JPH11512293A

JPH11512293A - 高密度オリゴヌクレオチドアレーに対するハイブリダイゼーションによる発現モニター

Info

Publication number: JPH11512293A
Application number: JP9512174A
Authority: JP
Inventors: ロックハート，ビデッド，ジェイ．; ブラウン，ユージーン，エル．; ウォン，ゴードン; チー，マーク; ジンジャーズ，トーマス，アール．; ミットマン，マイケル，ピー．; リップシャッツ，ロバート，ジェイ．; フォドー，ステファン，ピー．，エー．; ワン，チャンウェイ
Original assignee: アフィメトリックス，インコーポレイティド
Priority date: 1995-09-15
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 1999-10-26
Also published as: DE69625920D1; HK1015416A1; EP0853679A1; DE69625920T2; US20030215841A1; US6040138A; US20050158746A1; US6927032B2; US20020012940A1; CA2232047A1; WO1997010365A1; EP0853679B1; AU7073496A; ATE231559T1; US6548257B2; US6410229B1; US20050202500A1

Abstract

(57)【要約】本発明は多数の遺伝子の発現レベルをモニターする方法を提供する。この方法はオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレーに核酸サンプルをハイブリダイゼーションさせることを含み、ここでこの高密度アレーは核酸サンプル中の標的核酸のサブ配列に相補性であるオリゴヌクレオチドプローブを含む。一の態様において、本発明は、もしくは複数種の前記遺伝子のRNA 転写体を含んで成る標的核酸又はこのRNA 転写体に由来する核酸のプールを用意する；前記核酸のプールを表層上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーにハイブリダイゼーションさせて；ここで前記アレーは 100種以上のオリゴヌクレオチドを含んで成り；ここで各オリゴヌクレオチドは前記表層の所定の領域に局在しており；前記種々のオリゴヌクレオチドの密度は１cm²当り約60本以上のオリゴヌクレオチドであり；そして前記オリゴヌクレオチドプローブは前記RNA 転写体又は前記RNA転写体に由来する前記核酸のサブ配列に対して相補性である；そして前記アレー中のハイブリダイゼーションした核酸を定量する；ことを含んで成る方法。

Description

【発明の詳細な説明】高密度オリゴヌクレオチドアレーに対するハイブリダイゼーションによる発現モニター発明の背景多くの疾患状態は遺伝子DNA のコピー数の変化を介する又は特定遺伝子の転写レベルの変化（例えば開始のコントロール、RNA 前駆体の具備、RNA プロセシング等）を介する様々な遺伝子の発現レベルの相違を特徴とする。例えば、遺伝子材料の損失及び増加は悪性形質転換及び進行において重大な役割を果たす。このような増大及び損失は少なくとも２種類の遺伝子により「駆動」されると考えられている。癌遺伝子は腫瘍形成のポジティブな調節因子であり、腫瘍抑制遺伝子は腫瘍形成のネガティブな調節因子である（Marshall，Cell，64 : 313-326（19 91）; Weinberg，Sceince，254 : 1138-1146（1991））。従って、無秩序な増殖を活性化する一のメカニズムは癌遺伝子タンパク質をコードする遺伝子の数の増大又はこのような癌遺伝子の発現レベルの増大（例えば、細胞又は環境の変化に応答して）であり、そしてその他のメカニズムは遺伝子材料の損失又は腫瘍抑制因子をコードする遺伝子の発現レベルの低下である。このモデルはグリオーム進行に関わる遺伝子材料の損失及び増大により支持される（Mikkelson ら、J．Cel lular Biochm．46 : 3-8（1991））。即ち、特定の遺伝子（例えば癌遺伝子又は腫瘍抑制因子）の発現（転写）レベルの変化は様々な癌の存在及び進行の道標を担う。同様に、細胞周期及び細胞発育のコントロール並びに疾患は特定の遺伝子の転写レベルの変化を特徴とする。即ち、例えば、ウィルス感染は往々にして特定ウィルスの遺伝子の高揚した発現を特徴とする。例えば、単純ヘルペス、アプステイン−バ−ウィルス感染（例えば、感染性単核細胞症）、サイトメガロウィルス、バリセラ−ゾスタ−ウィルス感染症、パボウィルス感染症、ヒトパピロマウィルス感染症等の発症は全て対応のウィルスの中に存在する様々な遺伝子の高揚したレベルを特徴とする。特徴的なウィルス遺伝子の高揚した発現レベルの検出は疾患状態の有効な診断を提供する。詳しくは、ウィルス、例えば単純ヘルペスは短期間で迅速な複製を勃発するためだけに期間休止状態に入る。特徴的なウィルス遺伝子の発現レベルの検査はかかる活性増殖（そしておそらくは感染）状態の検査を可能にする。オリゴヌクレオチドプローブは注目の核酸（「標的核酸」）における相補性核酸配列を検出するために長い間使用されており、そして特定の遺伝子の発現を検出するために利用されている（例えばノーザンブロット）。一部のアッセイ方式において、オリゴヌクレオチドプローブは固相支持体に共有付加により連結され、そして固相支持体上に固定化された一連のオリゴヌクレオチドプローブは標的核酸の中の特定の核酸配列を検出するのに利用されている。例えば、PCT 特許公開No．WO89/10977及び89/11548を参照のこと。その他の者は標的核酸の完璧な核酸配列を供するための大量のオリゴヌクレオチドプローブの利用を提唱しているが、しかしこの目的のために一連の固定化プローブを利用することができる方法の提供に失敗している。米国特許第 5,202,231及び 5,002,867号、並びにPCT 特許公開No．WO93/17126号を参照のこと。遺伝子発現をモニター又は定量するための「伝統的」なハイブリダイゼーションプロトコールの利用は問題である。例えば、ほぼ同じ分子量の２種以上の遺伝子生成物はノーザンブロットで区別することが困難又は不可能であると証明されており、なぜならそれらは電気泳動法により容易に分離されないからである。同様に、ハイブリダイゼーション効率及び交差反応性はプロービングする遺伝子の特定のサブ配列（領域）により変動するため、標的遺伝子に対する１種、又は数種のプローブによる遺伝子発現の正確且つ信頼できる測定を得ることは困難である。 VLSIPS（商標）技術の開発は非常に小さな表面積を占める多種多様なオリゴヌクレオチドプローブのアレーを合成するための方法を提供した。米国特許第 5,1 43,854号及びPCT 特許公開No．WO90/15070号を参照のこと。1993年６月25日検出の米国特許出願第 082,937号には、標的核酸の完璧な配列を提供する及び特定のヌクレオチド配列を含む核酸の存在を検出するために利用できうるオリゴヌクレオチドプローブのアレーを作成するための方法が記載されている。しかしながら、本発明以前では、高密度オリゴヌクレオチドアレーが大量のその他（非標的）の核酸（例えば、cDNAライブラリー中、mRNAから逆転写されたDN A 、直接使用したmRNA、又はDNA 鋳型から増幅もしくは重合したmRNAの存在下で多重の選定遺伝子のメッセージレベルを信頼性よくモニターできることはわかっていなかった。更に、従来技術は、特定のハイブリダイゼーション効率を最大にし、同時に交差反応性を最少限にする一連のオリゴヌクレオチドプローブセットを同定するための迅速且つ有効な方法も、標的核酸濃度の定量のためにハイブリダイゼーションパターンを利用すること（特に、複数のオリゴヌクレオチドプローブが各標的核酸に特異的となっている多重オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションパターン）も供していない。発明の概要本発明は、多種多様のオリゴヌクレオチドプローブのマイクロ構築アレー（DN A チップ）が標的核酸配列の有無を検出するのみならず、複雑な核酸プール中の標的配列の相対的な量を定量するためにも有効に利用されうるという発見をある程度前提にしている。更に、比較的短いオリゴヌクレオチドプローブ（例えば20 量体）は、特に高密度オリゴヌクレオチドプローブアレーにおいて供されたときに核酸の複雑な混合物の中での遺伝子発現の定量を可能にするのに特に十分であることも発見された。本発明以前では、高密度プローブアッセイに対するハイブリダイゼーションは、標的核酸よりも 1,000倍〜1,000,000 倍又はそれより多くの数の核酸の複雑な集団の中で特定の遺伝子の発現レベルのごくわずかな変化を同定及び定量できることが知られていなかった。また、特定遺伝子の転写レベルはほんのわずかな（例えば20又は10未満でさえもの）比較的短いオリゴヌクレオチドプローブによって複雑な核酸混合物の中で定量できうることも知られていなかった。即ち、本発明は多重遺伝子の発現を同時モニター（例えば発現の検出及び／又は定量）する方法を提供する。事実上任意の数の遺伝子の転写レベルが同時に決定し得る。一般に、約10種以上の遺伝子、好ましくは約 100種以上、より好ましくは約 1,000種以上、そして最も好ましくは約10,000種以上の遺伝子が一度にアッセイできる。この方法は１もしくは複数種の前記遺伝子のmRNA転写体を含んで成る標的核酸のプール又はmRNA転写体に由来する核酸のプールを用意する；この核酸のプールを表層上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーにハイブリダイゼーションさせる、ここでこのアレーは 100種以上のオリゴヌクレオチドを含んで成り、各々のオリゴヌクレオチドは前記表層の所定の領域に位置し、各々のオリゴヌクレオチドは一本の共有結合を介してその表層に付加されており、種々のオリゴヌクレオチドの密度は１cm²当り約60種以上のオリゴヌクレオチドとなっており（ここで種々のオリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを意味する）、そしてこのオリゴヌクレオチドプローブはmRNA転写体又はmRNA転写体に由来する核酸に対して相補性である）；そしてこのアレー中のハイブリダイゼーションした核酸を定量する；ことを含む。この方法は更に前記アレーに対する標的核酸のハイブリダイゼーションを定量する工程を含みうる。この定量は好ましくは遺伝子の転写レベルの尺度を供する。好適な態様において、標的核酸のプールは、標的核酸（mRNA転写体又はmRNA転写体に由来する核酸）の濃度がその標的核酸をコードする遺伝子の発現レベルに比例しているものである。好適な態様において、このオリゴヌクレオチドプローブのアレーは約 100種より多くの、好ましくは約 1,000種より多くの、より好ましくは約16,000種より多くの、そして最も好ましくは約65,000種又は 250,000種、更には 1,000,000種より多くの種々のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る高密度アレーである。かかる高密度アレーはcm²当り一般に約 100種より多くの、最も一般的には約 60 0種より多くの、往々にして約 1,000種より多くの、より往々にして約 5,000種より多くの、最も往々にして約10,000種より多くの、好ましくは約40,000種より多くの、より好ましくは約 100,000種より多くの、そして最も好ましくは約 400 ,000種より多くの種々のオリゴヌクレオチドプローブのプローブ密度を含んで成る（ここで種々のオリゴヌクレオチドとは異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを意味する）。これらのオリゴヌクレオチドプローブの長さが約５〜約50ヌクレオチド、好ましくは約５〜約45ヌクレオチド、更により好ましくは約10〜約40ヌクレオチド、そして最も好ましくは約15〜約40ヌクレオチドに範囲する。特に好適なアレーは長さ約20〜約25オリゴヌクレオチドに範囲するプローブを含む。このアレーは各標的遺伝子に対して特異的な10より多くの、好ましくは50より多くの、より好ましくは 100より多くの、そして最も好ましくは 1,000より多くのオリゴヌクレオチドプローブを含んで成りうる。好適な態様において、このアレーは各遺伝子に対して10種以上のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る。別の好適な態様において、このアレーは各遺伝子に対して20以下のオリゴヌクレオチドである。平らなアレー表層が好ましいが、このアレーは事実上任意の形状の表層又は複数の表層上で作成されうる。このアレーは更に誤対合コントロールプローブを含んで成りうる。かかる誤対合コントロールが存在しているとき、定量工程は各オリゴヌクレオチドプローブとその対応の誤対合コントロールプローブとの間でのハイブリダイゼーションシグナル強度の差を計算することを含んで成りうる。この定量は更に各オリゴヌクレオチドプローブと各遺伝子に対するその対応の誤対合コントロールプローブとの間でのハイブリダイゼーションシグナル強度の平均差を計算することを含んで成りうる。高密度アレーに存在するプローブは下記の選別及び最適化方法に従って選定されたオリゴヌクレオチドプローブでありうる。他方、非最適プローブをアレーの中に含ませてよいが、定量（分析）のために用いられるプローブは下記の最適化方法に従って選定されうるものとする。本発明の実施のためのオリゴヌクレオチドアレーは好ましくは平行固定化ポリマー合成法により、より好ましくは光誘導ポリマー合成法により化学合成されたものである。化学合成したアレーは、プローブ調製がクローニング、核酸増幅工程又は酵素合成を必要としない点で有利である。事実、プローブの調製は任意の生物材料の取り扱いを要しない。このアレーは試験プローブを含み、それはオリゴヌクレオチドプローブであり、それぞれは発現を検出すべき遺伝子の一つのサブ配列（又はmRNAもしくは対応のアンチセンスcRNA）に相補性な配列を有する。更に、このアレーは本明細書に記載の通り標準化コントロール、誤対合コントロール及び発現レベルコントロールを含んでよい。特に好適な態様において、各アレーの種々のコピー（バッチ内及び／又はバッチ間）の変動は20％未満、より好ましくは約10％未満、そして最も好ましくは約５％未満であり、ここでこの変動はこのアレーが発現を検出する各遺伝子につき少なくとも５種のオリゴヌクレオチドプローブ間で平均したハイブリダイゼーション密度の変動係数として測定する。核酸のプールはハイブリダイゼーションの前、中、後にラベル化してよいが、好適な態様においては、核酸はハイブリダイゼーション前にラベル化する。蛍光ラベルが特に好ましくは、単一燐光体(fluorophore)によるラベリングが特に好ましく、そして蛍光ラベリングを使用する場合、ハイブリダイゼーションした核酸の定量はハイブリダイゼーションした蛍光ラベル化核酸由来の蛍光の定量による。かかる定量はアレーの自動スキャンを可能にする自動式ステージが備っており、且つ自動測定記録及びその後の蛍光強度情報の処理のためのデーター獲得システムが備っていることのある蛍光顕微鏡の利用により助長される。好適な態様において、ハイブリダイゼーションは少なくとも１回の高度なストリンジェンシーでの洗浄を伴って、低ストリンジェンシーで行う（例えば約20℃〜約50℃、より好ましくは約30℃〜約40℃、そして最も好ましくは約37°、及び６Ｘ以下のSSPE−Ｔ）。ハイブリダイゼーションは所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性が達成されるまでストリンジェンシーを暫進的に高めるその後の洗浄を含みうる。ハイブリダイゼーションシグナルの定量は当業者に公知の任意の手段によって行ってよい。しかしながら、特に好適な態様において、定量は同焦点蛍光顕微鏡の利用により達成される。データーは好ましくは各オリゴヌクレオチドプローブとその対応の誤対合コントロールプローブとの間でのハイブリダイゼーションシグナル強度の差を計算することにより評価する。この差は各遺伝子毎に計算及び評価することが特に好ましい。特に好ましい分析方法を本明細書において提供する。標的核酸のプールは生物サンプルから単離された全ポリＡ⁺mRNAであるか、又はRNA の逆転写により作成されたcDNA、又は二本鎖cDNA、又は二本鎖cDNA中間体から転写されたRNA であってよい。他方、標的核酸のプールは、サンプルの複雑さを軽減し、それ故ハイブリダイゼーションにおいて得られるバックグランドを引き下げるように処理してよい。一のアプローチにおいて、生物サンプルに由来するmRNAのプールを、高密度アレーの中に存在するオリゴヌクレオチドプローブを含んで成るオリゴヌクレオチドのプールとハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションした核酸のプールを次に一本鎖領域を消化するRNase Ａで処理する。残った二本鎖ハイブリダイゼーション複合体を変性し、そしてオリゴヌクレオチドプローブを除去し、高密度アレーの中のオリゴヌクレオチドプローブに対して相補性なmRNAについて高揚したmRNAのプールが残る。バックグランドの低下のための別の手法において、生物サンプル由来のmRNAのプールを対合した特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせる。ここでこの対合した標的特異的オリゴヌクレオチドは高密度アレーの中のオリゴヌクレオチドプローブに対して相補性なmRNAのサブ配列に隣接する領域に対して相補性である。ハイブリダイゼーションした核酸のプールを次にハイブリダイゼーションした（二本鎖となった）核酸配列を消化するRNase Ｈで処理する。残った一本鎖核酸配列であって対合して標的特異的オリゴヌクレオチドの隣接する領域にほぼ相当する長さを有するものを単離し（例えば電気泳動により）、そして遺伝子発現をモニターするための核酸のプールとして使用する。最後に、バックグランドの低下のための第三の手法は、特に予備選定した標的 mRNAメッセージ（例えばサンプルの中で特徴的に過剰発現されるメッセージ）のプールの中での存在を失わせる又は少なくすることを含む。この方法は生物サンプルに由来するポリＡ⁺mRNAのプールに対し、所定の標的mRNAメッセージに対して相補性なオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションさせることを含む。このオリゴヌクレオチドプローブは相補性である特定の予備選定したポリＡ⁺mRNA（メッセージ）とハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションした核酸のプールを二本鎖（ハイブリダイゼーションした）領域を消化するRN ase Ｈで処理し、これによりこのメッセージをそのポリＡ⁺テールから分離させる。これによりプール中のポリＡ⁺mRNAの単離及び増幅（例えばオリゴdTカラムを使用して）は所定の標的mRNAメッセージの少なくなった又は含まないプールを供する。本発明の方法は既知の配列又はサブ配列の任意の所望の遺伝子の発現をモニター（検査及び／又は定量）するのに利用できうる。更に、これらの方法は大量の遺伝子の発現を同時にモニターすることを可能にし、そして軽減した労力、コスト及び時間の有意義な利点を及ぼす。多重遺伝子の発現レベルの同時モニターは、相対的な発現レベルの効率的な対比と、様々な遺伝子の相対的な発現レベルの変化を特徴とする生物学的症状の同定とを可能にする。発現モニターに関して注目される特定の遺伝子には様々な病理症状（例えば癌）に関わる経路に関与し、且つその発現がそれ故病理症状の指標となる遺伝子が含まれる。かかる遺伝子には、限定することなく、乳癌の症例におけるHER2(ｃ −erb− ２／neu)プロト癌遺伝子、胸、肝臓、膀胱、膵臓の癌腫を含む様々な腫瘍、並びにグリア芽腫、肉腫及び鱗状癌腫の病因に関わるレセプターチロシンキナーゼ(RTK)、並びに腫瘍抑制遺伝子、例えばＰ53遺伝子、並びにその他の「マーカー」遺伝子、例えばRAS，MSH2，MLH1 及びBCRA１が含まれる。発現モニターについて特に注目されるその他の遺伝子は免疫応答に関与する遺伝子（例えばインターロイキン遺伝子）、並びに細胞接着（例えばインテグリン又はセレクチン）及びシグナル伝達（例えばチロシンキナーゼ）に関与する遺伝子等である。別の態様において、本発明は１もしくは複数種の薬剤により影される遺伝子の同定方法、又は逆に特定の遺伝子に対して作用を及ぼす薬剤の同定のための薬剤のスクリーニングを提供する。これは１又は複数種の薬剤と接触した１又は複数種の細胞由来の標的核酸のプールを用意し、そしてそのプールを本明細書に記載の任意の高密度オリゴヌクレオチドアレーにハイブリダイゼーションさせることを含む。このアレー中のプローブにより標的とされる遺伝子の発現レベルを決定し、そして１又は複数種の薬剤に曝露していない「コントロール」細胞由来の遺伝子の発現レベルを比較する。１又は複数種の薬剤に応答して過剰発現又は抑制発現される遺伝子を同定するか、又は逆に１又は複数種の遺伝子の発現を改変させる１又は複数種の薬剤を同定する。もう更なる別の態様において、本発明は、本明細書に開示の任意の高密度オリゴヌクレオチドアレーを含んで成る組成物を提供し、ここでこのオリゴヌクレオチドプローブは１又は複数の蛍光ラベル核酸（これは遺伝子の転写産物又はそのような転写産物に由来するものである）に特異的にハイブリダイゼーションし、これにより蛍光アレーを形成しており、ここでこのアレーの蛍光体は多重遺伝子の転写レベルの指標となる。当業者はかかるハイブリダイゼーションしたアレーが対照、コントロールもしくは標準品（例えばキットの中に備った）として利用されうる、又はそれ自身サンプル中の多重遺伝子の発現レベルを指標する診断アレーとなりうることを理解するであろう。本発明は更に多重遺伝子の発現レベルの同時モニター用のキットも提供する。このキットは多重遺伝子の発現レベルの検出及び／又は定量のためのこのアレーの利用を説明する仕様書も含んでよい。このキットは更に１又は複数の下記のものを含みうる：バッファー、ハイブリダイゼーションミックス、洗浄及び測定溶液、ラベル、ラベル用試薬（酵素等）、「コントロール」核酸、プローブ選別用ソフトウェア、アレー測定用の又はデーター分析用の、並びに請求の範囲記載の方法の実施のために本明細書に記載の任意のその他の材料又は試薬。別の態様において、本発明は標的核酸（例えば発現をモニターする１又は複数種の遺伝子、又はこの遺伝子又はその転写mRNAに由来する核酸）に特異的に結合する一式のオリゴヌクレオチドプローブを選別する方法を提供する。この方法はオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレーの用意を含み、ここでこのアレーは複数のプローブを含んで成り、ここで各プローブは標的核酸のサブ配列に対して相補的である。次いでこの標的核酸をオリゴヌクレオチドプローブのアレーにハイブリダイゼーションさせ、各プローブとその誤対合コントロールとの間のハイブリダイゼーションシグナル強度の差が検出可能（好ましくはバックグランドシグナル強度の約10％より高い、より好ましくはバックグランドシグナル強度の約20％より高い、そして最も好ましくはバックグランドシグナル強度の約50％より高い）であるプローブを同定及び選別する。この方法は更にこのアレーを標的核酸以外の核酸を含んで成る第二核酸プールにハイブリダイゼーションさせ；そして最低のハイブリダイゼーションシグナルを有するプローブを同定及び選別することを含んで成ってよく、ここでこのプローブとその誤対合コントロールの双方はバックグランドシグナル強度の約５倍以下、好ましくはバックグランドシグナル強度の約倍以下、より好ましくはバックグランドシグナル強度以下、そして最も好ましくはバックグランドシグナル強度の約半分以下のハイブリダイゼーション強度を有する。好適な態様において、この複数のプローブは標的核酸のサブ配列に対して相補性である長さｈの種々のプローブ全てを含みうる。これらのプローブは長さ約10 〜約50ヌクレオチドに範囲しうる。このアレーは好ましくは上記の高密度アレーである。同様に、このハイブリダイゼーション方法、条件、時間、流体容量、検出方法は本明細書に記載の通りである。別の態様において、本発明は遺伝子の発現をモニターするコンピューター一体化方法を提供し、この方法は下記の工程を含んで成る：完全対合プローブと誤対合プローブとのペアーを含む複数の核酸プローブについてのハイブリダイゼーション強度のインプットの受容（ここでこのハイブリダイゼーション強度は複数の核酸プローブと、遺伝子に対応する核酸との間のハイブリダイゼーション親和力を示し、そして各ペアーはこの核酸の一部に完璧に相補性である完全対合プローブと、この完全対合プローブとは少なくとも１個のヌクレオチドで相違する誤対合プローブとを含む）；各ペアーのこの完全対合プローブ及び誤対合プローブのハイブリダイゼーション強度を比較する；そしてこの対比工程の結果に従う遺伝子の発現を表示する。好ましくは、各ペアーの完全対合プローブと誤対合プローブとのハイブリダイゼーション強度の差を計算する。更に、本発明は遺伝子の発現をモニターするためのコンピューター一体化方法を提供し、この方法は下記の工程を含んで成る：遺伝子を構成する核酸配列のインプットを受容する；この遺伝子に完璧に相補性であるプローブセットを作成する；そして遺伝子の発現をモニターするためのこのセットの中のプローブよりも少ない数のプローブのサブセットを同定する。このセットの各プローブは低ハイブリダイゼーション又は高交差ハイブリダイゼーションの特徴的な指標を特定する基準により分析し得る。この基準には、プローブの中の特異的なヌクレオチドの出現率が域値をまたがる場合、プローブの中で順次反復する特定のヌクレオチドの数が域値をまたがる場合、プローブの中のパリンドロームの長さが域値とまたがる場合、等を含む。定義「集約的平行スクリーニング」とは、約1 00種、好ましくは約 1,000種、より好ましくは約10,000種、そして最も好ましくは約 1,000,000種以上の核酸のハイブリダイゼーションの同時スクリーニングを意味する。「核酸」又は「核酸分子」とは一本鎖又は二本鎖状のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、そして何らかのことわりのない限り、天然ヌクレオチドと同じように機能しうる天然ヌクレオチドの公知の類似体を含むであろう。オリゴヌクレオチドは長さ２〜約500 塩基に範囲する一本鎖核酸である。本明細書で用いる「プローブ」とは１又は複数種の化学結合を介して、通常は相補性塩基対合、通常は水素結合形成を介して相補性配列の標的核酸に結合できるオリゴヌクレオチドと定義する。本明細書において用いるオリゴヌクレオチドプローブは天然（即ち、Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴ）、又は改変塩基（７−デアザグアノシン、イノシン等）を含みうる。更に、オリゴヌクレオチドプローブ内の塩基はホスホジエステル結合以外の結合により、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、連結されていてよい。即ち、オリゴヌクレオチドプローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合により連結されたペプチド核酸であってよい。「標的核酸」なる語は、核酸（往々にして生物サンプル由来）であり、それに対してオリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイゼーションするようにデザインされている。検出すべきなのは標的核酸の存在又は非存在であり、又は標的核酸の量の定量であってよい。この標的核酸は標的に対して特異的な対応のプローブの核酸配列に対して相補性である配列を有する。標的核酸なる語は、プローブが特異的である大きめの核酸の特定のサブ配列又は発現レベルを検出することが所望される配列全体を意味しうる。その用語の差は文脈から明らかとなる。「サブ配列」とは核酸の長い配列の一部を占める核酸配列を意味する。ここで用いる「複雑度（complexity）なる語はBritten らMethods of Enzymol ，29 : 363（1974）により確立されたこの用語の標準的な意味に従う。また、Cantor and Schimmel Biophysical Chemistry : PartII 1228-1230を核酸複雑度の更なる説明のために参照のこと。「実質的に結合」とは、プローブ核酸と標的核酸との相補性ハイブリダイゼーションを意味し、そして標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを引き下げることにより適合しうるささいな誤対合を包括する。「に対して特異的なハイブリダイゼーション」とは、特定のヌクレオチド配列に対しのみ、その配列が複雑な混合（例えば全細胞）DNA 又はRNA において存在している場合にストリンジェンシー条件下で結合、二量化又はハイブリダイゼーションすることを意味する。「ストリンジェンシー条件」なる語は、プローブがその標的サブ配列に対してのみハイブリダイゼーションし、その他の配列に対してハイブリダイゼーションしない条件をいう。ストリンジェンシー条件は配列依存性であり、そして種々の環境において相違するであろう。長めの配列は高温で特異的にハイブリダイゼーションするであろう。一般にストリンジェンシー条件は規定のイオン強度及びpHで特定の配列に対して熱融点（Tm）より約５℃低くなるように選ばれる。Tmは標的配列に対して相補性であるプローブの50％が平衡状態で標的配列に対してハイブリダイゼーションする温度（規定のイオン強度、pH 及び核酸濃度のもとで）である。（標的配列は一般に過剰で存在しているため、 Tmでは、プローブの50％が平衡で占めている）。一般にストリンジェンシー条件は短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）に関し、塩濃度がpH 7.0〜8.3 において少なくとも約0.01から 1.0ＭのNaイオン濃度（又はその他の塩）であり、そして温度が約30℃以上のことであろう。ストリンジェンシー条件はホルムアルデヒドの如き脱安定化剤の添加によっても達成し得る。「完全対合プローブ」なる語は特定の標的配列に対して完璧に相補性である配列を有するプローブを意味する。この試験プローブは一般に標的配列の一部（サブ配列）に対して完璧に相補性である。この完全対合（PM）プローブは「試験プローブ」、「標準化プローブ」、発現レベルコントロールプローブ等であってよい。ところで完全対合コントロール又は完全対合プローブは「誤対合コントロール」又は「誤対合プローブ」とは区別される。「誤対合コントロール」又は「誤対合プローブ」とはその配列が特定の標的配列に対して完璧に相補性とならないように故意に選定したプローブを意味する。高密度アレーにおける各誤対合（MM）コントロールに関し、同じ特定の標的配列に対して完璧に相補性である対応の完全対合（PM）プローブが一般に存在する。この誤対合は１又は複数個の塩基を含んで成りうる。誤対合は誤対合プローブのどこにあってもよいが、末端誤対合はあまり好ましくなく、なぜなら末端誤対合は標的配列のハイブリダイゼーションをあまり阻止しないからである。特に好適な態様において、この誤対合はプローブの中心又は近くにあり、これによりその誤対合は試験ハイブリダイゼーション条件下で標的配列との二量化を最も不安定にする傾向にあるからである。「バックグランド」又は「バックグランドシグナル強度」はラベル化標的核酸とオリゴヌクレオチドアレーの成分（例えばオリゴヌクレオチドプローブ、コントロールプローブ、アレー支持体、等）との間の非特異的結合又はその他の相互作用に由来するハイブリダイゼーションシグナルを意味する。バックグランドシグナルはアレー成分自体の固有蛍光により生成されるものでもありうる。単一バックグランドシグナルをアレー全体について計算してよく、又は個々のバックグランドシグナルを各標的核酸について計算してよい。好適な態様において、バックグランドはアレー中のプローブの最低５％から10％の平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算され、又は個々のバックグランドシグナルを各標的遺伝子について計算する場合、各遺伝子に対するプローブの最低５％から10％の平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算される。むろん、当業者は特定の遺伝子に対してプローブがよくハイブリダイゼーションし、それ故標的配列に対して特異的に結合するようであるなら、それらはバックグランドシグナル計算に使用すべきでないことを理解するであろう。他方、バックグランドはサンプル中に見い出せる任意の配列（例えば反対のセンスの核酸に対して特異的なプローブ、又はサンプルが哺乳動物核酸の場合、細菌遺伝子の如きサンプル中で見い出せない遺伝子に対して特異的なプローブ）に対して相補的でないプローブに対するハイブリダイゼーションにより生成される平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算されうる。バックグランドはプローブの全くないアレー領域により生成される平均シグナル強度としても計算されうる。遺伝子の転写レベルの定量に関して用いられる「定量」なる語は絶対的又は相対的定量を意味しうる。絶対定量は既知の濃度の１又は複数種の標的核酸（例えばコントロール核酸、例えばBio Ｂ、又は既知量の標的核酸自体）を含ませ、そして未知のものと既知の標的核酸とのハイブリダイゼーション強度の参照（例えば、標準曲線の作製を通じ）により達成し得る。他方、相対定量は、２種以上の遺伝子間、又は２通り以上の処理間でのハイブリダイゼーションを対比してハイブリダイゼーションにおける変化を定量することにより、及び暗に転写レベルにより達成し得る。「配列同一性のパーセンテージ」又は「配列同一性」は、最適に整合させた２種類の配列又はサブ配列を対比窓又はスパンで対比させることにより決定し、ここでこの対比窓の中のポリヌクレオチド配列の部分は、２本の配列の最適整合にわたり、対照配列（これは付加又は欠失を含んでない）と比べて付加又は欠失（即ち、ギャップ）を任意的に含んで成りうる。パーセンテージは、対合した位置の数を得るように双方の配列の中に同一のサブユニット（例えば核酸塩基又はアミノ酸残基）がある位置の数を決定し、対合した位置の数を対比窓の中の総位置数で除し、そしてその結果に100 を剰じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。プログラムGAP 又はBESTFIT(下記参照)を利用して計算したパーセンテージ配列同一性はデフォルト・ギャップ・ウェイト（default gap weight）を用いて計算する。対比のための配列の整合方法は当業界において公知である。対比のための配列の最適整合はSmith and Waterman，Adv．Appl．Math．２ : 482（1981）の局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch J．Mol．Biol．48 : 443(1970)の相同性整合アルゴリズム、Pearson and Lipman，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 5 : 2444（1988）の類似の方法についての探索、これらのアルゴリズムのコンピューター統合（限定することなく、Intelligenetics，Mountain，View，Califor nia によるPC/Genc プログラム中のCLUSTAL，Wisconsin Genetics Software Pac kageの中のGAP，BESTFIT，FASTA 及びTFASTA Genetics Computer Group(GCG)，5 75 Science Dr．Madison，Wisconsin USAを含む）、又は検索により行われうる。詳しくは、CLUSTAL プログラムを利用する配列整合方法はHiggins and Sharp のGene 73 : 237-244(1988)及びCABIOS 5 : 151-153（1989）に詳しく記載されている。図面の簡単な説明図１はオリゴヌクレオチドアレーを利用する発現モニターの模式図を示す。抽出したポリ（Ａ）⁺RNA をcDNAへと変換させ、それを次にラベル化リボヌクレオチド三リン酸の存在下で転写する。Ｌはビオチン又はフルオレセインの如き色素のいづれかである。RNA はマグネシウムイオンの存在下での加熱により断片化されている。ハイブリダイゼーションは２次元DNA プローブアレーを含むフローセルの中で実施する。ハイブリダイゼーションしていないRNA を除去する簡単な洗浄工程の後、アレーを走査同焦点顕微鏡を用いてスキャンする。細胞性mRNAがDN A 中間体抜きでの直接ラベル化された他の態様が実施例に記載してある。イメージ分析ソフトウェアはスキャンしたアレーイメージをテキストファイルへと変換し、それにおいては特異的な物理位置での観察強度が特定のプローブ配列と一体化する。図２Ａは16,000種以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレーの蛍光イメージを示す。このイメージはマウスＢ細胞（Ｔ10）cDNAライブラリーから転写され、且つ１：3,000 のレベルでスパイクされた（細胞当り約100 コピーに相当する50pM）、ビオチンラベルされ、ランダムに断片化されたセンスRNA の13 種の特異的なRNA 標的とのハイブリダイゼーション（40℃で15時間）を経て得られる。任意の位置での輝度は特定のオリゴヌクレオチドプローブに対してハイブリダイゼーションしたラベル化RNA の量の指標である。図２ＢはIL−２及びIL− ３ RNAに対するプローブを含むアレーの一部（図２Ａの枠入り領域）を示す。対比のため、図２ＣはスパイクしていないＴ10 RNAサンプル（Ｔ10細胞はIL−２及びIL−３を発現しない）とのハイブリダイゼーションを経たアレーの同一の領域を示す。シグナル強度の変動は非常に再現性が良く、そしてハイブリダイゼーション効率の配列依存性を反映した。アレーの中央十字四つ角は一定の濃度（50pM）においてハイブリダイゼーション溶液に添加したビオチン−ラベル化オリゴヌクレオチドに相補性であるコントロール配列を含む。特徴の境界付近の鮮明度は測定装置の解像度(11.25μｍ)により制約され、そしてアレー合成の立体解像度により制約されるものではない。各合成特徴の境界領域におけるピクセルはイメージの定量分析においてシステム式に無視した。図３は11種のRNA 標的についてのハイブリダイゼーション強度（各遺伝子についてのPM−MM強度差の平均）、対、濃度の log／log プロットを提供する。ハイブリダイゼーションシグナルを標的濃度に定量的に相関させた。この実験は本明細書における実施例及び図２に記載の通りに実施した。10種のサイトカインRNA( とbio Ｂ)をラベル化Ｔ10 RNAに１： 300,000〜１：3,000 に範囲するレベルにおいてスパイクした。シグナルは１：300 の頻度までの濃度の上昇に伴って増大したが、反応はプローブ部位の飽和により高レベルにおいて直線性が失われてきた。直線域は短めのハイブリダイゼーション時間を利用することにより高い濃度まで広げることができる。Ｔ10細胞において発現される遺伝子由来のRNA(IL−10 ，β−アクチン及びGAPDH)も、cDNAライブラリーをプロービングすることにより得られた結果と一致するレベルにおいて検出された。図４はPMA 及びカルシウムイオノフォアによる刺激を経た様々な時間でのマウス2D6 Ｔヘルパー細胞系におけるサイトカインmRNAレベルを示す。ポリ（Ａ）⁺R NA を刺激後０，２，６及び24時間目において抽出し、そしてRNA ポリメラーゼプロモーターを含む二本鎖cDNAに変換した。次いでこのcDNAプールをビオチンラベル化リボヌクレオチド三リン酸の存在下で転写し、断片化し、そしてオリゴヌクレオチドプローブアレーに対して２及び22時間ハイブリダイゼーションした。蛍光強度を、ハイブリダイゼーション前に既知量でサンプルにスパイクした細菌性RNA(ビオチンシンセターゼ)について得られるシグナルとの対比によりRNA 頻度へと変換した。50,000のシグナルは約１：100,000 の頻度から１：5,000 の頻度に対応し、そして100 のシグナルは１：50,000の頻度に対応する。IL−２，IL−４，IL−６及びIL−12p40 についてのRNA はこれらの実験において約１：200,000 のレベルより高くでは検出されなかった。誤差バーは、種々の時点での同一のRNA についてのレベルに相対させ一定のRNA についてのレベルにおける推定の不確定性（25％）を反映している。相対不確定推定値は反復スパイキング実験の結果、並びにＴ10及び2D6 細胞（未刺激）の双方に由来する調製品におけるIL−10，β−アクチン及びGAPDM RNA の反復測定に基づく。絶対頻度における不確定性はハイブリダイゼーション効率におけるメッセージ間差、並びに mRNA単離、cDNA合成及びRNA 合成とラベリング工程における相違を含む。絶対頻度における不確定性は係数３と推定される。図５は 118種の遺伝子についての63,000より多くの種々のオリゴヌクレオチドプローブを含むアレーの蛍光イメージを示す。このイメージはラベル化マウスＢ細胞RNA サンプルの一夜ハイブリダイゼーションを経て得られる。各正方形合成領域は50×50μｍであり、そして 107〜108 コピーの特異的なオリゴヌクレオチドを含む。このアレーを約15分 7.5μｍの解像度でスキャンした。明るい列はRN A が高レベルで存在することを示す。低いレベルのRNA はハイブリダイゼーションパターンの定量的評価に基づき不明瞭に検出された。全部で21種のマウスRNA が約１：300,000 〜１：100 の範囲のレベルで検出された。中央の十字、角のチェッカーボード、及び頂部の MUR−１領域は全てのサンプルに添加したラベル化コントロールオリゴヌクレオチドに対して相補性のプローブを含む。図６は本発明の態様のソフトウェアを履行するのに用いるコンピューターシステムの例を示す。図７は本発明の態様のソフトウェアを履行するのに用いる典型的なコンピューターシステムのシステムブロックダイアグラムを示す。図８は完全対合及び誤対合プローブのペアーのハイブリダイゼーション強度の対比による遺伝子の発現のモニタープロセスの高レベルフローを示す。図９は決定マトリックスを利用する、遺伝子発現の決定のプロセスのフローを示す。図10Ａ及び10Ｂは基底スキャンデーター及び実験スキャンデーターを対比させることによる遺伝子の発現の決定プロセスのフローを示す。図11はプローブの数を削減又は枝刈りした後の、遺伝子の発現をモニターするためにプローブの数を増やすプロセスのフローを示す。詳細な説明Ｉ．遺伝子発現をモニターするための高密度アレー本発明は１又は複数種の遺伝子の発現レベルをモニター（検出及び／又は定量）する方法を提供する。この方法は核酸プローブの高密度アレーに対する核酸標的サンプルのハイブリダイゼーション、それに次ぐアレー中の各プローブに対してハイブリダイゼーションした標的核酸の量の定量を含む。核酸ハイブリダイゼーションは様々な遺伝子の発現レベルを決定するために時折り利用されているが（例えばノーザンブロット）、高密度アレーが大集団の異種核酸の存在下で遺伝子の発現（転写）レベルにおけるささいな変異の定量のために適切であることは本発明の驚くべき発見である。このシグナルは約 1,000分の１未満の濃度で存在し得、そして往々にして10,000 分の１未満、より好ましくは50,000分の１、そして最も好ましくは約 100,000分の１、 300,000分の１、又は更には 1,000,000分の１の濃度で存在し得る。本発明以前では、高密度アレーに対するかかる複合混合物のハイブリダイゼーションは有用なプローブを埋没し得、低レベル標的核酸の存在の検出を不可能にしうるものと予測されていた。従って、交差ハイブリダイゼーション並びに基質及びプローブの双方に対する非特異的な結合は基づく誤差シグナルの存在下で低レベルシグナルを単離及び検出することができることは不明であった。従って、これに反し、高密度アレーが多重遺伝子の発現のモニターに極めてよく適し、そして感度及び識別のレベルを供するという驚くべき発見は今日まで予測されなかった。また、高密度アレーにおいて利用した場合、たとえ比較的短いオリゴヌクレオチドであっても、遺伝子の発現（転写）レベルを正確に検出及び定量するのに利用できるということも本発明の驚くべき発見である。即ち、10ヌクレオチドほどの短いオリゴヌクレオチド、より好ましくは15オリゴヌクレオチド、そして最も好ましくは20又は25オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドアレーが遺伝子発現レベルを特異的に検出及び定量するのに利用できうる。むろん本明細書に記載の通りより長いオリゴヌクレオチドを含むアレーも適当である。Ａ）オリゴヌクレオチドアレーの利点一の好適な態様において、本発明の方法において利用する高密度アレーは化学合成したオリゴヌクレオチドを含んで成る。化学合成したオリゴヌクレオチドの利用は、ゲノムクローンのブロッティングアッセイ、制限フラグメント、オリゴヌクレオチド等に対立して、かなりの利点を供する。これらの利点は一般に４つのカテゴリーに属する：１）生産効率；２）アレー内及びアレー間変動の低下；３）情報内容の増大；並びに４）高いシグナル、対、ノイズ比（向上した感度）。１）生産効率好適な態様において、これらのアレーは立体技術式平行合成（spatially addr essed parallel synthesis）の方法を利用して合成する（例えば下記第Ｖ章参照のこと）。これらのオリゴヌクレオチドは、アレー表層に高度に平行な状態で共有結合されて化学合成される。これは非常に効率的なアレー製造を可能にする。例えば、何十万（又は何百万でさえもの）特異的に選定した20量体オリゴヌクレオチドが80サイクルより少ない合成サイクルで合成される。このアレーは配列情報のみに基づいてデザイン及び合成される。即ち、ブロッティング方法とは異なり、アレー調製は生物材料の取り扱いを要しない。クローニング工程、核酸増幅、クローンの分類又は生成物の増幅等の必要性がない。本発明における発現モニター用アレーの好適な化学合成は従ってより効率的なブロッティング法であり、そして比較的少ない労力及び費用で再現性の高い高密度アレーの製造を可能にする。２）アレー内及びアレー間変動の低下本発明の方法における化学合成した高密度オリゴヌクレオチドアレーの利用はアレー内及びアレー間変動を改善する。本発明にとって好適なオリゴヌクレオチドは非常にコントロールされた状況で大型バッチで作られる（現状、多重ウェーハーで、ウェーハー当り49アレーが平行で合成される）。これは世界中で実施されているアッセイの直接対比を可能にする一般的な診断及び研究手段に適するものとする。化学合成の際に得られる正確なコントロールを理由に、本発明のアレーは同じプローブ組成を有する高密度アレー間で（製造バッチ内又はバッチ間で）約25％未満、好ましくは約20％未満、より好ましくは約15％未満、更により好ましくは約10％未満、更により好ましくは約５％未満、そして最も好ましくは約２％未満の変動を示す。アレー変動は２以上のアッセイ間での１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブ中のハイブリダイゼーション強度（ラベル化されたコントロール標的核酸混合物に対し）の変動としてアッセイされる。より好ましくは、アレー変動は２以上のアッセイ間での１又は複数の標的遺伝子について測定されるハイブリダイゼーション強度（ラベル化されたコントロール標的核酸混合物に対し）の変動としてアッセイされる。アレー内及びアレー間変動の低下に加えて、化学合成したアレーは、点着方法、特に細胞由来核酸（例えばcDNA）を利用する方法に固有な相対プローブ頻度の変動も低下させる。多くの遺伝子は細胞当り数千のコピーのレベルで発現され、一方その他は細胞当り１コピーでしか発現されない。cDNAライブラリーはこの非常に大きな片寄りを反映し、なぜならcDNAライブラリーはこれらの材料から作られるものだからである。ライブラリーの標準化（例えば、対照cDNAとの対比による各々のプローブの量の調整）は過剰発現される配列の供与を下げるではあろうが、標準化は高度に発現されるcDNAの見込みを２又は３分の１にしか下げない。一方、化学合成法は全てのオリゴヌクレオチドプローブがほぼ均等な濃度で供与されることを確実にしうる。この低下は遺伝子間（アレー内）変動であり、そして特徴的な過剰発現及び抑制発現された核酸間の直接対比を可能にする。３）情報内容の増大前述の通り、発現モニターのための高密度オリゴヌクレオチドアレーの利用はその他の方法では見い出せない数多くの利点を供する。例えば、特定の標的遺伝子の転写生成物に特異的に結合する大量の種々のプローブの利用は、特定の標的遺伝子の有効な検出のためのプローブセットの最適化を可能にし、且つその他の核酸種との交差反応による誤差の可能性を最少限にする高度な冗長度及び内部コントロールを提供する。明らかに、適当なプローブは往々にしてハイブリダイゼーションによる発現モニターにとっては有効でないことが証明されている。例えば、特定の標的遺伝子のサブ配列がゲノムのその他の領域において見い出されることがあり、そしてこのようなサブ配列に特異的なプローブはこのその他の領域に交差ハイブリダイゼーションし、そして標的遺伝子の発現レベルの有効な尺度となるシグナルを供しない。若干の交差反応性しか示さないプローブでさえも不適当であり、なぜならそれらは有効なハイブリダイゼーションを妨害する構造の形成に基づき劣ったハイブリダイゼーションを一般に示すからである。最後に、大量のプローブを有するセットにおいては、セットの中の全てのプローブに適するハイブリダイゼーション条件を同定することは困難である。各標的遺伝子に対する大量のプローブにより供される高度冗長度を理由に、所定のハイブリダイゼーション条件のセットで良く機能しないプローブを排除し、しかもその遺伝子の発現レベル（転写レベル）の非常に高感度且つ信頼できる尺度を供するよう特定の標的遺伝子に対して十分なプローブを維持し続けることが可能である。更に、各標的遺伝子に対する大量の種々のプローブの利用は近縁核酸の科の発現をモニターすることを可能にする。これらのプローブは科の間で保存されるサブ配列及び科の中の各々の核酸において相違するサブ配列の双方にハイブリダイゼーションするように選定し得る。即ち、かかるアレーとのハイブリダイゼーションは、たとえ様々な遺伝子がほぼ同一のサイズであり、且つ高度な相同性レベルを有していたとしても、遺伝子科の様々な構成員の同時モニターを可能にする。かかる測定は伝統的なハイブリダイゼーション法では困難又は不可能である。高密度アレーはかかる大量のプローブを含むため、莫大な数のコントロール、例えば特定遺伝子における変動又は突然変異についてのコントロール、ハイブリダイゼーション条件全体のコントロール、サンプル調製条件についてのコントロール、核酸が由来する細胞の代謝活性についてのコントロール、及び非特異的結合又は交差ハイブリダイゼーションについての誤対合コントロールを供することが可能である。更に、上記に説明の通り、複雑な細胞メッセージ集団の中の遺伝子転写の有効な検出及び定量が比較的短いオリゴヌクレオチド及び遺伝子当り少ない（例えば 40未満、好ましくは30未満、より好ましくは25未満、そして最も好ましくは20， 15又は10未満）オリゴヌクレオチドプローブで決定し得ることが本発明の驚くべき発見である。一般に、各遺伝子に対して強力且つ特異的にハイブリダイゼーションする大量のプローブの存在は本発明の発見である。これは大量のプローブが検出のために必要であることを意味するのではなく、むしろ選択できるものが数多くあることを意味し、そしてその選択はその他の所見、例えば配列の固有さ（遺伝子科）、スプライス変異体についての検定、又はホットスポットのゲノタイピング（これらはcDNA点着法では容易にできない）に基づきうる。このような発見に基づき、４アレーのセットを作った。これは約 400,000づつのプローブを含む。約40,000の遺伝子それぞれについて相補性である約40本のプローブ（20組のプローブペアー）のセットを選択し、それについては公共データーベースにESTsがある。このESTsセットはほぼヒト全遺伝子の１／３〜１／２をカバーし、そしてこれらのアレーは一夜ハイブリダイゼーションの平行セットでその全てのレベルがモニターできることを可能にする。４）シグナル、対、ノイズ比の向上ブロッティングした核酸は一般に支持体にブロッティングした核酸を付加するイオン、静電及び疎水性相互作用を頼りとする。結合は核酸にわたる多数の地点で形成され、自由度を拘束し、そして核酸のその相補性標的に対するハイブリダイゼーションの能力を妨害する。一方、本発明の好適なアレーは化学合成する。これらのオリゴヌクレオチドプローブは単一の末端共有結合により支持体に付加される。これらのプローブはより高い自由度を有し、そしてその相補性標的との複雑な相互作用に関与することができる。従って、本発明のプローブアッセイはブロッティングしたアレーよりも有意に高いハイブリダイゼーション効率（10倍、 100倍、そして更に1000倍高い効率）を示す。一定のシグナルを生成するために少ない標的オリゴヌクレオチドが利用され、これによりシグナル、対、ノイズ比は劇的に改善される。従って、本発明の方法は非常に複雑な核酸混合物の中で数コピーのみの核酸の検出を可能にする。Ｂ）好適な高密度アレー本発明の好適な高密度アレーは約100 より多くの、好ましくは約 1,000より多くの、より好ましくは約16,000より多くの、そして最も好ましくは約65,000又は 250,000より多くの更には約 1,000,000より多くの種々のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る。これらのオリゴヌクレオチドプローブは約５〜約50、又は約５〜約45ヌクレオチド、より好ましくは約10〜約40 ヌクレオチド、そして最も好ましくは約15〜約40ヌクレオチドの長さに範囲する。特に好適な態様において、これらのオリゴヌクレオチドプローブは約15〜約40 ヌクレオチドの長さである。特に好適な態様において、このオリゴヌクレオチドプローブは長さ20又は25ヌクレオチドである。比較的短いオリゴヌクレオチドプローブが標的配列に特異的にハイブリダイゼーションしてそれを区別せしめるのに十分であることは本発明の発見である。即ち、一の好適な態様において、このオリゴヌクレオチドプローブは長さ50ヌクレオチド未満、一般には46ヌクレオチド未満、より一般には41ヌクレオチド未満、最も一般には36ヌクレオチド未満、好ましくは31ヌクレオチド未満、より好ましくは26ヌクレオチド未満、そして最も好ましくは21ヌクレオチド未満の長さである。これらのプローブは長さ16ヌクレオチド未満、又は11ヌクレオチド未満さえであってもよい。アレーの中の各々のオリゴヌクレオチドプローブ配列の位置及び配列はわかっている。更に、大量の種々のプローブは比較的小さな面積を占め、cm² 当り一般に約60より多く、より一般には約100 より多く、最も一般には約600 より多く、往々にして約 1,000より多く、より往々にして約 5,000より多く、最も往々にして約10,000より多く、好ましくは約40,000より多く、より好ましくは約 100,000 より多く、そして最も好ましくは約 400,000より多くの種々のオリゴヌクレオチドプローブのプローブ密度を有する高密度アレーを供する。このアレーの小さな表面積（往々にして約10cm²未満、好ましくは約５cm²未満、より好ましくは約２ cm²未満、そして最も好ましくは約1.6cm²未満）は非常に均一なハイブリダイゼーション条件（温度制御、塩濃度等）を可能にし、しかも非常に大量のプローブはハイブリダイゼーションの集約的平行処理を可能にする。最後に、高密度アレーにより占められる小面積を理由に、ハイブリダイゼーションは非常に少ない流体容量（例えば250μｌ以下、より好ましくは 100μｌ以下、そして最も好ましくは10μｌ以下）で実施できる。更に、ハイブリダイゼーション条件はサンプルを通じて非常に均一であり、そしてハイブリダイゼーション方式は自動化処理が可能である。II ．発現モニターの利用本発明は高密度オリゴヌクレオチドプローブアレーによるハイブリダイゼーションが多重遺伝子の発現の有効なモニター手段を供することを実証する。更に、本発明は複雑な核酸混合物中での非常に低い濃度でのシグナル検出を最適化するサンプル処理及びアレーデザインの方法並びにプローブ選択方法を提供する。本発明の発現モニター方法は多種多様な状況、例えば病気の検査、２つのサンプル間の示差的遺伝子発現の同定（例えば、健康サンプルと比べての病理）、特定の遺伝子の発現を上昇調節又は下降調節する組成物のスクリーニングにおいて利用され得る。一の好適な態様において、本発明の方法は発現が疾患状態において変異した核酸の発現（転写）レベルをモニターするのに利用される。例えば、癌、例えば乳癌の場合、HER2(ｃ−erbB−２／neu)プロト癌遺伝子の如き特定のマーカーの過剰発現を特徴としうる。同様に、レセプターチロシンキナーゼ（RTKs）の過剰発現は胸、肝臓、膀胱、膵臓の癌腫、並びにグリア芽腫、肉腫及び鱗状癌腫の如き数多くの腫瘍の病因に結びつく（Carpenter，Ann．Rev．Biochem.， 56 : 881-9 14(1987)）。逆に、癌（例えば結腸直腸、肺及び胸）はＰ53の如き腫瘍抑制遺伝子の突然変異又は発現低下を特徴としうる（例えばTo minagaら、Critical Rev，Oncogenes，3 : 257-282（1992）参照のこと）。別の好適な態様において、本発明の方法は一定の刺激、例えば薬剤に応答する様々な遺伝子の発現をモニターするのに利用される。これらの方法は極めて有利であり、なぜならこれらは数千の遺伝子の発現の同時モニターを可能とするからである。これは特に終点の状況が、単に特定の遺伝子が過剰発現であるか抑制発現であるかどうかを問わない複雑な場合の薬剤研究において有用である。即ち、疾患状態又は薬剤の作用態様がよく特定されていないとき、本発明の方法は特定の関連遺伝子の迅速な決定を可能にする。前記の通り、本発明の材料及び方法は多重の種々の遺伝子の発現を同時にモニターするのに一般に利用される。即ち、一の態様において、本発明は約10種以上、好ましくは約 100種以上、より好ましくは約 1,000種以上、更により好ましくは約10,000種以上、そして最も好ましくは約 100,000種以上の種々の遺伝子の同時モニターを供する。本発明の発現モニター方法は遺伝子の発見にも利用できうる。今日までに発見された多くの遺伝子は配列の共通性に基づき科へと分類されている。その非常に大量のプローブを理由に、それを高密度アレーの中に入れることが可能であり、全ての遺伝子クラスの既知の又は一部既知の構成員を占めるオリゴヌクレオチドプローブを含ませることが可能である。かかる「チップ」（高密度アレー）の利用において、既知の遺伝子は可変及び共通領域の双方を含む遺伝子座にポジティブなシグナルを供与するであろう。この結果は新たに発見される遺伝子の可能性を示唆する。本発明の発現モニター方法は「動的」遺伝子データーベースの開発も可能にする。ヒトゲノムプロジェクト及び商業配列決定プロジェクトは大型の静的データーベースを作製し、それには機能又は遺伝子相互作用と関係なく数千の配列が挙げられている。本発明の方法を利用する発現分析は遺伝子の機能及びそれとその他の遺伝子との相互作用を規定した「動的」データーベースを供する。しかしながら、大量の遺伝子の発現を同時にモニターする力がなければ、かかるデーターベースを作成する作業は大変である。発現パターンを決定するためのDNA 配列分析を利用する冗長な性質は、注目の細胞から単離したRNA 由来のcD NAライブラリーの調製、それに次ぐライブラリーの配列決定を包含する。DNA が配列決定できたら、オペレーターは得られる配列を列挙し、そしてそれらを数える。数千の配列が決定され、そしてその遺伝子配列の頻度は研究する細胞に関する遺伝子の発現パターンを規定するであろう。反対に、発現モニター用アレーを利用することで、本発明の方法に従ってデーターを得るのは比較的早く且つ容易である。この方法は細胞を刺激して発現を誘導し、細胞からRNA を入手し、そしてRNA を直接ラベルするか又はRNA のcDNAコピーを作成することを含む。ラベル化RNA 又はラベル化cDNAのいづれかを高密度アレーに一夜実験でハイブリダイゼーションさせる。このハイブリダイゼーションは追加の配列決定抜きでの遺伝子一つづつのレベルの定量評価を供する。更に、本発明の方法ははるかに高感度であり、細胞当り発現される遺伝子数コピーの検出を可能にする。この手順は本明細書において提供する実施例の中で実証されている。III ．遺伝子発現のモニター方法一般に、本発明の遺伝子発現のモニター方法は（１）１又は複数種の標的遺伝子のRNA 転写体又はこのRNA 転写体に由来する核酸を含んで成る標的核酸のプールを用意する；（２）この核酸サンプルをプローブ（コントロールプローブを含む）の高密度アレーにハイブリダイゼーションする；そして（３）ハイブリダイゼーションした核酸を検出し、そして相対的な発現（転写）レベルを計算する；ことを含む。Ａ）核酸サンプルの用意当業者は遺伝子の転写レベル（それ故発現レベル）を測定するため、遺伝子の mRNA転写体又はこのmRNA転写体に由来する核酸を含んで成る核酸サンプルを用意することが所望される。本明細書でいうmRNA転写体に由来する核酸とは、それが合成するためのmRNA転写又はそのサブ配列が最終的に鋳型を担う核酸を意味する。即ち、mRNAから逆転写したcDNA、そのcDNAから転写したRNA 、このcDNAから増殖させたDNA 、この増幅DNA から転写したRNA 等は全てmRNA転写体に由来し、そしてかかる生成物の検出はサンプル中のオリジナルの転写体の存在及び／又は量の指標となる。即ち、適当なサンプルは、限定することなく、遺伝子のmRNA転写体、mRNAから逆転写したcDNA、cDNAから転写したcRNA、これらの遺伝子から増幅させたDNA 、増幅DNA から転写したRNA 、等を含む。特に好適な態様において、サンプル中の１又は複数種の遺伝子の転写レベル（それ故、発現）を定量することが所望されるとき、この核酸サンプルは遺伝子の mRNA転写体の濃度又はこのmRNA転写体に由来する核酸の濃度がこの遺伝子の転写レベル（それ故発現レベル）に比例するものとする。同様に、ハイブリダイゼーションシグナル強度はハイブリダイゼーションした核酸の量に比例するのが好ましい。この比例は比較的厳密であることが好ましいが（例えば転写速度の二倍化は、サンプル核酸プール中のmRNA転写体の二倍化及びハイブリダイゼーションシグナルの二倍化をもたらす）、当業者はこの比例がより緩和なものであり、また非線形なものであってもよいことを理解するであろう。即ち、例えば、標的mRNAの濃度における５倍の相違が、ハイブリダイゼーション強度の３〜６倍の相違を供するアッセイがほとんどの目的のために十分である。より正確な定量が必要なら、本明細書に記載の通り、サンプル調製及びハイブリダイゼーションの中に導入される変動を較正するために適当なコントロールを流してよい。更に、「標準」標的mRNAの系列希釈を当業者公知の方法に従って検量曲線を調製するために利用できうる。むろん、転写体の有無の簡単な検出が所望されるなら、めんどうなコントロール又は検量は必要でない。最も簡単な態様において、かかる核酸サンプルは生物サンプルから単離された総mRNAである。本明細書における「生物サンプル」なる語は生体又は生体成分（例えば細胞）から得られたサンプルを意味する。このサンプルは任意の生物組織又は流体であってよい。しばしば、このサンプルは患者に由来するサンプルである「臨床サンプル」であろう。かかるサンプルには、限定することなく、痰、血液、血液細胞（例えば白血球）、組織又は微細針生検サンプル、尿、腹膜液及び胸膜液、又はそれらに由来する細胞が含まれる。生物サンプルは組織学的目的のために採取した凍結切片の如き組織切片も含みうる。核酸（ゲノムDNA 又はmRNAのいづれか）は当業者公知の数多くの方法のいづれかに従ってサンプルから単離し得る。当業者は遺伝子のコピー数の変化が検出できる場合、ゲノムDNA が好適に単離し得ることを理解するであろう。逆に、遺伝子の発現レベルを検出するなら、RNA(mRNA)を単離するのが好ましい。全mRNAを単離する方法は当業者に公知である。例えば、核酸の単離及び精製の方法はLaboratory Technigues in Biochemistry and Molecular Biology : 第３章、Hybridization With Nucleic Acid Probes、第１部。Theory and Nucleic Acid Preparation，P．Tijssen，ed．Els evier，N．Y．(1993)及びLaboratory Technigues in Biochemistry and Molecul ar Biology : 第３章、Hybridization With Nucleic Acid Probes、第１部。Teo ry and Nucleic Acid Preparation，P．Tijssen，ed．Elsevier，N．Y．(1993) に記載されている）。好適な態様において、全核酸は所定のサンプルから、例えば酸グアニジニウム −フェノール−クロロホルム抽出法を利用して単離され、そしてポリＡ⁺mRNAはオリゴdTカラムクロマトグラフィーにより又は（dT）_n磁性ビーズを用いることにより単離される（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory M anual(2nd ed.)，Vols．1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)又はCurr ent Protocols in Molecular Biology，F．Ausubelら、ed．Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York（1987）を参照のこと）。しばしば、ハイブリダイゼーションの前に核酸サンプルを増幅することが所望される。当業者はどのような増幅方法を利用しようと、もし定量的な結果が所望されるなら、増幅した核酸の相対頻度を維持又はコントロールする方法を利用する注意を払わなければならないことを理解するであろう。「定量的」な増幅の方法は当業者に公知である。例えば、定量性PCR は同じプライマーを用いる既知量のコントロール配列の同時の共増幅を包含する。これは PCR 反応を較正するために用いられうる内部標準を担う。この高密度アレーは従って増幅した核酸の定量のための内部標準に特異的なプローブを含みうる。一の好適な内部標準は合成AW106 cRNAである。AW106 cRNAを当業者公知の標準的な技術に従ってサンプルから単離されたRNA と組合せる。次いでこのRNA を逆転写酵素を利用して逆転写してコピーDNA を供する。そのcDNA配列をラベル化プライマーを用いて増幅させる（例えばPCR により）。その増幅生成物を一般に電気泳動により分離し、そして放射能の量（増幅生成物の量に比例）を決定する。次いでサンプル中のmRNAの量を既知のAW106 RNA 標準品により生成されるシグナルと対比させることにより計算する。定量性PCR についての詳細なプロトコールはPCR Protocols，A Guide to Methods and Applicat ions，Innis らAcademic Press，Inc．N．Y.，(1990)に記載されている。その他の適当な増幅方法には、限定することなく、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR )（Innis 、ら、PCR Protocols．A guide to Methods and Application．Academ ic Press，Inc．San Diego，(1990)）リガーゼ連鎖反応(LCR)（Wu and Wallace ，Genomics，4 : 560(1989)，Landegren 、ら、Sciecne，241 : 1077(1988)及び Barringer 、ら、Gene，89 : 117（1990）参照）、転写増幅（Kwoh、ら、Proc． Natl．Acad．Sci．USA，86 : 1173(1989)）及び自立配列複製（Guatelli、ら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA，87 : 1874(1990)）が含まれる。特に好適な態様において、サンプルmRNAを逆転写酵素及びオリゴdTとファージＴ７プロモーターをコードする配列とより成るプライマーで逆転写して一本鎖DN A 鋳型を得る。第二DNA 鎖をDNA ポリメラーゼを用いて重合する。二本鎖cDNAの合成後、Ｔ７ DNAポリメラーゼを加え、そしてRNA をcDNA鋳型から転写する。各一本鎖cDNA鋳型からの転写の連続ラウンドは増幅RNA を供する。in vitro重合の方法は当業者に公知であり（例えばSambrookら、前掲参照）、そしてこの特定の方法はVan GelderらProc．Natl．Acad．Sci．USA，87 : 1663-1667（1990）により詳しく説明され、彼はこの方法に従う in vitro増幅が様々なRNA 転写体の相対頻度を保持することを実証している。更に、EberwineらProc．Natl．Acad．Sci．USA，89 : 3010-3014はin vitro転写を介する２ラウンドの増幅を利用するプロトコールを提供しており、オリジナルの出発材料の10⁶倍より高い増幅を達成せしめており、これにより生物サンプルが制約されているときでさえも発現モニターが可能となっている。当業者により上記の直接転写方法がアンチセンス（aRNA）プールを提供することが理解されるであろう。アンチセンスRNA を標的核酸として用いる場合、このアレーの中に供するオリゴヌクレオチドプローブはアンチセンス核酸のサブ配列に対して相補性となるように選定する。逆に、標的核酸プールがセンス核酸のプールなら、オリゴヌクレオチドプローブはセンス核酸のサブ配列に対して相補性となるように選定する。最後に、核酸プールが二本鎖であるとき、プローブはいづれのセンスであってもよく、なぜなら標的核酸はセンス及びアンチセンス鎖の双方を含むからである。上記のプロトコールはセンス又はアンチセンス核酸のいづれかのプールを作製する方法を含む。事実、一の手法はセンス又はアンチセンス核酸のいづれかを所望通りに作製するのに利用できうる。例えば、このcDNAをベクター（例えばStra tageneのpBluescript II KS（＋）ファージミド）の中に直接クローニングし、それがＴ３及びＴ７プロモーターと隣接するようにすることができる。Ｔ３ポリメラーゼによるin vitro転写は一方のセンスのRNA(センスはインサートの方向に依存する)を生成し、Ｔ７ポリメラーゼによるin vitro転写は対立のセンスを有するRNA を生成するであろう。その他の適当なクローニング系には Cre−lox Ｐプラスミドサブクローニングのためにデザインされたファージラムダベクターが含まれる（例えばPalazzolo ら、Gene，88 : 25-36（1990）参照）。特に好適な態様において、高い活性のRNA ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７について約2500ユニット／μｌ；Epicentre Technologiesより入手可能）を使用する。Ｂ）核酸のラベリング好適な態様において、ハイブリダイゼーションした核酸はサンプル核酸に付加された１又は複数のラベルを検出することにより検出される。しかしながら、好適な態様において、このラベルはサンプル核酸の調製における増幅工程の際に同時に組込む。即ち、例えば、ラベル化プライー又はラベル化ヌクレオチドによるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)はラベル化増幅生成物を供するであろう。好適な態様において、ラベル化ヌクレオチド(例えばフルオレセイン−ラベル化UTP 及び／又はCTP)を用いる上記の転写増幅はラベルを転写核酸の中に組込む。他方、ラベルはオリジナルの核酸サンプル（例えばmRNA、ポリＡmRNA、cDNA等）に、又は増幅完了後の増幅生成物に直接加えてよい。核酸にラベルを付加する手段は当業者に公知であり、そして例えば核酸のキナーゼ処理及びその後のサンプル核酸をラベル／例えば燐光体）に連結する核酸リンカーの付加（ライゲーション）によるニックトランスレーション又は末端ラベリング（例えばラベル化DN A による）が含まれる。本発明において利用するのに適する検出可能なシグナルには吸光度学、光化学、免疫化学、電気、光学又は化学的手段により検出可能な任意の組成物が含まれる。本発明において有用なラベルにはラベル化ストレプトアビジンコンジュゲートによる染色のためのビオチン、磁性ビーズ（例えば、Dynabeads(商標)）、蛍光色素（例えばフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーンフルオレセントタンパク質等）、放射性ラベル（例えば³Ｈ，¹²⁵Ｉ，³⁵ Ｓ，¹⁴Ｃ又は³²Ｐ）、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びその他のELISA において一般的に利用されているもの）、並びに比色性ラベル、例えばコロイド金又は有色ガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等）ビーズが含まれる。かかるラベルの利用を教示する特許には米国特許第 3,817,837； 3,850,752； 3,939,3 50； 3,996,346； 4,277,437； 4,275,149及び 4,336,241号が含まれる。かかるラベルを検出する手段は当業者に公知である。即ち、例えば、放射性ラベルは写真フィルム又はシンチレーションカウントを用いて検出し得、蛍光マーカーは発光を検出する光検出器を利用して検出できうる。酵素ラベルは一般に酵素に基質を供し、そして酵素の基質に対する作用により生成される反応生成物を検出することにより検出され、そして比色ラベルは単に有色ラベルの目視により検出される。ラベルはハイブリダイゼーションの前又は後に標的（サンプル）核酸に添加してよい。いわゆる「直接ラベル」はハイブリダイゼーションの前に標的（サンプル）核酸に直接付加又は組込む検出可能なラベルである。反対に、いわゆる「間接ラベル」はハイブリダイゼーション後のハイブリド二量体に連結する。往々にして、間接ラベルはハイブリダイゼーションの前に標的核酸に付加させておいた結合成分に付加する。即ち、例えば、この標的核酸はハイブリダイゼーションの前にビオチニル化してよい。ハイブリダイゼーション後、アビジン−コンジュゲーション化燐光体はビオチン担持ハイブリド二量体に結合し、容易に検出できるラベルを供するであろう。核酸のラベル化及びラベル化されたハイブリダイゼーションした核酸の検出の方法の詳細については、Laboratory Techniqnes in Bio chemistry and Molecular Biology Vol．24 : Hybridization With Nucleic Aci d Probes，P．Tijssen，ed．Elseiver，N．Y.，(1993)を参照のこと。蛍光ラベルが好ましく、そしてin vitro転写反応の際に容易に添加される。好適な態様において、フルオレセインラベル化UTP 及びCTP は前記の通りにしてin vitro転写反応において生成されたRNA の中に組込む。Ｃ）シグナル／ノイズ比を改善するためのサンプルの改質核酸サンプルは、サンプルの複雑性を下げ、それ故バックグランドを低め、且つ測定感度を高めるため、高密度プローブアレーに対するハイブリダイゼーションの前に改質してよい。一の態様において、複雑性の低下はバックグランドmRNA の選択的な分解により達成し得る。これはサンプルmRNA（例えばポリＡ⁺RNA）を、アレー中のプローブが特異的にハイブリダイゼーションする領域に特異的にハイブリダイゼーションするDNA オリゴヌクレオチドのプールとハイブリダイゼーションすることにより成し遂げられる。好適な態様において、オリゴヌクレオチドのプールは高密度アレー上に見い出せるのと同じプローブオリゴヌクレオチドより成る。オリゴヌクレオチドのプールは多数の二本鎖（ハイブリド二量体）核酸を形成するサンプルmRNAにハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーションしたサンプルを次にRNase Ａ、即ち、一本鎖RNA を特異的に消化するヌクレアーゼで処理する。次いでRNase Ａをプロテアーゼ及び／又は市販のRNase インヒビターを用いて阻害し、そして二本鎖核酸を消化した一本鎖RNA から分離する。この分離は当業者に公知の数多くの方法、例えば限定することなく、電気泳動及び勾配遠心分離で成し遂げられうる。しかしながら、好適な態様において、ビーズに付加されたDNA オリゴヌクレオチドのプールであって、核酸アフィニティーカラムを構成しているものを提供する。RNase Ａによる消化後、ハイブリダイゼーションしたDNA は、ハイブリド二量体を変性し（例えば加熱又は塩の増加により）、次いで予めハイブリダイゼーションした mRNAを溶出バッファーの中に洗い流すことにより除去する。高密度アレーの中のプローブにハイブリダイゼーションするであろう末梢化の mRNAフラグメントを次にRNA リガーゼを用いてRNA リンカーに付加された燐光体で好適に末端ラベル化する。この手順は、アレーの中のプローブに対応しない核酸がなくなっており、それ故バックグランドシグナルに寄与しないラベル化サンプルRNA プールを供する。サンプルを複雑性を軽くするその他の方法はmRNAを、高密度アレープローブが特異的である領域のいづれか側に類似する領域にハイブリダイゼーションするデオキシオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることを含む。RNAse Ｈによる処理は二本鎖（ハイブリド二量体）を消化し、デオキシオリゴヌクレオチドプローブが以前結合し、且つ高密度アレープローブの標的に相当する短い領域（例えば20量体）に対応する一本鎖mRNAと、高密度アレーのプローブの標的の間の領域に対応する長めのmRNA配列とのプールを残す。この短いRNA フラグメントを長いフラグメントから分離し（例えば電気泳動により）、必要なら上記の通りにラベルし、これにより高密度プローブアッセイとのハイブリダイゼーションの用意が整う。第三の手法において、サンプル複雑性は特定の（予備選定）mRNAメッセージの選択的除去を包括する。特に、高密度アレー中のプローブにより特異的にプロービングされない高度に発現したmRNAのメッセージを除去するのが好ましい。この手法はポリＡ⁺mRNAを、３ ’（ポリＡ）末端近くの予備選定したメッセージに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションさせることを含む。このプローブは高い特異性及び低い交差反応性を供するように選定し得る。 RNase Ｈによるハイブリダイゼーションしたメッセージ／プローブ複合体の処理は二本鎖領域を消化し、メッセージの残りからポリＡ⁺テールを有効に除去する。次いでこのサンプルをポリＡ⁺RNAを特異的に保持又は増幅させる方法で処理する（例えばオリゴdTカラム又は（dT）_n 磁性ビーズ）。かかる方法は選定のメッセージを保持又は増殖しなく、なぜならそれらはもはやポリＡ⁺テールに結合していないからである。このような高度に発現したメッセージはサンプルから効果的に除去でき、低下したバックグランドmRNAを有するサンプルが供される。IV ．ハイブリダイゼーションアレーのデザインＡ）プローブ組成当業者は本発明の実施のために莫大の数のアレーデザインが適当であることを理解するであろう。この高密度アレーは一般に発現を検出すべき核酸に特異的にハイブリダイゼーションする数多くのプローブを含むであろう。更に、好適な態様において、このアレーは１又は複数のコントロールプローブを含むであろう。１）試験プローブその最も簡単な態様において、この高密度アレーは「試験プローブ」を含む。これらは長さが約５〜約45又は５〜約50個のヌクレオチド、より好ましくは約10 〜約40個のヌクレオチド、そして最も好ましくは約15〜約40個のヌクレオチドに範囲するオリゴヌクレオチドである。その他の極めて好適な態様において、これらのプローブは長さ20又は25個のヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、その発現を検出するようにデザインされた遺伝子の特定のサブ配列に対して相補性である配列を有する。即ち、これらの試験プローブはそれらが検出すべき標的核酸に対して特異的にハイブリダイゼーションすることができる。注目の標的核酸に結合する試験プローブの他に、高密度アレーはいくつかのコントロールプローブを含みうる。このコントロールプローブは本明細書でいう１）標準化コントロール；２）発現レベルコントロール；及び３）誤対合コントロールの３つのカテゴリーに属する２）標準化コントロール標準化コントロールは核酸サンプルに添加するラベル化された対照オリゴヌクレオチドに対して完璧に相補性であるオリゴヌクレオチドプローブである。ハイブリダイゼーション後に標準化コントロールから得られるシグナルはハイブリダイゼーション条件、ラベル強度、「測定効率」及びその他のアレー間の完璧なハイブリダイゼーションのシグナルを生じせしめうる要因の変動のコントロールを担う。好適な態様において、アレー中の全てのその他のプローブ由来のシグナル（例えば蛍光強度）測定値を、コントロールプローブ由来のシグナル（例えば蛍光強度）で除し、測定値を標準化させる。事実上全てのプローブが標準化コントロールを担いうる。しかしながら、ハイブリダイゼーション効率は塩基組成及びプローブ長に伴って変動する。好適な標準化プローブはアレーの中に存在するその他のプローブの平均的な長さを反映するように選択するが、それらは一定の長さをカバーするように選択されうる。標準化コントロールはアレー中のその他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選択されるが、好適な態様においては、１又は数個の標準化プローブしか利用せず、そしてそれらはよくハイブリダイゼーションし（即ち、二次構造がなく）、且つ標的特異的プローブには全く対合しないように選択する。標準化プローブはハイブリダイゼーションにおける立体的変動を効率的にコントロールするアレーの中の任意の位置又はアレーにわたる多数の位置に存在してよい。好適な態様において、標準化コントロールはアレーの角又は先端及び中央に位置する。３）発現レベルコントロール発現レベルコントロールは生物サンプル中で構成的に発現される遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするプローブである。発現レベルコントロールは細胞の総合的な健全さ及び代謝活性についてのコントロールのためにデザインされている。発現レベルコントロールと標的核酸の発現レベルとの共分散の調査は、遺伝子の発現レベルにおける測定できた変化又は変動がその遺伝子の転写速度の変化又は細胞の健全さの一般的な変動に基づくかどうかを示唆する。即ち、例えば、細胞が不健康であるか又は重要な代謝物を欠くとき、活性標的遺伝子及び構成的に発現される遺伝子の双方の発現レベルは低下するものと予測される。その逆も真なりである。即ち、発現レベルコントロール及び標的遺伝子の双方の発現レベルが共に低下又は共に上昇するとき、その変化は細胞全体の代謝活性の変化を担うことがあり、注目の標的遺伝子の示差的発現は担わないものと考えられる。逆に、標的遺伝子の発現レベル及び発現レベルコントロールが一緒に変動しないとき、標的遺伝子の発現レベルの変動はこの遺伝子の調節における相違を担い、そして細胞の代謝活性における総合的な変動は担わない。事実上任意の構成的に発現される遺伝子が発現レベルコントロールに適当な標的を担う。一般に発現レベルコントロールプローブは構成的に発現される「ハウスキーピング遺伝子」、例えばβ−アクチン遺伝子、トランスフェリンレセプター遺伝子、GAPDH 遺伝子等のサブ配列に対して相補性である。４）誤対合コントロール誤対合コントロールは標的遺伝子に対するプローブ、発現レベルコントロール又は標準化コントロールも担いうる。誤対合コントロールは１又は複数の誤対合塩基の存在を除き、その対応の試験又はコントロールプローブと同一である。誤対合塩基はプローブが本来特異的にハイブリダイゼーションする標的配列内の対合の塩基に対して相補性とならないように選定する。１又は複数の誤対合は、適当なハイブリダイゼーション条件（例えばストリンジェンシー条件）下で、試験又はコントロールプローブがその標的配列にハイブリダイゼーションするであろうが、誤対合プローブはハイブリダイゼーションしない（又は有意に弱い程度にしかハイブリダイゼーションしない）であろうように選ばれる。好適な誤対合は中央誤対合を含む。即ち、例えば、プローブが20量体であるとき、対応の誤対合プローブは６〜14位のいづれかにある単一塩基誤対合（例えばＡのＧ，Ｃ又はＴによる置換）を除き同一の配列を有するであろう（中央誤対合）。従って、誤対合プローブはプローブが特異的である標的以外のサンプル中の核酸に対する非特異的な結合又は交差ハイブリダイゼーションのためのコントロールを担う。即ち、誤対合プローブはハイブリダイゼーションが特異的か又はそうでないかを示唆する。例えば、もし標的が存在するなら、完璧誤対合プローブは誤対合プローブよりも一貫して明るいであろう。更に、全ての中央誤対合が存在するなら、誤対合プローブは突然変異の検出のために利用できうる。最後に、完全対合と誤対合プローブ（Ｉ（PM）−Ｉ（MM））との間での強度の差はハイブリダイゼーションした材料の濃度の良好な尺度を供するということも本発明の発見である。５）サンプルの調製／増幅コントロール高密度アレーはサンプル調製／増幅コントロールプローブも含みうる。これらのプローブは選定したコントロール遺伝子のサブ配列に対して相補性であり、なぜならそれらはアッセイする特定の生物サンプルの核酸の中で通常存在しないからである。適当なサンプル調製／増幅コントロールプローブには、例えば、注目のサンプルが真核細胞由来の生物学的なものであるとき、細菌性遺伝子に対するプローブ（例えばBio Ｂ）が含まれる。 RNA サンプルを、プロセシング前にサンプル調製／増幅コントロールプローブが特異的である既知量の核酸でスパイクする。これにより、サンプル調製／増幅コントロールプローブのハイブリダイゼーションの定量化はプロセシング工程（例えばPCR 、逆転写、in vitro転写、等）により生ずる核酸の量の変化の尺度を担う。Ｂ）プローブ選択及び最適化好適な態様において、高密度アレー中のオリゴヌクレオチドプローブは利用する特定のハイブリダイゼーション条件下で最少限の非特異的な結合又は交差ハイブリダイゼーションをもってそれらが特異的な核酸標的に対して特異的に結合するように選定する。本発明の高密度アレーは 1,000,000種以上のプローブを含みうるため、特定の核酸配列に結合する特徴的なプローブの全てを供することが可能である。即ち、例えば、この高密度アレーはIL−２ mRNA に対して相補性である考えられる20量体配列の全てを含みうる。しかしながら、IL−２ mRNA にとって固有でない20量体サブ配列が存在しうる。これらのサブ配列に対して特異的なプローブはサンプルゲノムのその他の領域中のその相補性配列の存在率で交差ハイブリダイゼーションするものと予測される。同様に、その他のプローブは単純にはハイブリダイゼーション条件下で効率的にハイブリダイゼーションしないことがある（例えば、二次構造により、又は基質もしくはその他のプローブとの相互作用により）。即ち、好適な態様において、かかる劣った特異性又はハイブリダイゼーション効率を示すプローブが同定でき、そしてそれらは高密度アレー自体（例えばアレーの作製中）又は後ハイブリダイゼーションデーター分析のいづれにも含まれないことがある。更に、好適な態様において、発現モニター用アレーは長さ数百塩基対である遺伝子の存在及び発現（転写）レベルの同定に利用される。ほとんどの用途にとって、数千〜数十万種の遺伝子の有無又は発現レベルの同定に有用であろう。アレー当りのオリゴヌクレオチドの数が好適な態様において制約されるため、発現を検出する各遺伝子に対して特異的な一定のセットのプローブのみを含ませることが所望される。 15，20又は25ヌクレオチドほどの短いプローブが遺伝子のサブ配列に対してハイブリダイゼーションするのに十分であり、そしてほとんどの遺伝子に関し、幅広い標的核酸濃度にわたってよく機能するプローブのセットがあることが本発明の発見である。好適な態様において、高密度アレーの合成前に各遺伝子に対して好適又は「最適な」プローブのサブセットを選定することが所望される。１）ハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーションデーターそこで、一の態様において、本発明は特定の遺伝子の検出のためのプローブセットを最適化する方法を提供する。一般に、この方法は、標的遺伝子により転写されるmRNAのサブ配列に対して相補的である１又は複数通りの特定の長さの多重プローブを含む高密度アレーの提供を含む。一の態様において、この高密度アレーは特定のmR NAに対して相補的である特定の長さの全てのプローブを含みうる。次いで高密度アレーのプローブをその標的核酸のみとハイブリダイゼーションさせ、次にプローブに対して相補性でない標的を含まない高度の複雑性、高濃度核酸サンプルとハイブリダイゼーションさせる。即ち、例えば、標的核酸がRNA であるとき、このプローブをまずその標的核酸のみとハイブリダイゼーションさせ、次いでcDNA ライブラリーから作ったRNA(例えば逆転写したポリＡ⁺mRNA)とハイブリダイゼーションさせるが、ここでハイブリダイゼーションしたRNA のセンスは標的核酸のそれと反対なものとする（高度の複雑性がプローブに対する標的を含まないことを確実にするため）。標的との強いハイブリダイゼーションシグナルを示し、且つ高複雑性サンプルとわずか又は全く交差ハイブリダイゼーションを示さないプローブが本発明の高密度アレーにおける利用のために好適なプローブである。高密度アレーは更に試験すべきプローブをそれぞれに対する誤対合コントロールを含みうる。好適な態様において、この誤対合コントロールは中央誤対合を含む。誤対合プローブ及び標的プローブが高レベルのハイブリダイゼーションを示すとき（例えば、誤対合に対するハイブリダイゼーションが対合の試験プローブに対するハイブリダイゼーションとほぼ同一又はそれより高いとき）、この試験プローブは高密度アレーにおいて利用しないのが好ましい。特に好適な態様において、最適なプローブは下記の方法に従って選定される：まず、前記の通り、この標的核酸のサブ配列に相補性である多重オリゴヌクレオチドプローブを含むアレーを用意する。このオリゴヌクレオチドプローブは単一の長さであるか、又は５〜50個のヌクレオチドに範囲する様々な長さのものであってよい。この高密度アレーは特定のmRNAに対して相補性である特定の長さの全てのプローブを含みうるか、又は特定のmRNAの様々な領域から選ばれるプローブを含みうる。各標的特異的プローブに関し、このアレーは誤対合コントロールプローブ、好ましくは中央誤対合コントロールプローブも含む。このオリゴヌクレオチドアレーをオリゴヌクレオチドプローブに対して相補性であるサブ配列を有する標的核酸を含むサンプルとハイブリダイゼーションさせ、そして各プローブとその誤対合コントロールとの間でのハイブリダイゼーション強度の差を決定する。プローブとその誤対合コントロールとの差が域値ハイブリダイゼーション強度（例えば、好ましくはバックグランドシグナル強度の10％より高い、より好ましくはバックグランドシグナル強度の20％より高い、そして最も好ましくはバックグランドシグナル強度の50％より高い）を超えるプローブのみを選択する。即ち、その誤対合コントロールと比べて強いシグナルを示すプローブのみ選択する。プローブ最適化手順は第二ラウンドの選別を任意的に含みうる。この選別において、オリゴヌクレオチドプローブアレーはプローブに対して相補性な配列を含まないものと予測される核酸サンプルとハイブリダイゼーションさせる。即ち、例えば、プローブがRNA センス鎖に対して相補性であるとき、アンチセンスRNA のサンプルを用意する。むろん、その他のサンプル、例えば特定の遺伝子を欠くことのわかっている、又は特定の遺伝子を発現しないことがわかっている生物又は細胞系に由来するサンプルを用意してよい。プローブ及びその誤対合コントロールが域値（例えば、バックグランドシグナル強度の約５倍未満、好ましくはバックグランドシグナル強度の約２倍以下、より好ましくはバックグランドシグナル強度以下、そして最も好ましくはバックグランド強度の半分以下）より低いハイブリダイゼーション強度を示すプローブのみを選定する。これにより、最少限の非特異的結合を示すプローブが選定される。最後に、好適な態様において、双方の選定基準を満たし、且つアレーへの組込みのために選別された各標的遺伝子に関して、又はアレーの中に既に存在しているときは、その後のデーター分析に関して最大のハイブリダイゼーション強度を有するｎ個のプローブ（ここでｎは各標的遺伝子に所望されるプローブの数）を選定する。むろん当業者は、いづれかの選別基準をプローブの選定のために単独で利用できうることを理解しているであろう。２）発見法則上記で得られたハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーションデーターを利用し、ハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーション、対、様々なプローブの特性、例えばAsの数、８塩基の窓の中のCsの数、パリンドローム強度、等のグラフが作成できうる。これらのグラフをこのような特性とハイブリダイゼーション又は交差ハイブリダイゼーション強度との間の相関のために調査し得る。域値であってそれより高いとハイブリダイゼーションが常に弱い、又は交差ハイブリダイゼーションが常に強いように見える域値を設定する。いづれかのプローブがこの基準の一つを満たさないとき、それはプローブのセットから除外し、チップに入れない。これを発見法則方法と呼ぶ。この方法で20量体のプローブに開発された一組の法則は下記の通りである：ハイブリダイゼーション法則：１）Asの数は９未満とする。２）Tsの数は10未満、且つ０より大とする。３）As，Gs又はTsの最大ランは一列中４塩基未満とする。４）任意の２個の塩基の最大ランは11塩基未満とする。５）パリンドロームスコアは６未満とする。６）クランピングスコアは６未満とする。７）Asの数＋Tsの数は14未満とする。８）Asの数＋Gsの数は15未満とする。法則番号４に関し、任意の２個の塩基の最大ランが11塩基未満であることの必要性は任意の12個の連続ヌクレオチド内で少なくとも３種類の塩基が存在することを保証する。パリンドロームスコアは、オリゴヌクレオチドを自己相補性を最大にする点で折りたたんだときの相補性塩基の最大数である。即ち、例えば完璧に自己相補性である20量体は10のパリンドロームスコアを有する。クランピングスコアは所定の配列中の同一塩基の３量体の最大数である。即ち、例えば、５個の同一塩基のランは３のクランピングスコアを供するであろう（塩基１−３、塩基２−４及び塩基３−５）。いづれかのプローブがこれらの基準（１−８）を満たさないとき、このプローブはチップ上に配されるプローブサブセットのメンバーとしない。例えば、仮説プローブが5'-AGCTTTTTTCATGCATCTAT-3'のとき、このプローブはチップ上で合成されず、なぜならそれは４個以上の塩基のラン（例えば６個の塩基のラン）を有するからである。 20量体について開発した交差ハイブリダイゼーション法則は下記の通りである：１）Csの数は８未満である；２）任意の８個の塩基内のCsの数は４未満とする。即ち、もし任意のプローブがハイブリダイゼーション法則（１〜８）又は交差ハイブリダイゼーション法則（１〜２）のいづれかを満たさないなら、このプローブはチップ上に配されるプローブサブセットのメンバーとならない。これらの法則は強く交差ハイブリダイゼーションする又は弱いハイブリダイゼーションを示す数多くのプローブを排除し、そして弱くハイブリダイゼーションするプローブを排除するという適切な作業を可能にする。これらの発見法則は手計算により履行されうるか、又はそれらは第IV章Ｂ．７に記載のソフトウェアで履行されうる。３）ニューラルネット別の態様において、プローブの配列又はその他のプローブ特性に基づいてハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーションを予測せしめるニューラルネットを訓練する(train)ことができる。ニューラルネットは任意の数の「最良」のプローブを拾うために利用できる。一のかかるニューラルネットは20量体プローブを選定するために開発した。このニューラルネットは、ハイブリダイゼーションよりも交差ハイブリダイゼーションにとって良好なモデルで、推定強度と測定強度との間の中程度(0.7)の相関を供する。このニューラルネットの詳細は実施例６に示す。４）ANOVA モデル分散分析(ANOVA)モデルを、連続塩基対の位置上の強度をモデル化するために構築し得る。これは溶融エネルギーが連続する塩基の総合エネルギーに基づくという理論を基礎とする。このANOVA モデルはプローブ配列とハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーション強度との間の相関を見い出すために利用した。インプットは連続する塩基対へと分解したプローブ配列とした。一のモデルはハイブリダイゼーションを推定するために作り、他方は交差ハイブリダイゼーションを推定するために作った。アウトプットはハイブリダイゼーション又は交差ハイブリダイゼーション強度とした。 304 通り（19×16）の可能なインプットがあり、それは14通り考えられる２塩基の組合せと、その組合せが見い出せうる19の位置より成る。例えば、配列 aggctga…は第一位に「ag」を有し、第２位に「gg」を有し、第三位に「gc」を有し、そして第４位に「ct」有する、等々である。得られるモデルは考えられるインプットそれぞれに対するアウトプット強度の成分を割り当て、従って所定の配列についての強度を推定するには、単にその19 の成分それぞれについての強度を加算するだけでよい。５）類似のプローブの枝刈り（排除）発現チップにおける弱いシグナルの原因の一つはモニターすべきもの以外の遺伝子がモニターすべき配列の一部に非常に似た配列を有することにある。この問題を解決するための最も簡単な方法は複数の遺伝子に類似しているプローブを除去することにある。即ち、好適な態様において、複数の遺伝子の転写生成物にハイブリダイゼーションするプローブを除去（枝刈り）することが所望される。最も簡単な枝刈り方法はモニターする生物についての全ての公知の遺伝子で提案プローブをラインアップし、次いで対合塩基の数を数えることにある。例えば、生物の遺伝子１及び生物の遺伝子２に対するプローブに関し：という整合において８組の対合塩基があるが、下記の整合においては20組の対合塩基がある：挿入又は欠失誤対合の検出を可能にするより複雑なアルゴリズムも存在する。かかる配列整合アルゴリズムは当業者に公知であり、そして限定することなくBL AST 又はFASTA 、又はその他の対合プログラム、例えば定義の章に記載のものが含まれる。別の変異体において、生物が非常に類似し合う数多くの遺伝子を有するとき、そのような非常に類似する遺伝子のうちの１つのみの濃度を測定するプローブセットを作ることは困難である。従って類似しない任意のプローブを枝刈りし、そしてその遺伝子科についてのプローブセットを作る。６）合成サイクルの枝刈りチップのためのマスクを製造する費用は合成サイクル数にほぼ正比例する。通常の遺伝子セットでは、構築のために任意のプローブがとるサイクル数の分布は Gausian 分布に近い。このため、マスク費用はプローブの約３％をなくすことにより15％削減できうる。好適な態様において、合成サイクルの枝刈りは、特定の対象高密度オリゴヌクレオチドアレーの調製のために選択される合成サイクルの最大数よりも多い合成サイクル数を必要とするプローブを排除（含ませない）ことを単純に包括する。典型的なプローブ合成は規則的な塩基配置パターン（acgt acgtacgt…）に従うため、プローブを構築するのに必要な合成段階の数の計測は簡単である。表１に示すリストはプローブが必要とするであろう合成サイクル数の計測のために典型的なコードを供する。７）選別方法の組合せ発見法則、ニューラルネット及びANNOVAモデルは遺伝子の発現をモニターするためのプローブの数の枝刈り又は削減の方法を供する。これらの方法は同一の結果を供する、又は全体的に独立した結果を供する必要はないため、これらの方法を組合せることが有利でありうる。例えば、複数の方法（３通りのうちの２通りの如く）がそのプローブが良好な結果を供さないようであると示唆したなら、そのプローブを枝刈り又は削除してよい。従って、合成サイクル枝刈りは費用の削減のために実施し得る。図11はプローブの数を削減又は枝刈りした後の遺伝子の発現をモニターするためにプローブの数を増大させるプロセスのフローである。一の態様において、ユーザーは各遺伝子の発現をモニターするためにチップに配すべき核酸プローブの数を特定することが可能である。上記の通り、良好な結果を供さないようであるプローブを減らすことが好都合である。しかしながら、プローブの数は所望のプローブ数よりかなり少ない数にまで削減できうる。段階402 において、多重遺伝子をモニターするためのプローブの数は発見法則方法、ニューラルネット、ANNOVAモデル、合成サイクル枝刈り、もしくは任意のその他の方法、又は方法の組合せにより削減される。遺伝子は工程404 で選定する。選定した遺伝子をモニターするための残留プローブの数が所望のプローブ数の 80％より多い（これは変えてもよく、又はユーザーが決めてもよい）かどうかを決定する。もしそうなら、このコンピューターシステムは段階408 で次の遺伝子を処理し、それは一般に段階404 に戻るであろう。もし選定した遺伝子をモニターするための残留プローブが所望のプローブ数の 80％より多くないとき、選定した遺伝子をモニターするための残留プローブが所望のプローブ数の40％より多い（これは変えてもよく、又はユーザーが決めてもよい）かどうかを決定する。もしそうなら、遺伝子名の最後に添えた「ｉ」は、枝刈り後、プローブが段階412 において不完全であったことを示唆する。段階414 において、プローブの数はプローブを却下する拘束をゆるめることにより増やす。例えば、発見法則における域値は１上昇させてよい。従って、もし先のプローブが列の中に４個のAsを有することで却下されるなら、その法則は一列の中の５個のAsまでゆるめてよい。次に選定した遺伝子をモニターするための残留プローブ数が段階416 での所望のプローブ数の80％より多いかどうかを決定する。もしそうなら、段階412 での遺伝子名の最後に「ｒ」を添え、それはその遺伝子のためのいくつかの合成プローブ数の作成のために法則をゆるめたことを示唆する。段階420 において、選定遺伝子をモニターするためのプローブが１又は２種のその他の遺伝子とのみ対立しないかを見定めるための検定を行う。もしそうなら、この遺伝子（又は標的配列）に相補性であるプローブのフルセットをとり、そして残っているプローブが専ら段階422 にある選定遺伝子に対して正に相補性となるように枝刈りする。次に選定遺伝子をモニターするための残留プローブ数が段階424 での所望のプローブ数の80％より多いかどうかを決定する。もしそうなら、段階426 での遺伝子名の最後に「ｓ」を添え、それは数遺伝子しか選定遺伝子に類似しないことを示唆する。段階428 において、選定遺伝子をモニターするためのプローブは対立によっては全く減らない。従って、選定遺伝子をモニターするための残留プローブ数が段階430 での所望のプローブ数の80％より多いかどうかを決定する。もしそうなら、段階432 での遺伝子名の最後に「ｆ」を添え、それはそのプローブがこの遺伝子に完璧に相補性であるプローブの科全体を含むことを示唆する。もし所望のプローブ数の80％までいまだ満たないなら、段階434 においてエラーが報告される。数多くのエラー取り扱い手順がとられうる。例えば、ユーザーのためにエラーメッセージを作製し、そして遺伝子のためのプローブは保存しなくてよい。他方、ユーザーは新たな所望のプローブ数を入力するように行動してよい。Ｖ．高密度アレーの合成少ない合成段階数によるオリゴヌクレオチド、ペプチド及びその他のポリマー配列の高密度アレーを形成する方法が公知である。オリゴヌクレオチド類似体アレーは固相支持体上に、様々な方法、例えば限定することなく、光誘導化学カップリング及び機械誘導カップリングにより合成できうる。Pirrung ら、米国特許第 5,143,854号（更にはPCT 出願第WO90/15070号）並びにFodor ら、PCT 公開番号WO92/10092及びWO93/09668号を参照のこと。これらは光誘導合成技術を利用するペプチド、オリゴヌクレオチド及びその他の分子の広大なアレーを形成する方法を開示する。更にFodor らScience，251，767-77（1991）も参照のこと。ポリマーアレーを合成するためのこれらの手順は現在VLSIPS（商標）手順と呼ばれている。VLSIPS（商標）アプローチを利用し、ポリマーの一の異種アレーを、いくつかの反応部位での同時カップリングを介し、別の異種アレーへと変換させる。米国出願第07/796,243号及び07/980,523号を参照のこと。上記の米国特許第 5,143,854号並びにPCT 特許公開第WO90/15070及び92/10092 号に記載のVLSIPS（商標）技術の開発は順列組合せ合成及び順列組合せライブラリーのスクリーニング分野における先駆的な技術と考えられる。より近年になって、1993年６月25日提出の特許出願第08/082,937号には標的核酸の部分又は完全配列を検定又は決定するため、並びに特定のオリゴヌクレオチド配列を含む核酸の存在を検出するために利用できうるオリゴヌクレオチドプローブのアレーを作製する方法が記載されている。簡単には、ガラス表層上でのオリゴヌクレオチドアレーの光誘導順列組合せ合成は自動ホスホラミジット化学及びチップマスキング技術を利用して進行する。一の特定の実施において、ガラス表層を光不安定性保護基によりブロッキングされたヒドロキシル基又はアミン基の如き官能基を含むシラン試薬で誘導化する。フォトリソグラフィーマスクを介する光分解を官能基の曝露のために選択的に利用し、それは到来してくる５’−光保護型ヌクレオシドホスホラミジットと容易に反応する。ホスホラミジットは照射された（それ故光不安定ブロッキング基の除去により露出されて）部位のみと反応する。即ち、ホスホラミジットは先の工程より選択的に露出された領域のみに付加される。これらの工程は所望の配列アレーが固体表層上に合成されるまで繰り返す。アレー上の種々の位置にある種々のオリゴヌクレオチド類似体の順列組合せ合成は合成の際の照射パターン及びカップリング試薬の添加の順序により決定される。ポリアミド骨格を有するオリゴヌクレオチド類似体をVLSIPS（商標）手順に用いる状況では、合成工程を実施するのにホスホラミジット化学品を利用するのは一般に不適当であり、なぜならこれらのモノマーはリン酸結合を介して互いに付加されないからである。その代わり、ペプチド合成法が代用される。例えば、Pi rrung ら、米国特許第 5,143,854号を参照のこと。ペプチド核酸は例えばBiosearch Inc．(Bedford，MA)から市販され、それはポリアミド骨格及び天然ヌクレオチドにおいて見い出せる塩基を含んで成る。ペプチド核酸は高い特異性をもって核酸に結合でき、そして本開示の目的のための「オリゴヌクレオチド類似体」と考えられる。上記に加えて、単一の支持体上でオリゴヌクレオチドアレーを作成するために利用できる更なる方法が1992年11月20日提出の同時係属出願第07/980,523号及び 1991年11月22日出願の同07/796,243号、並びにPCT 公開番号WO93/09668号に記載されている。これらの出願において開示されている方法において、試薬を支持体に、（１）所定の領域上に規定されたチャネル内に流動して、又は（２）所定の領域上に「点着」させることによって導入する。しかしながら、その他の手法、並びに点着及び流動の組合せが利用できうる。各状況において、支持体の所定の活性化領域は、モノマー溶液を様々な反応部位に導入したときにその他の領域から機械的に分離させる。本発明の化合物及びライブラリーに適用する典型的な「フローチャネル」は一般に下記の通りであってよい。分散ポリマー配列を支持体又は固相支持体の選定の領域において、この支持体の表層上にフローチャネルを形成し、それに適当な試薬を流す又は適当な試薬を載せることにより、合成する。例えば、モノマー「Ａ」を選定領域の第一の基において支持体に組合させる。必要なら、選定領域全体又は一部の中の支持体の表層全体又は一部を、例えば、チャネル全体又は一部に適当な試薬を流すことにより、又は支持体全体を適当な試薬で洗浄することにより、結合のために活性化させる。支持体の表層上のチャネルブロックの設置後、モノマーＡを有する試薬をチャネル全体又は一部に流す又はそこに載せる。このチャネルは第一選定領域に対する流体接触を担い、これにより支持体上のモノマーＡを第一選定領域の中に直接又は間接的（スペーサーを介し）に結合させる。その後、モノマーＢを第二選定領域にカップリングさせ、その領域の一部は第一選定領域をまたいで含まれうる。この第二選定領域は第二フローチャネルと、支持体の表層上のチャネルブロックの並進運動、回転又は置換を介して；特定のバルブの開閉を介して；又は化学又はホトレジストの層の付着を介して、流体接触するであろう。必要なら、少なくとも第二領域を活性化する工程を実施する。その後、モノマーＢを第二フローチャネルに流す又は載せ、モノマーＢを第二選定位置に結合させる。この特定の実施例において、この処理段階において支持体に結合した得られる配列は例えばＡ，Ｂ及びＡＢであろう。このプロセスは支持体上の既知の位置での所望の長さの広大な配列アレーを形成するように繰り返す。支持体を活性化した後、例えばモノマーＡはチャネルの一部に流してよく、モノマーＢはその他のチャネルを介して流してよく、モノマーＣは更にその他のチャネルを介して流してよい。このようにして、反応領域の多く又は全てを、チャネルブロックを移動させる前、又は支持体を洗浄及び／もしくは再活性化させる前に、モノマーと反応させる。有効な反応領域の多く又は全てが同時に有用となることにより、洗浄及び活性化工程の数は最少となりうる。当業者はチャネルを形成する又はそうでなければ支持体の表層の一部を保護する別の方法があることを認識するであろう。例えば、ある態様に従うと、保護コーティング、例えば親水性又は疎水性コーティング（溶媒の種類に依存）を保護すべき支持体の領域上に、時折りその他の領域における反応溶液による濡れを促進する材料と組合せて、利用する。この場合、流動溶液はそのデザインされた流路の外を通ることが更に阻止されている。本発明の化合物及びライブラリーを調製する「点着」方法はフローチャネル法とほとんど同じようにして履行されうる。例えば、モノマーＡを適当に活性化された反応領域の第一の基に導入してカップリングさせてよい。その後、モノマーＢを活性化反応領域の第二の基に導入して反応させてよい。上記のフローチャネル態様とは異なり、反応体は比較的少量のそれらを選定の領域に直接付着（流すのではなく）させることにゆより導入する。ある工程においては、むろん支持体全体に溶液をスプレー又はその他の方法でコーティングしてよい。好適な態様において、分注器を領域間で移動させ、各停止時に必要な分だけモノマーを付着させる。典型的な分注器はモノマー溶液を支持体に導入するマイクロピペット及び支持体に対するマイクロピペットの位置をコントロールするロボットシステムを含む。別の態様において、この分注器は一式のチューブ、マニホールド、一組のピペット等を含み、様々な試薬を反応領域に同時に導入できる。VI ．ハイブリダイゼーション核酸ハイブリダイゼーションは単に変性プローブ及び標的核酸を、そのプローブ及びその相補性標的が相補性塩基対合を介して安定なハイブリド二量体を形成できる条件下に置くことを含む。ハイブリド二量体を形成しない核酸は、一般に付加された検出可能ラベルの検出を介して検出すべきハイブリダイゼーションした核酸が残るように洗い流す。一般に核酸は温度を上げる又は核酸を含むバッファーの塩濃度を下げることにより変性することが認識されている。低ストリンジェンシー条件下（例えば低温及び／又は高塩）では、ハイブリド二量体(例えば DNA：DNA，RNA：RNA 又は RNA：DNA)はアニーリングした配列が完璧に相補性でないときでさえも形成されるであろう。即ち、ハイブリダイゼーションの特異性は低めのストリンジェンシーで低下する、逆に、高めのストリンジェンシーでは（例えば高温又は低塩）、有効なハイブリダイゼーションは少なめの誤対合を要する。当業者は、ハイブリダイゼーション条件はあらゆるストリンジェンシー度を供するように選定されうることを理解するであろう。好適な態様において、ハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシーで実施され、この場合、ハイブリダイゼーションが確実となるように６ＸのSSPE−Ｔの中で 37℃(0.005％のTriton X-100)にて行れ、そしてその後の洗浄は誤対合ハイブリド二量体を排除するために高めのストリンジェンシー（例えば１ＸのSSPE−Ｔ， 37℃）で行う。連続洗浄は所望のハイブリダイゼーション特異性レベルが得られるまで高めのストリンジェンシーを強めながら（例えば37℃から50℃までにおいて、0.25ＸのSSPE−Ｔほどの低さにまで下げて）行ってよい。ストリンジェンシーはホルムアミドの如き試薬の添加によっても高まりうる。ハイブリダイゼーション特異性は、試験プローブに対するハイブリダイゼーションと、存在しうる様々なコントロール（例えば発現レベルコントロール、標準化コントロール、誤対合コントロール等）に対するハイブリダイゼーションとの対比により評価し得る。一般に、ハイブリダイゼーション特異性（ストリンジェンシー）とシグナル強度との間には矛盾がある。即ち、好適な態様において、洗浄は一貫した結果を供し、且つバックグランド強度の約10％より高いシグナル強度を供する最大のストリンジェンシーで行う。即ち、好適な態様において、このハイブリダイゼーションしたアレーを順次高まるストリンジェンシー条件下で洗い、そして各洗浄内で測定する。このようにして得られるデーターセットの分析は洗浄ストリンジェンシーであって、それを超えてもハイブリダイゼーションパターンは有意に変わらず、且つ注目の特定のオリゴヌクレオチドプローブにとっての適当なシグナルを供するものを示す。好適な態様において、バックグランドシグナルはハイブリダイゼーション中で非特異的結合を抑制する界面活性剤（例えばＣ−TAB）又はブロッキング試薬（例えば精子DNA，cot−１DNA 等）の利用により低下する。特に好適な態様において、ハイブリダイゼーションは約 0.5μｍ／mlのDNA(例えばにしんの精子DNA)の存在下で実施する。ハイブリダイゼーションにおけるブロッキング試薬の利用は当業者に公知である（P．Tijssen 第８章、前掲参照のこと）。 RNA 又はDNA 間で形成される二量体の溶液中での安定性は RNA：RNA ＞RNA：D NA ＞ DNA：DNA の順序である。長いプローブは標的との良好な二量体安定性を有するが、短めのプローブよりも弱い誤対合識別性を有する（誤対識別は完全対合プローブと一個の塩基誤対合プローブとの間で測定されるハイブリダイゼーションシグナル比を意味する）。短めのプローブ（例えば８量体）は非常に良く誤対合を識別するが、全体的な二量体安定性は低い。例えば既知のオリゴヌクレオチド類似体を用いる標的とプローブとの間で形成される二量体の熱的安定性（Tm）を変えることは、二量体安定性及び誤対合識別の最適化を可能にする。Tmを変える一の有用な観点はアデニン−チミン（Ａ−Ｔ）二量体がグアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）二量体よりも低いTmを有することにより生じ、それはＡ−Ｔ二量体が一塩基対当り２本の水素結合を有し、一方Ｇ−Ｃ二量体が塩基対当り３本の水素結合を有するからである。均一でない塩基の分布がある異種オリゴヌクレオチドアレーにおいては、各オリゴヌクレオチドプローブについてのハイブリダイゼーションを同時に最適化することは一般に可能でない。即ち、ある態様において、Ｇ−Ｃ二量体を選択的に不安定化する及び／又はＡ−Ｔ二量体の安定性を高めることが所望される。これは、例えばＧ−Ｃ二量体を形成するアレープローブ内のグアニン残基をヒポキサンチンで置換することにより、又はＡ−Ｔ二量体を形成するプローブ内のアデニン残基を２，６−ジアミノプリンで置換することにより、又はNaClの代わりに塩テトラメチルアンモニウムクロリド(TMACL)を利用することにより達成し得る。オリゴヌクレオチド類似体プローブを利用することにより供される改変された二量体安定性は、標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたオリゴヌクレオチド類似体アレーの蛍光シグナル強度を経時的に追うことにより確認できる。このデーターは例えば室温での特異的なハイブリダイゼーション条件の最適化を可能にする（将来の簡略化診断用途のため）。改変された二量体安定性の別の手法はハイブリダイゼーションにより生成するシグナル強度を経時的に追うことによる。DNA 標的及びDNA チップを利用する従来の実験はシグナル強度が経時的に増大し、そしてより安定な二量体が高めのシグナル強度を安定性の弱い二量体よりも速く生成することを示す。シグナルは全くの結合部位が占拠されることにより一定時間経過後にプラトー又は「飽和」に達する。これらのデーターはハイブリダイゼーションの最適化及び特定の温度での最良の条件の決定を可能にする。ハイブリダイゼーション条件の方法の当業者に公知である（例えば、Laborato ry Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol．24 : Hybridiza tion With Nucleic Acid Probes，P．Tijssen，ed．Elsevier，N．Y.，(1993)を参照のこと）。VII ．シグナル検出高密度アレーのプローブにハイブリダイゼーションしたラベル化標的（サンプル）核酸を検出する手段は当業者に公知である。即ち、例えば、比色ラベルを使用するとき、ラベルの簡単な目視で十分である。放射能ラベル化プローブを使用する場合、放射線の検出（例えば写真フィルム又はソリッドステート検出器による）で十分である。しかしながら好適な態様において、この標的核酸を蛍光ラベルでラベルし、そしてプローブアレー上のラベルの位置決定を蛍光顕微鏡で行う。ハイブリダイゼーションしたアレーを光源により、特定の蛍光ラベルの励起波長で励起し、そして発光波長で得られる蛍光を検出する。特に好適な態様において、励起光源は蛍光ラベルの励起のために適当なレーザーとする。同焦点顕微鏡は高密度アレー全体を自動スキャンするためにコンピューターコントロール式ステージで自動化されていてよい。同様に、顕微鏡はアレー上の各オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションにより供される蛍光シグナルを自動記録するための自動データー獲得システムに装着された光変換器（例えば光増幅器、ソリッドステートアレー、ccd カメラ等）を装備していてよい。かかる自動システムは全体的に米国特許第 5,143,854号、PCT 出願 20 92 /10092、及び1994年２月10日提出の同時係属U.S.S.N08/195,889号に記載されている。シグナル検出のための自動同焦点顕微鏡と一緒でのレーザー照射の利用は約 100μｍより良い、より好ましくは約50μｍより高い、そして最も好ましくは約25μｍより良い解像度においての検出を可能にする。VIII ．シグナル評価当業者はハイブリダイゼーション結果を評価するための方法が利用する特定のプローブ核酸の種類及び備っているコントロールにより変わることを理解するであろう。最も簡単な態様において、各プローブについての蛍光強度の簡単な定量化を決定する。これは単に高密度アレー上の各位置（別のプローブを占める）でのプローブシグナル強度の測定による（例えばラベルが蛍光ラベルのとき、アレー上の各位置での固定化励起照射により生成される蛍光（強度）の値の検出による）。「コントロール」サンプルにより生成される強度との「試験」サンプル由来の核酸に対してハイブリダイゼーションしたアレーの絶対強度の対比は各プローブにハイブリダイゼーションした核酸の相対発現の尺度を提供する。しかしながら、当業者はハイブリダイゼーションシグナルは、ハイブリダイゼーションの効率、サンプル核酸上のラベルの量及びサンプル中の特定の核酸の量により強度が変化するであろうことを理解しているであろう。一般に、非常に低いレベル（例えば＜１pM）で存在する核酸は非常に弱いシグナルを示すであろう。若干低い濃度レベルでは、シグナルはバックグランドから事実上識別できなくなりはじめる。ハイブリダイゼーションデーターの評価において、限界強度値であって、それを下廻るとシグナルはバックグランドから本質的に識別されずに計算できない値が検出される。低レベルで発現される核酸を検出することが所望されるとき、低めの域値が選定される。逆に、高い発現レベルのみを評価するとき、高めの域値が選定される。好適な態様において、適当な域値は平均バックグランドシグナルより約10％高い。更に、適当なコントロールの供与はハイブリダイゼーション条件、細胞の健康さ、非特異的結合等の変動をコントロールしたより詳細な分析を可能にする。即ち、例えば、好適な態様において、ハイブリダイゼーションアレーには第IV章Ａ．２．で上記した標準化コントロールが備っている。これらの標準化コントロールはサンプルに既知の濃度で添加されたコントロール配列に対して相補性であるプローブである。全体的なハイブリダイゼーション条件が劣っている場合、標準化コントロールはハイブリダイゼーションの低下を反映する弱めのシグナルを示すであろう。逆に、ハイブリダイゼーション条件が良好の場合、標準化コントロールは向上したハイブリダイゼーションを反映する高めのシグナルを供するであろう。標準化コントロールに対するアレー中のその他のプローブに由来するシグナルの標準化は従ってハイブリダイゼーション条件における変動のためのコントロールを供する。一般に、標準化はアレー中のその他のプローブに由来する測定シグナルを標準化コントロールにより生成される平均シグナルで除することにより行われる。標準化はサンプル調製及び増幅に基づく変動のための補正も含みうる。かかる標準化は測定シグナルをサンプル調製／増幅コントロールプローブ（例えばBio Ｂプローブ）由来の平均シグナルで除することによって行われうる。得られる値に定数を剰して結果を評価する。上記の通り、高密度アレーは誤対合コントロールを含みうる。好適な態様において、アレー中の全てのプローブ（標準化コントロールを除く）に対する中央誤対合を有する誤対合コントロールがある。ストリンジェンシー条件下での洗浄の後、プローブに対するハイブリダイゼーションに完全対合が予測されるとき、誤対合コントロール由来のシグナルは非特異的結合か、又は誤対合とハイブリダイゼーションする核酸のサンプル中の存在のみを反映するべきである。注目のプローブ及びその対応の誤対合コントロールの双方が共に高いシグナルを示すとき、又は誤対合がその対応の試験プローブよりも高いシグナルを示すとき、ハイブリダイゼーション及びこれらのプローブ由来のシグナルが無視されてしまうという問題がある。標的特異的プローブとその対応の誤対合コントロール間でのハイブリダイゼーションシグナル強度の差は標的特異的プローブの識別の尺度である。即ち、好適な態様において、誤対合プローブのシグナルをその対応の試験プローブ由来のシグナルから差し引き、試験プローブの特異的な結合に基づくシグナルの尺度を供する。特定の配列の濃度は遺伝子に特異的に結合する各プローブのシグナル強度を測定し、そして標準化コントロールに対して標準化することにより決定し得る。プローブ由来のシグナルが誤対合よりも高いとき、誤対合を差し引く。誤対合強度がその対応の試験プローブのそれ以上であるとき、シグナルは無視する。特定遺伝子の発現レベルは陽性シグナルの数（絶対値又は域値より高い）、陽性シグナルの強度（絶対値又は域値より高い）、又は双方の尺度の組合せ（例えば重みつき平均）により評価し得る。本発明の驚くべき発見は、標準化コントロールがハイブリダイゼーションシグナルの有用な定量化のために往々にして不要であることにある。即ち、上記の二段選別プロセスにおいて最適プローブが同定されたとき、選定の最適プローブにより生成される平均ハイブリダイゼーションシグナルはハイブリダイゼーションした核酸の濃度の良好な定量尺度を供する。IX ．コンピューター一体化発現モニター本発明の遺伝子発現モニター方法はコンピューターを用いて実施されうる。コンピューターは一般に、支持体又はチップから測定されたハイブリダイゼーション強度を分析し、それ故、１又は複数種の遺伝子の発現をモニターするため、本発明に含まれるコンピューターコードを含むソフトウェアプログラムを実行化させる。以下は本発明の特定の態様を示すものであるが、本発明はそれらに限定されるものではない。図６は本発明の態様のソフトウェアを実行化するのに用いたコンピューターシステムの例を示す。示す通り、コンピューターシステム100 はモニター102 、スクリーン104 、キャビネット106 、キーボード108 及びマウス110 を含む。マウス110 は１又は複数のボタン、例えばマウスボタン112 を有しうる。キャビネット106 には、CD−ROM ドライブ114 、本発明を実施するコンピューターコード、本発明に利用するためのデーター等の入ったソフトウェアプログラムを保存及び検索するために用いられうるシステムメモリー及びハードドライブ（双方共に図７に示す）が収容されている。CD−ROM 116 は典型的なコンピューターリーダブル保存媒体として示すが、その他のコンピューターリーダブル保存媒体、例えばフロッピーディスク、テープ、フラッシュメモリー、システムメモリ及びハードドライブを利用してよい。キャビネット106 には更に慣用のコンピューターコンポネント（図示せず）、例えばセントラルプロセッサー、システムメモリー、ハードディスク等が収容されている。図７は本発明の態様のソフトウェアを実行化するために用いるコンピューターシステム100 のシステムブロックダイアグラムを示す。図６に示すように、コンピュータシステム100 はモニター102 及びキーボード108 を含む。コンピューターシステム100 は更にサブシステム、例えばセントラルプロセッサー120 、システムメモリー122 、Ｉ／Ｏコントローラー124 、ディスプレーアダプター126 、リムーバブルディスク128(例えばCD−ROM ドライブ)、固定ディスク130(例えばハードドライブ)、ネットワークインターフェース132 、及びスピーカー134 を含む。本発明に利用するのに適当なその他のコンピューターシステムは更なる又は少ないサブシステムを含みうる。例えば、その他のコンピューターシステムは複数のプロセッサー120(即ちマルチプロセッサーシステム)又はキャッシュメモリーを含みうる。矢印、例えば136 はコンピューターシステム100 のシステムバスアーキテクチャーを示す。しかしながら、これらの矢印はサブシステムを連結する任意のインターコネクションスキームの例示である。例えば、セントラルプロセッサーをシステムメモリー及びディスプレーアダプターに接続するのにローカルバスを使用してよい。図７に示すコンピューターシステム100 は本発明に利用するのに適当なコンピューターシステムの例である。本発明に利用するのに適当なサブシステムのその他の形態は当業者に明らかであろう。図８は遺伝子の発現をモニターあるプロセスのフローチャートである。このプロセスは、支持体又はチップの表層に好適には共有付加された完全対合及び誤対合プローブのペアーのハイブリダイゼーション強度を比較する。最も好ましくは、核酸プローブは支持体１cm²当り約60種より多くの核酸プローブの密度を有する。このフローチャートは明瞭化のために段階式に示しているが、これらの段階はこの特定の順序で実施しなければならないことを意味するのではない。当業者は本発明から逸脱することなく、多くの段階と順序換え、組合せ及び省略してよいことを容易に認識するであろう。最初に、核酸プローブは標的配列（又は遺伝子）に相補性となるように選定する。これらのプローブは完全対合プローブである。標的配列に対して完璧に相補性でないことを意図する別のセットのプローブを特定する。これらのプローブは誤対合プローブであり、そして各誤対合プローブは完全対合プローブと少なくとも一のヌクレオチド誤対合を含む。従って、誤対合プローブ及びそれが由来する完全対合プローブはプローブのペアーを成す。前記の通り、ヌクレオチド誤対合は誤対合プローブの中央付近にあるのが好ましい。完全対合プローブのプローブ長は一般に標的配列と高いハイブリダイゼーション親和力を示すように選定する。例えば、核酸プローブは全て20量体であってよい。しかしながら、様々な長さのプローブを、不明瞭性の解決を含む数多くの理由のため、支持体上で合成してもよい。標的核酸は一般に断片化し、ラベルし、そして前述の核酸プローブを含む支持体に曝露させる。次いで核酸プローブのハイブリダイゼーション強度を測定し、そしてコンピューターシステムに入力する。このコンピュータシステムは支持体のハイブリダイゼーションを指令するのと同じシステムであるか、又は一体化した別のシステムであってよい。むろん、本発明に利用するための任意のコンピューターシステムは本実験の有用なその他の詳細、例えば考えられるものとして遺伝子名、遺伝子配列、プローブ配列、支持体上のプローブの位置、等を有すべきである。図８を参照すると、ハイブリダイゼーションの後、コンピューターシステムは段階202 での完全対合及び誤対合プローブの多重ペアーのハイブリダイゼーション強度の入力を受容する。このハイブリダイゼーション強度は核酸と標的核酸との間のハイブリダイゼーション親和力を示唆する（それは遺伝子に対応する）。各ペアーは標的核酸の一部に完璧に相補性である完全対合プローブと、この完全対合プローブと少なくとも１ヌクレオチドで相違する誤対合プローブとを含む。段階204 において、このコンピューターシステムは各ペアーの完全対合プローブと誤対合プローブのハイブリダイゼーション強度を対比する。もし遺伝子が発現されると、ペアーの完全対合プローブのハイブリダイゼーション強度（又は親和力）は対合の誤対合プローブよりも有意に高いであろう。一般に、プローブペアーのハイブリダイゼーション強度が実質的に同じであるなら、遺伝子は発現されていないことを示唆しうる。しかしながら、その決定は一組のプローブペアーには基づかず、遺伝子が発現されたかどうかの決定は数多くのプローブペアーの分析に基づく。プローブペアーのハイブリダイゼーション強度を対比させる典型的なプロセスは図９を参考に更に詳しく説明する。このシステムが完全対合と誤対合プローブのハイブリダイゼーション強度を対比させた後、このシステムは段階206 での遺伝子の発現で表示する。例えば、このシステムはユーザーに、遺伝子が存在している（発現された）、ぎりぎりで存在している、又は存在していない（発現されない）ことを示唆しうる。図９は決定マトリックスを利用して遺伝子が発現されたかを決定するプロセスのフローチャートを示す。段階252 の後、コンピューターシステムは完全対合及び誤対合プローブのＮ組のペアーの生スキャンデーターを受容する。好適な態様において、ハイブリダイゼーション強度は支持体上のプローブにハイブリダイゼーションしたフルオレセインラベル化標的由来の光子カウントである。簡略のため、完全対合プローブのハイブリダイゼーション強度を「Ｉpm」と表示し、そして誤対合プローブのハイブリダイゼーション強度を「Ｉmm」と表示する。プローブペアーのハイブリダイゼーション強度を段階254 で検索する。バックグランドシグナルデーターを段階256 においてペアーのハイブリダイゼーション強度それぞれから差し引く。バックグランドの差し引きは全ての生スキャンデーターについて同時に行ってもよい。段階258 において、プローブペアーのハイブリダイゼーション強度を差域値（Ｄ）及び比域値（Ｒ）と対比させる。ペアー（Ｉpm−Ｉmm）のハイブリダイゼーション強度間の差が差域値以上であるか、そしてペアー（Ｉpm／Ｉmm）のハイブリダイゼーション強度の商が比域値以上であるかどうかを決定する。差域値は一般に１又は複数種の遺伝子の正確な発現モニターを供するために決定されるユーザーが規定する値である。一の態様において、差域値は20とし、そして比域値は１，２とする。もしＩpm−Ｉmm＞＝Ｄ及びＩpm／Ｉmm＞＝Ｒなら、値NPOSを段階260 で増大させる。一般に、NPOSは遺伝子が発現したようであることを示唆するハイブリダイゼーション強度を有する何組かのプローブペアーを示唆する値である。NPOSは遺伝子の発現の決定において利用される。段階262 において、Ｉmm−Ｉpm＞＝Ｄ及びＩmm／Ｉpm＞＝Ｒが決定される。もしこの発現が真実なら、値NNEGを段階264 で高める。一般に、NNEGは遺伝子が発現されていないようであることを示唆するハイブリダイゼーション強度を有する何組かのプローブペアーを示唆する値である。NNEGは、NPOSと同様に、遺伝子の発現の決定において利用される。遺伝子が発現された又は発現されていないことを示すハイブリダイゼーション強度を示す各ペアーに関し、log 比値（LR）及び強度差値（IDIF）を段階266 で計算する。LRはペアー（Ｉpm／Ｉmm）のハイブリダイゼーション強度の高のlog により計算される。IDIFはペアー（Ｉpm−Ｉmm）のハイブリダイゼーション強度の差により計算される。もし段階268 において次のハイブリダイゼーション強度のペアーがあるなら、それらは段階254 で検索される。段階272 において、遺伝子が発現されたかを示すのに決定マトリックスを使用する。決定マトリックスは値Ｎ，NPOS，NNEG及びLR（多重LR）を利用する。以下の４通りの割り当てを実施する。Ｐ１＝NPOS／NNEG Ｐ２＝NPOS／ＮＰ３＝（10×SUN(LR)）／（NPOS＋NNEG）これらＰ値は遺伝子が発現されたかを決定するのに用いる。例えば、Ｐ値を範囲分けする。Ｐ１が2.1 以上なら、Ａは真なりである。Ｐ１が2.1 未満、且つ1.8 以上なら、Ｂが真なりである。それ以外では、Ｃが真なりである。即ち、Ｐ１は３つの範囲Ａ，Ｂ及びＣに分けられる。これは本発明の理解に役立つのに行う。即ち、Ｐ値は全て下記の通りの範囲へと分ける：Ａ＝（Ｐ１＞＝2.1）Ｂ＝（2.1 ＞Ｐ１＞＝1.8）Ｃ＝（Ｐ１＜1.8）Ｘ＝（Ｐ２＞＝0.35）Ｙ＝（0.35＞Ｐ２＞＝0.20）Ｚ＝（Ｐ２＜0.20）Ｑ＝（Ｐ３＞＝1.5）Ｒ＝（1.5 ＞Ｐ３＞＝1.1）Ｓ＝（Ｐ３＜1.1）Ｐ値を上記ブール式値に従って範囲分けしたら、遺伝子発現を決定する。遺伝子発現は存在している（発現された）、ぎりぎり、又は存在していない（発現されない）、として表示される。遺伝子は下記の式が真なりであるなら発現されたこととなる：Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）。換言すれば、遺伝子はＰ１＞＝2.1 ，Ｐ２＞＝0.20、そしてＰ３＞＝1.1 なら発現されたものとして表示される。更に、遺伝子は下記の式が真なりであるなら発現されたものとして表示される：Ｂ及びＸ及びＱ。上記の説明により、以下は遺伝子発現表示のまとめである：存在Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）Ｂ及びＸ及びＩぎりぎりＡ及びＸ及びＳＢ及びＸ及びＲＢ及びＹ及び（Ｑ又はＲ）非存在全ての他の７−２（例えば任意のＣの組合せ）ユーザーに対するアウトプットにおいて、段階274 で存在は「Ｐ」、ぎりぎりは「Ｍ」、そして非存在は「Ａ」として表示されうる。プローブのペアー全てが処理され、そして遺伝子の発現が示唆されたら、LRを平均10回、段階275 でコンピューター計算する。更に、NPOS及びNNEGを増大させるプローブについてのIDIF値の平均を計算する。これらの値はこの実験とその他の実験との定量比較のために利用してよい。定量測定は段階276 で実施してよい。例えば、現在の実験を過去の実験と対比してよい（例えば段階270 で計算した値を利用して）。更に、この実験を既知量で生物サンプルの中に存在しているRNA(例えば細菌由来)のハイブリダイゼーション強度と対比させてよい。このようにして、遺伝子発現指標又は判定の精度を確認し、域値を改え、又はいろいろな上記の改良を実施してよい。簡略化のため、図９を単一遺伝子で説明する。しかしながら、このプロセスは生物サンプル中の多重遺伝子に利用されうる。従って、単一遺伝子の分析の任意の説明はこのプロセスが多重遺伝子の処理に及ばないことがあることを示すものではない。図10Ａ及び10Ｂは基底スキャンデーター及び実験スキャンデーターを対比させることによる遺伝子の発現の決定プロセスのフローを示す。例えば、基底スキャンデーターは遺伝子が発現されることのわかっている生物サンプルに由来しうる。即ち、このスキャンデーターを別の生物サンプルと比較して遺伝子が発現されたかどうかを決定してよい。更に、１又は複数の遺伝子が生体で経時的にどのように変化するかを決定することができうる。段階302 で、コンピューターシステムは基底由来サンプル由来のＮ組の完全対合及び誤対合プローブの生スキャンデーターを受容する。基底サンプル完全対合プローブのハイブリダイゼーション強度は「Ｉpm」と表示し、そして基底値からの誤対合プローブのハイブリダイゼーション強度は「Ｉmm」と表示することができる。バックグランドシグナル強度を段階304 において基底スキャンデーターのペアーのハイブリダイゼーション強度それぞれから差し引く。段階306 で、コンピューターシステムは実験生物サンプル由来のＮ組の完全対合及び誤対合プローブの生スキャンデーターを受容する。実験由来の完全対合プローブのハイブリダイゼーション強度は「Ｊpm」と表示し、そして実験由来の誤対合プローブのハイブリダイゼーション強度は「Ｊmm」と表示することができる。バックグランドシグナル強度を段階308 で実験スキャンデーターのペアーのハイブリダイゼーション強度それぞれから差し引く。段階310 で、Ｉ及びＪペアーのハイブリダイゼーション強度を標準化してよい。例えば、Ｉ及びＪペアーのハイブリダイゼーション強度を第II章Ａ．２に記載のコントロールプローブのハイブリダイゼーション強度で除してよい。段階312 で、Ｉ及びＪプローブペアーのハイブリダイゼーション強度を差域値（DDIF）及び比域値（RDIF）と比較する。一のペアー（Ｊpm−Ｊmm）と他方のペアー（Ｉpm−Ｉmm）の差が差域値以上であるかどうか、及び一のペアー（Ｊpm− Ｊmm）と他のペアー（Ｉpm−Ｉmm）のハイブリダイゼーション強度の商が比域値以上であるかどうかを決定する。差域値は一般に１又は複数種の遺伝子の正確な発現モニターを供するように決定されるユーザーが規定する値である。（Ｊpm−Ｊmm）−（Ｉpm−Ｉmm）＞＝DDIF及び（Ｊpm−Ｊmm）／（Ｉpm−Ｉmm ）＞＝RDIFなら、値NINCを段階314 で増大させる。一般に、NNICは実験プローブペアーが遺伝子発現が基底サンプルよりも強いようである（又は高まったようである）ことを示唆することを示す値である。NINCは遺伝子の発現が、基底サンプルとべ、実験サンプルにおいて強い（又は高まった）、弱い（又は低まった）、又は変化しなかったことの決定に利用される。段階316 において、（Ｊpm−Ｊmm）−（Ｉpm−Ｉmm）＞＝DDIF及び（Ｊpm−Ｊ mm）／（Ｉpm／Ｉmm）＞＝RDIFがどうかを決定する。この発現が真なりであるなら、NDECを増大させる。一般に、NDECは実験プローブペアーが遺伝子発現が基底サンプルよりも弱い（又は低い）ようであることを示唆することを示す値である。NDECは遺伝子の発現が、基底サンプルと比べ、実験サンプルにおいて強い（又は高まった）、弱い（又は低まった）、又は変化しなかったことの決定に利用される。遺伝子が実験サンプルにおいて多く又は少なく発現されたことを表示するハイブリダイゼーション強度を示す各ペアーに関し、値NPOS，NNEG及びLRを各プローブペアーについて計算する。これらの値は図９に関して上記した通りに計算する。接尾辞「Ｂ」又は「Ｅ」は、値が基底サンプルであるか実験サンプルであるかを示すために各値に付けた。段階322 において次のハイブリダイゼーション強度ペアーがあるなら、それらを示す通りに同様に処理する。図10Ｂに関し、絶対決定コンピューター計算を段階324 において基底サンプル及び実験サンプルの双方について行う。絶対決定コンピュータ計算は遺伝子が基底及び実験サンプルにおいて発現されたか、ぎりぎりであるか、又は存在していないかの指標となる。従って、好適な態様において、この段階は各サンプルに関する図９の由来の段階272 及び274 の実施を包括する。これを行ったら、各サンプルについての遺伝子発現の表示が単独で得られる。段階326 で、２つのサンプル間の遺伝子発現の差を決定する決定マトリックスを利用する。この決定マトリックスは値、Ｎ，NPOSP，NPOSE，NNEGB，NNEGE，NI NC，NDEC，LRB 及びLRE を上記で計算したまま利用する。この決定マトリックスはNINCがNDEC以上であるかに従って種々の計算で機能する。その計算は下記の通りである。 NINC＞＝NDECなら、以下の４つのＰ値が決定される：Ｐ１＝NINC／NDEC Ｐ２＝NINC／ＮＰ３＝（(NPOSE−NPOSB)−(NNEGE−NNEGB)）／ＮＰ４＝10^* SUM(LRE−LRB)／Ｎ次にこれらのＰ値を２つのサンプル間の遺伝子発現の差を決定するために利用する。例えば、Ｐ値を先に行った通りに範囲へと分ける。即ち、全てのＰ値を以下の通りにして範囲分けする。Ａ＝（Ｐ１＞＝2.7）Ｂ＝（2.7 ＞Ｐ１＞＝1.8）Ｃ＝（Ｐ１＜1.8）Ｘ＝（Ｐ２＞＝0.24）Ｙ＝（0.24＞Ｐ２＞＝0.16）Ｚ＝（Ｐ２＜0.160）Ｍ＝（Ｐ３＞＝0.17）Ｎ＝（0.17＞Ｐ３＞＝0.10）Ｏ＝（Ｐ３＜0.10）Ｑ＝（Ｐ４＞＝1.3）Ｒ＝（1.3 ＞Ｐ４＞＝0.9）Ｓ＝（Ｐ４＜0.9）Ｐ値を上記のブール式値に従って範囲分けしたら、２つのサンプル間の遺伝子発現の差を決定する。 NINC＞＝NDECであるこのケースの場合、遺伝子発現変化は増大、ぎりぎりに増大、又は変化していないことを示す。以下は遺伝子発現表示のまとめである：増大Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ又はＯ）Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ又はＳ）及び（Ｍ又はＮ）Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ）Ａ及びＸ及び（Ｑ又はＲ又はＳ）及び（Ｍ又はＮ又はＯ）ぎりぎりＡ又はＹ又はＳ又はＯ増大Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及びＯＢ及び（Ｘ又はＹ）及びＳ及び（Ｍ又はＮ）Ｃ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ）変化なしその他のケース（例えば任意のＺの組合せ）ユーザーに対するアウトプットにおいて、増大は「Ｉ」、ぎりぎり増大は「MI 」、そして変化なしは「NC」として表示してよい。 NINC＜NDECなら、以下の４通りのＰ値が決定される：Ｐ１＝NDEC／NINC Ｐ２＝NDEC／ＮＰ３＝（(NNEGE−NNEGB)−(NPOSE−NPOSB)）／ＮＰ４＝10^* SUM(LRE−LRB)／ＮこれらのＰ値は２つのサンプル間の遺伝子発現の差を決定するために利用する。Ｐ値はNINC＞＝NDECの場合、その他のケースと同じ範囲に分ける。即ち、この場合のＰ値は同じ範囲を示し、従って便宜上繰り返さない。しかしながら、２つのサンプル間の遺伝子発現の異なる変化を一般に示す範囲を下記に示す。 NINC＜NDECであるこのケースにおいて、遺伝子発現変化は低下、ぎりぎり低下又は変化なしとして表示する。以下は遺伝子発現表示のまとめである：低下Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ又はＯ）Ａ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ又はＳ）及び（Ｍ又はＮ）Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ）Ａ及びＸ及び（Ｑ又はＲ又はＳ）及び（Ｍ又はＮ又はＯ）ぎりぎりＡ又はＹ又はＳ又はＯ低下Ｂ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及びＯＢ及び（Ｘ又はＹ）及びＳ及び（Ｍ又はＮ）Ｃ及び（Ｘ又はＹ）及び（Ｑ又はＲ）及び（Ｍ又はＮ）変化なしその他の全てのケース（例えば、任意のＺの組合せ）ユーザーに対するアウトプットにおいて、低下は「Ｄ」、ぎりぎり低下は「MD 」、そして変化なしは「NC」として表示する。以上は、基底サンプルと実験サンプルとの間での遺伝子発現の相対差が決定されうることを示す。遺伝子が双方のサンプル（例えば段階324 から）において発現されるならＩ， MI，Ｄ又はMD（即ち、NCでない）判定をNCへと変える更なる試験を行ってよく、そして下記の式は全て真なりである：平均(IDIFB)＞＝200 平均(IDIFE)＞＝200 1.4 ＞平均(IDIFE)／平均(IDIFB)＞＝0.7 即ち、遺伝子は双方のサンプルにおいて発現されるなら、増大又は低下（ぎりぎりか又はそうでない）の判定は、各サンプルについての平均強度差が双方のサンプルにとって比較的大きい又は実質的に同一であるなら、変化なしの判定へと変わるであろう。IDIFB 及びIDIFE はＮで除した各サンプルについての全てのID IFの合計として計算される。段階328 において、定量差評価についての値を計算する。各ペアーの（（Ｊpm −Ｊmm）−（Ｉpm−Ｉmm））の平均を計算する。更に、Ｊpm−Ｊmmの平均とＩpm −Ｉmmの平均の商を計算する。これらの値はその結果を段階330 においてその他の実験と比較するために利用してよい。Ｘ．発現レベルのモニター上記の通り、本発明の方法は多種多様な内容物の遺伝子の発現レベルをモニターするのに利用されうる。例えば、遺伝子発現に対する薬剤の作用を決定するなら、薬剤を生体、組織サンプル又は細胞に投与する。組織サンプル、細胞又は生体由来の生物サンプルからの、並びに未処置の生体組織サンプル又は細胞からの核酸を上記の通りにして単離し、注目の遺伝子に対して特異的な高密度プローブアレー含有プローブにハイブリダイゼーションさせ、そしてその遺伝子の発現レベルを上記の通りにして決定する。同様に、疾患マーカー（例えばＰ53，RTK 又はHER2）の発現レベルを検出するとき（例えば患者の病理症状の診断のため）、サンプル中の疾患マーカーの発現レベルの健康生体由来の疾患マーカーとの対比は、健康サンプルと比べて試験サンプル中のマーカーの発現レベルの任意の変化を示すであろう。病理症状とのかかる変化の相関はその症状にとっての診断アッセイを供する。実施例下記の実施例は例示のために提供し、本発明を限定するものではない。実施例１少数のマウスサイトカインについてのmRNAレベルを測定するためにデザインされた第一世代オリゴヌクレオチドアレーＡ）ラベル化RNA の調製１）予備選定遺伝子それぞれから 14種の遺伝子（IL−２，IL−３，IL−４，IL−６，IL−10，IL− 12ｐ40，GM−CSF，IFN−γ， TNF−α，CTLA８，β−アクチン，GAPDH ，IL−11 レセプター及びBio Ｂ）をpBluescript II KS（＋）ファージミド(Stratagene ，La Jolla，California，USA)の中にそれぞれクローニングした。インサートの方向はＴ３ RNAポリメラーゼがセンス転写体を供し、そしてＴ７ポリメラーゼがアンチセンスRNA を供するようなものとした。 in vitro転写(IVT)反応におけるラベル化リボヌクレオチド。ビオチン−又はフルオレセイン−ラベル化UTP 及びCTP(ラベル化、対、非ラベル化は１：３)のいづれかと未ラベルATP 及びGTP を2500単位のＴ７ RNAポリメラーゼ(Epicentre Technologies，Madison，Wisconsin，USA)との反応のために用いた。in vitro 転写はMeltonら、Nucleic Acids Research，12 : 7035-7056（1984）に記載のようにして切断鋳型で行った。典型的なin vitro転写反応は５μｇのDNA 鋳型、バッファー、例えばAmbion's Maxiscript in vitro Transcription Kit(Ambion Inc.，Huston，Texas，USA)に含まれているもの、並びにGTP(３mM)、ATP（1.5mM ）、並びにCTP 及びフルオレセイン化UTP(全部で３mM，UTP : Fl-UTP＝３：１) 、又はUTP 及びフルオレセイン化CTP(全部で２mM，CTP : FCl-CTP ＝３：１)を使用する。Ambionバッファーで行う反応は20mMのDTT 及びRNase インヒビターを有する。反応は 1.5〜約８時間実施した。反応の後、一体化しなかったヌクレオチド三リン酸をサイズ選別膜（microcon -100）又はPharmacia microspin S-200 カラムを用いて除去した。RNA の総モル濃度は 260nmでの吸収の測定に基づく。RNA 量の定量の後、RNA を40mMのトリス −酢酸pH8.1，100mMの酢酸カリウム、30mMの酢酸マグネシウムの中で94℃で30〜 40分加熱することにより平均の長さ約50〜100 塩基にまでランダムに断片化した。断片化はRNA 二次構造に由来する考えられる妨害を抑制し、そして密接な間隔のプローブ分子との多重相互作用を最少限にする。２）cDNAライブラリーからラベル化RNA は、２種のマウス細胞系Ｔ10、即ちこの研究において標的遺伝子として利用される遺伝子（IL−10、アクチン及びGADPH を除く）を発現することのわかっていないＢ細胞プラスマ細胞腫、及び2D6 、即ちこの研究において標的遺伝子として利用されるほとんどの遺伝子を発現することで知られるIL−12増殖依存性Ｔ細胞系（Th₁サブタイプ）の一方から生産した。即ち、Ｔ10細胞系由来のRNA は特定の標的遺伝子由来の既知量のRNA によるスパイキングに適する良好な総RNA 基底混合物を供する。一方、2D6 細胞系由来のmRNAは、標的遺伝子由来の典型的な内因性転写量のRNA を供する良好な良性コントロールを担う。ｉ）Ｔ10マウスＢ細胞系Ｔ10細胞系（Ｂ細胞）はIL−11の存在下での選別によりIL−６依存性マウスプラスマ細胞腫系Ｔ1165(Nordanら（1986）Science 233 : 566-569)に由来した。指向性cDNAライブラリーを調製するため、全細胞RNA をRNA Stat 60（Tel-Test Ｂ）を用いてＴ細胞から単離し、そしてポリ（Ａ）⁺RNA をPoly Atract キット（Promega，Madison，Wisconsin，USA）を用いて選別した。第一及び第二鎖cDNA をToole ら（1984）Nature，312 : 342-347 に従って合成したが、但し双方の反応においてDCTPの代わりに５−メチルデオキシシチジン５’三リン酸（Pharmaci a LKB，Piscataway，New Jersey，USA）を使用した。 cDNA頻度を決定するため、Ｔ10ライブラリーをプレート培養し、そしてDNA をニトロセルロースフィルターに移し、そして³²Ｐ−ラベル化β−アクチン、GAPD H 及びIL−10プローブでプロービングした。アクチンは１：3000，GAPDHは１：1 000、そしてIL−10は１： 35,000の頻度で示された。ラベル化センス及びアンチセンスＴ10 RNAサンプルを NotＩ及び SfiＩ切断cDNAライブラリーより前記のin vitro転写反応で合成した。 ii ）2D6 マウスヘルパーＴ細胞系 2D6 細胞系はFujisawaらにより開発されたマウスIL−12依存性Ｔ細胞系とする。細胞を10％の熱不活性化胎児牛血清(JRH Biosciences)、0.05mMのＰ−メルカプトエタノール及び組換マウスIL−12(100 単位／ml、Genetics Institute，Cam bridge，Massachusetts，USA)を有するRPMI 1640 培地の中で培養した。サイトカイン誘導のため、細胞をIL−12フリー培地の中で一夜プレインキュベーションし、次いで再懸濁した（10⁶個の細胞／ml）。５nMのカルシウムイオノフォアＡ2 3187（Sigma Chemical Co.，St．Louis Missouri，USA）及び 100nMの４−ホルボール−12−ミリステート13−アセテート（Sigman）を含む培地の中で０，２，６及び24時間インキュベーション後、細胞を遠心により集め、そしてRNA の単離の前にリン酸緩衝食塩水で１回洗った。ラベル化2D6 mRNAは2D6 cDNAをGibco BRL より入手できるα LipLox，NotＩ− SaIIアームと共に類似の態様でＴ10に指向式クローニングすることにより生産した。線形化pZ11ライブラリーを上記のようにセンスRNA を作るためにＴ７で転写した。 iii ）RNA の調製細胞性RNA から直接作った材料に関し、サイトプラスマRNA をFavaloroら（19 80）Meth．Enzym.，65 : 718-749の方法により細胞から抽出し、そしてポリ（Ａ）⁺RNA をオリゴdT選別段階（Poly Atract，Promega）で単離した。RNA はEberw ineら（1992）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89 : 3010-3014（Van Gelderら（1 990）Science 87 : 1663-1667も参照のこと）により発表の手順の改良法を利用して増幅させた。１μｇのポリ（Ａ）⁺RNA をcDNA合成キット(Life Technologie s)を用い、Ｔ７ RNAポリメラーゼプロモーター部位を組込むオリゴdTプライムで二本鎖cDNAへと変換した。第二鎖合成の後、この反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そして二本鎖DNA を膜濾過工程（Microcon-100，Amicon，In c．Beverly，Massachusetts，USA）を用いて単離した。ラベル化cRNAはcDNAプールから、前記のIVT 工程により直接作った。ラベル化cRNAの総モル濃度は 260nm での吸収により、1000リボヌクレオチドの平均RNA サイズを仮定して決定した。 RNA 濃度はIOD が40μｇのRNA に相当し、そして１μｇの細胞性mRNAが３pmole のRNA 分子より成る慣用の変換を利用して計算した。細胞性mRNAは任意の中間cDNA又はRNA 合成段階抜きで直接ラベル化もした。ポリ（Ａ）⁺RNA は上記の通りにして断片化し、そしてフラグメントの５’末端はキナーゼ処理し、次いでＴ４ RNAリガーゼ（Epicentre Technologies）の存在下でビオチニル化オリゴヌクレオチド（５’−ビオチン−AAAAAA−３’）と一夜インキュベーションした。他方、mRNAはビオチンに連結したプソラレン誘導体への UV誘導架橋により直接ラベルした（Schleicher & Schuell）。Ｂ）高密度アレー調製 20量体オリゴヌクレオチドプローブの高密度アレーをVLSIPS技術を利用して生産した。高密度アレーは表２記載のオリゴヌクレオチドプローブを含む。各遺伝子特異的プローブに対して中央誤対合コントロールプローブを用意し、16,000種を超えるオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレーを得た。高密度アレーは平らなガラススライド上で合成した。Ｃ）アレーハイブリダイゼーション及びスキャニング cDNAから転写したRNA を高密度オリゴヌクレオチドプローブアッセイに低ストリンジェンシーでハイブリダイゼーションさせ、そしてよりストリンジェンシーな条件下で洗浄した。ハイブリダイゼーション溶液は 0.9ＭのNaCl，60mMの NaH₂ PO₄，６mMのEDTA及び 0.005％のTriton−X100を含み、pH7.6 に調整されている（６×のSSPE −Ｔと称する）。更に、この溶液 0.5mg／mlのラベル化されていないにしん精子 DNA(Sigma Chemical Co.，St．Louis，Missouri，USA）を含む。ハイブリダイゼーションの前、RNAサンプルをハイブリダイゼーション溶液の中で９℃で10分加熱し、氷の上に５分載せ、そして室温に平衡化し、次いでハイブリダイゼーションフローセルの中に入れた。ハイブリダイゼーションの後、溶液を除去し、これらのアレーを６×のSSPE−Ｔで22℃で７分洗い、次いで 0.5×のSSPE−Ｔで40℃ で15分洗った。ビオチンラベル化RNA を使用したとき、ハイブリダイゼーションしたRNA をストレプトアビジン−フィコエリストリンコンジュゲート(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon，USA)で染色してから測定した。ハイブリダイゼーションしたアレーを２μｇ／mlのストレプトアビジンフィコエリスリンで６ ×のSSPE−Ｔの中で40℃で５分染色した。これらのアレーを本目的のために改良された走査同焦点顕微鏡（Molecular Dy namics，Sunnyvale，California，USA）を用いて測定した。このスキャナーは励起源としてアルゴンレーザーを使用し、そして発光は 530nmバンドパスフィルター（フルオレセイン）又は 560nmロングパスフィルター（フィコエリスリン）のいづれかを介して光増幅管で検出した。センス又はアンチセンス方向のいづれかの核酸をハイブリダイゼーション実験に用いた。いづれかの方向（互いとの逆相補体）のアレーは光化学工程の順序を逆にし、そして相補性ヌクレオチドを組込むことによって同じセットのフォトリソグラフィーマスクを用いて作った。Ｄ）ハイブリダイゼーションパターン及び強度の定量分析ハイブリダイゼーション結果の定量分析は、完全対合プローブ（PM）が対応の誤対合プローブ（MM）よりも明るいという状況を計測する、各プローブ科（即ち、各遺伝子についてのプローブコレクション）についての差（PM引くMM）を平均化する、及びスパイクしていないサンプルで同じようにして合成したアレーについての横並び実験で得られる値を比較する（適宜）ことを含む。種々の方法の利点は、ランダム交差ハイブリダイゼーション由来のシグナルが、平均して、PM及びMMプローブに同等に寄与し、しかも特異的なハイブリダイゼーションがPMプローブに一層寄与することにある。対合の差を平均することにより、真のシグナルが加算的に増し、一方交差ハイブリダイゼーションの寄与はなくなる傾向にある。差（PM−MM）の平均値の変化の程度はスパイキング実験の結果との対比並びに既知量で各サンプルにスパイキングされた内部標準細菌RNA について観察されるシグナルにより解釈される。アルゴリズム及びソフトウェアを利用して実施した分析を本明細書に記載する。Ｄ）プローブ選定の最適化各標的遺伝子についてのプローブ選別の最適化のため、オリゴヌクレオチドの高密度アレーを各標的遺伝子から転写したラベル化RNA の混合物とハイブリダイゼーションした。高密度アレー上の各位置での蛍光強度をデーター獲得システムに接続されたレーザー照射型同焦点蛍光顕微鏡により高密度アレーをスキャンすることにより決定した。次にプローブを２段手順で更なるデーター分析について選定した。第一に、計測されるには、プローブとその対応の誤対合プローブとの間の強度の差は域値限界を超えていなければならない（この場合、50カウント、又はバックグランドのほぼ半分）。これはよくハイブリダイゼーションしないかなりの数のプローブ及び完全対合に匹敵する強度で誤対合コントロールがハイブリダイゼーションするプローブを排除する。高密度アレーを、原則として高密度アレー上のどの配列も含まないラベル化RN A サンプルとハイブリダイゼーションさせる。この場合、センスRNA に相補性なオリゴヌクレオチドプローブを選定する。即ち、アンチセンスRNA 集団はアレー上のどのプローブにもハイブリダイゼーションできないべきである。プローブ又はその誤対合のいづれかが域値（バックグランドより100 カウント高い）より高いシグナルを示す場合、それはその後の分析に含ませない。次に、特定の遺伝子についてのシグナルを各遺伝子に対して選定したプローブについての平均差（完全対合−誤対合コントロール）として計測する。Ｅ）結果：標的核酸の特異的且つ高感度検出を供する高密度アレー説明した通り、一次アレーは、12種のmRNA、即ち、９種のサイトカイン、１種のサイトカインレセプター、２種の構成的に発現された遺伝子（５−アクチン及びグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、１種のラットサイトカイン及び定量対照を担う１種の細菌遺伝子（Ｅ．コリ(E．coli)ビオチンシンセターゼ、bio Ｂ）に対して相補性である16,000本より多くのプローブを含んだ。これら比較的単純なアレーによる一次実験は、短いin situ 合成オリゴヌクレオチドが複雑な細胞性RNA 集団においてRNA を定量検出するのに十分な感度及び特異性をもってハイブリダイゼーションするように作成できるかを決定するためにデザインされている。これらのアレーは意識的に非常に冗長なものとし、発現レベルの決定のために必要なものよりもはるかに多い、RNA 当り数百本のオリゴヌクレオチドプローブを含む。これは大量のプローブのハイブリダイゼーション挙動を調べるため、及びかなり大量の遺伝子をカバーするアレーの最小プローブセットの優先選定のための一般配列法則の開発のために行った。これらのオリゴヌクレオチドアレーはモニターすべき各RNA についてのプローブペアーのコレクションを含む。各プローブペアーは特定のメッセージのサブ配列に対して完璧に相補性である20量体（完全対合又はPMプローブと称する）及び中央位置において１個の塩基の相違を除き同一なコンパニオンより成る。各ペアーの誤対合（MM）プローブはハイブリダイゼーション特異性のための内部コントロールを担う。PM／MMペアーの分析は微量のRNA からの低強度ハイブリダイゼーションを交差ハイブリダイゼーションの存在下で高感度且つ高精度で認識されることを可能にする。アレーハイブリダイゼーション実験のため、ラベル化RNA 標的サンプルを個々のクローン、クローニングしたcDNAライブラリー、又は直接細胞性mRNAから上記の通りにして調製した。アレーハイブリダイゼーションのための標的RNA は蛍光ラベル化リボヌクレオチドをin vitro転写(IVT)反応で組込み、次いでこのRNA を30〜100 塩基の平均サイズにランダムに断片化することにより調製した。サンプルは30分〜22時間に範囲する時間にわたり自蔵フローセル（容量約 200μｌ）の中でアレーとハイブリダイゼーションさせた。アレーの蛍光イメージングは走査同焦点顕微鏡（Molecular Dynamics）で成し遂げた。アレー全体を 11.25μｍの解像度(100×100 μｍの合成領域それぞれにおいて約80倍の過剰サンプリング )において15分以内で測定し、個々のハイブリダイゼーションそれぞれの迅速且つ定量的な測定を得た。１）ハイブリダイゼーションの特異性ハイブリダイゼーションの特異性を評価するため、上記の高密度アレーをIL− ２，IL−３，IL−４，IL−６、アクチン、GAPDH 及びBio Ｂ又はIL−10，IL−12 p40 ，GM−CSF，IFN−γ， TNF−γ，mC TLA8及びBio Ｂの50pMのRNA センス鎖とハイブリダイゼーションした。このハイブリダイゼーションしたアレーは最少の交差ハイブリダイゼーションをもって試験標的核酸それぞれに対する強力な特異的シグナルを示した。２）複雑な標的サンプル中の遺伝子発現レベルの検出個々のRNA 標的がどれぐらいよく全哺乳動物細胞メッセージ集団の存在下で検出できうるかを決定するため、スパイキング実験を実施した。既知量の個々のRN A 標的をマウスＢ細胞系Ｔ10から作った代表的なcDNAライブラリーに由来するラベル化DNA の中にスパイキングした。Ｔ10細胞系を選定し、なぜならモニターされるサイトカインのうち、IL−10のみが検出可能レベルで発現されるからである。単にRNA 混合物に選定の標的遺伝子でスパイクし、その直後にハイブリダイゼーションすることは混合物の残りに相対して人偽的に高まった測定値を供するため、スパイキングしたサンプルをライブラリーRNA 及び添加RNA との間の差を小さくする一連の手順で処理する。即ち、「スパイク」をサンプルに付与し、それを次いで37℃で加熱し、そしてアニーリングする。次いでサンプルを凍結し、融解し、５分煮沸し、氷上で冷やし、そして室温にもどし、それからハイブリダイゼーションを実施する。図２Ａは13種の標的RNA を全RNA プールの中に１：3000のレベル（細胞当り数百コピーに相当）でスパイクした実験の結果を示す。RNA 頻度は全RNA １モル当りの個々のRNA のモル量として付与する。図２Ｂはインターロイキン−２及びインターロイキン−３（IL−２及びIL−３）に特異的なプローブを含むアレーの小部分（２Ａの枠で囲った領域）を示し、そして図２Ｃはスパイクした標的のない同一の領域を示す。ハイブリダイゼーションシグナルはスパイク及びスパイクしていないイメージ間での対比により特異的であると示され、そして完全対合（PM）ハイブリダイゼーションは明るい列（PMプローブに対応）と暗い列（MMプローブに対応）との交互のパターンにより示されるように誤対合（MM）からよく区別できる。種々の完全対合ハイブリダイゼーションシグナル間で観察される変動は非常に再現性がよく、そしてハイブリダイゼーションの配列依存性を反映した。いくつかの状況において、完全対合（PM）プローブはその誤対合（ MM）パートナーよりも有意に明るくなく、その理由は複雑なRNA 集団のその他の構成員との交差ハイブリダイゼーションによる。これらのパターンは非常に再現性がよいため、また検出はRNA 当り一本のプローブのみに依存しないため、このタイプのめったに起こらない交差ハイブリダイゼーションは低レベルでさえもRN A の高感度且つ高精度な検出を損わなかった。同様に、例えばRNA 又はプローブの二次構造、多形態の存在、又はデーターベースエラーに基づくめったに起こらない劣ったハイブリダイゼーションは検出を損わなかった。ハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーションの観察パターンの分析は本明細書に記載の最良の感度及び特異性をもつオリゴヌクレオチドプローブの選定のための一般法則の作製に結びつく。３）標的濃度とハイブリダイゼーションシグナルとの関係第二セットのスパイク実験はハイブリダイゼーションシグナルがRNA レベルの直接定量のために利用できうる濃度範囲を決定するために実施した。図３は10種のサイトカインRNA をＢ細胞（Ｔ10）cDNAライブラリー由来の0.05mg／mlのラベル化RNA と一緒に１：300〜１：300,000 に範囲するレベルでスパイクした実験結果を示す。１：300,000 の頻度は細胞当り数コピー以下でしか存在しないmRNA のそれである。10μｇの全RNA 及び 200μｌの容量において、１： 300,000 の頻度は約 0.5ピコモル及び 0.1フェントモル（約６×10⁷個の分子又は約30ピコグラム）の特異的RNA の濃度に相当する。ハイブリダイゼーションは平行で、40℃で15〜16時間実施した。10種のサイトカインRNA それぞれの存在は最低の頻度においてさえもバックグランドより高く再現よく検出された。更に、ハイブリダイゼーション強度は１：300,000 〜１： 3,000 の間のRNA 標的濃度で直線的に相関した（図３）。１：3,000 〜１：300 の間では、シグナルは10倍ではなく４〜５倍上昇し、なぜならプローブ部位は15 時間のハイブリダイゼーションの間に高めの濃度において飽和し始めたからである。直線応答域はハイブリダイゼーション時間を短くすることにより高い濃度まで広げることができる。短い及び長いハイブリダイゼーションを、10⁴倍より高いRNA 濃度域を定量的にカバーするために組合せることができる。目かくしスパイキング実験を、複雑なRNA 集団の中で広範囲の濃度で存在する多重近縁RNA を同時に検出及び定量する能力を試験するために実施した。マウスＢ細胞cDNAライブラリーから転写した0.05mg／mlのセンスRNA と、種々の濃度において10種のサイトカインRNA それぞれの組合せとを含む４種のサンプルのセットを調製した。個々のサイトカインRNA を下記のレベルのいづれかにおいてスパイクした：０，１：300,000，１：30,000，１：3,000 又は１：300 。４種のサンプルとスパイクしていない対照を別々のアレーに40℃で15時間かけてハイブリダイゼーションした。RNA 標的の有無はハイブリダイゼーションのパターンにより、及びそれがスパイクしていない対照のそれとどのように相違するかにより決定し、そしてその濃度を強度により検定した。４通りの目かくしサンプル中の10 種のサイトカインそれぞれの濃度が、偽陽性又は偽陰性なく、正確に決定された。一のケースは特に意味がある：IL−10はcDNAライブラリーを作るのに用いたマウスＢ細胞において発現され、そして１：60,000〜１：30,000の頻度でライブラリーの中に存在することがわかっている。未知のものの一つにおいて、追加量の IL−10 RNA（１：300,000の頻度に相当）をサンプルの中にスパイクした。スパイクしたIL−10 RNAの量は、たとえそれが固有レベルより10〜20％高い上昇しか示さなくても、正確に決定された。これらの結果は、発現における微妙な変化が同じように合成したアレーに基づく同じように調製したサンプルによる横並び実験の実施により高感度で決定されることを示す。実施例２刺激後の時間の関数としてサイトカインmRNAを測定するＴ細胞誘導実験次に本発明の高密度アレーを、生化学的刺激後種々の時間でのマウスＴ細胞におけるサイトカインmRNAレベルのモニターに用いた。マウスＴヘルパー細胞系(2 D6)由来の細胞をホルボールエステル４−ホルボール−12ミリステート13−アセテート(PMA)及びカルシウムイオノフォアで処理した。ポリ（Ａ）⁺mRNAを刺激の０，２，６及び24時間目に単離した。単離したmRNA（約１μｇ）を、二本鎖cDNA 合成段階をその後のin vitro転写反応と組合せる手順を利用してラベル化アンチセンスRNA に変換した。このRNA 合成及びラベリング手順はmRNA集団全体を見かけ上片寄りなく、且つ再現性のある状況で20〜50倍増幅させる（表２）。４つの時点からのラベル化アンチセンスＴ細胞RNA をDNA プローブアレーに２〜22時間ハイブリダイゼーションした。γ−インターフェロンmRNAレベルの大きな上昇が、４種のその他のサイトカイン（IL−３，IL−10，GM−CSF 及び TNFα ）における有意な変化と共に観察された。図４に示すように、サイトカインメッセージは同じ反応速度で誘導されなかった。１：130,000 未満のサイトカインmRNAのレベルの変化は、γ− インターフェロンについて観察される非常に大きな変化を共にあいまいに検出された。これらの結果は本方法において固有な大実験ダイナミックレンジの値を際立たせた。ハイブリダイゼーション結果由来のRNA レベルの定量評価は直接的なものであり、追加のコントロールハイブリダイゼーション、サンプル操作、増幅、クローニング又は配列決定は要しない。この方法は効率的でもある。現状のプロトコール、装置及び分析ソフトウェアを用いて、一人のユーザーが一台のスキャナーで１日に30アレーほどの多さのアレーを測定及び分析できる。実施例３ 100 種を超えるマウス遺伝子に対して65,000本のプローブを含む高密度アレー図５はマウスＢ細胞RNA 集団とのハイブリダイゼーションを経た65,000本を超えるオリゴヌクレオチドプローブ（50μｍのフィーチャーサイズ）を含むアレーを示す。この複雑度のアレーは15分以内で7.5limの解像度で測定される。このアレーは前記単純なアレー上を占める12種のマウス遺伝子、35Ｕ．Ｓ．Ｃ．§102 （）追加マウス遺伝子、３種の細菌性遺伝子及び一種のファージ遺伝子を含む 1 18種の遺伝子についてのプローブを含む。遺伝子当り約 300プローブペアーがあり、プローブは本明細書に記載の選別法則を利用して選定される。これらのプローブは各遺伝子の翻訳領域の３’末端にある600 塩基の配列から選ばれる。全部で21種のマウスRNA がＢ細胞RNA 集団において、約１：300,000 〜１：100 に範囲するレベルであいまいに検出された。Ｔ細胞誘導実験由来のラベル化RNA サンプル（図４）をこれら一層複雑な118 遺伝子アレーにハイブリダイゼーションさせ、そして双方のチップタイプに共通する遺伝子セットについてと類似の結果が得られた。発現変化は図４に示すものに加えて20種以上のその他の遺伝子についてあいまいに観察された。遺伝子当りはるかに小さいプローブセットがRNA の信頼できる検出にとって十分であるかを決定するため、118 遺伝子チップ由来のハイブリダイゼーション結果を遺伝子当り20プローブペアーの10組の異なるサブセットを用いて分析した。即ち、アレーが遺伝子当り20プローブペアーしか含まないかの如く分析した。20 ペアーの10組のサブセットをアレー上の遺伝子当り約 300本のプローブペアーから選定した。一次プローブ選別は上記のプローブ選別及び枝刈りアルゴリズムを利用して行った。20組のペアーの10の対象物を選別及び枝刈りに生き残ったプローブからランダムに選別した。ラベル化RNA をマウスＢ細胞RNA 集団の中に１： 25,000，１：50,000及び１：100,000 のレベルでスパイクした。スパイクしたRN A についてのハイブリダイゼーションシグナルの変化はこの小さめのプローブセットで３つのレベル全てにおいて一貫して検出された。予測通り、ハイブリダイゼーション強度は大量のプローブを平均化したときほど集束しなかった。この分析は遺伝子当り20組のプローブペアーのセットが低レベルでの発現変化の測定のために十分であるが、プローブ選別及び実験手順における改良はかかる小さなプローブセットにより非常に低いレベルでRNA をルーチン式に検出するために好適であろうことが示唆される。かかる改良は、限定することなく、高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーションと若干長めのオリゴヌクレオチドプローブ（例えば25量体プローブ）との組合せを含む。実施例４数千の遺伝子に至るスケールアップ全部で6620種の遺伝子に対する約1650種のヒト遺伝子の25量体オリゴヌクレオチドプローブを含む４種の高密度アレーのセットを用意する。各遺伝子につき20 本のプローブがあった。アレー上のフィーチャーサイズは50ミクロンとした。高密度アレーは上記のプロトコールを本質的に利用してcDNAライブラリーに有効にハイブリダイゼーションした。全ての既知の発現配列tag（EST）に対するオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレーの類似のセットを準備した。実施例５数千のRNA の同時モニターのための直接スケールアップ高感度、特異性及び定量性であることに加えて、本明細書に記載のアプローチは本質的に平行であり、そして非常に大量のRNA のモニターのために容易にスケールアップできる。モニターするRNA の数はRNA 当りのプローブの数を少なくし、且つアレー当りのプローブの数を増やすことにより大幅に増大できる。例えば、上記の技術を利用し、1.6cm²の面積（20×20μｍの合成フィーチャー）において 400,000本ほどの多さのプローブを含むアレーが現状合成及び測定される。遺伝子当り20組のプローブペアーを用いることは、一アレーで10,000種の遺伝子がモニターでき、しかもプローブの冗長性の重要性が維持できることを可能にする。４種のかかるアレーのセットは40,000種以上のヒト遺伝子をカバーでき、それに関して公共データーベースにおいて発現配列tags（ESTS）があり、そして新しいESTSが入手でき始めている。化学合成の順列組合せ的性質を理由に、この複雑度のアレーはここで用いる単純なものと同じ時間で同じ工程数で作れる。遺伝子当り更に少ない数のプローブ及びより高密度なアレーの利用は単独又は少数の小型チップに基づく全ての配列決定されるヒト遺伝子の同時モニターを可能にする。大量の遺伝子についての発現レベルの定量モニターは遺伝子機能の推定、病気の原因及びメカニズムの解明、並びに有用な治療及び診断標的の発現における有用性を実証する。ゲノム情報自体増大するため、ここに記載の高度に平行なタイプの方法は細胞の基礎生理を推定するのに役立つ配列情報の利用のための効率的且つ直接的な手段を供する。実施例６ニューラルネットを利用するプローブ選別ニューラルネットはプローブ中の塩基の配列又はその他のプローブ特性に基づくプローブのハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーション強度を推定するのにトレインできうる。ニューラルネットは任意の数の「最良」のプローブを拾うのに利用できる。これを行うのにニューラルプローブをトレインしたとき、それは推定の強度と測定強度との間の中程度(0.7)の相関を供し、ハイブリダイゼーションよりも交差ハイブリダイゼーションについての良好なモデルとなる。Ａ）インプット／アウトプットマッピングニューラルネットを20量体のプローブのハイブリダイゼーション特性を同定するために訓練した。20量体プローブを80ビット長のインプットベクターはマッピングし、ここで最初の４ビットはプローブの第一位の塩基を示し、次の４ビットは第二位の塩基を示す、等々である。即ち、４個の塩基は下記の通りにコードされる：Ａ：1000 Ｃ：0100 Ｇ：0010 Ｔ：0001 ニューラルネットワークは２つのアウトプット、即ちハイブリダイゼーション強度及び交差ハイブリダイゼーション強度を生成する。アウトプットは実際の実験からのアウトプットの95％が０〜１の範囲に属するような直線的なスケールとした。Ｂ）ニューラルネットアーキテクチャーニューラルネットは80インプットのニューロン、20ニューロンの１のヒドウン層及び２ニューロンのアウトプット層を有するバックプロパゲーションネットワークである。シグモイド変換関数を使用した：（ｓ（ｘ）＝１／（１＋exp(−１^* ｘ)）。これはインプット値を非線形（シグモイド）式に０〜１のスケールにする。Ｃ）ニューラルネットトレインネットワークはNeural Works Professional 由来のバックプロップネットワークのためのデフォルトパラメーターを用いてトレインした。（Neural Works Pro fessional はNeural Ware，Pittsburgh Pennsylvania，USA の製品）。トレインセットは約8000例のプローブ、並びに関連のハイブリダイゼーション及び交差ハイブリダイゼーション強度より成る。Ｄ）ニューラルネット重み２つのマトリックスの中に供されたニューラルネット重み：81×20マトリックス（表３）（重み＿１）及び２×20マトリックス（表４）（重み＿２）。Ｅ）ネットをランさせるためのコードニューラルネットをランさせるためのコードを表５（neural_n.c）及び表６（ lin_alg.c）に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブラウン，ユージーン，エル. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02161，ニュートンハイランズ，ウォールナットストリート 1388 (72)発明者ウォン，ゴードンアメリカ合衆国，マサチューセッツ 02146，ブルックライン，クラークロード 239 (72)発明者チー，マークアメリカ合衆国，カリフォルニア 94306, パロアルト，ウェーバリーストリート 3199 (72)発明者ジンジャーズ，トーマス，アール. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92021, エンシニタス，ジューニパーヒルドライブ 528 (72)発明者ミットマン，マイケル，ピー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94303, パロアルト，セントフランシスドライブ 2377 (72)発明者リップシャッツ，ロバート，ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94301, パロアルト，パロアルトアベニュ 970 (72)発明者フォドー，ステファン，ピー．，エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94303, パロアルト，ネイサンウェイ 3863 (72)発明者ワン，チャンウェイアメリカ合衆国，ユタ 84102，ソルトレイクシティー，イースト 300 サウス 1103

Claims

【特許請求の範囲】１．多数の遺伝子の発現を同時にモニターする方法であって、（ａ）１もしくは複数種の前記遺伝子のRNA 転写体を含んで成る標的核酸又はこのRNA 転写体に由来する核酸のプールを用意する；（ｂ）前記核酸のプールを表層上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーにハイブリダイゼーションさせて；ここで前記アレーは 100種以上のオリゴヌクレオチドを含んで成り；ここで各オリゴヌクレオチドは前記表層の所定の領域に局在しており；各々のオリゴヌクレオチドは一本の共有結合を介して前記表層に付加されており；前記種々のオリゴヌクレオチドの密度は１cm²当り約60本以上のオリゴヌクレオチドであり；そして前記オリゴヌクレオチドプローブは前記RNA 転写体又は前記RNA 転写体に由来する前記核酸のサブ配列に対して相補性である；そして（ｃ）前記アレーに対する前記核酸のハイブリダイゼーションを定量する、ここでこの定量は前記遺伝子の転写レベルの尺度を担う；ことを含んで成る方法。２．前記各々のオリゴヌクレオチドプローブが化学合成されたものである、請求項１記載の方法。３．各遺伝子につき、前記アレーがこの遺伝子のサブ配列に対して相補性である10種以上のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る、請求項１記載の方法。４．各遺伝子につき、前記アレーがこの遺伝子のサブ配列に対して相補性である20種以上のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る、請求項１記載の方法。５．前記オリゴヌクレオチドが長さ５〜45ヌクレオチドである請求項１記載の方法。６．前記オリゴヌクレオチドが長さ20〜25ヌクレオチドである、請求項１記載の方法。７．前記オリゴヌクレオチドが光誘導ポリマーにより合成されたものである、請求項１記載の方法。８．前記アレーが構成的に発現されたコントロール遺伝子に由来するオリゴヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載の方法。９．前記コントロール遺伝子がβ−アクチン、GAPDH 及びトランスフェリンレセプターより成る群から選ばれる、請求項８記載の方法。 10．各アレーの種々のコピー間の変動率が20％未満であり、ここで前記変動率はその発現をアレーが検出すべき各遺伝子につき５種以上のオリゴヌクレオチドプローブを平均したハイブリダイゼーション強度の変動係数として測定したものである、請求項１記載の方法。 11．前記標的核酸のプールが単一の燐光体でラベルされたものである、請求項１記載の方法。 12．前記オリゴヌクレオチドプローブの調製がクローニング、核酸増幅工程、又は酵素的合成を要しない、請求項１記載の方法。 13．前記オリゴヌクレオチドプローブの調製が任意の生物材料の取り扱いを要しない、請求項１記載の方法。 14．前記プール中の核酸濃度が前記遺伝子の発現レベルに比例する、請求項１記載の方法。 15．前記オリゴヌクレオチドアレーが誤対合コントロールプローブを更に含んで成り、従って遺伝子に特異的な各プローブに関して誤対合プローブが存在する、請求項１記載の方法。 16．前記定量が各々の前記オリゴヌクレオチドプローブとその対応の誤対合プローブとの間でのハイブリダイゼーションシグナル強度の差を計算することを含んで成る、請求項15記載の方法。 17．前記定量が各遺伝子に対する前記オリゴヌクレオチドプローブとその対応の誤対合コントロールプローブとの間でのハイブリダイゼーションシグナル強度の平均差を計算することを含んで成る、請求項15記載の方法。 18．分析のために選定した前記オリゴヌクレオチドプローブが請求項53の方法に従って選定される、請求項15記載の方法。 19．分析のために選定した前記オリゴヌクレオチドプローブが請求項73の方法に従って選定される、請求項15記載の方法。 20．前記アレー中のオリゴヌクレオチドが請求項53記載の方法に従って選定される、請求項１記載の方法。 21．前記アレー中のオリゴヌクレオチドが請求項73記載の方法に従って選定される、請求項１記載の方法。 22．前記ハイブリダイゼーション及び定量が48時間で成し遂げられる、請求項１記載の方法。 23．前記多数の遺伝子が 100種以上の遺伝子である、請求項１記載の方法。 24．前記ハイブリダイゼーションが約 250μｌ以下の流体容量で行われる、請求項１記載の方法。 25．前記定量が、前記核酸サンプル中の前記RNA の濃度に比例するハイブリダイゼーションシグナルの検出を含んで成る、請求項１記載の方法。 26．前記定量が、前記標的核酸プール中の各遺伝子に対する前記標的核酸の濃度に比例するハイブリダイゼーションシグナルの検出を含んで成る、請求項１記載の方法。 27．前記ハイブリダイゼーションが30〜50℃及び６×以下のSSPE−Ｔの低ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション並びに高ストリンジェンシーでの洗浄を含んで成る、請求項１記載の方法。 28．前記核酸プールがmRNAのプールである、請求項１記載の方法。 29．前記核酸プールがcDNAのプールからin vitro転写したRNA のプールである、請求項１記載の方法。 30．前記核酸プールが生物サンプルから増幅したものである、請求項１記載の方法。 31．前記核酸プールが蛍光ラベルされた核酸を含んで成る、請求項１記載の方法。 32．前記検出が 100μｍ以上の間隔解像度での前記ハイブリダイゼーションした核酸上のラベルの蛍光の定量を含んで成る、請求項１記載の方法。 33．前記定量が走査同焦点蛍光顕微鏡による、請求項32記載の方法。 34．前記方法であって、前記用意が：（ａ）ハイブリダイゼーションした核酸のプールを形成するためにRNA のプールを前記オリゴヌクレオチドプローブと同じ配列を有するオリゴヌクレオチドのプールとハイブリダイゼーションさせる；（ｂ）前記ハイブリダイゼーションした核酸をRNase Ａで処理することで、一本鎖核酸配列は消化し、ハイブリダイゼーションした二本鎖領域は完全に残す；（ｃ）ハイブリダイゼーションした二本鎖領域を変性し、そして前記オリゴヌクレオチドを除去することで、前記高密度アレー中のオリゴヌクレオチドプローブに対して相補性であるRNA に関して増大したRNA のプールを残す；ことを含んで成る、請求項１記載の方法。 35．前記方法であって、前記用意が：（ａ）RNA のプールを対合した標的特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせる、ここで前記対合した標的特異的オリゴヌクレオチドは前記高密度アレー中の前記オリゴヌクレオチドプローブに対して相補性であるサブ配列に隣接する領域に対して相補性である；（ｂ）前記核酸プールをRNase Ｈで処理し、ハイブリダイゼーションした（二本鎖）核酸配列を消化する；（ｃ）前記対合した標的特異的オリゴヌクレオチドの隣接する領域とほぼ等しい長さを有する残った核酸配列を単離する；ことを含んで成る請求項１記載の方法。 36．前記方法であって、前記用意が：（ａ）ポリＡ⁺mRNAのプールを、特定の所定のmRNA標的メッセージに特異的にハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせる；（ｂ）前記核酸のプールをRNase Ｈで処理し、ハイブリダイゼーションした（二本鎖）核酸配列を消化してポリＡ⁺テールからコード配列を分離する；（ｃ）前記プールの中の残ったポリＡ⁺RNA を単離又は増幅させる；ことを含んで成る、請求項１記載の方法。 37．多数の遺伝子の発現レベルを指標する組成物であって、表層上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレーを含んで成り、ここで前記アレーは 100種より多くのオリゴヌクレオチドを含んで成り、ここで：各遺伝子は前記表層の所定の領域に局在しており；各々のオリゴヌクレオチドは一本の共有結合を介して前記表層に付加されており；前記種々のオリゴヌクレオチドの密度は１cm²当り約60本以上のオリゴヌクレオチドであり；そして前記オリゴヌクレオチドは前記遺伝子のサブ配列に対して相補性であり；そして前記オリゴヌクレオチドプローブは１又は複数種の蛍光ラベルされた核酸に特異的にハイブリダイゼーションして蛍光アレーを形成し、これにより前記アレーの蛍光は多数の遺伝子の転写レベルの指標となる、前記組成物。 38．前記蛍光強度が生物サンプル中の所定の多数の遺伝子の転写レベルに比例する、請求項37記載の組成物。 39．前記オリゴヌクレオチドアレーが誤対合コントロールプローブを更に含んで成る、請求項37記載の組成物。 40．前記オリゴヌクレオチドプローブが化学合成されたものである、請求項37 記載の方法。 41．前記オリゴヌクレオチドが長さ５〜45ヌクレオチドである、請求項40記載の組成物。 42．前記オリゴヌクレオチドが長さ20〜25ヌクレオチドである、請求項43記載の組成物。 43．前記オリゴヌクレオチドが光誘導ポリマー合成により合成されたものである、請求項41又は42記載の組成物。 44．前記アレーが１又は複数種の構成的に発現された遺伝子に対して相補的である配列を有する発現コントロールプローブを更に含んで成る、請求項37記載の組成物。 45．前記構成的に発現された遺伝子がβ−アクチン、GAPDH 及びトランスフェリンレセプターより成る群から選ばれる、請求項44記載の組成物。 46．前記核酸プールがmRNAのプールである、請求項37記載の組成物。 47．前記RNA がcDNAのプールからin vitro転写されたものである、請求項46記載の組成物。 48．多数の遺伝子の発現レベルの検出のためのキットであって：表層上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブアレー、ここでこのアレーは 100種以上のオリゴヌクレオチドを含んで成り；ここで各オリゴヌクレオチドは前記表層の所定の領域に局在しており；各々のオリゴヌクレオチドは一本の共有結合を介して前記表層に付加されており；前記種々のオリゴヌクレオチドの密度は１cm²当り約60本以上のオリゴヌクレオチドであり；そしてここで前記多数の遺伝子それぞれにつき、前記アレーは前記遺伝子に対して相補性である少なくとも一種のオリゴヌクレオチドプローブを含む；及び前記複数の遺伝子の発現レベルの定量のための前記アレーの使用を説明した仕様書；を含んで成るキット。 49．前記オリゴヌクレオチドが５〜45ヌクレオチドの長さに範囲する、請求項 48記載のキット。 50．前記アレーが誤対合プローブを更に含んで成り、これにより遺伝子に対して特異的な各プローブにつき、誤対合コントロールプローブが存在する、請求項48記載のキット。 51．前記アレーのオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションするRN A 又はDNA をラベルするための蛍光ラベルを更に含んで成る、請求項48記載のキット。 52．前記アレーのオリゴヌクレオチドプローブに対するRNA のハイブリダイゼーションのためのバッファー及び試薬を更に含んで成る、請求項48記載のキット。 53．１又は複数種の標的核酸に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブのセットを選別する方法であって、（ａ）高密度オリゴヌクレオチドプローブアレーを用意する、こで前記アレーは多数のオリゴヌクレオチドプローブを含んで成り、ここで各プローブは前記標的核酸のサブ配列に対して相補的であり、そして各プローブにつき対応の誤対合プローブが存在する；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドプローブに対して前記標的核酸をハイブリダイゼーションさせる；そして（ｃ）各プローブとその誤対合コントロールとのハイブリダイゼーション強度の差が検出可能であるプローブを選択する；ことを含んで成る方法。 54．更に、（ｃ）前記アレーを前記標的核酸以外の核酸を含んで成る核酸のプールにハイブリダイゼーションさせる；そして（ｄ）最低のハイブリダイゼーションシグナルを有し、そしてプローブとその誤対合コントロールがバックグランドに等しい又は10倍未満のハイブリダイゼーション強度を有するプローブを選択する；ことを含んで成る、請求項53記載の方法。 55．前記オリゴヌクレオチドプローブが約50〜約45ヌクレオチドの長さの範囲である、請求項53記載の方法。 56．前記オリゴヌクレオチドプローブが全て同じ長さである、請求項53記載の方法。 57．各プローブとその誤対合コントロールとの前記ハイブリダイゼーション強度差がバックグランドシグナルの10％以上である、請求項53記載の方法。 58．前記多数のプローブが前記標的核酸のサブ配列に対して相補性である単一の長さのプローブのみを含み、ここで前記プローブは約５〜50ヌクレオチドの長さを有する、請求項53記載の方法。 59．前記アレーが 100種より多くのオリゴヌクレオチドを含んで成り、ここで各々のオリゴヌクレオチドは前記表層の所定の領域に局在しており、そして前記種々のオリゴヌクレオチドの密度は前記表層１cm²当り約60本より多くのオリゴヌクレオチドである、請求項53記載の方法。 60．前記標的核酸が遺伝子由来の核酸である、請求項53記載の方法。 61．前記オリゴヌクレオチドプローブが光誘導ポリマー合成により合成されたものである、請求項53記載の方法。 62．前記誤対合コントロールプローブが中央に位置する１塩基の誤対合を有する、請求項53記載の方法。 63．前記ハイブリダイゼーションが30〜50℃及び６×以下のSSPE−Ｔの低ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーション、それに次ぐ所望レベルのハイブリダイゼーション特異性が得られるまでの順次高まるストリンジェンシーでの１又は数回の洗浄を含んで成る、請求項53記載の方法。 64．核酸のプールが、オリゴヌクレオチドプローブが相補性である核酸と対立するセンスを有する核酸のプールである、請求項63記載の方法。 65．コンピューターシステムにおける、遺伝子の発現をモニターする方法であって：完全対合プローブ及び誤対合プローブのペアーを含む多数の核酸プローブについてのハイブリダイゼーション強度のインプットを受容する、ここでこのハイブリダイゼーション強度はこの複数の核酸プローブと前記遺伝子に対応する核酸とのハイブリダイゼーション親和力を示し、そして各ペアーは核酸の一部に完璧に相補性である完全対合プローブとこの完全対合プローブとは少なくとも１個のヌクレオチドで相違する誤対合プローブとを含む；各ペアーの完全対合プローブと誤対合プローブとのハイブリダイゼーション強度を比較する；そしてこの比較工程の結果に従って遺伝子の発現を表示する；工程を含んで成る方法。 66．前記比較工程が各ペアーの完全対合プローブと誤対合プローブとのハイブリダイゼーション強度の差の計算工程を含む、請求項65記載の方法。 67．前記比較工程が差の平均の計算工程を含む、請求項66記載の方法。 68．前記比較工程が、各ペアーの完全対合プローブと誤対合プローブとの差が差域値をまたがるかどうかを決定する工程を含む、請求項66記載の方法。 69．前記比較工程が、各ペアーの完全対合プローブと誤対合プローブとの商が比域値をまたがるかどうかを決定する工程を含む、請求項60記載の方法。 70．前記比較工程が、差域値をまたがる差及び比域値をまたがる商を有する第一組のペアーを決定する工程を含む、請求項69記載の方法。 71．前記比較工程が差域値をまたがない差及び比域値をまたがない商を有する第二組のペアーを決定する工程を含む、請求項70記載の方法。 72．前記表示工程が、第一組及び第二組の商が発現域値をまたがるなら遺伝子が発現されたものと表示する、請求項65記載の方法。 73．前記複数の核酸プローブがチップの表層に付加されており、この複数の核酸プローブは１cm²当り約60種より多くの核酸プローブの密度を有する、請求項6 5記載の方法。 74．コンピューターシステムにおける、遺伝子の発現をモニターするためのプローブを選別する方法であって：遺伝子を構成する核酸配列のインプットを受容する；この遺伝子に完璧に相補性であるプローブのセットを作る；そしてこのセットの中のプローブの数よりも少ない数の、この遺伝子の発現のモニター用のプローブのサブセットを同定する；工程を含んで成る方法。 75．前記同定工程が、低いハイブリダイゼーション又は高い交差ハイブリダイゼーションの特徴的な指標を特定の基準により前記セットの各プローブを分析する工程を含む、請求項74記載の方法。 76．各基準が、選定プローブが域値をまたがる特徴を有するなら、低いハイブリダイゼーション又は高い交差ハイブリダイゼーションが選定プローブに関して表示されるという域値を含む、請求項75記載の方法。 77．サブセット内のプローブの数を増やすために少なくとも一つの域値を高める工程を更に含んで成る、請求項76記載の方法。 78．前記同定工程がインプットとして前記セットのプローブ及びアウトプットとして前記サブセットのプローブを受容するニューラルネットワークにより実施する、請求項75記載の方法。 79．多数の実験に由来する発見法則として前記基準を決定する工程を更に含んで成る、請求項75記載の方法。 80．前記基準の一つが、プローブ中の特異的なヌクレオチドの頻度が域値をまたがるなら低いハイブリダイゼーション又は交差ハイブリダイゼーションであることを表示する、請求項75記載の方法。 81．前記基準の一つが、プローブの中に順次反復する特異的なヌクレオチドの数が域値をまたがるとき低いハイブリダイゼーション又は交差ハイブリダイゼーションであることを表示する、請求項75記載の方法。 82．前記基準の一つが、プローブの中のパリンドロームの長さが域値をまたがるとき低いハイブリダイゼーション又は交差ハイブリダイゼーションであることを表示する、請求項75記載の方法。 83．前記基準の一つが、２通りの特異的なヌクレオチドのみを含むプローブ内のサブ配列の長さが域値をまたがるとき低いハイブリダイゼーション又は交差ハイブリダイゼーションであることを表示する、請求項75記載の方法。