CN110129438A - 一种用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒，属于分子生物学与生物医药技术领域。所述遗传分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在其第501位存在单核苷酸多态性：C>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基C和碱基T两种情况。本发明提供的试剂盒含有基于NANOG基因的单核苷酸多态性遗传分子标记设计的两对特异性PCR引物，遗传分子标记与罹患子宫内膜癌易感性密切关联，利用PCR技术可以有效检测NANOG基因中的单核苷酸多态性，进而预测子宫内膜癌的易感性，这对于子宫内膜癌易感人群的筛选和高危个体的检测，对子宫内膜癌进行早期预测、早期诊断和个性化治疗具有重要的临床意义。

Description

一种用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种基于NANOG基因的SNP位点检测子宫内膜癌易感性的试剂盒。

背景技术

子宫内膜癌是世界上最常见的妇科肿瘤之一。在过去的几十年里，它的发病率一直在上升，并且有年轻化的趋势，特别是在发达国家。近年来，随着全球肥胖率的增加，中国的子宫内膜癌发病率也有所上升，2015年新确诊病例达到了63400例。根据FIGO 2009分类，80％的子宫内膜癌确诊时为临床Ⅰ-Ⅱ期，I期5年生存率为89.6％，II期下降为78.3％，III期为61.9％，Ⅳ期为21.1％。虽然早期诊断的子宫内膜癌可以通过手术加辅助放疗或化疗得以治愈，但仍有约15％的患者会复发进展。

由于发病机制复杂，子宫内膜癌的病因尚不清楚。环境因素，包括激素暴露和肥胖、异常错配修复(MMR)系统、遗传异常以及DNA和microRNA的异常甲基化，目前被认为是子宫内膜癌发生的主要机制。文献报道PTEN、β-catenin和K-ras等基因在子宫内膜癌细胞中存在基因突变，另有文献报道，个体遗传背景不同在子宫内膜癌的发病中也起着重要作用，但目前对子宫内膜癌遗传背景的研究还不够全面，不能完全解释子宫内膜癌的易感性和遗传背景之间的关系。因此，需要更为广泛的遗传背景研究，对潜在的相关基因单核苷酸多态性的鉴定有助于我们进一步全面理解子宫内膜癌的发生、发展和预后。对子宫内膜癌的早期预警和早期防治具有重要的临床应用价值，同时可以更好的用遗传分子标记对疾病进行有效监控。

Nanog是在胚胎干细胞中首次发现的一种分化同源盒结构域蛋白，在细胞自我更新和多潜能的转录调控中具有重要功能，在多能干细胞中高度表达，细胞走向分化后表达下降。虽然在正常的体细胞中表达是沉默的，但在多种类型的人类肿瘤细胞中，包括脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌和卵巢癌等细胞中均存在NANOG基因的异常表达，并且NANOG基因的表达与肿瘤进展、耐药复发和远处转移有关。但这些研究均只停留在蛋白表达层面没有在DNA水平的遗传背景水平进行检测，而蛋白水平变化往往是细胞恶性转化后的结果，属于分子水平上的晚期事件，无法在疾病的发生阶段甚至在发生前进行检测和预警。但这提示我们如果对NANOG基因进行DNA水平遗传背景检测可能发现肿瘤早期预测的遗传分子标记。

发明内容

本发明旨在提供一种子宫内膜癌易感相关遗传分子标记，并以此开发用于检测子宫内膜癌易感性的试剂盒和检测方法，为发现子宫内膜癌易感人群和子宫内膜癌易感个体进行有效的早期诊断和个性化治疗提供有效而敏感的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种基于NANOG基因单核苷酸多态性位点的遗传分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1(rs4438116)所示，在第501位存在单核苷酸多态性：C>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基C和碱基T两种状态，相应基因型存在CC、CT和TT三种型别。

当表现为碱基C时是正常的NANOG基因遗传状态，当表现为碱基T时是子宫内膜癌高危易感的NANOG基因遗传状态。

本发明在对大量候选基因的单核苷酸多态性位点在子宫内膜癌外周血样本中进行了检测和分析的基础上，首次发现了NANOG基因特定位点和子宫内膜癌易感性相关，研究结果表明SEQ ID NO.1(rs4438116)中的501C>T和子宫内膜癌的致病性存在显著相关，表现为501TT纯合子基因型个体罹患子宫内膜癌的可能性明显提高，因此可以作为子宫内膜癌易感性检测和早期诊断的遗传标记。

本发明提供了所述的遗传分子标记作为检测靶点在制备检测子宫内膜癌易感性的试剂盒中的应用。

作为上述遗传标记的应用，本发明提供了一种用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒，所述试剂盒包含：用于检测所述的NANOG基因单核苷酸多态性遗传分子标记第501位SNP位点的特异性PCR引物。

针对上述NANOG基因特定位点的单核苷酸多态性，本发明设计并合成了两条特异性PCR上游引物和一条特异性PCR下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的C、T碱基序列，分别和下游引物作PCR特异性扩增，扩增产物长度为224bp，根据相应配对引物PCR扩增的阳性条带判断对应位点的基因型是纯合子亦或杂合子。

同时为了提高碱基检测的特异性，把上游引物的3’端倒数第2个碱基设计为与互补链相同的碱基，而不是互补的碱基，使得更好地避免非特异性PCR扩增条带的出现，保证了检测的高度特异性。

具体地，所述PCR上下游引物序列为：

上游引物1:5’-AGAGACAGAAATACCTCACC-3’(SEQ ID NO.2)；

上游引物2:5’-AGAGACAGAAATACCTCACT-3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物:5’-GGAAGTTACAAAAGCATTTC-3’(SEQ ID NO.4)。

所述试剂盒还包含PCR反应液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTP混合液和TaqDNA聚合酶。PCR反应液中各组分的剂量按照常规PCR条件下的比例配比，对所属领域技术人员是常规知识。

所述试剂盒还包括阳性对照Ⅰ和阳性对照Ⅱ，所述阳性对照Ⅰ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的基因片段；所述阳性对照Ⅱ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段。

作为上述试剂盒的应用，本发明还提供了一种检测体外DNA样本是否存在NANOG基因特定位点单核苷酸多态性的方法，具体步骤如下：

(1)提取外周血细胞中的基因组DNA作模板，利用NANOG基因特异性上下游引物进行PCR扩增，得到扩增产物，所述NANOG基因特异性引物为两对，其核苷酸序列分别为SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

(2)用凝胶电泳对PCR扩增产物进行电泳，根据阳性条带情况判断NANOG基因特定位点是否存在单核苷酸多态性：501C>T，多态性位置序号基于SEQ ID NO.1碱基序列，从而确定外周血样本中的NANOG基因特定位点是否存在单核苷酸多态性。

利用本发明提供的检测试剂盒对子宫内膜癌易感个体进行罹患风险评估和预测时，与正常的NANOG基因碱基序列进行比对，如存在如上所述差异，即存在单核苷酸多态性：501C>T，则说明该个体罹患子宫内膜癌的风险高于正常人群。

本发明具备的有益效果：

本发明提供了一种用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒，试剂盒中包括基于遗传分子标记设计的两对特异性PCR引物，该遗传分子标记与子宫内膜癌易感性显著相关，利用PCR扩增技术可以高效特异检测NANOG基因特定位点的单核苷酸多态性，该方法技术简捷、检测特异性及性价比高，无需特殊的DNA测序设备，便于在基层医院开展工作，这对于子宫内膜癌易感人群的监测，对子宫内膜癌进行早期预警、早期诊断和临床早期治疗具有重要的意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详尽说明。以下的实施例中采用的方法目的是更好地理解本发明，但并不限于本发明。

如无特殊说明，实施例中涉及的实验方法均为实验室常规方法，所用的实验试剂均为可在常规试剂公司购买获得。

实施例1.NANOG基因单核苷酸多态性检测和子宫内膜癌易感性的关联分析

1.1研究对象

病例选取时间为2010年8月到2012年12月，来自浙江大学医学院附属妇产科医院病理诊断明确的病例，随机选取子宫内膜癌病例272例，同时选取同时期346例正常体检的女性志愿者作正常对照，正常对照的入选标准为无其它妇科肿瘤、无任何其他实体癌和无任何免疫性疾病。所有病例和正常对照个体均为汉族居民。所有受试人员均按照浙江大学医学院附属妇产科医院伦理委员会要求征得同意，所有的研究方法均遵循了批准的指导方针和条例。

抽取患者和正常志愿者外周抗凝血2ml左右，于-80℃冷冻保存待用。

1.2抽提外周血细胞基因组DNA

对100μL外周血进行基因组DNA抽提和纯化(上海生工生物工程有限公司的全血细胞抽提试剂盒)，按照试剂盒的步骤说明进行抽提，所获基因组DNA溶解于去离子水后低温冷冻保存以备后续PCR检测使用。

1.3 PCR反应液组成、特异性上下游引物和PCR条件

从GenBank的单核苷酸多态性(SNP)库下载NANOG基因的碱基序列(rs4438116)，并使用网上在线设计软件Primer-BLAST进行引物设计，同时为进一步提高单碱基检测的特异性，根据我们自己的设计原则和经验对上游引物3’端倒数第二位的碱基改为与互补链相同的碱基，最终确定我们自己设计的上游引物，具体引物碱基序列见表1。

表1 NANOG单核苷酸多态性PCR检测用上下游引物和产物长度

PCR反应液组成：共20μL总体积，内含：1.0U Taq DNA polymerase，0.25mM dNTP，上下游引物各5.0pmol，10ng基因组DNA，PCR缓冲液。

PCR扩增反应条件：94℃5分钟，(94℃30秒，56.5℃25秒，72℃30秒)×40个循环，72℃延伸6分钟，10℃保温，产物长度为224bp。

PCR扩增产物检测：用2.0％琼脂糖凝胶对10μLPCR扩增产物进行电泳分离，50V电压电泳25分钟，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物配对的PCR产物电泳条带分析NANOG基因501位点(位置序号基于SEQ ID NO.1序列)的核苷酸多态性情况。

经结果收集和统计学分析，我们发现在所试样本中存在501C>T这样的单核苷酸多态性，基因型表现为CC纯合子、CT杂合子和TT纯合子三种型别。

1.4 NANOG基因单核苷酸多态性基因型和子宫内膜癌的关联分析

以正常对照组为参考进行疾病易感性相关分析。对NANOG基因特定位点(rs4438116)单核苷酸多态性的基因型与子宫内膜癌罹患风险进行相关性分析，通过二元logistic回归分析得到比值比(Odds ratio,OR)、95％置信区间(confidence interval,CI)和P值。所有统计均为双侧显著性检验，显著性水平设为P值小于或等于0.05。所有统计分析均采用SPSS18.0软件(SPSS Inc.Chicago,USA)。

结果发现SEQ ID NO.1(rs4438116)中的501C>T和罹患子宫内膜癌存在显著相关性，501TT纯合子明显提高了个体罹患子宫内膜癌的风险，OR值达到了3.18(1.70-5.96)；501T等位基因频率风险值OR达到了1.70(1.29-2.23)，明显高于正常对照组。具体数据见表2。

表2.NANOG基因碱基变异关联分析及罹患子宫内膜癌的风险

实施例2.NANOG基因单核苷酸多态性和子宫内膜癌易感性检测试剂盒

1、基于实施例1的分析结果，我们发现SEQ ID NO.1(rs4438116)中的501C>T的碱基变异与罹患子宫内膜癌存在显著相关，因此我们设计了用于对NANOG基因特定位点(rs4438116)单核苷酸多态性进行检测的特异性PCR上下游引物，最终设计了对子宫内膜癌易感人群的外周血DNA模板进行检测的试剂盒。

2、制备专用试剂盒(100tests)，具体试剂组成见表3，如下：

表3.遗传分子标记位点检测试剂盒试剂成分组成

3、外周血细胞基因组DNA抽提：抽取受试者外周血1mL，采用常规酚氯仿抽提法，或者第三方外周全血细胞基因组DNA抽提试剂盒，抽提得到的基因组DNA溶解于去离子水，低温保存待集中标本检测时使用。

4、单个检测PCR试剂配方，具体见表4：

表4

10×PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>25mM)	2μL
		dNTP Mixture(各2.5mM)	8μL
Taq DNA polymerase(5U/μL)	0.2μL
		上游引物(100pmol)	1μL(1,2中任选一)
下游引物(100pmol)	1μL
		总体积	20μL

5、PCR扩增反应条件：

PCR反应液组成：共20μL总体积，内含：1.0U Taq DNA polymerase，0.25mM dNTP，上下游引物各5.0pmol，10ng基因组DNA，PCR缓冲液。

PCR扩增反应条件：94℃5分钟,(94℃30秒，56.5℃25秒,72℃30秒)×40个循环，72℃延伸6分钟，10℃保温，产物长度为224bp。

6、PCR扩增产物观察：10μLPCR扩增产物加入2.0％琼脂糖凝胶进行电泳分离，50V电压电泳20分钟，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察阳性条带。根据不同引物配对的PCR产物阳性条带分析NANOG基因501位点(位置序号基于SEQ ID NO.1序列)的单核苷酸多态性情况。

与正常的NANOG基因碱基序列进行比较，存在差异即表明该个体罹患子宫内膜癌的风险高于正常人群。所述差异即存在单核苷酸多态性：501C>T。

申请人声明：在阅读本发明的上述内容之后，在具体实行检测时，对本发明做各种改动或者修整，如为本发明的等价形式替换同样落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<221> variation

<222> (501)..(501)

<223> n is c or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (501)..(501)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

tcctaatttt aaaaaaaagg ggtagcgccg ctcagcaatg cattggccac cattatagat 60

ctctcccaac gcagtctatt atgtacaaaa tggagatact gataagactt cttggagtaa 120

tactatataa agcttgccaa agtgccaggg ctgcttaaga aattgcttct tattacttag 180

atctggggtt ctgggaatta tcaaagtact ttgaaaacaa tttttttaaa ggatatttta 240

atatttgaaa aattttagac aaaagtgtcc ttttatttgt tcccaacagt ctctcctctt 300

ccttcctcca tggatctgct tattcaggac agccctgatt cttccaccag tcccaaaggc 360

aaacaaccca cttctgcaga gaagagtgtc gcaaaaaagg aagacaaggt cccggtcaag 420

aaacagaaga ccagaactgt gttctcttcc acccagctgt gtgtactcaa tgatagattt 480

cagagacaga aatacctcag nctccagcag atgcaagaac tctccaacat cctgaacctc 540

agctacaaac aggtaggctt gttttgtcct tggaataagg tgaacaaaaa ttggactaat 600

ttgcatggct aagacctctg tggatgcatg tagatgtgtg tactatgtgt ccgtacatcg 660

cctcttgcaa ataatttatg aagatgaaat gcttttgtaa cttccttcac ctctttcttt 720

ccttaaatat tctattatgt gaataattat gtcataattt aaccactttc ttgcacagac 780

caatattgtg aaaatctttc caacgtttcc ttaataaaaa agaagtatct aactccactt 840

accagggtag gagaaaccct aactcacact ggttctcatt aaaataaaaa cttttttttt 900

cctttttttc tttctgccag caactccagc ttgttttgtt ttttatctgt gtgcattcaa 960

taaggccaat cattgtttat tacttgttgg ccattttcct t 1001

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagacagaa atacctcacc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagacagaa atacctcact 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaagttaca aaagcatttc 20

<210> 5

<211> 224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagacagaa atacctcagc ctccagcaga tgcaagaact ctccaacatc ctgaacctca 60

gctacaaaca ggtaggcttg ttttgtcctt ggaataaggt gaacaaaaat tggactaatt 120

tgcatggcta agacctctgt ggatgcatgt agatgtgtgt actatgtgtc cgtacatcgc 180

ctcttgcaaa taatttatga agatgaaatg cttttgtaac ttcc 224

<210> 6

<211> 224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagacagaa atacctcagt ctccagcaga tgcaagaact ctccaacatc ctgaacctca 60

gctacaaaca ggtaggcttg ttttgtcctt ggaataaggt gaacaaaaat tggactaatt 120

tgcatggcta agacctctgt ggatgcatgt agatgtgtgt actatgtgtc cgtacatcgc 180

ctcttgcaaa taatttatga agatgaaatg cttttgtaac ttcc 224

Claims (6)

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的NANOG基因单核苷酸多态性遗传分子标记作为检测靶点在制备检测子宫内膜癌易感性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述遗传分子标记的第501位存在单核苷酸多态性：C>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基C和碱基T两种情况，相应基因型存在CC、CT和TT三种型别。

2.一种用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒，其特征在于，包括：用于检测如权利要求1所述的NANOG基因单核苷酸多态性遗传分子标记第501位SNP位点的特异性PCR引物。

3.如权利要求2所述的用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒，其特征在于，所述特异性PCR引物为两对，其中一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；另一个引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求2所述的用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶和dNTP混合液。

5.如权利要求2所述的用于检测子宫内膜癌易感相关遗传分子标记的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照Ⅰ和阳性对照Ⅱ，所述阳性对照Ⅰ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的基因片段；所述阳性对照Ⅱ含有核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段。

6.一种检测体外样本是否存在NANOG基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取外周血细胞的基因组DNA作模板，利用NANOG基因特异性上下游引物进行PCR扩增得到PCR产物，所述NANOG基因特异性引物为两对，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

(2)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，根据阳性条带情况判断NANOG基因是否存在以下的单核苷酸多态性：501C>T，变异位置序号基于SEQ ID NO.1序列，进而确定外周血样本的NANOG基因特定位点是否存在单核苷酸多态性。