者的BRAFV600E突变的升高类似(图7)。
总而言之，在32名转移性癌症患者中的17名中的BRAFV600E的纵向分析通过测试连续收集的尿液进行。在17名晚期癌症患者中的13名(76％)中，尿液无细胞BRAFV600E的动力学与对疗法的响应性(或无响应)相关联。
实施例4.监测BRAFV600E突变的存在与治疗响应
在17名对于尿液中的BRAFV600EcfDNA为阳性的转移性癌症患者中的15名中，随时间评价尿液中的BRAFV600EcfDNA(或ctDNA，循环肿瘤DNA)，以监测疾病进展和/或对疗法的响应性。如在图9中所显示的，所述监测具有追踪具有可检测的BRAFV600EcfDNA或ctDNA的转移性癌症患者中的靶向疗法的治疗效果的临床用途。
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US专利8623603。
US专利申请公开US2010/0068711。
US临时专利申请号62/039905。
综上所述，将看出本发明的多个目标被实现并获得了其他的优势。
由于对于以上方法和组合物可以进行多种变化而不背离本发明的范围，因此意图在以上说明中包含的和在附图中显示的所有事物应被解释为示例性的而非限制性意义的。
本说明书中引用的全部参考文献以引用的方式特此并入。本文中对参考文献的讨论仅意图概括作者做出的主张，而非承认任何参考文献构成现有技术。申请人保留质疑所引用的参考文献的准确性和相关性的权利。

Claims (24)

1.一种随时间监测患者中的与癌症相关的基因突变的方法，所述方法包括
(a)从所述患者获得体液的样品；
(b)定量或半定量地确定所述样品中的无细胞DNA(cfDNA)中突变的量；和
(c)在较后的时间重复(a)和(b)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液是血清或血浆。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液是尿液。
4.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述突变位于APC、BRAF、CDK4、CTNNB1、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER3、PDGFR1、PDGFR2、AKT1、雌激素受体、雄激素受体、EZH2、FLT3、HER2、IDH1、IDH2、JAK2、KIT、KRAS、c-Myc、NOTCH1、NRAS、PIK3CA、PTEN、p53、pl6或Rbl基因中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述突变是BRAFV600E或KRAS突变G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V或G13D。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中测试包括测序。
7.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中测试包括聚合酶链式反应(PCR)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述PCR是液滴数字PCR。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述PCR扩增少于约50个核苷酸的序列。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述PCR使用抑制野生型形式的基因的扩增的阻断寡核苷酸来进行。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过检查来自健康受试者或具有野生型状态的靶基因的患病受试者的体液样品建立对于所述突变的无检出指定阈值。
12.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中重复(a)和(b)至少两次。
13.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述患者之前未经受过针对所述突变的测试。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述患者正经受使用靶向具有所述突变的基因的产物的药物的治疗。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述患者正经受使用不靶向具有所述突变的基因的产物的药物的治疗。
16.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述突变的量被定量地确定。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述突变的量被半定量地确定。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法还包括比较所确定的突变的量与肿瘤负荷。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在监测所述突变的任何时间，不将所确定的突变的量与肿瘤负荷比较。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述肿瘤负荷通过射线照相术、计算机断层成像(CT)扫描、正电子发射断层成像(PET)或PET/CT扫描来评价。
21.一种为受试者选择和/或应用治疗或疗法的方法，所述方法包括根据权利要求1-20中任一项监测基因突变；和基于所述检测选择和/或应用治疗或疗法。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述监测鉴定对治疗或疗法的低响应性或无响应性，并且所述选择和/或应用包括不同的治疗或疗法。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述监测鉴定有效的治疗或疗法，并且所述选择和/或应用包括继续相同的治疗或疗法。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述监测鉴定所述突变的消除，并且所述选择和/或应用包括中止治疗。
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