JP3414679B2

JP3414679B2 - Ｒｎａの検出方法

Info

Publication number: JP3414679B2
Application number: JP29994699A
Authority: JP
Inventors: 菊也加藤; 亮的場
Original assignee: 菊也加藤
Priority date: 1999-05-25
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2003-06-09
Anticipated expiration: 2019-10-21
Also published as: JP2001037487A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、RNAの検出方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子発現のレベルを定量するには、一
般にノーザンハイブリダイゼーションが行われている。
実験室レベルでは、通常は5pgのRNAが存在すれば検出す
ることが可能である。しかし、遺伝子の発現量が極めて
少ない場合は、0.3 〜3μgのmRNAが必要とされている。
従って、限られた量のサンプルしか入手できない場合
（例えば臨床検体など）は、ノーザンハイブリダイゼー
ションを適用することは困難である。

【０００３】ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、他の手法
と比較して最も高感度にDNA又はRNAを検出することがで
きる手法である。しかし、PCRによる遺伝子の発現の定
量は、いわゆる「インターナルコントロール」（内部基
準）として標的分子と同様の増幅効率を有するDNA断片
を用いて、検量線を作成する対照実験を行わなければな
らないことから、操作が煩雑である。さらに、定量的PC
Rを行うには、定量の対象となる遺伝子ごとに検量線を
作成する必要があるため、研究や遺伝子の診断を行うに
は手間がかかる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、RNAの検出
方法を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、RNAから合成され
た検出対象cDNA及び標準曲線作製用cDNAに、それぞれ種
類の異なるアダプターを付加してPCRを行うことによ
り、当該検出対象RNAを高精度に検出し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、以下の工程： (a) 検出の対象となるRNA及び標準RNAをそれぞれ逆転写
させて測定用cDNA及び標準cDNAを得、(b) 段階的に濃度
調製した標準cDNAの各群にそれぞれ種類の異なるアダプ
ターを付加し、(c) 測定用cDNAに前記アダプターとは別
の種類のアダプターを付加し、(d) 前記(b)及び(c)によ
り得られたアダプター付加cDNAを混合して増幅し、(e)
測定用cDNAの標準cDNAに対する量比を測定し、(f) 前記
測定結果からRNAを検出することを含む、前記RNAの検出
方法である。種類の異なるアダプターとしては、互いに
長さの異なるヌクレオチドを含むものが挙げられる。さ
らに、増幅としては、アダプタープライマー及び遺伝子
特異的プライマーを用いたものが挙げられる。以下、本
発明を詳細に説明する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明は、コントロールとして使
用されるRNA（標準曲線作製用RNAであり、「標準RNA」
という）から合成されたcDNA（「標準cDNA」という）
と、検出の対象となる目的RNA（「検出対象RNA」とい
う）から合成されたcDNAであって実際に測定の対象とな
るcDNA（「測定用cDNA」という）とを混合して同一の反
応系で増幅させることにより、標準cDNAに対する測定用
cDNAの量比を測定し、得られる測定結果を指標としてRN
Aを検出することを特徴とするものである。

【０００８】上述の通り、PCRによる遺伝子発現の検出
を行う場合は、内部基準として標的分子と同様の増幅効
率を有するDNA断片を用いて、標的分子とは別の反応系
で検量線を作成する対照実験を行わなければならない。
この操作を、標的分子が含まれる単一の反応系で行うこ
とができれば、簡単に、かつ少ない誤差で検出対象の検
出結果を得ることができる。本発明者は、単一の試験管
内反応で目的とするDNAを正確かつ簡便に測定すること
ができるようにするため、増幅用DNAに異なる種類のア
ダプターを付加することにより増幅後の各DNAを識別で
きるようにした。以下、本発明の方法の各工程について
説明する。

【０００９】(1) RNA及びcDNAの調製検出の目的となるRNA（検出対象RNA）としては、各種臓
器由来のRNAが挙げられる。但し、RNAの種類はこれらに
限定されるものではない。また、検出対象RNAは1種類で
もよく、2種以上でもよいが、１〜５種が好ましい。2種
以上の場合は、異なる組織又は細胞由来のものであって
も同一の組織又は細胞由来のものでもよい。例えば、同
一種のRNAであるが時期の異なるもの（例えば生後数日
後、数週後及び数年後のもの等）を検出対象RNAとして
選択することができる。

【００１０】一方、標準曲線作製用RNA（標準RNA）は、
検出対象RNAとは異なる種類のRNAであり、検出対象RNA
の種類に応じて適宜選択される。従って、例えば検出対
象RNAを小脳抽出液由来のものとした場合は、標準RNAは
小脳を除く全脳（大脳、間脳、中脳及び延髄）抽出液由
来のものを使用することができる。

【００１１】上記検出対象RNA及び標準RNAから逆転写酵
素を用いてそれぞれのRNAに対応するcDNAを合成し、そ
れぞれ測定用cDNA及び標準cDNAとする。測定用cDNA及び
標準cDNAの調製は、ともに公知のいずれかの手法により
行うことができる。例えば、各種臓器の細胞又は組織等
からポリ(A)+RNA を調製して逆転写酵素を作用させる手
法（Gubler, U and Hoffman, B.J., Gene, 25, 263-269
(1983); Okayama, Hand Berg, P., Mol. Cell. Biol.,
18, 5294 (1982))、市販のキットにより調製する方法
（cDNA合成キット：ライフテックオリエンタル社など）
等が挙げられる。

【００１２】なお、上記cDNA合成後のcDNA集団の中に
は、測定用又は標準用cDNAとして使用される目的遺伝子
の他に、当該目的遺伝子に対応しないcDNAも含まれてい
る。そこで、本発明においては、後述の、アダプター付
加反応及び特定のプライマー（例えばアダプタープライ
マー及び遺伝子特異的プライマー等）を用いたPCR反応
により、上記cDNA中の目的遺伝子を増幅し、量比の測定
をすることができるようにすることができる。

【００１３】(2) アダプターの調製本発明は、前記の通り、種類の異なるアダプターが付加
されたDNAを同一の反応系、すなわち同一の反応試験管
内において一度に測定することを特徴とするものであ
る。異なる種類のアダプターとは、あるDNAを増幅した
ときに他のDNAを区別することができるように設計され
たものであって、二本鎖の測定用cDNAに連結することが
できる二本鎖のオリゴヌクレオチドを意味する。増幅断
片を互いに区別し得るものであればアダプターの種類に
限定されるものではなく、例えばオリゴヌクレオチド長
の異なるもの等が挙げられる。

【００１４】本発明において同一の反応系に使用するこ
とのできるアダプターの数（種類）は特に限定されるも
のではないが、好ましくは6〜７種類までである。従っ
て、使用するアダプターの種類の範囲内で、標準cDNAに
付加すべきアダプターの種類と、測定用cDNAに付加すべ
きアダプターの種類とを適宜選択することができる。例
えば、1種類のcDNAを測定しようとする場合は、測定用c
DNAに付加すべきアダプターは1種類となる。一方、標準
曲線を作成するには少なくとも2つのデータを得ること
が必要であるため、標準cDNAは少なくとも2段階に濃度
調製することとなる。従って、アダプターの種類は最低
3種類となる。上記好ましいアダプター数（６〜７種
類）を用いる場合は、標準cDNAに付加すべきアダプター
は５〜６種類まで（すなわち、標準cDNAの濃度調製すべ
き段階数は５〜６段階まで）に設定することができる。

【００１５】上記と同様に、３種類のcDNAを測定しよう
とする場合は、測定用cDNAに付加すべきアダプターは３
種類となり、標準DNAに付加すべきアダプターは、例え
ば３又は４種類（すなわち、濃度調製すべき段階数は３
又は４段階）に設定することができる。本発明において
使用されるアダプターは、cDNAの付着末端（制限酵素
処理により得ることができる）とアニーリングすること
ができる突出部の一本鎖の配列（付着末端配列とい
う）、各アダプターごとに異なる長さの配列（スペー
サー配列という）、及び各アダプターに共通する配列
（共通配列という）から構成されており、付着末端配
列、スペーサー配列及び共通配列がこの順序で連結され
たものである（スペーサー配列及び共通配列は二本鎖を
構成する）（図１）。

【００１６】図１Aにおいて、付着末端配列2は、RNAか
ら逆転写されたcDNAを適当な長さに切断するときに使用
する制限酵素の種類に応じて適宜設計することができ
る。また、共通配列1及びスペーサー配列3も任意に設計
することができる。スペーサー配列は、オリゴヌクレオ
チドの鎖長を異にするのみならず、使用するアダプター
ごとにスペーサーのオリゴヌクレオチド配列を異にする
こともできる。但し、最も短いアダプターにはスペーサ
ー配列3を入れても入れなくてもよい。

【００１７】本発明において、共通配列1は20〜30塩基
を最小単位とする。従って、上記スペーサーの配列を変
えることにより、種々の長さのアダプターを作製するこ
とができる(図１A)。例えば、6種類のアダプターを使用
する場合は、最小のアダプターの長さは20〜30塩基と
し、これに適当な長さのヌクレオチド（2〜4塩基）を順
次付加しながら、付着末端配列を除く最短の配列を有す
るアダプターとして塩基数20のものを、付着末端配列を
除く最長の配列を有するアダプターとして32〜54塩基の
ものを作製することができる。その結果、上記スペーサ
ーの配列の長さに応じて長さの異なるアダプターを得る
ことができ、これにより後述のPCR産物を区別すること
ができる。これらのアダプターは、公知の手法により、
例えばPerkin-Elmer社のDNA合成装置を用いた化学合成
により得ることができる。なお、上記したアダプター
数、オリゴヌクレオチド数等によって本発明の範囲が限
定されるものではない。

【００１８】(3) アダプターの付加次に、測定用cDNAのそれぞれに、それぞれ異なる種類の
アダプターを付加する。同様に、標準cDNAにも互いに異
なる種類のアダプターをそれぞれ付加する。本発明にお
いては、測定用cDNAに付加するアダプターの量が不足し
ないようにするため、アダプターを各試料に過剰に混合
することができる。この場合は、過剰に混合したアダプ
ターを除去するため、すなわち、アダプターが付加した
試料のみを回収できるようにするため、ある特定の物質
及びその物質と特異的に反応する物質のうちいずれか一
方（例えば抗体に対する抗原、酵素に対するその基質、
ストレプトアビジンに対するビオチン等）を各試料中の
cDNAに付加しておくことが好ましい。上記物質の他方を
反応容器の固相に固定しておくと、上記物質同士の特異
的反応によりアダプターが付加されたcDNAを回収するこ
とができる（図１B）。図１Bでは、ビオチン（cDNAの末
端に「-b」と表示）、ストレプトアビジン7、及び回収
を容易にする磁気ビーズ8を例示した。

【００１９】但し、原料であるRNAの量が多い場合は、R
NAの逆転写により得られるcDNAの量と遊離のアダプター
との相対的な差は少ないと考えられる。従って、このよ
うな場合はアダプターを除去する必要がないため、上記
特定の物質を付加しなくてもよい。アダプターと測定用
cDNAとの連結、及びその後の工程を、測定用cDNAとして
3種類（DNA₁、DNA₂及びDNA₃とする）、標準cDNAとして
１種類を挙げて以下に説明する（図2）。測定用cDNAで
あるDNA₁、DNA₂及びDNA₃に、アダプター（長さを変え
たものであって、それぞれAP1、AP2及びAP3とする）を
付加し、アダプターの長さの相違により区別できるよう
にする。アダプターが付加された測定用cDNAは、いずれ
も1倍量に調製する(図2A)。

【００２０】一方、標準cDNAは段階的に濃度調製し、各
濃度のDNAのそれぞれに、種類の異なるアダプターを付
加する。例えば、図2において10倍量、3倍量及び1倍量
に段階的に調製した標準cDNAに、それぞれ長さの異なる
アダプターAP4、AP5及びAP6を付加する。但し、DNAの濃
度調製は上記の通り10:3:1に限定されるものではなく、
標準曲線を作成するために最も良い条件を設定すること
ができる。従って、アダプターの種類が3種類の場合
は、1:10:100、1:5:25などのように、任意に濃度を設定
することができる。なお、「1倍量」とは、段階的に濃
度調製するときの基準量をいう。

【００２１】(4) 混合及び増幅上記の通り調製した各cDNAを1つの反応チューブに混合
し、当該cDNAを鋳型として、アダプタープライマー及び
遺伝子特異的プライマーを用いて増幅反応（PCR)を行
う。アダプタープライマーとは、本発明に用いるアダプ
ターの配列と相補的な配列を有し、かつハイブリダイズ
することができるオリゴヌクレオチドを意味する（図１
Ｃ）。但し、アダプタープライマーの配列のうち少なく
とも15塩基は共通配列とハイブリダイズすることが必要
である。図1Cにおいて、アダプタープライマー5のヌク
レオチド配列は、アダプターのうち共通配列1の配列に
応じて任意に設計し合成することができる。この場合、
上記アダプタープライマー5のヌクレオチド配列の長さ
は15〜50塩基、好ましくは25〜30塩基である。ハイブリ
ダイズさせるアダアプタープライマー5は、アダプター
の二本鎖のうち長い方の鎖とハイブリダイズするように
設計する。

【００２２】本発明においては、PCR後の増幅産物が検
出機により検出されるように、アダプタープライマーに
適当な標識9をしておくことが好ましい(図1C)。標識9の
標識物質としては、蛍光標識にあってはフルオレセイ
ン、ローダミン等が挙げられ、放射性物質標識にあって
は³²P、³⁵S等が挙げられる。これらの標識物質のプライ
マーへの標識は、公知手法に従って行うことができる。
一方、遺伝子特異的プライマーとは、測定用cDNA4の配
列と相補的な配列を有し、かつハイブリダイズすること
ができるオリゴヌクレオチドを意味する(図1C)。遺伝子
特異的プライマー6のヌクレオチド配列の長さは15〜50
塩基、好ましくは25〜30塩基である。

【００２３】PCRの条件は、増幅目的のcDNAにより適宜
変更することができる。例えば、増幅の条件は、90℃〜
98℃で15秒〜1分、好ましくは94℃で20秒の変性工程、3
7℃〜72℃で15秒〜1分、好ましくは50℃で40秒のアニー
リング工程、及び50℃〜75℃で15秒〜1分、好ましくは7
2℃で40秒の伸長工程を１サイクルとしてこれを30〜40
サイクル、好ましくは35サイクル行う。但し、Taq Gold
(Perkin-Elmer社）を使用する場合は、上記増幅サイク
ルの前に95℃で10分の活性化工程を加えることが好まし
く、また、増幅されたDNAのうち未伸長断片を完全に伸
長させるために、増幅サイクルの後に72℃で10〜30分の
伸長工程を加えることもできる。さらに、測定を別の日
に行うことができるようにするために、増幅産物を凍結
保存（例えば-20℃）することもできる。

【００２４】(5) 検出得られた増幅産物の検出は、種々の方法により行うこと
ができる。例えば、PCRに使用するプライマーに予め蛍
光色素等を標識したときは蛍光強度として検出すること
ができ、放射性物質で標識したときはX線フィルムに感
光後デンシトメーターで検出することができる。また、
増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR
Green液等により染色し、そして増幅産物のバンドの強
度を測定することもできる。

【００２５】段階的に濃度調製した標準cDNAの各群にそ
れぞれ異なる種類のアダプターを連結（付加）すると、
アダプターが付加された標準cDNAは、PCR後の測定工程
において、アダプターの種類に対応して各断片ごとに区
別して測定される。本発明の方法は、この標準cDNAの区
別された各測定値に基づいて標準曲線（例えば1次関
数、2次関数等の数学的関数）を作成し、その標準曲線
に、測定用cDNAの測定値を外挿することにより、標準cD
NAに対する量比を測定する。

【００２６】増幅産物は、所定の測定機（例えばPerkin
-Elmer社製シークエンサー）で測定することができる。
図2において、10倍量、3倍量、1倍量に調製した標準cDN
Aの測定結果（蛍光強度）が、アダプターの鎖長の違い
によりピークの位置を異にしてそれぞれP1、P2及びP3の
ように表れたとすると（図2B、黒色のピーク)、標準曲
線は図2Cのように表すことができる。図2Cのグラフは1
次関数として表すことができるので、測定用cDNAの蛍光
強度を当該関数の式に代入することにより、測定用cDNA
は標準cDNAに対して何倍量発現しているかを知ることが
できる。例えば、図2において、DNA₂について得られた
蛍光強度値が500であるとすると（図2BのP5)、図2Cによ
り、倍率は５となる。従って、測定用cDNAであるDNA
₂は、標準cDNAに対して5倍の発現をしていることが分か
る。DNA中の当該遺伝子由来のmRNAの絶対量が分かって
いる場合は、測定用cDNAの絶対量を知ることができ、mR
NAの絶対量が分かっていない場合は、発現の相対比を求
めることができる。

【００２７】さらに、標準cDNAの絶対量は既知であって
も未知であってもよい。cDNAの絶対量がわかっている場
合は、測定用cDNAの絶対量を知ることができ、標準cDNA
の絶対量がわからない場合は、標準cDNAに対する測定用
cDNAの量比を知ることができる。最後に、上記の通り得
られた測定結果を指標として、試料として使用した組織
中の当該遺伝子のRNAの発現量比が検出される。

【００２８】２．本発明の方法による遺伝子発現パター
ンの解析本発明の方法により、検出目的のRNAを正確に検出する
ことができるため、同一種類の遺伝子の発現パターンを
その個体の発育段階ごとに検出すると、様々な遺伝子の
発現パターンを解析することができる。例えば、あるマ
ウスの遺伝子について生後数日、生後10日前後、生後数
週後の発現量を測定すると、発育に従ってその発現量が
増加する遺伝子もあれば減少する遺伝子もある。また、
発育段階に関わらず発現量が一定のものもある。従っ
て、これらの発現パターンの態様によって遺伝子をいく
つかの群に分類することができる。さらに、健常人の発
現パターンと、ある疾患に罹った被検者の遺伝子の発現
パターンとを検出することにより、どの遺伝子が変化を
受けているかを判断することもできる。

【００２９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。〔実施例1〕 ATP合成酵素カップリング因子(ATP syntha
se coupling factor)遺伝子のRNAの検出本実施例は、ATP合成酵素カップリング因子遺伝子のRNA
の検出を目的とするものである。目的とするマウス小脳
組織由来のRNAをトリゾール（trizole; Giboco-BRL)等
で抽出した。3 μg の総 RNAと1.5 pmolの５’ビオチン
化オリゴdTを11μl の蒸留水に溶解した。次に、70℃ 5
分間加熱した後、室温に戻した。次に、RNAからcDNAの
合成を行った。

【００３０】 (1) 第一鎖 cDNA の合成 cDNA合成用反応液組成 0.1 M DTT 2 μl ５ｘ第一鎖バッファー (Gibco-BRL) 4 μl 10 mM dNTP 1 μlRNase 阻害剤 1 μl

【００３１】上記反応組成液を42℃で2分間加熱後、sup
erscript II 200 units/μl を１μl 加えた。37℃で30
分間加熱後、42℃で30分間加熱した。氷上に移した後、
以下の第二鎖cDNA合成用試薬を加えた。

【００３２】 (2) 第二鎖 cDNA の合成 cDNA合成用反応液組成 10x 第二鎖合成用バッファー 10μl 10 mM dNTP 4μl 100 mM DTT 2μl E. coli DNA リガーゼ 2μl (20 units) E. coi DNAポリメラーゼＩ 4μl (40 units)E. coli RNase H 1μl (2 units) 全量（蒸留水で調整） 100 μl

【００３３】上記反応液を16℃で2時間保温した後、70
℃で30分間加熱することにより酵素を失活させた。上記
反応液の40μl を新しいチューブへ移した。

【００３４】 (3) 制限酵素による切断反応液組成 10x K バッファー 10 μl 上記cDNA溶液 40 μlMbo I 10 units 全量（蒸留水で調整） 100 μl

【００３５】上記反応液を37℃で30分処理することによ
り、cDNAを切断した。次に、cDNA断片をフェノール-ク
ロロホルム抽出により抽出し、エタノール沈殿を行っ
た。70%エタノールを用いてcDNAのリンスを２回行い、5
00 μl の 0.1xTE バッファーに溶解した。

【００３６】 (4) アダプター付加反応反応液組成 10x T4ライゲーションバッファー 7.5μl 10 pmol/μl MA-1Lアダプター 7.5μl 10 pmol/μl MA-1Sアダプター 7.5μl T4 DNAリガーゼ 350 units (TaKaRa)上記Mbo I 切断cDNA 50μl 全量（蒸留水で調整） 75μl

【００３７】なお、アダプター名MA-1L 及びMA-1Sの
「L」及び「S」は、それぞれ各アダプターの長鎖及び短
鎖を意味する。上記反応液を16℃で一晩保温した。アダ
プター及びアダプタープライマーのオリゴヌクレオチド
配列は以下の通りである。

【００３８】

【００３９】本実施例では、標準cDNAとしてマウス成体
の全脳から小脳を除いた脳由来のcDNAを使用した。この
cDNAに、アダプターMA-6、MA-3又はMA-1を結合させ、3
種類のアダプター付加cDNAを調製した。一方、検出対象
として、上記マウスの小脳由来cDNAを用い、生後４日の
cDNAにはMA-2、生後12日のcDNAにはMA-4、そして生後６
週のcDNAにはMA-5を連結した。アダプター付加反応の
後、5M NaCl 25μlを加え、ストレプトアビジン被覆常
磁気性ビーズ 10mg/ml 20μl を加え、氷上で吸着させ
た。

【００４０】次に、全脳由来cDNA並びに生後4日、12日
及び6週の小脳由来cDNAを以下の量に調製し、それぞれ
を混合した。標準cDNAのうち、1倍量のcDNAにはMA-6を
連結したものを、3倍量のcDNAにはMA-3を連結したもの
を、10倍量のcDNAにはMA-1を連結したものを用いた。ま
た、検出対象は生後4日、12日及び6週の小脳由来のcDNA
を用い、いずれも1倍量とした。

【００４１】全脳由来cDNA (MA-1を連結) 30μｌ全脳由来ｃＤＮＡ（ＭＡ−３を連結) 9μl 全脳由来cDNA (MA-6を連結) 3μl 生後4日の小脳由来cDNA（MA-2を連結） 3μl 生後12日の小脳由来cDNA（MA-4を連結） 3μl生後16週の小脳由来cDNA（MA-5を連結） 3μl

【００４２】蒸留水120 μlでビーズを洗浄後、それぞ
れ120 μlの蒸留水を加えた。2.1 μlずつ 96 ウェルマ
イクロタイタープレートに分注し、0.4 μl (10 pmol/
μl)の遺伝子特異的プライマー（ATP合成酵素カップリ
ング因子遺伝子に対する特異的プライマー）配列を加え
た。遺伝子特異的プライマーの配列（小脳由来及び全脳
由来cDNAともに同一）： 5'-ATGACAAATTACCACATGGA-3'（配列番号14）次に、2x TaqGold混合物 2.5μl を加えた（5 μl/サン
プル)。反応液組成は以下の通りである。

【００４３】 2x TaqGold混合物 10x PCR バッファー 54 μl 20 mM dNTP 4 μl 10 pmol/μl 6-FAM-C1S 20 μlTaqGold 5 μl (25 units) 全量（蒸留水で調整） 270 μl

【００４４】PCR反応は以下の条件で行った。すなわ
ち、TaqGold 活性化のため95℃で10分反応させた後、94
℃で20秒、50℃で40秒及び72℃で40秒のサイクルを１サ
イクルとして40サイクル行った。反応終了後、72℃で20
分保温した。反応液に、T4混合物 5μl を加え、37℃で
２時間保温した。

【００４５】 T4混合物の組成 10x K バッファー 27μlT4 DNAポリメラーゼ 20 units 全量（蒸留水で調整） 270μl

【００４６】上記T4混合物の1 μl をとり、7 μl のホ
ルムアミド色素を加えた。この希釈したサンプルに等量
のマーカーミックスを加え、95℃で3分加熱した。加熱
後、0.8 μl ずつDNA シークエンサー（Perkin-Elmer
社）にかけた。その結果、図3aに示す蛍光強度のピーク
が得られた。図3aにおいて、黒色のピークは標準cDNAの
もの、白色のピークはマウス小脳由来DNAのものであ
る。この黒色のピークの蛍光強度に基づいて標準曲線を
描いたところ、図3bに示すものが得られた。この標準曲
線に基づいてマウス生後4日、12日及び6週のcDNAを測定
したところ、標準cDNAの発現量に対してそれぞれ2.5
倍、4倍及び2.8倍の発現量を有することが分かった。

【００４７】〔実施例2〕本実施例では、5種類の遺伝子
のそれぞれについて、実施例１と同様にして発現量の比
を測定した。標準cDNAは、実施例1と同様全脳由来cDNA
を使用した。結果を表１に示す。

【００４８】

【表１】

【００４９】表１中、Aはマウスセリン/スレオニンプロ
テインキナーゼDLK遺伝子、B及びＥは未確認の新規遺伝
子、Ｃはマウス局所接着性キナーゼ遺伝子、Dはマウス
リボゾームタンパク質S6キナーゼ遺伝子(rsk)について
の測定結果を示す。Aのうち、MA-2、MA-4及びMA-5は遺
伝子にそれぞれアダプターMA-2、MA-4及びMA-5を付加し
たときの検出結果（蛍光強度）を、MA-1、MA-3及びMA-6
はマウス全脳由来のcDNAにそれぞれアダプターMA-1（10
倍量）MA-3（3倍量）及びMA-6（1倍量）を付加したとき
の検出結果（蛍光強度）を示す。A〜Eの標準曲線の相関
係数は１に近く、いずれも正しい曲線が描かれているこ
とを示している。

【００５０】上記結果に基づき、全脳に対するそれぞれ
のサンプルでの発現量比を、標準曲線で算出した場合
と、標準cDNAとしてMA-3が付加された全脳cDNAのみを使
用した場合との比較を行った。結果を表２に示す。A〜E
において、上段の数字は標準曲線を使って得られた発現
量比を、下段の数字は1個の標準cDNA（MA-3付加全脳cD
N）のみを用いて算出した比を示す。表2に示すように上
段の数値と下段の数値との間でばらつきが大きいものが
あり（表2、A及びD)、標準曲線を作成することにより正
確な測定をすることができることが分かった。

【００５１】

【表２】

【００５２】〔実施例3〕遺伝子の分類マウス小脳のcDNAライブラリーから無作為に抽出したク
ローンの塩基配列のプール（約7000)から選択した419個
のDNAに対して、生後4日（顆粒細胞の増殖の最盛期）、
生後12日（顆粒細胞の移動、軸索伸長シナプス形成の最
盛期）、及び生後6週（成体）の3種類の検体における発
現の相対量を本発明の方法により測定した。アダプター
は実施例1と同様のものを用い、標準cDNAとしてマウス
全脳（小脳を除く）由来のcDNAを用いた。アダプター連
結、PCR及び検出は実施例1と同様に行った。発現のパタ
ーンによって遺伝子を分類するために、クラスター分析
（ウォード法）を行った。

【００５３】その結果、419個の遺伝子が19個のクラス
ターに分類された。これらのクラスターは、4つの大き
なグループに分類された（図4)。また、それぞれのクラ
スターの発現パターンを図5に示す。図5において、aは
発育に従って増加する遺伝子、bは発現段階に関わらず
ほぼ一定の発現量を示す遺伝子、cは生後12日に発現の
ピークを示す遺伝子、dは発育に従って発現量が減少す
る遺伝子の発現パターンである。図5の各グラフに付さ
れた番号は、図4における各クラスターの番号と対応す
る。従って、例えば図4のグループ1（クラスター1〜4)
は、図5aに示すように発育に従って発現量が増加する群
であることがわかる。

【００５４】また、上記419個の遺伝子を、タンパク質
キナーゼをコードする遺伝子群、リボゾームタンパク質
をコードする遺伝子群、骨格筋タンパク質をコードする
遺伝子群及び脳に関与するタンパク質をコードする遺伝
子群の4つのカテゴリーに分け、これらの遺伝子がどの
グループに属するかを調べた。結果を図6に示す。例え
ば、大部分のリボゾームタンパク質は生後4日を頂点と
するグループに属し、細胞骨格に関する遺伝子はグルー
プ3及び4のみに属する。これに対し、タンパク質キナー
ゼには、特徴的な発現パターンはない。さらに、小脳特
異的遺伝子は、12日に発現量の頂点があるグループ３
と、成体に発現量の頂点があるグループ1にのみ認めら
れる。このことは、小脳特異的発現パターンと発生過程
の発現パターンとが密接に連関していることを示す。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、RNAの検出方法が提供さ
れる。本発明の方法は、目的遺伝子の発現量を高精度に
検出することができるため、特定の疾患に関与する遺伝
子の検出等に有用である。

【００５６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KATO, Kikuya <120> A method for detecting RNA <130> P99-0599 <150> JP99/145440 <151> 1999-05-25 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gatccgcgtt ctaacgacaa tatgtac 27 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gtacatattg tcgttagaac gcg 23 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gatctcttag cgttctaacg acaatatgta c 31 <210> 4 <211> 27 <212> DNA ＜２１３＞ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 gtacatattg tcgttagaac gctaaga 27 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 gatccacgat tagcgttcta acgacaatat gtac 34 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 gtacatattg tcgttagaac gctaatcgtg 30 ＜２１０＞７＜２１１＞３７＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｑｕｅｎｃｅ <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 gatcgagcac tcttagcgtt ctaacgacaa tatgtac 37 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 gtacatattg tcgttagaac gctaagagtg ctc 33 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 gatcctaagc taccagttag cgttctaacg acaatatgta c 41 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 gtacatattg tcgttagaac gctaactggt agcttag 37 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 gatcagcgtt agagccttta gtgcgttcta acgacaatat gtac 44 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 12 gtacatattg tcgttagaac gcactaaagg ctctaacgct 40 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 13 gtacatattg tcgttagaac gc 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 14 atgacaaatt accacatgga 20

【００５７】

【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成DNA 配列番号２：合成DNA 配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA 配列番号５：合成DNA 配列番号６：合成DNA 配列番号７：合成DNA 配列番号８：合成DNA 配列番号９：合成DNA 配列番号10：合成DNA 配列番号11：合成DNA 配列番号12：合成DNA 配列番号13：合成DNA 配列番号14：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に使用するアダプターの概略図である。

【図２】本発明の検出方法の概要を示す図である。

【図３】マウス小脳の発現パターンを検出した結果を示
す図である。

【図４】クラスター分析結果を示す図である。

【図５】4つのグループに分類されたそれぞれのクラス
ターの発現パターンを示す図である。

【図６】マウスの生後の小脳に含まれる各種遺伝子の分
類結果を示す図である。

【符号の説明】

１：共通配列２：付着末端配列３：スペーサー
配列４：測定用cDNA ５：アダプタープライマー６：遺伝子特異的プライ
マー７：ストレプトアビジン８：磁気ビーズ
９：標識

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/00 - 3/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の工程： (a)検出の対象となるRNA及び標準RNAをそれぞれ逆転写
させて測定用cDNA及び標準cDNAを得、 (b)同一の反応系に使用することができる、標準cDNAに
付加すべきアダプターと測定用cDNAに付加すべきアダプ
ターとを含む種類の異なる複数のアダプターを用意し、 (c)段階的に濃度調製した標準cDNAの各群に、それぞれ
種類の異なる前記標準cDNAに付加すべきアダプターを付
加し、 (d)測定用cDNAに、前記測定用cDNAに付加すべきアダプ
ターを付加し、 (e)前記(c）及び(d）により得られたアダプター付加cDN
Aを混合して増幅し、 (f)測定用cDNAの標準cDNAに対する量比を測定し、 (g)前記測定結果からRNAを検出することを含む、前記RN
Aの検出方法。
【請求項２】種類の異なるアダプターが、互いに長さ
の異なるヌクレオチドからなるものである請求項１記載
の検出方法。
【請求項３】増幅が、アダプタープライマー及び遺伝
子特異的プライマーを用いたものである請求項1記載の
検出方法。