CN117230180A - 用于检测21处耳聋相关基因snp组合的引物组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
用于检测21处耳聋相关基因snp组合的引物组、试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组、试剂盒及其检测方法。本发明针对21个与耳聋高度相关的SNP位点设计由扩增引物和单碱基延伸引物组成的引物组,并提供了包含该引物组的试剂盒。引物组能同时对21个耳聋易感基因突变位点进行检测,分析人类遗传性耳聋特异性的SNP位点的基因型情况,具有高准确性、高灵敏度和重复性的优势。同时,还提供了利用引物组或试剂盒检测与耳聋相关基因SNP的检测方法,无需提取基因组DNA,在同一体系中同时检测21处耳聋相关基因SNP的基因型,克服了现有技术中单管反应检测SNP位点较少的问题。而且本发明通过多次引物序列优化,避免多对引物之间的相关干扰。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组、试剂盒及其检测方法,属于生物技术领域。
背景技术
耳聋是最常见的出生缺陷之一,我国新生儿中,严重听力障碍发生率为1%-3%。在所有的致聋因素中,遗传因素导致的耳聋约占60%左右。我国听力正常的人群中,耳聋基因携带者有7800万人,正常人群中有5%-6%携带耳聋基因突变。80%以上的聋儿是由听力正常的父母所生。其中至少有50%的学语前耳聋是由遗传因素导致的;由环境因素导致的耳聋约占25%,如:感染、耳毒性药物和外伤等;另外25%的耳聋病因不明,但可能有遗传因素,所以遗传因素是导致学语前耳聋的最主要的因素。遗传性耳聋中约70%为非综合征型,其余约30%为综合征型。学语前非综合征型耳聋中,常染色体隐性遗传方式占80%,常染色体显性遗传方式占15-20%,X染色体连锁遗传的占1%,线粒体遗传的约占1%。目前我国要求将耳聋等遗传性疾病列入出生缺陷综合防控方案,建立涵盖孕前、孕期和新生儿各阶段的出生缺陷防治,明确耳聋基因的突变类型,选择合适的耳聋基因检测方法对于明确耳聋的病因、预防及治疗等至关重要。
先天性耳聋是人类最常见的出生缺陷之一,是导致交流障碍最常见的疾病,在病因学上是由遗传和(或)环境因素导致的,其中50%-60%是由遗传因素引起的。遗传性耳聋可分为两类:一类为综合征型耳聋(Syndramic Hearing Impairment,SHI),即除听力障碍外,还伴有其他临床症状(如耳、头颅、视觉器官、皮肤、四肢骨骼系统等的先天性畸形);另一类为非综合征型耳聋(Non-Syndramic Hearing Impairment,NSHI),即听力障碍外不伴有其他临床症状。而所有的非综合征型耳聋几乎都符合孟德尔单基因遗传规律,而遗传学家估计约有700多个基因与遗传性耳聋相关,而每个基因又有散在的数目众多的突变位点,因而具有较高的基因和位点遗传异质性。国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明,突变较为高发的基因或DNA片段主要为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、以及线粒体DNA12S rRNA等。这为我们设计检测技术时基因及位点的选择提供了理论依据。
根据遗传方式,遗传性聋又分为常染色体显性、隐性遗传,X染色体连锁和线粒体母系遗传性聋。一般来说,常染色体显性遗传引起的耳聋大多是迟发、进行性和症状较轻的耳聋,而常染色体隐性遗传引起的具有发病早和病情重的特点。随着基因组计划的实施和完善,听觉基因的定位和克隆不断取得飞跃性进展。目前定位的非综合征型听力损失的基因座位已达137个,其中,常染色体显性遗传型基因座54个,常染色体隐性遗传型基因座67个,X染色体连锁基因座位7个,Y染色体连锁基因座1个。在这些基因座中,己克隆的基因有43个,包括常染色体显性遗传基因21个、隐性遗传性基因23个(其中6个基因既可见于隐性遗传又可见于显性遗传),X染色体连锁遗传1个,线粒体遗传4个。
研究表明,遗传性耳聋与其相关基因的SNP息息相关,因此,开展对遗传性耳聋相关基因SNP的检测对耳聋的分子流行病学研究和聋儿的提前筛查具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组,所述引物组特异性好、灵敏度高,能同时检测21处耳聋相关基因的SNP位点,覆盖的SNP位点广。
本发明的第二个目的是提供用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组在制备检测耳聋相关基因SNP的检测产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种包含用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组的试剂盒,该试剂盒能同时检测21处与耳聋相关基因的SNP位点,具有检测结果准确、操作简便,适合大规模高通量筛查等优点。
本发明的第四个目的是提供一种利用引物组或试剂盒检测与耳聋相关基因SNP的检测方法,本发明的检测方法无需提取受检者的基因组DNA,直接使用血样能在一个反应体系内对不同基因上的21处基因多态性位点同时进行检测,具有技术成本低、操作简便的优点。
为了实现上述目的,本发明中用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组的技术方案是:
用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组,所述引物组包括PCR扩增引物对和与引物对对应的延伸引物;
所述PCR扩增引物对包括核苷酸如SEQ ID NO:1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40和41-42所示的引物对;
与引物对对应的延伸引物包括:与核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40和41-42所示的引物对分别对应的核苷酸如SEQ ID NO:43-63所示的延伸引物。
上述方案的有益效果在于:本发明针对目前与耳聋高度相关的SNP位点设计PCR扩增引物及相对应的单碱基延伸引物,通过实验证明上述的引物组特异性好、灵敏度高,能同时检测21处耳聋相关基因SNP位点组合的基因型,为耳聋的分子流行病学研究和聋儿的提前筛查提供新的引物资源。
为了实现上述目的,本发明中用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组在制备检测耳聋相关基因SNP的试剂或试剂盒中的应用的技术方案是:
一种用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组在制备检测耳聋相关基因SNP的检测产品中的应用。
上述方案的有益效果在于:本发明通过实验证明引物组特异性好、灵敏度高,而且在同一反应体系内进行PCR扩增不存在互相干扰,且包含目前与耳聋高度相关的SNP位点,可应用于制备检测耳聋相关基因SNP的试剂或试剂盒,进行遗传性耳聋疾病相关的点突变、缺失突变及线粒体点突变等突变类型进行准确分型,实现对遗传性耳聋疾病快速有效的检测。
为了实现上述目的,本发明中一种包含用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组的试剂盒的技术方案是:
一种包含用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组的试剂盒。
上述方案的有益效果在于:本发明提供的试剂盒能同时检测21处耳聋相关基因SNP位点的基因型,具有检测结果准确、操作简便,适合大规模高通量筛查等优点,能对遗传性耳聋疾病相关的点突变、缺失突变及线粒体点突变等突变类型进行准确分型,为遗传性耳聋疾病快速有效的检测奠定基础。
为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果,优选地,SEQ ID NO:1-42的PCR扩增引物的5’端增加一定数目的碱基;进一步优选的,增加的碱基为10bp的tag,序列为ACGTTGGATG,例如,增加10bp的tag碱基后,SEQ ID NO:1所示的PCR扩增引物的核苷酸序列为5’-ACGTTGGATGACGTTGGATGTCCATAGCCTTGTGCTTGAC-3’。
作为进一步地改进,所述21个耳聋相关的基因SNP分别是:SLC26A4基因rs111033318(2027T>A位点)、SLC26A4基因rs786204601(1520delT位点)、GJB2基因rs773528125(508-511insAACG位点)、GJB3基因rs74315319rs74315318#1(538C>T,547G>A位点)、GJB2基因rs111033401(9G>A位点)、SLC26A4基因rs111033305rs111033220#1(1226G>A,1229C>T位点)、GJB2基因rs750188782rs80338942#2(176-191del16,167delT位点)、SLC26A4基因rs1562835480rs1562835515#1(1318A>T,1340del A位点)、SLC26A4基因rs111033305rs111033220#2(1226G>A,1229C>T位点)、SLC26A4基因rs1562835480rs1562835515#2(1318A>T,1340del A位点)、GJB2基因rs750188782rs80338942#1(176-191del16,167delT位点)、SLC26A4基因rs121908363rs121908362#1(2162C>T,2168A>G位点)、GJB2基因rs111033204(299-300delAT位点)、SLC26A4基因rs766206507(1673A>T位点)、SLC26A4基因rs1057516953(281C>T位点)、12S rRNA基因rs267606617(1555A>G位点)、GJB2基因rs80338948(427C>T位点)、GJB3基因rs74315319rs74315318#2(538C>T,547G>A位点)、SLC26A4基因rs121908363rs121908362#2(2162C>T,2168A>G)、SLC26A4基因rs111033380(589G>A位点)和SLC26A4基因rs111033313(IVS7-2 A>G位点)。
上述方案的有益效果在于:上述SNP位点与耳聋高度相关,且覆盖全面,对受检者进行上述SNP位点组合进行分型检测,能极大程度的为受检者提供健康信息,且检测结果结合其他临床指标,可为临床医师合理制定临床治疗方案提供参考,避免不良反应。
作为进一步地改进,所述试剂盒包括PCR反应试剂、PCR产物纯化试剂和单碱基延伸反应试剂。
上述方案的有益效果在于:本发明试剂盒中提供的试剂包括完成多重PCR、产物纯化和单碱基延伸反应的试剂,与引物组配合使用,能快速、准确地完成SNP位点的分型检测,且试剂盒成分简单,能有效降低生产成本。
优选地,所述试剂盒包括:
(1)用于PCR的反应试剂,包括:特异性PCR引物,耐高温的DNA聚合酶,dNTPs,PCR反应缓冲液;
(2)用于PCR产物纯化的试剂;
(3)用于单碱基延伸反应的试剂,包括:延伸引物,耐高温的单碱基延伸酶,ddNTPs,延伸反应缓冲液。
为了提高检测结果的可信度并方便使用者的检测,进一步优选地,所述试剂盒还包括:阴性质控品,阳性质控品,纯化用树脂,点样及质谱检测用靶片,外切酶等试剂。
作为进一步地改进,所述PCR产物纯化试剂包括碱性磷酸酶、碱性磷酸酶和外切酶ExoI、电泳凝胶回收试剂或PCR产物纯化柱中的任一种。
上述方案的有益效果在于:本发明试剂盒中的纯化试剂有多种选择,可以根据使用者的具体检测条件进行定制,能满足不同客户的需求,扩大了试剂盒的适用范围。
具体地,当纯化试剂为碱性磷酸酶和外切酶ExoI时,所使用的PCR扩增引物无需包括保护碱基。
为了实现上述目的,本发明中一种利用引物组或试剂盒检测与耳聋相关基因SNP的检测方法的技术方案是:
一种利用引物组或试剂盒检测与耳聋相关基因SNP的检测方法,包括如下步骤:
(1)多重PCR扩增:在一个反应体系中使用PCR扩增引物对待测样本进行PCR扩增;
(2)单碱基延伸反应:在一个反应体系中使用延伸引物对步骤(1)PCR扩增的产物进行单碱基延伸反应;
(3)质谱仪检测:对步骤(2)单碱基延伸反应的产物纯化后进行质谱仪检测,根据延伸产物的分子量的差异,判断SNP位点的基因型。
上述方案的有益效果在于:本发明提供的检测方法利用上述试剂盒或检测引物,能快速有效地同时对21处耳聋相关基因SNP位点进行分型检测。检测方法无需提取受检者基因组DNA的过程,直接以血样为模板,简化了实验流程,提高了检测的效率。同时克服了现有技术中单管反应检测SNP位点较少的缺陷,通过多次引物序列优化,避免多对引物之间的相关干扰,进一步提高了检测的效率,也为受检者提供了更全面的信息。
具体地,本发明检测方法的原理在于:
(1)在多重PCR步骤中,通过设计并使用合适的引物,能同时扩增多达21个SNP位点所在DNA片段,且引物之间不存在相互干扰的现象。
(2)在单碱基延伸步骤中,对上一步多重PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中,延伸引物共21条,分别与21个SNP位点对应,并在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸,该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对(如某SNP位点处是A基因型,将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸)。在单碱基延伸步骤中,采用ddNTP代替dNTP,因此,在延伸一个碱基后,延伸引物将终止延伸。
(3)在质谱检测过程中,单碱基延伸产物在纯化后,点至含基质的靶片,并在真空环境中被激光激发,通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关,即分子量越大,飞行速度越慢,到达检测器的时间越晚。
作为进一步地改进,步骤(1)中包括对PCR扩增的产物进行纯化。
上述方案的有益效果在于:在多重PCR反应完成后对产物进行纯化,能有效降低体系中残余的dNTP等物质对下一步单碱基延伸反应的影响,提高整体的检测灵敏度。
作为进一步地改进,所述延伸产物的分子量如下:
上述方案的有益效果在于:根据上述标准能有效的区分待测SNP位点的基因型。
本发明的有益效果为:
1、本发明提供的用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组,检测灵敏度高、特异性好,由其制备的试剂盒,能够同时检测21处耳聋相关基因SNP位点的基因型,能更加全面地了解受检者与耳聋高度相关的SNP位点的基因型,从而更了解自身的健康状况。
2、本发明提供的检测方法综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体,既可通过PCR技术放大检测模板,又可通过质谱技术检测微量样本,综合了两种技术的优点,远远优于单独使用PCR检测多态性SNP,检测灵敏度更高、特异性好、假阳性低,且错概率更低。同时检测方法中直接使用受试者血液样本为PCR扩增模板,不需要提取DNA,速度快、效率高,而且操作简单、安全、自动化程度高、污染几率小,适合大规模、高通量检测。
附图说明
图1为本发明实施例3中rs111033318位点的阴性对照质谱图;
图2为本发明实施例3中rs786204601位点的阴性对照质谱图;
图3为本发明实施例3中rs773528125位点的阴性对照质谱图;
图4为本发明实施例3中rs74315319rs74315318#1位点的阴性对照质谱图;
图5为本发明实施例3中rs111033401位点的阴性对照质谱图;
图6为本发明实施例3中rs111033305rs111033220#1位点的阴性对照质谱图;
图7为本发明实施例3中rs750188782rs80338942#2位点的阴性对照质谱图;
图8为本发明实施例3中rs1562835480rs1562835515#1位点的阴性对照质谱图;
图9为本发明实施例3中rs111033305rs111033220#2位点的阴性对照质谱图;
图10为本发明实施例3中rs1562835480rs1562835515#2位点的阴性对照质谱图;
图11为本发明实施例3中rs750188782rs80338942#1位点的阴性对照质谱图;
图12为本发明实施例3中rs121908363rs121908362#1位点的阴性对照质谱图;
图13为本发明实施例3中rs111033204位点的阴性对照质谱图;
图14为本发明实施例3中rs766206507位点的阴性对照质谱图;
图15为本发明实施例3中rs1057516953位点的阴性对照质谱图;
图16为本发明实施例3中rs267606617位点的阴性对照质谱图;
图17为本发明实施例3中rs80338948位点的阴性对照质谱图;
图18为本发明实施例3中rs74315319rs74315318#2位点的阴性对照质谱图;
图19为本发明实施例3中rs121908363rs121908362#2位点的阴性对照质谱图;
图20为本发明实施例3中rs111033380位点的阴性对照质谱图;
图21为本发明实施例3中rs111033313位点的阴性对照质谱图;
图22为本发明实施例3中rs111033318位点的阳性质谱图;
图23为本发明实施例3中rs786204601位点的阳性质谱图;
图24为本发明实施例3中rs773528125位点的阳性质谱图;
图25为本发明实施例3中rs74315319rs74315318#1位点的阳性质谱图;
图26为本发明实施例3中rs111033401位点的阳性质谱图;
图27为本发明实施例3中rs111033305rs111033220#1位点的阳性质谱图;
图28为本发明实施例3中rs750188782rs80338942#2位点的阳性质谱图;
图29为本发明实施例3中rs1562835480rs1562835515#1位点的阳性质谱图;
图30为本发明实施例3中rs111033305rs111033220#2位点的阳性质谱图;
图31为本发明实施例3中rs1562835480rs1562835515#2位点的阳性质谱图;
图32为本发明实施例3中rs750188782rs80338942#1位点的阳性质谱图;
图33为本发明实施例3中rs121908363rs121908362#1位点的阳性质谱图;
图34为本发明实施例3中rs111033204位点的阳性质谱图;
图35为本发明实施例3中rs766206507位点的阳性质谱图;
图36为本发明实施例3中rs1057516953位点的阳性质谱图;
图37为本发明实施例3中rs267606617位点的阳性质谱图;
图38为本发明实施例3中rs80338948位点的阳性质谱图;
图39为本发明实施例3中rs74315319rs74315318#2位点的阳性质谱图;
图40为本发明实施例3中rs121908363rs121908362#2位点的阳性质谱图;
图41为本发明实施例3中rs111033380位点的阳性质谱图;
图42为本发明实施例3中rs111033313位点的阳性质谱图。
具体实施方式
本发明中术语“rs111033318、rs786204601”等,均是人SNP位点在NCBI数据库的统一编号。
本发明中术语“保护碱基”,指在PCR引物的5’端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR引物(即核心引物)的分子量增大,可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口,以避免干扰检测效果。此外,延伸引物的5’端也可以适量增加碱基序列,但其作用并非如同PCR引物的保护碱基,使其超出检测窗口,而是适当调整延伸引物的分子量,使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如,当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时,通过给其中一个延伸引物增加碱基,改变引物及其产物的分子量,与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距,以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清,从而提高检测效果。因此,增加碱基后的延伸引物及产物的分子量,一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。
本发明中术语“碱性磷酸酶消化”,其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP,其原理是使dNTP的5’-P末端转换成5’-OH末端,从而失去与引物结合使引物延伸的能力,避免了对下一步单碱基延伸的影响。
本发明中术语“单碱基延伸”,又被称之为微测序(mini sequence),指在体系中加入延伸引物和ddNTP,ddNTP与延伸引物的3’端连接形成延伸产物(即引物延伸了一个碱基),根据碱基互补配对原则,由SNP位点处基因型决定具体连接何种ddNTP,这个过程类似于PCR过程中dNTP根据互补链的碱基组成,逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是,在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基,不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键,因而,延伸引物仅在SNP位点处连接一个ddNTP,而不能像PCR那样,不断的往下延伸,因此称之为单碱基延伸。
单碱基延伸与测序过程非常相似,测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物,测序引物连接dNTP后将继续延伸,只有连接ddNTP后,方终止延伸,因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物;单碱基延伸体系中加入只有ddNTP,延伸引物只能连接一个ddNTP,并终止延伸,因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。
本发明中术语“检测产品”,指用于检测SNP位点基因型的任何常规产品,包括:检测试剂、检测芯片、检测载体,以及检测试剂盒等。
本发明中术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸,本技术方案共采用四种,它们之间存在分子量差异,如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTTP是修饰后的分子量)。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸,将形成分子量差异。通过质谱检测,可分辨出这种差异。例如,某SNP位点若是A/G多态,对应的延伸引物长度为22个碱基(分子量7200Da),当该SNP位点处是A基因型,延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸,形成23个碱基长、分子量7487.2Da的延伸产物,当该SNP位点处是G基因型,延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸,形成23个碱基长、分子量7447.2Da的延伸产物,两种产物之间存在40Da的分子量差异。即对该SNP位点而言,若使用此7200Da的延伸引物,G基因型将对应7447.2Da的质谱峰,A基因型将对应7487.2Da的质谱峰。在实际检测过程中,使用者可通过软件对7200Da、7447.2Da、7487.2Da三处进行观察:若7200Da处出现质谱峰,则是有部分或全部延伸引物没有与ddNTP结合;不论7200Da处是否出现质谱峰,若7447.2Da与7487.2Da处仅出现一处质谱峰,则该SNP位点的基因型为纯合型,并与质谱峰的位置对应,如前所述,7447.2Da的质谱峰对应G基因型,7487.2Da的质谱峰对应A基因型;若7447.2Da与7487.2Da两处质谱峰均出现,则该SNP位点的基因型为杂合型;若7447.2Da与7487.2Da两处质谱峰均未出现,则实验失败。
本发明中术语“纯化”,指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式:一是分离杂质并丢弃,二是使杂质失去活性。其中,切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质,并回收相对较纯的PCR产物,可以认为是第一种纯化方式,该方式一般耗时,操作复杂,特别是样本量大时;碱性磷酸酶的作用是降解(亦称“消化”)dNTP,使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与PCR或单碱基延伸反应,从而不干扰后续反应,可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是,单独的外切酶ExoI不起纯化作用,当它与碱性磷酸酶混合使用时,其作用是预先将单链DNA(在反应完成后的PCR产物体系中,主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP,再由碱性磷酸酶使dNTP继续降解。由于PCR引物被降解,不会进入最后的质谱检测步骤,因此,如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理,那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外,在单碱基延伸步骤之前,由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活,其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等,因此避免对后续实验产生影响。
本发明中术语“检测窗口”,指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围,通常涉及引物的设计参考范围。其中,在设计延伸引物时,对于不同的SNP位点,根据这些位点所在DNA区域的序列特点,以及SNP位点的基因型,可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物,避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰,从而可在一个相对宽阔的检测窗口,如4000-9000Da,实现对多个SNP位点的检测。
本发明中术语“SNP”基因型,指表示人基因组中单核苷酸多态性的类型。其中,在实际检查中,作为对照的用于检测的基因型既可来自于对照人基因组中,也可来自已克隆入质粒的载体工具,而后者具有可复制和保存便捷、来源稳定而受到实际使用者的欢迎。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外,各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
实施例1用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组
本实施例提供了能同时检测人SLC26A4基因rs111033318(2027T>A位点)、SLC26A4基因rs786204601(1520delT位点)、GJB2基因rs773528125(508-511insAACG位点)、GJB3基因rs74315319rs74315318#1(538C>T,547G>A位点)、GJB2基因rs111033401(9G>A位点)、SLC26A4基因rs111033305rs111033220#1(1226G>A,1229C>T位点)、GJB2基因rs750188782rs80338942#2(176-191del16,167delT位点)、SLC26A4基因rs1562835480rs1562835515#1(1318A>T,1340del A位点)、SLC26A4基因rs111033305rs111033220#2(1226G>A,1229C>T位点)、SLC26A4基因rs1562835480rs1562835515#2(1318A>T,1340del A位点)、GJB2基因rs750188782rs80338942#1(176-191del16,167delT位点)、SLC26A4基因rs121908363rs121908362#1(2162C>T,2168A>G位点)、GJB2基因rs111033204(299-300delAT位点)、SLC26A4基因rs766206507(1673A>T位点)、SLC26A4基因rs1057516953(281C>T位点)、12S rRNA基因rs267606617(1555A>G位点)、GJB2基因rs80338948(427C>T位点)、GJB3基因rs74315319rs74315318#2(538C>T,547G>A位点)、SLC26A4基因rs121908363rs121908362#2(2162C>T,2168A>G)、SLC26A4基因rs111033380(589G>A位点)和SLC26A4基因rs111033313(IVS7-2 A>G位点)的21个与耳聋相关的基因多态位点的引物组,核苷酸序列如表1所示:
表1耳聋相关的基因多态位点的引物组的核苷酸序列
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实施例2一种包含用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组的试剂盒
本实施例提供一种包含实施例1所述的用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组的试剂盒,试剂盒的组分包括:PCR反应试剂、PCR产物纯化试剂和单碱基延伸反应试剂,具体组分如表2所示:
表2用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分
为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果,每条PCR扩增引物的5’端在增加10bp的碱基,碱基序列为ACGTTGGATG,以使PCR引物的分子量增大,从而超出质谱仪检测窗口。
实施例3一种引物组或试剂盒检测与耳聋相关基因SNP的检测方法
本实施例使用实施例2中的试剂盒,对21处耳聋相关基因SNP位点的基因型进行分型,具体实施操作如下:
1、PCR扩增
1.1、在PCR配液区,按照待检样品数(含阳性质控品、阴性对照、空白对照)准备210μLPCR反应管,并在管上标记样本编号。
1.2、从试剂盒中取出PCR引物混合液、PCR反应液,使其自然解冻,涡旋振荡使其充分混匀,瞬时离心至管底。
1.3、根据样本数目,按表3的比例取出PCR引物混合液和PCR反应液,置于一个离心管中混匀,按每PCR反应管加入4μL引物混合物进行分装。由于分装过程中,移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数,建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份待测样品时,可按10.5-11份样品配制混合物。
表3 PCR反应体系
组分名称 | 单反应体积(μL) |
反应液I | 13.7 |
酶I | 0.8 |
扩增引物 | 4.0 |
合计 | 18.5 |
1.4、在PCR扩增区内向每管混合物中加入1.5μL待测样品,使每份PCR反应体系总体积为20μL。其中,阴性对照为纯化水,空白对照为不加模板。
1.5、将PCR反应管置于PCR扩增仪中,按下表4的程序进行PCR扩增反应。
表4 PCR反应程序
2、SAP酶消化
从PCR反应管中吸取5μL的PCR扩增产物后,加入2μL酶切反应液,酶切反应液的体系见表5。然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中,执行表6程序。
表5酶切反应液的体系
组分 | 单体积反应(μL) |
反应液Ⅱ | 0.17 |
酶Ⅱ | 0.5 |
纯水 | 1.33 |
总计 | 2 |
表6 SAP酶消化程序
温度(℃) | 时间 | 循环数 |
37 | 40min | 1 |
85 | 5min | 1 |
4 | 保温 |
3、单碱基延伸反应
3.1、在PCR配液区,根据样本数目,按表7的比例取出延伸引物混合液和延伸反应液,置于一个离心管中混匀。由于分装过程中,移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数,建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时,可按10.5-11份样品配制混合物。
表7单碱基延伸反应体系
组分名称 | 单体积反应(μL) |
反应液Ⅲ | 0.83 |
酶Ⅲ | 0.23 |
延伸引物 | 0.94 |
合计 | 2 |
3.2、在PCR扩增区,按每管酶切产物加入2μL反应体系进行分装。
3.3、将PCR反应管置于PCR扩增仪中,按表8的程序进行延伸反应。
表8单碱基延伸反应程序
4、纯化
在PCR扩增区向每管延伸产物中加入41μL超纯水和15mg阴离子交换树脂,颠倒混匀5分钟后离心(条件为以2250g(标准板离心机的3700rpm)离心5分钟)。
5、点样
使用微量移液器,吸取0.5μL纯化产物,点样至靶片(检测时装样品用的芯片)。
6、上机检测及结果判读。
如前所述,21条延伸引物及它们在21个基因多态位点上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量,这些分子量对应各自的质谱峰,若在某分子量处出现质谱峰,则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物),各位点延伸产物分子量如表9所示:
表9各位点延伸产物分子量
判断标准:
(1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现,无论延伸引物对应的质谱峰是否存在,均判断为实验失败;
(2)若野生型或突变型对应的质谱峰仅出现一个,则判断为所出现质谱峰对应的基因型的纯合型;
(3)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现,则判断为杂合型。
质谱结果如图1-42所示,其中图1-图21是21个阴性对照组的各位点的质谱图,图22-图42为阳性血液样本测得的质谱图,从质谱图可以很清楚的看出有突变的SNP位点的突变情况,如对于位点rs111033318(对比图1和图22),说明有T向A的纯合突变发生。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式,并非用以限定本发明的范围。任何本领域的普通技术人员,在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改,均应属于本发明保护的范围。
Claims (9)
1.用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组,其特征在于:所述引物组包括PCR扩增引物对和与引物对对应的延伸引物;
所述PCR扩增引物对包括核苷酸如SEQ ID NO:1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40和41-42所示的引物对;
与引物对对应的延伸引物包括:与核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20、21-22、23-24、25-26、27-28、29-30、31-32、33-34、35-36、37-38、39-40和41-42所示的引物对分别对应的核苷酸如SEQ ID NO:43-63所示的延伸引物。
2.一种如权利要求1所述的用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组在制备检测耳聋相关基因SNP的检测产品中的应用。
3.一种包含权利要求1所述的用于检测21处耳聋相关基因SNP组合的引物组的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于:所述耳聋相关基因SNP分别是:SLC26A4基因rs111033318(2027T>A位点)、SLC26A4基因rs786204601(1520delT位点)、GJB2基因rs773528125(508-511insAACG位点)、GJB3基因rs74315319rs74315318#1(538C>T,547G>A位点)、GJB2基因rs111033401(9G>A位点)、SLC26A4基因rs111033305rs111033220#1(1226G>A,1229C>T位点)、GJB2基因rs750188782rs80338942#2(176-191del16,167delT位点)、SLC26A4基因rs1562835480rs1562835515#1(1318A>T,1340del A位点)、SLC26A4基因rs111033305rs111033220#2(1226G>A,1229C>T位点)、SLC26A4基因rs1562835480rs1562835515#2(1318A>T,1340del A位点)、GJB2基因rs750188782rs80338942#1(176-191del16,167delT位点)、SLC26A4基因rs121908363rs121908362#1(2162C>T,2168A>G位点)、GJB2基因rs111033204(299-300delAT位点)、SLC26A4基因rs766206507(1673A>T位点)、SLC26A4基因rs1057516953(281C>T位点)、12S rRNA基因rs267606617(1555A>G位点)、GJB2基因rs80338948(427C>T位点)、GJB3基因rs74315319rs74315318#2(538C>T,547G>A位点)、SLC26A4基因rs121908363rs121908362#2(2162C>T,2168A>G)、SLC26A4基因rs111033380(589G>A位点)和SLC26A4基因rs111033313(IVS7-2 A>G位点)。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括PCR反应试剂、PCR产物纯化试剂和单碱基延伸反应试剂。
6.根据权利要求5述的试剂盒,其特征在于:所述PCR产物纯化试剂包括碱性磷酸酶、碱性磷酸酶和外切酶ExoI、电泳凝胶回收试剂或PCR产物纯化柱中的任一种。
7.一种利用如权利要求1所述的引物组或权利要求3~6任一项所述的试剂盒检测与耳聋相关基因SNP的检测方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)多重PCR扩增:在一个反应体系中使用PCR扩增引物对待测样本进行PCR扩增;
(2)单碱基延伸反应:在一个反应体系中使用延伸引物对步骤(1)PCR扩增的产物进行单碱基延伸反应;
(3)质谱仪检测:对步骤(2)单碱基延伸反应的产物纯化后进行质谱仪检测,根据延伸产物的分子量的差异,判断SNP位点的基因型。
8.根据权利要求7所述的利用引物组或试剂盒检测与耳聋相关基因SNP的检测方法,其特征在于:步骤(1)中包括对PCR扩增的产物进行纯化。
9.根据权利要求7所述的利用引物组或试剂盒检测与耳聋相关基因SNP的检测方法,其特征在于:所述延伸产物的分子量如下:
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