CN111424116A - 用于检测黄热病毒疫苗株的rt-lamp试剂盒及其专用引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT‑LAMP试剂盒及其专用引物和应用，属于生物技术检测领域。提供的用于检测黄热病毒疫苗株的RT‑LAMP引物能够实现对黄热病毒疫苗株的特异性检测和鉴别，提供的RT‑LAMP试剂盒的检测操作简单、特异性强、灵敏度高，可以快速且高效对黄热病毒疫苗株进行检测和鉴别，可以用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和鉴别黄热病毒疫苗株。

Description

用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒及其专用引物和 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测专用引物和检测试剂盒。

背景技术

黄热病毒(Yellow fever virus)是黄病毒科(Flaviridae)，黄病毒属(Flavivirus)的单股正链RNA病毒。病毒经蚊虫传播，传播媒介主要为埃及伊蚊，临床特征有发热、剧烈头痛、黄疸、出血和蛋白尿等，目前主要在非洲及南美洲流行。人群对黄热病毒疫苗株较为易感，病死率可达20％-40％，是国际三大检疫传染病之一，目前通过接种黄热病毒减毒活疫苗来控制黄热病的流行。目前使用的疫苗株为Theiler和Smith在1936年减毒的Asibi株，命名为17D株，并在17D株的基础上进一步传代减毒，衍生出现代生产黄热疫苗所使用的17D-204(欧美国家使用)，17D-213和17DD疫苗株(巴西使用)。黄热减毒疫苗已为世界大面积人群提供了近50年的保护力，是疫苗史上最安全有效的减毒活疫苗之一。

虽然目前我国未见有黄热病的大规模流行，但我国某些地区的地理条件和气候条件与黄热病高发区域相似，也存在发病的可能性。在过去的20多年里，黄热病感染者逐年增加，据世界卫生组织(WHO)估计，每年至少有20万黄热病病例，造成3万人死亡，严重威胁到人们的健康。目前，黄热病毒减毒疫苗已在世界范围内大量使用，因此在检疫口岸，需要结合黄热病毒的检测以及黄热病毒疫苗株的鉴定，以快速判断该病毒是否为输入性感染病例或是否为新感染病例，及时对感染病例采取相应的处置措施，可将外来感染阻挡于国门之外。

因此需要建立黄热病毒疫苗株的快速、灵敏检测鉴别方法，以快速区分是否为输入性感染病例或新感染病例，能够尽早对疑似病例做出正确的实验室诊断，对有效指导后续的疫情处理与防控工作具有极其重要的意义。

目前病毒疫苗株的鉴别检测方法主要为利用PT-PCR及Real-time RT-PCR的核酸检测方法，该方法需要特殊仪器，一些设备条件相对简陋的基层单位或检疫口岸无法进行。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP引物组，包括序列表中SEQ ID NO:2所示的引物F3、SEQ ID NO:3所示的引物B3、SEQ ID NO:4所示的引物FIP、SEQ ID NO:5所示的引物BIP、SEQ ID NO:6所示的引物LF和SEQ ID NO:7所示的引物LB。

本发明另一方面提供一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒，包含上述的RT-LAMP引物组。

上述RT-LAMP引物组在25μL反应体系中的使用浓度为：引物F3和B3的终浓度独立地为2～8pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为24～36pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为10～16pmol。

上述引物F3和B3的终浓度独立地为4pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为32pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为12pmol。

上述RT-LAMP试剂盒中还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol Reaction Buffer、100mM MgSO₄、5mM betaine、10mM dNTP、8U Bst DNApolymerase和7.5U WarmStart RTx reverse transcriptase。

上述基础反应试剂在25μL反应体系中的使用量分别为：10×Thermopol ReactionBuffer2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，Bst DNApolymerase 1μl，WarmStart RTx reverse transcriptase 0.5μl。

上述RT-LAMP试剂盒还包含阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包含黄热病毒疫苗株基因组RNA，所述阴性对照为不含黄热病毒疫苗株基因组RNA的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。

上述的RT-LAMP引物组在制备用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测试剂中的应用也属于本发明的内容，该应用采用上述的RT-LAMP试剂盒检测黄热病毒疫苗株，包括以下步骤：

S1：提取待测样品RNA；

S2：反应体系配制：25μL反应体系包含2μL待测样品RNA、10×Thermopol ReactionBuffer2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，8U Bst DNApolymerase 1μl，7.5U WarmStart RTx reverse transcriptase 0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl，100μM LF/LB引物各0.3μl，100μM F3/B3所示引物各0.1μl，ddH₂O补至25μl；

S3：将反应体系置63℃-65℃条件下恒温扩增反应45-60min，获得反应液；

S4：结果分析：使用钙黄绿素颜色指示剂或浊度仪对所述反应液进行检测分析。

上述步骤S3中将反应体系置65℃条件下恒温扩增反应50min。

上述步骤S4中所述结果分析的具体方法为：当使用钙黄绿素颜色指示剂进行检测时，在反应液中添加1μl的钙黄绿素颜色指示剂，呈现绿色表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株(阳性)，呈现橙色表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株(阴性)；

当使用浊度仪进行检测时，浊度上升(>0.1)表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株(阴性)。

基于以上技术方案提供的用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测试剂盒及其专用引物能够实现高效、快速、高特异性地检测黄热病毒疫苗株的目的，且操作简单，灵敏度高，结果鉴定简便，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)通过设计并筛选获得的引物可以对黄热病毒疫苗株的特有序列进行特异性识别，保证了RT-LAMP扩增的高度特异性；

2)本发明具有灵敏度高等特点，检测最低限达到9.46pg/μl；

3)本发明操作简便、快速且高效，只需将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入65℃恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果，因此不需要大型仪器设备和专业人员，更加适用于基层检测；

4)本发明结果鉴定简便，可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；

综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到黄热病毒疫苗株，不需要复杂仪器，为黄热病毒疫苗株的检测提供了新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测黄热病毒疫苗株，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

附图说明

图1为用于检测黄热病毒疫苗株的引物筛选曲线；

图2为用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测方法的反应温度的筛选曲线；

图3为用于黄热病毒疫苗株检测的特异性实时浊度仪检测曲线；

图4为用于黄热病毒疫苗株检测的特异性钙黄绿素染色照片；

图5为用于黄热病毒疫苗株检测的灵敏度实时浊度仪检测曲线；

图6为用于黄热病毒疫苗株检测的灵敏度钙黄绿素染色照片；

图7为黄热病毒疫苗株PCR检测灵敏度凝胶图像。

具体实施方式

为了实现快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度检测黄热病毒疫苗株的目的，本发明采用环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP，Notomi T,Okayama H,MasubuchiH,等.Loop-mediated isothermal amplification ofDNA.Nucleic Acids Res2000；28(12):63.)，该技术依赖4-6条特异识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，不需热变性，在60℃至65℃的等温条件下即可进行反应，因此不需要昂贵的热循环设备。并且由于热变化没有时间损失，该技术的放大效率非常高，可实现在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列。

基于以上原理，经过探索，本发明人设计了适用于黄热病毒疫苗株检测的四条或六条专用引物，并基于开发的引物制备了适用于快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度检测黄热病毒疫苗株的试剂盒和检测方法，该试剂盒和方法能够用于检测鉴定血液、尿液及其他体液等样品中是否存在黄热病毒疫苗株，并且不需要专门的或昂贵的设备和专业人员，非常适合于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心临场快速检测。

以下结合具体实施例对本发明作进一步描述。

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方面。本发明提供了各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：用于对黄热病毒疫苗株进行RT-LAMP检测的引物设计

该实施例从GenBank数据库检索获得黄热病毒疫苗株17D和黄热病毒野生株的基因组序列，通过BLAST进行同源性分析，截取并确定以黄热病毒疫苗株17D特有的一段特异性保守片段为靶基因序列(序列表中SEQ ID NO：1所示)，再根据该靶基因序列，用软件Primerdesign V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计用于对黄热病毒疫苗株17D进行RT-LAMP检测的引物。共设计出五组黄热病毒疫苗株17D特异性检测引物，各组引物的核苷酸序列如下表1所示。

表1：黄热病毒疫苗株特异性检测引物的核苷酸序列信息

分别利用上述五组检测引物对黄热病毒疫苗株阳性质粒pGSI-YF-NS(将用于检测黄热病毒疫苗株17D的特异性保守序列(SEQ ID NO:1)克隆至pGSI载体上获得，该克隆步骤由生工生物工程有限公司完成)进行LAMP扩增反应，用以筛选扩增效果更好的一组引物。反应结束后，直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化，具体检测方法在以下实施例2中详述。检测结果如图1所示，可见相对于NS1-2、NS1-3、NS1-4和NS1-5引物组，NS1-1引物组的扩增效果最好，其反应前后的浊度变化最为明显，并且出现浊度变化所耗费的时间也最短，因此，本发明确定使用NS1-1引物组作为以下实施例中检测黄热病毒疫苗株17D的最佳引物组。

实施例2：黄热病毒疫苗株RT-LAMP检测方法的建立

该实施例在相同的反应体系(以下详述)下，分别在58-65℃条件下使用实施例1的NS1-1引物组对黄热病毒疫苗株17D基因组RNA(通过市售RNA提取试剂盒从待测样品(黄热病毒疫苗株17D培养物，来源于中国科学院武汉病毒研究所)中提取获得)进行LAMP检测，以确定最佳反应温度，包括以下步骤：

1)以黄热病毒疫苗株17D基因组RNA(终浓度>1ng/μl)为模板，25μl RT-LAMP反应体系包括：基因组RNA 2μl、2.5μl 10×ThermoPol Reaction Buffer(New EnglandBiolabs Inc.,Massachusetts,USA,1×ThermoPol Reaction Buffer包括20.0mM Tris-HCl(PH 8.8),10.0mM KCl,2.0mM MgSO₄,10.0mM(NH₄)₂SO₄,0.1％Triton X-100)、5mMbetaine(Sigma-Aldrich Inc.,St Louis,USA)4μl、100mM MgSO₄(New England BiolabsInc.,Massachusetts,USA)1.5μl、10mM dNTP(TaKaRa Bio Inc.,Clontech Laboratories,Inc.,Dalian,China)3.5μl、8U Bst DNA polymerase(New England Biolabs Inc.,Massachusetts,USA)1μl、7.5U WarmStart RTx reverse transcriptase(New EnglandBiolabs Inc.,Massachusetts,USA，模板为RNA时添加，即RT-LAMP时添加；当使用黄热病毒疫苗株阳性质粒pGSI-YF-NS为模板时，无需添加)0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl(终浓度32pmol)，100μM LF/LB引物各0.3μl(终浓度12pmol)，100μM F3/B3所示引物各0.1μl(终浓度4pmol)，ddH₂O补充至25μl。

2)扩增条件为：分别置58-65℃条件下恒温60min。

3)反应结束后进行结果判定：直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，检测结果如图2所示。

根据图2中的检测结果，可见当反应温度为63℃-65℃时，反应液反应前后的浊度变化相对于其他温度条件(58℃-62℃)较为明显，并且出现浊度变化所用的时间(40min即可)也相对较短，其中以反应温度为65℃的反应前后浊度变化最为明显，出现浊度变化所用的时间也最短，因此，本发明确定使用反应温度为65℃作为黄热病毒疫苗株RT-LAMP检测方法的最佳反应温度。

实施例3：黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测方法的特异性、灵敏度

该实施例使用实施例1获得的NS1-1引物组，采用实施例2确定的黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测方法对黄热病毒疫苗株17D进行检测，以检测该方法的特异性和灵敏度。

3.1、特异性检测

该步骤分别以黄热病毒疫苗株17D阳性质粒pGSI-YF-NS、丙型肝炎病毒HCV基因组全长质粒、乙型肝炎病毒HBV基因组全长质粒、人获得性免疫缺陷病毒HIV基因组全长质粒、SARS冠状病毒包膜蛋白S1C端缺失19个AA质粒pCAGGS-SARS-S1Δ-19、中东呼吸综合征病毒MERS刺突蛋白质粒、冠状病毒OC43包膜蛋白S1C端缺失17个AA质粒pCAGGS-OC43-S1Δ-17、埃博拉病毒Ebola包膜糖蛋白质粒、A型流感病毒Influenza A virus、脑膜炎奈瑟菌B群BCMCC 29022、尼帕病毒N基因质粒pUC57-NiV-MN、拉萨热病毒NP基因质粒pUC57-LSR-NP(以上质粒均来自于中国科学院武汉病毒研究所流感病学科组)为模板，Nuclease-free水为阴性对照，以检测上述实施例2确定的最佳的黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测方法(反应温度为65℃，反应体系参见实施例2)的特异性。

反应结束后进行结果判定：在反应液中添加1μl的(终反应体系为26μl)含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰的钙黄绿素颜色指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果(原理为：钙黄绿素是金属离子指示剂，钙黄绿素与试剂中的Mn²⁺结合处于淬灭状态，当扩增反应发生释放出的焦磷酸与Mn²⁺结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光)，绿色表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株(阳性)，橙色表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株(阴性)，如图4所示；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理为：LAMP反应的过程中会产生释放焦磷酸，焦磷酸与体系中的Mg²⁺结合焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应)，浊度上升(>0.1)表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株(阴性)，如图3所示。

如图3和图4所示，其中1表示黄热病毒疫苗株17D阳性质粒pGSI-YF-NS；2表示丙型肝炎病毒HCV基因组全长质粒；3表示乙型肝炎病毒HBV基因组全长质粒；4表示人获得性免疫缺陷病毒HIV基因组全长质粒；5表示SARS冠状病毒包膜蛋白S1C端缺失19个AA质粒pCAGGS-SARS-S1Δ-19；6表示中东呼吸综合征病毒MERS刺突蛋白质粒；7表示冠状病毒OC43包膜蛋白S1C端缺失17个AA质粒pCAGGS-OC43-S1Δ-17；8表示埃博拉病毒Ebola包膜糖蛋白质粒；9表示A型流感病毒Influenza A virus；10表示脑膜炎奈瑟菌B群B CMCC 29022；11表示尼帕病毒N基因质粒pUC57-NiV-MN；12表示拉萨热病毒NP基因质粒pUC57-LSR-NP；13表示阴性对照。图中：“+”为阳性，“-”为阴性。根据图3和图4结果，可见只有1(黄热病毒疫苗株17D阳性质粒pGSI-YF-NS)发生了LAMP反应，其余均未发生，而且钙黄绿素指示剂染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明的黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测方法具有较高的特异性。

3.2、灵敏度检测

该步骤比较上述实施例2提供的RT-LAMP检测方法与普通PCR方法检测黄热病毒疫苗株的灵敏度，方法为：使用实施例1获得的黄热病毒疫苗株17D阳性质粒pGSI-YF-NS，对其以10倍梯度进行稀释，再以经梯度稀释的质粒(浓度分别为94.6ng/μl、9.46ng/μl、0.946ng/μl、0.0946ng/μl、9.46pg/μl、0.946pg/μl、0.0946pg/μl、0.00946pg/μl)为模板，分别用实施例2的LAMP检测方法与普通PCR方法(PCR检测引物序列为NS1-F：5′-CCAACATTTTGGATGGGAAG-3′(SEQ ID NO:28)，NS1-R：5′-TATCCGTGGTGGATCTGGTT-3′(SEQ IDNO:29))对上述梯度稀释的黄热病毒疫苗株17D阳性质粒进行检测，以比较两者的检测灵敏度。

结果判定如上述步骤3.1所述，采用在反应液中添加钙黄绿素颜色指示剂以及采用浊度仪两种方法进行检测判定。检测结果如图5-7所示，其中图5为浊度仪检测结果，图6为钙黄绿素指示剂颜色反应检测结果，图7为普通PCR法的灵敏度检测结果。图中：1-8分别为94.6ng/μl、9.46ng/μl、0.946ng/μl、0.0946ng/μl、9.46pg/μl、0.946pg/μl、0.0946pg/μl、0.00946pg/μl；“+”为阳性，“-”为阴性；M：DNA marker D2000。可见上述实施例2提供的RT-LAMP检测方法的最低检测浓度为9.46pg/μl，与普通PCR方法的最低检测浓度一致，而且钙黄绿素指示剂染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明用RT-LAMP方法检测黄热病毒疫苗株的检测方法具有较高的灵敏度，并且相对于PCR的方法，不需要昂贵的仪器，且耗时较短(最短仅需40min左右)，更加适合于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心临场快速检测。

实施例4：黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测试剂盒

基于以上实施例1、实施例2和实施例3的结果，该实施例提供一种用于黄热病毒疫苗株检测的RT-LAMP检测试剂盒，具体包括：

用于检测黄热病毒疫苗株的专用特异性引物组(即实施例1获得的NS1-1引物组，包括引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB)；

具体地，用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测试剂盒包括以下用于25μL反应体系的试剂：2.5μl 10×ThermoPol Reaction Buffer(1×ThermoPol Reaction Buffer包括20.0mM Tris-HCl(PH 8.8),10.0mM KCl,2.0mM MgSO₄,10.0mM(NH₄)₂SO₄,0.1％TritonX-100)、5mM betaine 4μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、10mM dNTP 3.5μl、8U Bst DNApolymerase 1μl、7.5U WarmStart RTx reverse transcriptase(模板为RNA时添加，即RT-LAMP时添加；当使用黄热病毒疫苗株阳性质粒pGSI-YF-NS为模板时，无需添加，即LAMP时不添加)0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl(终浓度32pmol)，100μM LF/LB引物各0.3μl(终浓度12pmol)，100μM F3/B3所示引物各0.1μl(终浓度4pmol)；使用时，向25μl反应体系中添加的模板(待测样品的基因组RNA，终浓度>1ng/μl)的量为2μL，ddH₂O补充至25μl；

为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有黄热病毒疫苗株17D的基因组RNA的反应体系(例如实施例1中所述的阳性质粒pGSI-YF-NS)，所述阴性对照为不含黄热病毒疫苗株基因组RNA的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)；

为方便检测，试剂盒中还可包括实施例2获得的RT-LAMP检测方法和实施例3所述的结果检测判定方法，其中检测方法包括反应条件：置63℃-65℃(优选65℃)恒温45-60min。

实施例5：临床样品检测

该实施例采用实施例4提供的黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测试剂盒对10份待测样品(从10份待测血液样本(来源于中国科学院武汉病毒研究所流感病毒学科组)中提取获得的RNA样品，通过市售RNA提取试剂盒获得)进行RT-LAMP检测，并通过钙黄绿素颜色指示剂和浊度仪两种方法判定待测样品中是否还有黄热病毒疫苗株。检测结果如下表2所示。

表2：10份待测样品的黄热病毒疫苗株检测结果

注：“+”表示黄热病毒疫苗株阳性，待测血液样本含有黄热病毒疫苗株；“-”表示黄热病毒疫苗株阴性，待测血液样本中不含有黄热病毒疫苗株。

由以上表2结果可知，检测的10份待测样品中样品号4、6、7、9反应后的钙黄绿素颜色指示剂检测结果为绿色，并且浊度仪检测的反应前后浊度变化大于0.1，可以判定为黄热病毒疫苗株阳性，对应的血液样本中含有黄热病毒疫苗株，为黄热病毒疫苗株感染血液样本；其他待测样品反应后的钙黄绿素颜色指示剂检测结果为橙色，并且浊度仪检测的反应前后浊度变化均小于0.1，可以判定为黄热病毒疫苗株阴性，对应的血液样本中不含有黄热病毒疫苗株，为未感染黄热病毒疫苗株血液样本。

本实施例说明利用RT-LAMP检测试剂盒针对临床样品的检测，样品中提取的RNA加入检测试剂在63℃～65℃恒温水浴锅中40min后，就可以依据颜色变化或浊度变化判断结果，特异性高，灵敏度好，并可批量检测，操作简便、快速且高效。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 首都儿科研究所

中国科学院武汉病毒研究所

首都医科大学附属北京地坛医院

<120> 用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒及其专用引物和应用

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> 黄热病病毒(Yellow fever virus)

<400> 1

gatcaaggat gcgccatcaa ctttggcaag agagagctca agtgcggaga tggtatcttc 60

atatttagag actctgatga ctggctgaac aagtactcat actatccaga agatcctgtg 120

aagcttgcat caatagtgaa agcctctttt gaagaaggga agtgtggcct aaattcagtt 180

gactcccttg agcatgagat gtggagaagc agggcagatg agatcaatgc catttttgag 240

gaaaacgagg tggacatttc tgttgtcgtg caggatccaa agaatgttta ccagagagga 300

actcatccat tttccagaat tcgggatggt ctgcagtatg gttggaagac ttggggtaag 360

aaccttgtgt tctccccagg gaggaagaat ggaagcttca tcatagatgg aaagtccagg 420

aaagaatgcc cgttttcaaa ccgggtctgg aattctttcc agatagagga gtttgggacg 480

ggagtgttca ccacacgcgt gtacatggac gcagtctttg aatacaccat agactgcgat 540

ggatctatct tgggtgcagc ggtgaacgga aaaaagagtg cccatggctc tccaacattt 600

tggatgggaa gtcatgaagt aaatgggaca tggatgatcc acaccttgga ggcattagat 660

tacaaggagt gtgagtggcc actgacacat acgattggaa catcagttga agagagtgaa 720

atgttcatgc cgagatcaat cggaggccca gttagctctc acaatcatat ccctggatac 780

aaggttcaga cgaacggacc ttggatgcag gtaccactag aagtgaagag agaagcttgc 840

ccagggacta gcgtgatcat tgatggcaac tgtgatggac ggggaaaatc aaccagatcc 900

accacggata gcgggaaagt tattcctgaa tggtgttgcc gctcctgcac aatgccgcct 960

gtgagcttcc atggtagtga tgggtgttgg tatcccatgg aaattaggcc aaggaaagcg 1020

catgaaagcc atctggtgcg ctcctgggtt acagct 1056

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accagagagg aactcatcca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccatcgcag tctatggtgt 20

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcctccctgg ggagaacaca ttttatggtc tgcagtatgg ttgg 44

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaatgcccgt tttcaaaccg ggtttttgta cacgcgtgtg gtga 44

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttttccagaa ttcggga 17

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acctgcgtca gaaacttat 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccacacctt ggaggcatta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtccatcaca gttgccatca 20

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggcctccgat tgatctcggc gtgtgagtgg ccactgac 38

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggttcagacg aacggacctt ggccctgggc aagcttctct 40

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcaactgtg atggacgg 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agctgtaacc caggagcg 18

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttgtgcagga gcggcaacac aatcaaccag atccaccacg 40

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcctgtgagc ttccatggta gtaccagatg gctttcatgc g 41

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgttggtatc ccatggaaat tagg 24

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccagggact agcgtgatc 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agctgtaacc caggagcg 18

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agcggcaaca ccattcagga ataactgtga tggacgggga 40

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcctgtgagc ttccatggta gtaccagatg gctttcatgc g 41

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgtggtggat ctggttgatt t 21

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gatgggtgtt ggtatcccat ggaa 24

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

accagagagg aactcatcca 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tccatcgcag tctatggtgt 20

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcctccctgg ggagaacaca atggtctgca gtatggttgg 40

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaatgcccgt tttcaaaccg ggtgtacacg cgtgtggtga 40

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctggaattct ttccagatag aggag 25

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ccaacatttt ggatgggaag 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tatccgtggt ggatctggtt 20

Claims (10)

1.一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP引物组，其特征在于，包括序列表中SEQ IDNO:2所示的引物F3、SEQ ID NO:3所示的引物B3、SEQ ID NO:4所示的引物FIP、SEQ ID NO:5所示的引物BIP、SEQ ID NO:6所示的引物LF和SEQ ID NO:7所示的引物LB。

2.一种用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的RT-LAMP引物组。

3.根据权利要求2所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP引物组在25μL反应体系中的使用浓度为：引物F3和B3的终浓度独立地为2～8pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为24～36pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为10～16pmol。

4.根据权利要求3所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物F3和B3的终浓度独立地为4pmol，引物FIP和BIP的终浓度独立地为32pmol，引物LF和LB的终浓度独立地为12pmol。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP试剂盒中还包含基础反应试剂，所述基础反应试剂包括：10×Thermopol Reaction Buffer、100mMMgSO₄、5mM betaine、10mM dNTP、8U Bst DNA polymerase和7.5U WarmStart RTx reversetranscriptase。

6.根据权利要求5所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述基础反应试剂在25μL反应体系中的使用量分别为：10×Thermopol Reaction Buffer 2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，Bst DNA polymerase 1μl，WarmStart RTx reversetranscriptase 0.5μl。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP试剂盒还包含阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包含黄热病毒疫苗株基因组RNA，所述阴性对照为不含黄热病毒疫苗株基因组RNA的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。

8.权利要求1所述的RT-LAMP引物组在制备用于检测黄热病毒疫苗株的RT-LAMP检测试剂中的应用，该应用采用权利要求2-7中任一项所述的RT-LAMP试剂盒检测黄热病毒疫苗株，包括以下步骤：

S1：提取待测样品RNA；

S2：反应体系配制：25μL反应体系包含2μL待测样品RNA、10×Thermopol ReactionBuffer 2.5μl、100mM MgSO₄ 1.5μl、5mM betaine 4μl、10mM dNTP 3.5μl，8U Bst DNApolymerase 1μl，7.5U WarmStart RTx reverse transcriptase 0.5μl，引物加入量为：100μM FIP/BIP引物各0.8μl，100μM LF/LB引物各0.3μl，100μM F3/B3所示引物各0.1μl，ddH₂O补至25μl；

S3：将反应体系置63℃-65℃条件下恒温扩增反应45-60min，获得反应液；

S4：结果分析：使用钙黄绿素颜色指示剂或浊度仪对所述反应液进行检测分析。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤S3中将反应体系置65℃条件下恒温扩增反应50min。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，步骤S4中所述结果分析的具体方法为：当使用钙黄绿素颜色指示剂进行检测时，在反应液中添加1μl的钙黄绿素颜色指示剂，呈现绿色表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株(阳性)，呈现橙色表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株(阴性)；

当使用浊度仪进行检测时，浊度上升(>0.1)表示待测样品中存在黄热病毒疫苗株(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在黄热病毒疫苗株(阴性)。

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