CN111088359A - Setd8基因在制备诊断宫颈癌的产品以及治疗宫颈癌的药物中的应用 - Google Patents

Setd8基因在制备诊断宫颈癌的产品以及治疗宫颈癌的药物中的应用 Download PDF

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张庆华
刘婷
王鑫
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    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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Abstract

本发明提供检测SETD8基因突变的试剂在制备宫颈癌的诊断工具中的应用。还提供了一种SETD8基因突变类型，所述突变类型为在SETD8基因的外显子Exon2、Exon3、Exon4或Exon7中的至少一种发生基因突变。本发明首次发现并证实SETD8基因突变类型与宫颈癌发生的密切相关性，并且通过高通量分析获得该基因6种不同的突变类型，并针对这6种突变类型设计了特异性引物，用于确诊宫颈癌，并经试验验证检测结果准确。

Description

SETD8基因在制备诊断宫颈癌的产品以及治疗宫颈癌的药物 中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，更具体地，本发明涉及SETD8基因在制备诊断宫颈癌的产品以及治疗宫颈癌的药物中的应用。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，在女性生殖器官肿瘤中占首位。根据世界卫生组织2014年统计数据，宫颈癌的年新发病例约为52.8万例，年死亡例数约为26.6万例，其中85％的患者均发生在在发展中国家，且农村高于城市。我国是宫颈癌发病的大国，根据国家肿瘤中心公布的最新癌症统计数据，2015年我国的宫颈癌新发病例约为9.89万例，年死亡例数约为3.05万例，并且该数据呈现逐年上升且发病年轻化的趋势。宫颈癌的发生与多种因素密切相关，如早婚、早育、多产及性生活紊乱等，但人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染被认为是宫颈癌发病的必要条件，99.7％的宫颈癌患者HPV筛查呈阳性，且HPV持续感染患者罹患宫颈癌的风险是HPV阴性者的250多倍。
我国采用的是以宫颈液基细胞学为主要内容的宫颈癌筛查策略，同时局部采用HPV-DNA+细胞学联合筛查。我国尚未建立完善的国家筛查体系，而且由于筛查的不平衡性(地域经济、医疗资源、公众认知等影响因素)，导致目前筛查缺乏与筛查过度并存、不规范治疗与过度治疗并存。宫颈液基细胞学存在1、单一应用敏感性不高(约为50％-85％)；2、ASCUS及LSIL的特异性不高；3、取材、制片、阅片水平的参差不齐，缺乏规范化的质量控制等缺陷。因此单一依赖细胞学检查容易造成假阴性，漏检率高。HPV-DNA检测能够显著提高灵敏度，但往往可能检出一过性HPV感染，而不是具有致病性高危型HPV持续感染。因此单一依靠HPV筛查，会造成过度诊断和过度治。
目前虽然己有多种肿瘤标志物用于临床宫颈癌的诊断，但是己有肿瘤标志物因在正常情况下组成性表达、或在非恶性肿瘤疾病中水平也升高，缺乏肿瘤特异性。因此，亟待寻找肿瘤特异性抗原作为生物标志，用于临床宫颈癌的早期诊断和预后判定。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供检测SETD8基因突变的试剂在制备宫颈癌的诊断工具中的应用。
SETD8(又称PR-SET7、KMT5A)是目前发现的一个唯一能够特异性单甲基化组蛋白H4赖氨酸20位(histone H4 lysine20，H4K20)的赖氨酸甲基转移酶，在2002年从HeLa细胞中提纯并克隆。发明人发现SETD8的突变率显著高于FBXW7(7％)，TP53(5％)，NFE2L2(5％)等肿瘤常见突变位点，并且这一特征与Ojesina外显子测序发现的宫颈癌高频突变的基因结果FBXW7(15％)，NFE2L2(4％)，TP53(5％)，和ERBB2(6％)以及2017年TCGA报道的新突变基因SHKBP1，ERBB3，CASP8，HLA-A，TGFBR2有明显区别。这一发现提示SETD8高频突变是汉族人群宫颈癌特有的基因突变特征，为我们探索符合中国人群的宫颈癌靶向治疗提供了新的研究方向。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
检测SETD8基因突变的试剂在制备宫颈癌的诊断工具中的应用。本发明通过针对SETD8基因不同突变类型设计特异性引物用于确诊宫颈癌。
作为上述方案的进一步改进，用于检测SETD8基因突变的引物其核苷酸序列如SEQID NO：1～12所示。其中，针对SETD8基因突变类型：exon2:c.42_47del设计的引物其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示，SEQ ID NO：1为上游引物，SEQ ID NO：2为下游引物；针对SETD8基因突变类型：exon3:c.289_290insAGAAAA和exon3:c.289+2T>A设计的引物其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示，SEQ ID NO：3为上游引物，SEQ ID NO：4为下游引物；针对SETD8基因突变类型：exon4:c.C456T设计的引物其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示，SEQID NO：5为上游引物，SEQ ID NO：6为下游引物；针对SETD8基因突变类型：exon7:c.G713C和exon7:c.C772T设计的引物其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示，SEQ ID NO：7为上游引物，SEQ ID NO：8为下游引物。
本发明还提供了一种SETD8基因突变类型，所述类型包括在SETD8基因的外显子Exon2、Exon3、Exon4或Exon7中的至少一种发生基因突变。
进一步地，所述突变类型在外显子Exon2中的第42～47位的碱基被删除；该突变类型的蛋白的第14～16位的氨基酸序列被删除。
进一步地，所述突变类型在外显子Exon3中的第289～290位置的碱基被AGAAAA替换；该突变类型的蛋白的第97位的谷氨酸E被EKK替换。
进一步地，所述突变类型在外显子Exon3中的第289位置的碱基T突变为A。
进一步地，所述突变类型在外显子Exon4中的第456位置的碱基C突变为T；该突变类型的蛋白的第152位的异亮氨酸I被异亮氨酸I替换。
进一步地，所述突变类型在外显子Exon7中的第713位置的碱基G突变为C；该突变类型的蛋白的第238位的精氨酸R被脯氨酸P替换。
进一步地，所述突变类型在外显子Exon7中的第772位置的碱基C突变为T；该突变类型的蛋白的第258位的精氨酸R被色氨酸W替换。
本发明还提供了上述的基因突变类型在制备诊断宫颈癌试剂中的应用，进一步地，所述诊断宫颈癌试剂包括检测SETD8基因突变类型的引物。
本发明的有益效果：本发明首次发现并证实SETD8基因突变类型与宫颈癌发生的密切相关性，并且通过高通量分析获得该基因6种不同的突变类型，并针对这6种突变类型设计了特异性引物，用于确诊宫颈癌，并经试验验证检测结果准确。
附图说明
图1为实施例2电泳结果图，其中：
1表示SETD8:NM_020382:exon2:c.42_47del:p.14_16del；
2表示SETD8:NM_020382:exon3:c.289_290insAGAAAA:p.E97delinsEKK；
3表示SETD8:NM_020382:exon3:c.289+2T>A；
4表示SETD8:NM_020382:exon4:c.C456T:p.I152I；
5表示SETD8:NM_020382:exon7:c.G713C:p.R238P；
6表示SETD8:NM_020382:exon7:c.C772T:p.R258W。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1获得SETD8基因的突变类型
通过全外显子测序(whole exome sequencing，WES)技术对156例宫颈癌组织标本提取RNA，进行鉴定以及突变分析，首次在宫颈癌汉族人群中发现新的高频突变基因SETD8基因。SETD8基因的登录号为Gene ID:387893；Location:NC_000012.12(123384132-123409353).>NC_000012.12:123384132-123409353Homo sapiens chromosome 12,GRCh38.p13 Primary Assembly。该基因在宫颈癌患者中的突变率为11.5％(18/156)，统计突变类型共发现9种突变体，其中3种为已知突变体，有6种是发明人新发现的突变类型，具体信息如下：
exon2:c.42_47del:p.14_16del；
exon3:c.289_290insAGAAAA:p.E97delinsEKK；
exon3:c.289+2T>A；
exon4:c.C456T:p.I152I；
exon7:c.G713C:p.R238P；
exon7:c.C772T:p.R258W；
其中exon7:c.G713C:p.R238P突变为最主要突变类型(39％)。
实施例2验证本发明的突变类型对宫颈癌确诊的效果
根据实施例1获得的SETD8基因不同的突变类型设计引物，具体信息如下表：
Figure BDA0002372103400000051
按照实施例1的标准收集宫颈癌组织和相应的正常对照组织，采用上表中的引物进行PCR扩增，扩增体系如下表：
Figure BDA0002372103400000052
Figure BDA0002372103400000061
PCR反应程序：94℃，5min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)×30个循环；72℃，5min。
将PCR扩增的产物进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示：宫颈癌组织中能检测出6条目的条带，分别针对每种突变类型均有目的条带出现，说明通过本发明的突变类型能检测出宫颈癌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120> SETD8基因在制备诊断宫颈癌的产品以及治疗宫颈癌的药物中的应用
<130> 1.7
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 合成
<400> 1
tccaggcagg aagatgtc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成
<400> 2
agtcaaactt ttccgaggt 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 合成
<400> 3
tcctcctcct cgtgaatgct 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成
<400> 4
agggaaaacc tgtcaaacca ac 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 合成
<400> 5
agctggtcgt ctggaaat 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 合成
<400> 6
ggaagaggac tgaatggg 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 合成
<400> 7
gatgagcacc aaggaacc 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成
<400> 8
gaaaagccac tctaagcaa 19

Claims (10)

1.检测SETD8基因突变的试剂在制备宫颈癌的诊断工具中的应用。
2.如权利1所述的应用，其特征在于，所述的检测SETD8基因突变的试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～8所示的引物。
3.一种SETD8基因突变类型，其特征在于，在SETD8基因的外显子Exon2、Exon3、Exon4或Exon7中的至少一种发生基因突变。
4.如权利要求3所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon2中的第42～47位的碱基被删除。
5.如权利要求3所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon3中的第289～290位置的碱基被AGAAAA替换。
6.如权利要求3所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon3中的第289位置的碱基T突变为A。
7.如权利要求3所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon4中的第456位置的碱基C突变为T。
8.如权利要求3所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon7中的第713位置的碱基G突变为C。
9.如权利要求3所述的基因突变类型，其特征在于，在外显子Exon7中的第772位置的碱基C突变为T。
10.如权利要求3～9任一项所述的基因突变类型在制备诊断宫颈癌试剂中的应用。
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