JPH07508891A - ヒト乳頭種ウイルス検出アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト乳頭腫ウィルス検出アッセイ 発明の背景 ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）は、上皮の種々の増殖性発疹に関連したヘテロジ ーナスな一部のＤＮＡウィルスである。これらの発疹の多ては、ＨＰＶ６及びＨ ＰＶＮに関連しているもののように良性であって、イボ、及びコンジローム等の ような状態を引き起こすと考えられている（Ｇｉｓｓｍａｎ、　Ｃａｎｃ、　５ ｕｒｖ、、　３：　１６１　（１９８１１）を参照のこと）。しかしながら、疫 学的及び分子的研究は、異形成に関連し時には頚管癌へと発展する、性路に感染 する数種の危険性の高いタイプとの関係を示している（例えば、Ｄｕｒｓｔ、　 ａｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ、　８０：３８＋２　（＋９８３）を参照のこと）。

危険性の高いＨＰＶタイプは、主としてＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８であり、ＨＰ Ｖ３１、ＨＰＶ３３、及ヒＨＰＶ３５はこれより重要度が低い。より最近、悪性 腫瘍に関連した別のＨＰＶタイプ、ＨＰＶ’１１１が同定されている（　Ｌｏｒ ｉｎｃｚ、米国特許第４．８１１９．３３１号）。

如何なるタイプのＨＰＶも、生物学的標本中に、一般に極度に少ない数でしか見 出されない。従って、核酸ウィルスマーカーを、標本中の非常に小さな数から検 出可能なレベルへと増幅するために、分子的技術を実施しなければならない。Ｗ Ｏ９０１０２８２１及び５ｈｉｂａｔａ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、、　１６７：　２２５に開示されているように、ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）が、この仕方でＨＰＶウィルスＤＮＡを増幅するために利用されてき た。ＨＰＶ診断へのＰＣＲの他の適用は、Ｍａｉｔｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８８年５月、　５ｅｖｅｎｔｈ　ＩｎｔａｒｎａｔｉｏｎａｌＰａｐｉｌｌ ｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、　Ａｂｓｔｒａｃｔ、　ｐ、５及びＣａ ｍｐｉｏｎｅ−Ｐｉｃｃａｒｄｏ　。

ａｔ　ａｌ、、　１９８８年５月、　５ｅｖｅｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ ａｌ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐにある。ＨＰＶのＰＣ Ｒ増幅に伴う主たる問題の一つは、如何なる良性又は悪性の病変をも呈していな い健康な婦人のうちの相当のパーセントにおいて、これらのウィルスが偶発的な パラセンジャーとして検出されることである。そのようなパラセンジャーの存在 のパーセント見積りは、１０％（米国特許第’１，９８３，７２８を参照のこと ）から６０％の高さにまでわたっている。ＨＰＶの検出は、従って、それ自身限 られた診断価値しかない。

核酸に基づく多くのアッセイが、周知のヘテロジーナスな方式におけるサンドイ ッチ形態を利用している。この方式においては、捕捉オリゴヌクレオチドが、ミ クロタイターウェル又はビーズのような固体支持体に化学的に接合され、サンプ ルが添加され、そして捕捉オリゴヌクレオチドに対する塩基相同性を有する標的 核酸がハイブリダイズされる。１回の洗浄（相分離）の後、検出オリゴヌクレオ チドがハイブリダイズし、そしてハイブリダイズしなかった検出オリゴヌクレオ チドを除去するための第２の洗浄の後、トレーサー又はレポーターの量が測定さ れる、すなわち該信号発生手段が信号を発生する。そのようなアッセイの詳細に ついては、Ｒａｎｋｉの米国特許第４．１１８６，５３９号及び米国特許第１１ ，７３１，３２５号を参照のこと。そのようなサンドイッチアッセイに伴う基本 的問題は、固体支持体への捕捉効率が比較的低いことであり、それはアッセイの 感度を非常に低下させ得る。

発明の要約 本発明の一目的は、頚管の異形成と細胞の悪性腫瘍への転換とに関連したＨＰＶ 感染についての特異的アッセイを提供することである。この目的を達成するには 、悪性の又は前癌性の頚管発疹との関係の示されたＨＰＶタイプの癌遺伝子領域 （遺伝子Ｅ６／Ｅ７）から発現されたメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）のみ を、検出可能なレベルまで最初に増幅することが不可欠である。これは悪性の及 び前癌性のＨＰＶタイプに検出を限定するだけでな（、また、単なるウィルスパ ラセンジャーの存在から実際の癌遺伝子の発現を識別もする。

本発明の更なる一目的は、ＨＰＶについての、最初の捕捉ハイブリダイゼーショ ン段階において高い捕捉効率を有する、高感度のアッセイを提供することである 。このことは、患者標本が非常に低いコピー数のウィルスｍＲＮＡＬか含んでな い状況においては、アッセイ自体が高感度でない限り、検出に十分な高レベルに まで増幅が起こらないかも知れないから、重要である。

本発明の尚も更なる一面は、最適に効率的な増幅のためのブライマーファミリー や、高い選択性と特異性を与えるために緊縮性の条件においてそれらの標的にア ニールするプローブのような、試薬を提供することである。最後に、本発明は、 これらの試薬、緩衝剤、サンプル調製溶液、固体支持体、及び反応容器、を含ん だキットを意図している。

本発明のアッセイによれば、頚管の異形成、悪性細胞又は前癌性細胞に関連した 少なくとも１つのタイプのＨＰＶによりコードされたメツセンジャーＲＮＡを含 有することの疑われた患者標本は、（１）少な（とも１０のヌクレオチドによっ て分離された２つのプライマー（そのようなプライマーのうちの少なくとも１つ は転写プロモーターを含む）を利用して、自己支持配列複製による核酸増幅に付 され、 第１のそのようなプライマーを該標的領域のメツセンジャーＲＮＡ上のその相補 的配列にアニーリングし　、該プライマーの３′末端を、補因子及びヌクレオチ ド三リン酸の存在下に鎖延長ポリメラーゼの作用によって延長させ、 形成されたばかりのＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ＠を、エキソ又はエンドリボ ヌクレアーゼＨ活性を有する酵素で消化し第２のそのようなプライマーを、得ら れた一本鎖のｃＤＮＡ上のその相補的配列にアニーリングし、鎖延長ポリメラー ゼの作用によって該プライマーの３°末端をプライマー延長させ、ヌクレオシド 三リン酸の存在下に転写酵素によって該二本鎖ＤＮＡを転写し、そして 新たに合成された転写物を利用して増幅を繰り返し、（２）増幅されたメツセン ジャーＲＮＡを、該増幅されたＲＮＡの最初の部分に相補的な配列を有するビオ チン化された遊離の試薬である捕捉プローブに溶液中においてハイブリダイズさ せて、試薬捕捉複合体を形成させ、 （３）該固相の表面に結合させたストレプトアビジンと該捕捉プローブのビオチ ン残基の作用によって該捕捉複合体を固相に取付け、 （４）該結合させた複合体を洗浄して未結合及び未反応の試薬を除去し、 （５）該増幅したＲＮＡの第２の部分と相補的であるが第１のそのようなＲＮＡ 部分と重ならない配列を有するものである、ウィルスタイプに特異的な、酵素を 接合させた検出プローブをハイブリダイズさせ、 （６）該複合体を洗浄してハイブリダイズしなかった検出プローブを除去し、そ して （７）蛍光原性又は色原性の酵素基質を添加し、該接合させた酵素を反応させて 検出可能な蛍光体又は色原体を産生させる。

本発明はまた、ＨＰＶ検出アッセイにおいて使用するための特定のプライマーフ ァミリー及び選ばれたプローブにも、並びに使用者に試薬を便利に提供するため のキットにも向けられている。

図面の簡単な記述 図１：　ＨＰＶＩ６ゲノム構成。転写はＰｔｖプロモーターから時計方向に進行 する。Δ、及びＡＬは、早期の及び遅い時期の転写物のためのポリアデニル化部 位である。

図２：　ＨＰＶ＋６の配列。プライマーは下線で示しである。ボックスは、スプ ライス・ドナー及びアクセプター配列を示す。

図３：　ＨＰＶＩ８の配列。ＨＰＶＩ８プライマーの配列は下線で示しである。

ボックスは、スプライス・ドナー及びアクセプター配列を示す。

図４・　）ＩＰＶＩ６のブライマーファミリー。種々のプライマーが、５ｉＨａ 細胞（ＨＰＶ１６を感染させた）からの総ＲＮＡを増幅する能力によって試験さ れた。該反応は、１０％のＤＭＳＯ及び１５％のソルビトール（ＳＯＲＢ）を含 んだ。これらのプライマーは、オートラジオグラム上に示されている。

図５：　ＨＰＶ＋６ブライマーフアミリーを用いた、リボヌクレアーゼＨ濃度を 高めることの効果。

図６：　ＨＰＶ１６プライマー感度。総ＲＮＡは、５ｉＨａＲＮＡ、　ｐ−３２ 、Ｎ５から単離された特異的Ｅ　６−７　ＲＮＡの、ｌ、０．１．０．０１．０ ．００＋アトモルから力価測定される。

図７：　Ｈｐｖ＋ｓのＤＮＡを含有する細胞を用いたプライマー感度。右から左 へ細胞１０−乃至１０個。ｐ３１１Ｎ４図８：　３Ｒ３反応精製物を展開したオ ートラジオグラム。リボヌクレアーゼ力価測定は、ＨＰＶＩ８のＲＮＡを増幅し たプライマー３２−５１１を用いて実施した。

図９：　異なった添加物を含んだプライマー３２−５４を用いて実施した３ＳＲ 反応のオートラジオグラム。添加物（左から右）は１０％ＤＭＳＯ１１０％ボチ エチレングリコール（ＰＥＧ）及び１０％グリセロール（ＧＬＹ）であった。こ れらの反応の交差反応性の有無を判定するために、プライマー２９−１５を用い ５ｉＨａ細胞を用いこれらの添加物を用いた交差反応性が含められた。

図１０：　プライマー３２−５１１及び６つ一５匂を比較する３ＳＲ反応のオー トラジオグラム。プライマー６９−５４を用いた３ＳＲ反応は、添加物を含まな い（第１列）か又は１５％のソルビトール（第２列）を含んだ。プライマー３２ −５１４を用いた反応は、１０％のポリエチレングリコール（第３列）を含有し た。上から下まで、ポリメラーゼＨの力価は、反応当たり１〜３単位である。

図１１．　同時増幅。レーンＡは、プライマー１３６−７３　（ＨＰ　Ｖ　１６ ）を用い、レ−ンＢ　ハブライフ　−１３６−９１（ＨＰＶ１６）を用い、漸減 する量のＤＭＳＯ／ソルビトール混合物を用いて５ｉＨａのＲＮＡの５ａｒｎｏ 　］ヲ増幅した。レーンＣは（上から下へ）　：　１３６−７３　（ＨＰ　Ｖ１ ６）　及ヒ５１１−６９　（ＨＰＶＩ８）　、＋３６−９１及ヒ５４−６９　、 及ヒ５４−６９　。５ｉＨａ細胞（ＨＰＶＩ６に感染させた）及びＨｅＬａ細胞 （ＨＰＶ１８１：感染させた）の５　ａｍｏ　］の混合物を増幅。二重プロット を調製しＨＰＶ１８に特異的なプローブ（５９）及びＨＰＶ＋６に特異的なプロ ーブ（９８）でプローブした。

図１２：　ＨＰＶ１６プレートの最適化。捕捉プローブ２８５の温度最適値。異 なった温度範囲３０°Ｃ，１１０°ｃ１５０°Ｃ１６０°Ｃ及び７０°ｃにおけ るＣＡＰ　（捕捉プローブ）２４５を用いた吸光度値。各ラインは異なった検出 プローブ、ＤＥＴ　（検出プローブ）２５＋　、ＤＥＴ２５２及びＤ　Ｅ　Ｔ　 ２５４を表す。

図１３：　ＨＰｖ１６プレートの最適化。捕捉プローブ２５０の温度最適値。異 なった温度範囲、３０°Ｃ，１１０°Ｃ１５０°Ｃ１６０°Ｃ及び７０°Ｃにお けるＣ　Ａ　Ｐ　２５０を用いた吸光度値。各ラインは異なった検出プローブＤ 　Ｅ　Ｔ２５＋　、　Ｄ　Ｅ　Ｔ２５２及びＤＥＴ２５４を表す。

図１４・　ＣＡ　ｐ　２４５を用いた検出プローブの最適なハイブリダイゼーシ ヨン。検出プローブは、異なった温度範囲、３０°ｃ１４０°Ｃ１５０°Ｃ１６ ０°Ｃ及び７０°Ｃを用いてハイブリダイズした。各ラインは異なった検出プロ ーブＤＥＴ９８、Ｄ　Ｅ　Ｔ２５１　、Ｄ　Ｅ　Ｔ２５２及びＤＥＴ２５勾を表 す。

図１５：　ＣＡＰ２５０を用いた検出プローブの最適なハイブリダイゼーション 。検出プローブは、異なった温度範囲、３０°ｃ、４０°ｃ１５０°Ｃ１６０° Ｃ及び７０°Ｃを用いてハイブリダイズした。各ラインは異なった検出プローブ ＤＥＴ９８、Ｄ　Ｅ　Ｔ２５＋　、Ｄ　Ｅ　Ｔ２５２及びＤＥＴ２５４を表す。

図１６：　ＨＰＶ＋６プレートアツセイ。ＤＥＴ９８、ＤＥＴ２５１、ＤＥＴ２ ５２及びＤＥＴ２５’ｌを用いた捕捉プローブ２４５．２５０及び２５３の比較 。各捕捉プローブは、３ＳＲ産物に５０°Ｃにてハイブリダイズした。検出プロ ーブは、室温にてハイブリダイズした。

図１７：　ＨＰＶ１６検出プローブ性能。ＣＡ　Ｐ　２５０を用いた、ＨＰＶ１ ６についての全ての検出プローブオリゴの比較。検出プローブ名は各数字の下に 掲げである。

図１８＝　酵素プローブアッセイにおいてＣＡ　Ｐ　２５０を用いた、検出プロ ーブ長さの比較。Ｄ　Ｅ　Ｔ　２５６は、１７マーのオリゴでありＤＥＴ２５７ は１５マーのオリゴである。配列は、ＤＥＴ２５７で２個の塩基が除かれている こと以外は同一である。

図１９＝　捕捉緩衝液中において異なる添加物を用いた、吸光度値の比較。左か ら右へ、ＤＥＴ２５５　、ＤＥＴ９８、及びＤ　Ｅ　Ｔ　２５６を用いた２つず つのウェル。列１〜６は、プライマー９６−９１を用いた３ＳＲ産物。列７〜１ ２は、プライマー１３７−９１を用いた、異なった検出プローブを用いた３ＳＲ 産物。添加物は吸光度値の左に示しである。行１及び２は、５％ポリエチレング リコールを用いた、鋳型プラス及びマイナスである。行３及び４は、１％ＢＳＡ を用いた、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔａ）プラス及びマイナスである。行５及び６は 、５％ＰＥＧ５１％ＢＳＡを用いた鋳型プラス及びマイナスである。行７及び８ は、０．１　％ポリビニルピロリドン、５ｘｓｓｃを用いた標準のハイブリダイ ゼーション緩衝液である。

図２０＝　検出緩衝液中において異なった添加物を用いた、吸光度値の比較。左 から右へ、異なった検出プローブＤＥＴ２５６　、ＤＥＴ９８及びＤ　Ｅ　Ｔ　 ２５５を使用。列ｌ、５及び９は、標準ハイブリダイゼーション緩衝液である３ ０％グリセロール、０．１％ＰＶＰ、１％ＢＳＡ及び５ＸＳＳＣを含有。カラム ２．６及び１０は、ハイブリダイゼーション緩衝液として５％ＰＥＧ、０．１％ ＰＶＰ及び５ＸＳＳＣを含有した。カラム３．７及び１１は、ハイブリダイゼー ション緩衝液として１％ＢＳＡ、０．１％ＰＶＰ及び５ＸＳＳＣを含有した。カ ラム４．８及び１２は、ハイブリダイゼーション緩衝液として５％のＰＥＧ、１ ％のＢＳＡ、０．１％ＰＶＰ及び５ＸＳＳＣを含有した。

行Ａ及びＢは、５ｉＨａのＲＮＡを増幅するプライマー９６−９１を用いた、鋳 型プラス及びマイナスである。行Ｃ及びＤは、５ｉＨａのＲＮＡを増幅するプラ イマー１３６−９１を用いた、鋳型プラス及びマイナスである。

図２１；ＨｅＬａのＲＮＡ　（ＨＰＶＩ８）を増幅する、異なったプライマーの 組。プライマーはオートラジオグラム上に認められる。

図２２　酵素プローブアッセイを用いたＨＰＶ１８についての捕捉プローブオリ ゴの比較。３ＳＲ産物は、プライマー５４−６９を用いてＨｅＬａのＲＮＡから 増幅された。列ｌは基質のみである。列２及び３は、捕捉プローブ５６を用いた 、鋳型プラス及びマイナスである。

列４及び５は、捕捉プローブ２６７を用いた、鋳型プラス及びマイナスである。

行は、異なった検出プローブを示す。行ＡはＤＥＴ５９、行ＢはＤＥＴ２６０、 行ＣはＤＥＴ２６２、行りはＤＥＴ２６８、行ＥはＤＥＴ２６９、そして行Ｆは ＤＥＴ２７０である。

図２３：　酵素プローブアッセイを用いた、ＨＰＶＩ６及びＨＰＶ１８について の捕捉プローブオリゴの比較。３ＳＲ産物は、ＨａＬａ及び５ｉＨａのＲＮＡか ら、ブライｖ−１３６−９１（ＨＰ　Ｖ　１６）及び５４−６９　（ＨＰＶ］８ ）を用いて同時増幅したものである。

図２４：　ＨＰＶ１６及びＨＰＶＩ８ＥＰＡ、典型的な標本の吸光度レベル。Ｈ ＰＶ１６及びＨＰＶ＋８は、プライマー１３６−９１及び５１１−６９を、用い て同時増幅された。ＣＡ　ｐ　２６５及びＣＡ　ｐ　２６７が添加され、ハイブ リダイズされた。反応は２つのマイクロウェルに加えられ、タイプ特異的なオリ ゴＤＥＴ２５６をＨＰＶ１６について、及びＤＥＴ２６０をＨＰＶ１８について 用いて検出された。

図２５＝　酵素プローブアッセイの概要。該捕捉プローブオリゴは、ＨＰＶ＋６ 又はＨＰＶＩ８の増幅された３ＳＲ産物に／’％イブリダイズする。該複合体は 、ＨＲＰ標識オリゴヌクレオチドを用いて検出される。

図２６及び２７：５０℃及び１４２℃において実施された反応の収率を比較する 増幅産物のオートラジオグラフ。

好ましい具体例の詳細な記述 図１は、一般化されたＨＰＶ１６ゲノムを示す概要図である。太い同心の線は、 開いた読み枠を示す。図２及び３は、ＨＰＶ＋６及び１８遺伝子についてのスプ ライス・ドナー及びアクセプター（Ｅ６／Ｅ７領域内のスプライスに関与する末 端の２つの塩基の周りを囲むボックスによって示されている。）の位置を示して いる。Ｅ６／Ｅ７ポリペプチドをコードするためのＨＰＶ＋６及びＨＰＶ１８の ウィルスゲノムの部分は、それぞれ配列番号ｌ及び２として、配列表中に同定さ れてい。これは該ゲノムの重要な領域である。そのコードされたタンパク質が、 ｐ５３サプレッサータンパク質（細胞の増殖を制御する）の分解に関与すると考 えられているためである。ｐ５３の機能の喪失は、悪性腫瘍と関連している。こ うして、Ｅ６／Ｅ７の発現は、頚管の癌又は前癌状態についての診断になる。

Ｅ６／Ｅ７領域の発現においては、図中に示された位置でのスブライジングが実 質的なしかし未知の頻度で起こる。この領域から転写されるｍＲＮＡ標的の増幅 のためのプライマーを設計するに際しては、従って、転写物の、スプライシング がｍＲＮＡフラグメントの切り出しをもたらすものである部分の外側に、全ての プライマー対が位置していることを確認することが重要である。選ばれた典型的 なプライマーは、図２及び３に図解されている。

本発明のアッセイの理論的根拠は、遺伝子Ｅ６／Ｅ７を実際に発現してい、る細 胞において産生された遺伝子産物のみを検出することであるから、自己保持配列 複製（３ＳＲ）が、選択される増幅方法である。ポリメラーゼ連鎖反応はＤＮＡ を増幅し、そしてそれがウィルスの存在を非常な感度をもって検出できる一方、 それは遺伝子の発現を検出するには適さない。３ＳＲの方法は、Ｇｉｎｇａｒａ ｓ　ａｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ１１ｎ、、　１１８：　４９８ 　（１９９０）、　Ｇｕａｔａｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ。

８７：　＋５７４（１９９０）及びＷｏ　９０１０６９９５に完全に記述されて いる。別に述べたとき以外は、そこに記述されている方法によっており、そして 該方法は本発明の実際において従われるべき手順を規定する。

Ｇｉｎｇｅｒａｓ　ａｔ　ａｌ、　、及びＧｕａｔｅｌｌｉ　ａｔ　ａｌ、にお いて提示された一般の３ＳＲ増幅手順は、次の段階を含む。１００μＬの３Ｒ３ 増幅反応は、標的ＲＮＡ５’ＪＯｍＭのトリス塩酸ｐ）（８，１，２０ｍＭのＭ ｇＣ１ｚ、２５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭの塩酸スペルミジン、５ｍＭのジチオス レイトール、８０μｇ　／　ｍ　Ｌの牛血清アルブミン、１ｍＭのｄＡＴＰ、１ ｍＭのｄｃＴＰ、ＩｍＭのｄＧＴＰ、１ｍＭのｄＴＴＰ、４ｍＭのＡＴＰ、４ｍ ＭのＣＴＰ、４ｍＭのＧＴＰ、４ｍＭのＵＴＰ、及び２５０　ｎ　ｇの各々選択 されたオリゴヌクレオチドブライマーを含有した。６５°Ｃにて１分間加熱しそ して３７°Ｃにて２分間冷却した後、３０単位のＡＭＶ逆転写酵素、１００単位 のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、及び４単位のＥ、　ｃｏｌｉリボヌクレアーゼＨを 、各反応に加えた。

全ての反応は、３７°Ｃに１時間インキュベートし、そして反応を氷上に置くこ とにより停止された。

一般には、３ＳＲは、ＨＰＶＩ本について次の通りに行われる。

すなわち、サンプルは膣洗浄又は頚管擦過によって得られる。メッセンジ＋　− ＲＮＡは、カオトロフィック（ｃｈａｏｔｒｏｐｈｉｃ　）　／　７　エンール 試薬で処理することによって遊離されそして通常エタノールによって沈殿される 。好ましい一段階抽出は、ＲＮ　ＡＺＯＩ　Ｂ　（Ｃｉｎｎａ／Ｔｉｏｔｅｃｘ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）を該製造業者の指図書に従って利用 する。このＲＮＡは、次いで、３ＳＲ増幅を行うために、ヌクレオチド及びヌク レオシド三リン酸、プライマー、酵素及び補因子と共に３ＳＲ緩衝液に溶解され る。試薬は次の通りにして得られた。

プライマーオリゴヌクレオチド 全てのオリゴヌクレオチドは、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ　８７００　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装 置のような、市販の合成装置によって合成することができる。５′　ビオチンを 含むオリゴヌクレオチドは、ビオチンホスホアミダイト（Ｇｌｅｎｎ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ）を用いて合成することができる。３゛　ビオチンを含むオリゴヌクレ オチドは、保護されたビオチンを含有するコントロール多孔質ガラスを用いて合 成することができる（Ｇｌｅｎｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）。３′アミンを含むオリ ゴヌクレオチドは、「アミノ・オン」コントロール多孔質ガラスカラム（Ｇｌｅ ｎｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）を用いて慣用的に合成される。以下は、本発明のＨＰ Ｖ］６／１８酵素プローブアッセイの開発に用いられたオリゴヌクレオチドのリ ストである。配列の全ては、左から右へ５゛から３゛である。該オリゴヌクレオ チドブライマーはまた、配列表に配列番号３−３１として掲げられている。

配列番号　プライマープローブ ３　ＨＰＶ１５：　ＡＡＴ　ｎ’Ａ　ＡＴＡ　ＣＧＡ　ＣｒＣＡＣＴ　ＡＴＡ　 ＧＧＧＡＧＣｍ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＣＡＣＡＧＴ　ＧＧＣ４ＨＩ’Ｖ１ ９：　ＡＡＴ　ＧＴｒ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＣＣＣＡＣＡ　ＧＧＡ　ＧＣ５ＨＩ’ Ｖ２０：　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＴＡＣＴＧＣＡＡＧ　ＣＡＡＡＧ ６　ＨＰＶ２９：　ＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＡ７　ＨＰ Ｖ３２：　ＣＡＣＴｒＣＡＣＴ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＡＧＡ　Ａ８　ＨＰ Ｖ４８：　ＡＡＴｒｒＡＡＴＡ　ＣＧＡ　ＣＴＣＡ＠　ＡＴＡ　ＧＧＧＡＴＧ　 ＴＧＴ　ＣＴＣＣＡＴ　ＡＣＡ　ＣＡＧ　ＡＧＴ　Ｃ９Ｈｒ’Ｖ５３：　ＧＡＡ 　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＴＡＣＴＧＣＣＡＡＧ　ＣＡＡＡＧ １０　Ｈｒ’Ｖ５４：　ＡＡＴＴｒＡＡＴＡＣＧＡＣｒＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ ＡＡ　ＧＧＴ　ＧＴＣＴＡＡ　ＧＴｒ　ｍ　ＣＴＧ　ＣＴＧ１１　ＨＰＶ６９： 　ＣＴＧＡＡＣＡＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＡＣ１２ＨＰＶ７３：　ＣＡＧ　Ｔ ｒＡ　ＴＧＣＡＣＡ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＡＣ１３ＨＰＶ７４：　ａＴｒ ＡＴＧ　ＣＡＣＡＧＡ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＡＡＣＡＡ１４　ＨＰＶ７７：　ＣＡ Ａ　ＧＣＡ　ＡＣＡ　ＧＴｒ　ＡＣＴ　ＧＣＧ　ＡＣ１５ＨＰＶ８９：　ＡＧＣ ＡＡＣＡＧＴ　ＴＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴ１６　ＨＰＶ９０：ＧＣＡＣＡＧＡＧＣ ＴＧＣＡＡＡＣＡＡ口ＡＴＡ１７　ＨＩ’Ｖ９１：　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　 ＣＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　ＣＡ１８　ＨＰＶ９２：　ＡＡＴ　ＴＴＡ　 ＡＴＡ　ＣＧＡ　ＣＴＣＡＣＴ　ＡＴＡ　ＧＧＧＡＣ丁Ｔｒｒｃ丁ＴＣＡＧ　Ｇ ＡＣＡＣＡ　ＧＴＧ　ＧＣＴＴＴ １９　ＨＩ’Ｖ９３：　ＡＡＴ　ＴｒＡ　ＡＴＡ　ＣＧＡ　ＣＴＣＡＣＴ　ＡＴ Ａ　ＧＧＧＡＴｒ　ＴＧＣｍ’　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＣＡＣＡＧＴＧ ２０　ＨＩ’Ｖ９４：　ＡＡＴＴｒＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ ＴＣｍＧＣＴｍＣＴｒＣＡＧＧＡＣＡＣＡ　−Ｔ ２１　ＨＩ’Ｖ９５：　ＡＡＴＴｒＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ ＴＧＴＣＴＴｒＧＣＴｒＴｒＣＴｒＣＡＧＧ　ＡＣＡＡ ２２　ＨＰＶ９６：　ＡＡＴＴｒＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧ ＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣｍＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡ ２３　ＨＰＶＩＯＩ：　ＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＣＡＴＧ２４ 　ＨＰＶ１０６：　ＡＡＴ　ＴｒＡ　ＡＴＡ　ＣＧＡ　ＣＴＣＡＣ：ｒ　ＡＴＡ 　ＧＧＧＡＴｒＣＡＴＧＣＡＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣ２５ＨＰＶ１０７ ：　ＡＡＴＴｒＡＡＴＡＣＧＡ　ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＴｒＣＡＴＧ ＣＡＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣ２６ＨＩ’Ｖ１１８：　ＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣ ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＴＧＡＴ２７　ＨＰＶ１２０：　ＡＡＴＴｒＡＡＴＡＣＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧ ２８　ＨＰＶ１２９：　ＡＡＴ丁ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ ＡＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡ’ｒＧＣＡＧ２９　ＨＰＶ１３１：　Ａ ＡＡＣＡＡＣｒＡＴＡＣＡＴＧＡＴＡＴＡＡＴＡ３０　ＨＰＶ１３６：　ＡＡＴ ＴｒＡＡＴＡＣＧＡＣｒＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＧＴＡＧＣ；ＴＧＴＡＴＣ ＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧ３１　ＨＰＶ１３７：　ＡＡＴＴｒＡＡＴＡＣＧＡＣｒＣ ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＡ高レベ ルの増幅のためのプライマーの選択は、基本的には方向づけられた試行錯誤の過 程である。第１の組のプライマーを規定するために、ＩＪ００個の塩基よりなる スパン（開始部位及び終了部位をスプライスされる領域の外側に有する）が、Ａ ＴＧコドンで始まり４゜Ｏ塩基を数えるＥ６遺伝子の５゛末端の第１の１０−３ ０個のヌクレオチドを指定し、ついで次の＋　０−３０個の塩基をプライマーと して選択することによって選択された。各対について、プライマーの少なくとも １つが転写のだめのプロモーターを含まなければならないことに注意。強さと特 異性から、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼ結合部位（配列番号： ’１４）　、ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴＡ　ＣＧＡ　ＣＴＣＡＣＴ　ＡＴＡ　ＧＧＧ 　Ａ、が好ましい。

プライマー対は、増幅効率について試験される。最適化させるためには、第２の プライマー位置は静止させておき、第１のプライマーを任意に２０塩基だけ第２ のプライマーの方へと動かす（それによって、プライマー間のスパンを、例えば 第１のプライマーの３′末端の位置と第２のプライマーの５゛末端との間の塩基 を、３８０塩基まで２０塩基だけ減少させる）。細かな調節が、２〜５塩基のジ ャンプによって最良の組み合わせからプライマーをウオーキングさせることによ って達成できる。達成される ブライマーファミリー　図４は、ＨＰＶ１６のＥ６−７を増幅するブライマーフ ァミリーを与える。全てのプライマーは、５ｉＨａ細胞系から単離された（ＨＰ ＶＩ６転写物を含む）総ＲＮＡを増幅した。

反応条件は、７ｍＭのｒＮＴＰｓ、１ｍＭのｄＮＴＰｓ、４０ｍＭのトリスｐＨ ８，＋　、３０ｒｎＭのＭｇＣ］　２．２０ｍＭのＫＣＩ、５０ｍＭのジチオス レイトール、２０ｍＭのスペルミジン、１０％のＤＭＳＯ１１５％のソルビトー ル、及び＋５ｐｍｏｌの各ブライミングオリゴヌクレオチドを含んだ。各チュー ブを４２°Ｃにて５分間前加温の後、３０単位のＡＭＶ逆転写酵素、２単位のり ボヌクレアーゼＨ１及び２５０単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、各反応に混合 物として添加した。反応は１１２°Ｃにて１時間行わせた。３ＳＲ反応のサンプ ルを、ニトロセルロース上に展開した。このニトロセルロースを４５分間焼き、 次いでタイプ特異的検出オリゴを用いて４５分間ハイブリダイズさせた。

このニトロセルロースにフィルムを１１５分間−７０℃にて暴露させることによ ってオートラジオグラムを作った。１２０についてのブライマーファミリーは２ ９及び９０である。１５についてのブライマーファミリーは１９．２０．７７． ５３及び８９である。プライマー１２９についてのブライマーファミリーは２９ ．７４．７３．１１８．１３０及び１３１である。プライマー１３６についての ブライマーファミリーは９１．２９．９０．７ｕ、　７３．１３０．１３１及び １１８である。プライマー１３７についてのブライマーファミリーは２９．９０ ．７４．７３．１３１及び１１８である。

図５は、リボヌクレアーゼＨＨＰＶ１６ブライマーフアミリーを力価測定するこ との効果を図解している。該３ＳＲ反応条件は、ＤＭＳＯ及びソルビトールが反 応から除かれいること以外は図４に記述したのと同一である。１０μｌをニトロ セルロース上に展開し、次いで焼き、そしてタイプ特異的検出オリゴ（ＨＰＶ５ ５）でプローブした。プライマー９３についてのブライマーファミリーは７３及 び９１である。これら２つのプライマー対を用いた反応に必要な最適のりボヌク レアーゼＨは、ｌ乃至２単位である。９５についてのブライマーファミリーは１ ０１及び９１である。これらのプライマーの組は、異なるリボヌクレアーゼＨ濃 度に敏感であるようには見えない。プライマー９２　、９２−９１、プライマー ９１１　、９１１−９１、及びプライマー８５　、８５−７７について、単一の プライマー組が規定された。プライマー９６についてのブライマーファミリーは ７３及び９１である。これらのプライマーの組の全ては、２乃至３単位のりボヌ クレアーゼＨを用いて最適に増幅を行った。プライマー９６−７３．９６−９１ 、及び９４−９１の感度は、５ｉＨａ細胞から単離されたＥ６−７の力価測定を 用いて試験された。各プライマーの組が一旦規定され最適化されると、感度は、 対照細胞からの漸減する量のＲＮＡを増幅することによって測定することができ る（図６）。３ＳＲ反応の条件は、プライマー９６−７３を用いてる場合ＤＭＳ Ｏが含まれており且つソルビトールが除かれていること及びプライマー９１１− ９１を用いる場合ソルビトールが１０％しか含有されていないこと以外は、図４ に記述されているのと同一である。

図７〜１０は、ＨＰＶ１８　Ｅ６−７を増幅するのに使用されるプライマーを記 述している。プライマー５８についてのブライマーファミリーは３２．６９及び ７０である。プライマー４８および３２もまた）ｌａＬａＲＮＡを増幅する。プ ライマー５４−３２及び５４−１１８は共に、３ＳＲ反応への１０％のポリエチ レングリコール又はＤＭＳＯ及びソルビトールの添加を必要とする。プライマー ５１１−６９は増幅を成功させるのに添加物の添加を必要としない。プライマー ；’Ｉｌｌについての更なるブライマーファミリーは６９．２１ｉＬｌ　、２＋ １１及び７０てあり、それらはいずれも増幅反応への添加物を必要とする。

同時増幅　ＨＰＶＩ６及びＨＰＶ＋８の両方のために一旦プライマーが選択され たら、臨床的用途のためには両像的の同時増幅が必要である。同時増幅が必要な のは、単一の標本しか得られないからである。これはＨＰＶ＋６又はＨＰＶ１８ についてのみならず、ＨＰＶ３１．３３、及び３５（シかし限定はされない）並 びに腫瘍原性であることの判明した如何なる他のタイプをも含む、複数のＨＰＶ タイプにも適用することができる。単一標本を２つの独立した反応のために分け ることは実際的でない。図１１は、１６及び１８のタイプに特異的な検出プロー ブでプローブされた二重プロットである。レーンＣは、２つの独立した標的の交 差反応性を明らかにしている。

捕捉プローブ及び検出プローブ：　プレートを高い温度でインキュベートするこ とが実際的でないために、検出プローブは室温において最大の信号を生み出さな ければならない。多くの場合、ミクロウェルの不均一な温度はハイブリダイゼー ションの差を引き起こしそれによって吸光度値の変動を引き起こす。プレートの 方式は、アッセイの性能に影響を及ぼす。３ＳＲ生成物を最初に捕捉しそして別 のインキュベーション段階において検出する代わりに、捕捉プローブ及び検出プ ローブの両方を同時にインキュベートすることは、相対的光学密度値に影響を及 ぼす。捕捉プローブ及び検出プローブの両方の同時インキュベーションの欠点が ある。高い鋳型濃度においては、３ＳＲ反応は非常に高い生成物濃度を与える。

一段階で捕捉プローブが標的にインキュベートされ次いでミクロウェルに適用さ れそして結合させられるとき、過剰の標的は続いて後洗い去られる。検出プロー ブが次いで適用され、それは捕捉された３Ｓ、Ｒ標的にのみハイブリダイズする 。

捕捉オリゴヌクレオチド配列を設計するとき、ハイブリダイゼーション温度を規 定することはアッセイの性能にとって極めて重要である。図１２及び１３はＨＰ Ｖ１６捕捉オリゴヌクレオチドのためのハイブリダイゼーションの至適温度を規 定している。３ＳＲ生成物は、吸光度レベルを低下させるために１　、１０００ ０に希釈されて、それにより異なった検出プローブの差が一層明白になることを 許容する。ハイブリダイゼーション反応は、５０μｌの希釈された３ＳＲ生成物 を、０．１％のＰＶＰ、２ＸＳＳＣ及び４ｐｍｏ　１の捕捉オリゴヌクレオチド 中に含有する。該反応は、室温から７０℃までにわたる種々の温度にてインキュ ベートされた。該反応はミクロウェル中において２９分間進行し、そしてウェル は２ＸＳＳＣ（０，６ＭのＮａＣ１，０，０６Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７，０） 　、０．０５％のＴｗｅａｎ　２００、及び０．０１％のＴｈｉｍａｒｓｏｌ　 ”で３回洗浄された。検出プローブを添加し室温にて３０分間インキュベートし た。ミクロウェルを２ＸＳＳＣ１０，５％のＴｗａｅｎ　２０、及び０．０１％ のＴｈｉｍｅｒｓｏｌで再び３回洗浄した。

西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素の基質、３’、３’、５’、５゜−テトラメチ ルベンジジン及び過酸化水素を各ウェルに添加し、室温にて１５分間発色させた 。この反応をＩＭのリン酸の添加によって停止させ、４５０ｎｍにて読み取った 。

捕捉プローブ２４５についてのハイブリダイゼーションの最適温度は、５０°Ｃ 乃至６０°Ｃである。７０°Ｃにおいて信号は比較的一定に留まるが、ＲＮＡの 熱分解がこの温度では懸念される。捕捉プローブ２５０ハイブリダイゼーシヨン に最適なのは５０°Ｃ乃至６０°Ｃである。検出プローブのハイブリダイゼーシ ョンのための最適温度を実験的に決定しなければならないことから、様々な検出 プローブを試験しなければならない。捕捉オリゴ最適温度が一旦規定されると、 同じ実験を異なったプローブを用いて繰り返さなければならない。

最良の態様二　図１４及び１５は、最適の検出プローブを規定している。ＣＡ　 Ｐ　２５０及びＣＡ　Ｐ　２４５は、ＤＥＴ２５＋を室温にてハイブリダイズさ せたとき最も高い吸光度値を与えた。この反応は、°図１３に記述されているよ うにして実施した。以下は有用な検出プローブ、捕捉プローブ、及び陽性のハイ ブリダイゼーション対照プローブのリストである。これら検出プローブ、捕捉プ ローブ及び陽性ハイブリダイゼーション対照プローブはまた、配列表においても 配列番号３２−’Ｊ３として掲げられている。

配列番号　捕捉プローブ ３２　ＣＡＰＺ３５：　ＴｃＴＡＴｒ　ＡＡＣＴＧＴ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＣＣＡ 　ＢＩＯＴＩＮ３３　ＣＡＰ２５０：　ＴＧＴ　ＡＴｒ　ＡＡＣＴＧＴ　ＣＡＡ 　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡビオチン ３４　ＣＡｒ’　２５３：　ＴＧＴ　ＡＴｒ　ＡＡＣＴＧＴ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　 ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡ　Ａビオチン ３５　ＣＡＰ２６５：　ＧＴＡ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＣＡＧＣＴＧＴ　ＡＡＡ 　ＡＡＡビオチン ３６　ＣＡＰ２６７：　ｃＴｃ　ｃｃＴｃｃｃ　ｃＴｃ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡ Ａ　ＡＡＡビオチン 配列番号　検出プローブ ３７　ＤＥＴ５９：　ＧＡＣＡＧＴＡＴｒＧＧＡＡＣＴＴＡＣＡＧ３８　ＤＥＴ ９８：　ＴｒＡＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＮＨ２３９ＤＥＴ２５５ ：　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＴｒＡ　ＣＴＧ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　ＧＡＧ　ＮＨ２４０Ｄ ＥＴ２５６：　ＴｒＡ　ＣＴＧ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　ＧＡＧ　ＧＴ　ＮＨ２４１Ｄ ＥＴ２６０：　ＧＴＡ　ＴＡＴ　ＴＧＣＡＡＧ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＮＨ２配列番 号　陽性ハイブリダイゼーション対照プローブ。

４２　１’ＨＣ２７１：　ＴＧＴ　Ｃｎ’　ＧＣＡ　ＡＴＡ　ＴＡＣＡＡＡ　Ａ Ａビオチン４３　ＰＨＣ２７２：　ＣＴＣＡＣＧ　ＴＣＧ　ＣＡＧ　ＴＡＡ　Ａ ＡＡ　ＡＡＡビオチン図１６は４つの異なった検出プローブを用いた最もよい性 能の捕捉プローブ全ての比較である。捕捉プローブは、０．１％ＰＶＰ、２ｘｓ ｓｃ及び８ｐｍｏｌ捕捉プローブ中において最適温度にて３０分間３ＳＲ生成物 にハイブリダイズさせた。反応はミクロウェルに適用し、室温にて２０分間イン キュベートした。ミクロセルを２ＸＳＳＣ，０，０５％（７）Ｔｗｅｅｎ　２０ 及び０．０１％のＴｈｉｍｅｒｓｏｌで３回洗浄した。ミクロウェルに検出プロ ーブを添加し室温にて３０分間ハイブリダイズさせた。ウェルを再び３回洗浄し 、そして１５分間発色させた。反応を停止させてＡ３５０にて読み取った。プレ ートアッセイによる該捕捉プローブの性能は、ウェルに最も近いオリゴの末端上 にアデニン残基を加えることによって増大させることができた（データは示さず ）。種々の塩基が標的とされた（Ｇ、Ｃ，Ａ及びＴ）。Ｔは選ばれなかった。殆 とのｍＲＮＡがポリアデニル化されておりＴは末端ハイブリダイゼーションを起 こすからである。ＣＡ　Ｐ　２５０は、５ｉＨａ細胞を増幅するとき最も高い信 号を与えた。しかしながら、ＣＡＰ２５０のみては、３つのスプライスされたＥ ６のＲＮＡの２つが捕捉できる。他の数種の捕捉プローブが検討され、ＣＡ　ｐ 　２６５が３つのＥ６転写物の全てを捕捉した。各細胞系はＥ６を異なった速度 でスプライスする。ＣＡ　Ｐ２６５が選ばれた。臨床標本はＥ６のスプライソン グにおいてへテロジーナスであろうからである。

一旦捕捉ブローブが規定されると、酵素を接合させた検出プローブの選択か行わ れる。図１７はＨＰＶ＋６についての全ての検出プローブの比較である。ＤＥＴ ２５６は本アッセイにおいて最も高い吸光度値を与えた。説明のために２つの検 出プローブが合成された。効率的なハイブリダイゼーションのために必要な塩基 の最少数を規定するため、第１は１７マー、第２は１５マーとした。最小の長さ の検出プローブオリゴは、約１７塩基であることができる（図１８）。信号酵素 が３′末端において該オリゴヌクレオチドに接合しているときに最良の結果が達 成されるということに注意。

捕捉緩衝液中に種々の添加物の添加が行われたが、プレートアッセイにおいて相 対的吸光度に殆ど上昇はなかった（図１９）。これらの同し添加物が検出緩衝液 に加えられたとき、信号は２倍以上となった（図２０）。この効果は、３ＳＲ生 成物の長さに関係しているように見える。該生成物が長いほど、効果が一層明白 であった。

プライマー９６−９１は、１３６−９１に比して、短い３ＳＲ生成物を与える（ 図２０）。検出緩衝液中に添加剤を含有することは、バックグラウンドのレベル を高める。グリセロールを用いた力価決定は、バックグラウンドのレベルを低下 させる。図２１は、ＨｅＬａのＲＮＡを用いてＨＰＶ１８を増幅する更なるプラ イマーの組のオートラジオグラムである。図２２は、種々の検出プローブを用い てＨＰＶ１８捕捉プローブの性能を示している。図２３は、タイプ特異的検出プ ローブを用いて、ＨＰＶ＋６及びＨＰＶ１８の同時増幅及び同時捕捉の吸光度値 を示している。図２４に示されているように、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のため の増幅において、最良の結果は、プライマー１３６−９１　（ＨＰＶ１６）　、 ５１１−６９　（ＨＰＶＩ８）　、ＣＡＰ２６５　（ＨＰＶ１６）　、ＣＡＰ２ ６７　（ＨＰＶ１８）及びＤＥＴ２５６　（ＨＰＶ＋６）　、ＤＥＴ６０（ＨＰ Ｖ１８）を同時に使用して達成された。このアッセイの構成は、図２５に示され ている。

アッセイ方式二　上記の試薬を用いて、低いウィルスｍ　ＲＮ　Ａのコピー数し か有しない標本から得られる信号を最適化するため、本発明のアッセイ方式を考 案した。捕捉プローブ配列と相補的であるサンプル標的配列の液相捕捉は、固相 上に直接に吸着させるよりもずっと効率的である。実際、典型的なサンドイッチ 形態においては、サンプル中の利用し得る核酸のうち僅か１〜３％しか捕捉しな いことも珍しくない。このことはそれに対応して強さの２桁だけ感度を低下させ る。

固相上に核酸複合体を分離することはやはり必要であるため、該「捕捉」サンプ ルは、検出プローブが添加される前に固相上に固定化されなければならない。本 アッセイは、ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用についての極度に 高い結合定数を利用する。捕捉プローブオリゴヌクレオチドは、慣用の技術によ る３′又は５゛末端の標識化によってビオチン化されている。捕獲プローブを３ ′末端においてビオチン化することは、サンプル標的配列にハイブリダイズさせ たプローブを固定化するに際して一層効率的であるということが、これまで研究 されているプローブについて実験的に判定されている。

該固相はストレプトアビジンで被覆され、それによってハイブリダイズさせた捕 捉ブローブーサンプル配列複合体がそれと接触するに至るとき、ストレプトアビ ジンとビオチンとの反応が起こる。固相は、好ましくは、ミクロタイタートレー ウェルの内側表面であるが、当該分野で既知のいかなる固相分離システムも満足 できるものでありそれらには、ポリスチレンビーズ、磁性微粒子、プラスチック 又は金属の試験片、浸漬棒、種々の材料を充填したカラム等が含まれる（しかし 限定はされない）。慣用のアッセイにおけるプラスチック支持体による特に低い 捕捉効率のために、本発明のこの液相捕捉法は、プラスチックで作られた固体支 持体を用いて高い結果を与えることが期待される。

オリゴヌクレオチドに共有結合により又は静電的に接合される能力を有ししかも 相補的配列へのそのハイブリダイズを妨害することのないいかなる信号発生酵素 又は他のレポーター又はトレーサー系も、本アッセイにおいて意図されている。

西洋ワサビペルオキシダーゼが好ましいが、アルカリ性ホスファターゼ並びに合 成の蛍光原性及び色素原性分子を加水分解する酵素もまた使用することができる 。環境上の及び安定性への配慮から、放射性のトレーサーよりも非アイソトープ 性のレボータ／トレーサー系が好ましい。

種々の捕捉プローブ及び検出プローブの加水分解の動力学は、それらの熱力学的 特性に従って異なり、そして、説明のためにここに開示されている類似ではある が同じではない配列を有するプローブについてのアッセイを最適化するためには 、幾つかの比較的大した量でない実験をすることが必要であろう。

代わりの増幅反応条件 図２６は標準の３ＳＲ反応条件（４２°Ｃ）を用いて実施される増幅反応を、高 めた温度（５０°Ｃ）にて実施される増幅反応と比較している。これらのアッセ イは、プライマーの組＋３６−９１　（ＨＰ　Ｖ　１６）及び５４−６９　（Ｈ ＰＶ１８）を−緒に又は別個に用いた。標準の３ＳＲ反応条件は、４０ｍＭのト リス塩酸、ｐ　Ｈ８，１，３０ｍＭのＭｇＣ１ｚ、２０ｍＭのＫＣＩ、１０ｍＭ のジチオスレイトール、４ｍＭのスペルミジン、１５ｐｍｏｌの各ブライミング オリゴヌクレオチド、１ｍＭのｄＮＴＰ、７ｍＭのｒＮＴＰ、３０単位のＡＭＶ 逆転写酵素、２単位のりポリメラーゼＨ１及び１０００単位のＴ７のＲＮＡポリ メラーゼであった。反応は、４２°Ｃにて１時間インキュベートした。高めた温 度゛の反応の条件は、４ｏｍ　Ｍのトリス酢酸、ｐ）（８ｊ　、３０ｍＭの酢酸 Ｍｇ、ｉｏｍＭのジチオスレイトール、１００ｍＭのグルタミンサンカリウム（ ｐＨ８，＋）、１ｍＭのｄＮＴＰ、６ｍＭのｒＮＴＰ、１５％のソルビトール、 ３０単位のＡＭＶ逆転写酵素、２単位のりボヌクレアーゼＨ１及び１０００単位 のＴ７のＲＮＡポリメラーゼであった。反応は、５０°Ｃにて１時間インキュベ ートした。

増幅反応のインキュベーションの後、増幅生成物の１／１０を、６５°Ｃの水浴 中において１０分間、９０μｌの７．４％ホルムアルデヒド＋１０ｘｓｓｃ中で 変性させ、そして少なくとも１分間、氷上で急冷した。ＢＡ−８５ニトロセルロ ースを水で、次いで１０×ＳＳＣで予め濡らした。変性させた増幅サンプルを、 該予め濡らしたニトロセルロースを含んだ展開プロット装置にかけ、真空を用い てサンプルを該ニトロセルロース上に引いた。該フィルターを次いで８０℃にて ４５分間焼き、ＨＰＶＩ８（ＤＥＴ５９）　又１；！ＨＰＶＩ６（ＤＥＴ９８） ｉｌ：対ｔ、てｅ異的な、タイプ特異的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ させた。該ハイブリダイゼーション溶液は、６ＸＳＳＣ１１０ｘ　Ｄｅｎｈａｒ ｄｔＳ、］ＯｍＭのトリス、Ｉ）　Ｈ７，ｌ＋　、０．２　ｍ　ｇ／ｍ　ｌの剪 断した鮭精子ＤＮＡ、及び１％のＳＤＳを含有した。

図２６及び２７は、５０°Ｃ及び１１２°Ｃにて実施した反応の増幅収率の比較 を描いている。両方の数字において、列１の増幅反応はＨＰＶ１６プライマー１ ３６−９１を使用し、列２の反応はＨＰＶ１８プライマー５４−６９を使用し、 列３の反応は、ＨＰＶＩ６とＨＰＶＩ８ブラー１’　７−１３６−９１及び５１ １−６９を使用した。該標的配列は、各５ａｍｏｌの５ｉＨａ細胞（ＨＰＶ１６ に感染させた）及びＨｅｆ、ａ細胞（ＨＰＶＩ８（：感染させた）ＲＮＡの混合 物であった。行１〜４はそれぞれ１５％、１０％、５％、及び０％の濃度のソル ビトールを含有し、行５は１５％ソルビトールを用いた鋳型不合反応であり、行 ６はブランクであり、そして行７〜１１は、１５％、１０％、５％及び０％の濃 度のソルビトールをそれぞれ含んだ。行１〜５は、５０°Ｃにてインキュベート したものであり、行７〜１１は４２°Ｃにてインキュベートしたものである。図 ２６における増幅生成物は、ＨＰＶＩ６に特異的であるＤＥＴ９８によってプロ ーブした。図２７の増幅生成物は、ＨＰＶ＋８に特異的であるＤＥＴ５９によっ てプローブした。

図２６は、それらのバンドが、５％又は０％レベルに比して１０％及び１５％ソ ルビトールレベルにおいてずっと強いことを描いている。これらの結果は、ソル ビトールの濃度を高めることは酵素を保護し、それにより反応を４２°Ｃではな しに５０．”Ｃにおいてインキュベートできることを明らかにしている。ソルビ トールの濃度が１０％より下に落とされると、酵素は熱的に保護されず、高めた 温度においては変性し、増幅のレベルを低下させる。図２６及び２７は、高めら れた温度は、４２°Ｃの反応条件に比較したとき、増幅のレベルを高めることを 明らかにしている。ことことは、混合されたプライマーの組＋３６−９１　（Ｈ Ｐｖ＋６）　及び５４−６９　（ＨＰＶ１８）を用いて標的配列が同時増幅され たとき特に明らかであった。高めた温度を用いた増幅のレベルの評価では、４２ °Ｃの反応条件を用いた増幅のレベルに比して１０倍高かった。

上記の詳細な記述は、本発明のよりよい理解のためにのみ提供されており、これ から不必要な限定を読み取ってはならない。添付の請求の範囲の情神及び範囲か ら外れることなく何らかの修正を加えることは当業者に明らかだからである。

配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：　ジャニス、ティー、ブラウン（１、発明の名称：ヒトの乳頭腫 ウィルスの検出アッセイ（ｉｉｉ）配列の数：ｌｌ４ （１ｖ）連絡住所 （Ａ）住所：　バクスター、ダイアノスチックス、インコーホレイテッド （Ｂ）ストリート：　バクスターパークウェイ！、ＤＰ−３Ｅビル（Ｃ）市：　 ディヤフィールド （Ｄ）州：　イリノイ （Ｅ）国：　アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ　、６００１５ （Ｖ）コンピューター読み取り可能様式（Ａ）媒体タイプ：　フロッピーディス ク（Ｂ）コンピューター、　アップル、マツキントラシュ（Ｃ）オペレーティン グシステム：　アップルマツキントラシュシステム７．０ （Ｄ）ソフトウェア：　マツキントラシュ・テキストファイル（ｖｉ）　現在の 出願データー （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願のデータ （Ａ）出願番号：　米国特許出願第０８１０５８　、９２０Ｔ　ＡＴＧ　ＣＡＣ ＣＭ　ＭＧ　ＡＧＡ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＣＡＧ　ＧＡＣＣＣＡ 　ＣＡＧ　ＧＡＧＣＣＣＡＧＡ　ＡＡＧ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＴＴＡ　Ｔ ＧＣＡＣＡ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＣＭ　ＡＣＡ　ＡＣＴＣＡＴ　ＧＡＴ　ＡＴＡ　 ＡＴＡ　ＴＴＡ　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＴＡＣＴＧＣＡＡＧ　ＣＡＡ　ＣＡ Ｇ　ＴＴＡＴＴＴ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＴＡＴ 　ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＴＡＴ　ＴＧＴ　ＴＡＴ　ＡＧＴＴＡＴ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　 ＡＣＡ　ＴＴＡ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＣＡＡ　ＴＡＣＡＡＣＡＡＡ　ＣＣＧ　ＴＴ Ｇ　ＴＧＴＴＴＧ　ＴｒＡ　ＡＴＴ　ＡＧＧ　ＴＧＴ　ＡＴＴ　ＭＣＴＧＴ　Ｃ Ｍ　ＭＧ　ＣＣＡ　ＣＴＯＴＧＴ　ＣＣＴＡＧＧ　ＧＧＴ　ＣＧＧ　ＴＧＧ　Ａ ＣＣＧＧＴ　ＣＧＡ　ＴＧＴ　ＡＴＧ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＴＧＣＡＧＡ　ＴＣＸ ＡＧＡ　ＡＣＡ　ＣＧＴ　ＡＧＡ　ＧＭ　ＡＣＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＴＡＡＴＣＡ ＴＧ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＡＣＡＣＣＴ　ＡＣＡ　ＴＴＧ　ＣＡＴ　ＧＭ 　ＴＡＴ’　ＡＴＧ　’Ｉ？Ａ　ＧＡＴ　ＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　Ａ ＣＡＧＡＴ　ＣＴＣＴＡＣＴＧＴ　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＣＭ　ＴＴＡ　ＭＴ　ＧＡ Ｃ（２）配列番号２についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝４８３ ＣＢ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　二重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし く■１）起源： （Ａ）生物；　Ｐａｐｏｖｉｒｉｄｉａｅ、ヒト乳頭腫ウィルス（Ｂ）株、１８ （ｖｉｉｉ）　ゲノム中における位置 （Ａ）染色体／セグメント （ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー・　Ｅ６／Ｅ７ボリペプチドをコードするウィルスゲノムの一 部分 （Ｘ）刊行物情報・ （Ａ）著者：　Ｃｏ１ｅ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｄａｎｏｓ、　０゜（Ｂ）標題：　 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　 Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｐａｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｔ ｙｐｅ　１８　Ｇｅｎｏｍｅ（Ｃ）雑誌芯：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｄ）巻・　１９３ （Ｅ）発行： （Ｆ）頁：　５９９−６０８ （Ｇ）日（寸、＋９８７ （ｘｉ）　配列の記述　配列番号・２ ＡＴＧ　ＧＣＧ　ＣＧＣＴＴＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＣＧＧ　Ｃ ＧＡ　ＣＣＣＴＡＣＭＧ　ＣＴＡ　ＣＣＴＧＡＴ　ＣＴＧ　ＴＧＣＡＣＧ　ＧＡ Ａ　ＣＴＧ　ＡＡＣＡＣＴ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＧＡＣＡＴＡ　ＧＡＡ　 ＡＴＡＡＣＣＴＧＴ　ＧＴＡ　ＴＡＴ　ＴＧＣＡＡＧ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＴＴＧ 　ＧＭ　ＣＴＴ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＴＴＴＧＭ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＴＴ Ｔ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＴＴＡ　ＴＩ’Ｔ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＴＡＴ　ＡＧＡ　Ｇ ＡＣＡＧＴ　ＡＴ八へＣＧ　ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＴＧＣＣＡＴ　ＡＡＡ　 ＴＧＴ　ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＡＴＴＡＧＡ　Ｇ Ｍ　ＴＴＡ　ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＣＴＣＴ　ＧＴＧ　ＴＡＴ 　ＧＧＡ　ＧＡＣＡＣＡ　ＴＴＧＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＴＡ　ＡＣＴ　ＡＡＣＡＣ Ｔ　ＧＧＧ　ＴＴＡ　ＴＡｃＡＡＴ　ＴｒＡ　ＴＴＡ　ＡＴＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣ ＣＴＧ　ＣＧＧ　ＴＧＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＣＣＧ　ＴＴＧ　ＡＡＴ　ＣＣＡ　Ｇ ＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＣＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＡＡ Ａ　ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＴＴＴ　ＣＡＣＡＡＣＡＴＡ　ＧＣＴ　ＧＧＧ　、ＣＡＣ ＴＡＴ　ＡＧＡＧＧＣＣＡＧ　ＴＧＣＣＡＴ　ＴＣＧ　ＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＧ Ａ　ＧＣＡ　ＣＧＡ　ＣＡＧ　ＧＭ　ＣＧＡ　ＣＴＣ（２）配列番号３について の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：８９ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）分子型：　他の核酸、合成りＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティヵル配列：　 なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー・　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ１５．　ファージＴ７のＲＮＡの５゛末端にあるポ リメラーゼ結合部位、ＨＰ　Ｖ　１６／１８配列がこれに続く（ｘｌ）配列の記 述、　配列番号＝３ ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＧＣＴＴＴ　ＴＣＴＴ ＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧＣＴ（２）配列番号４についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ：２３ （Ｂ）型、　核酸 （Ｃ）鎖の数、　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶＩ９゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝４ＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧ　ＧＡＣＣＣＡＣ ＡＧＧ　ＡＧＣ２３（２）配列番号５についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２４ （Ｂ）型、　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型。

（Ａ）記述、　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス・　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ２０゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝５ＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴ　ＡＣＴＧＣＡＡ ＧＣＡ　ＡＣＡＧ　２ｕ（２）配列番号６についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２３ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列、　なしくｉｖ）　アンチセンス、　なし くｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー、ＨＰＶ２９゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号、６ＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧ　ＣＴＧＣＡＡＡ ＣＡＡ　ＣＴＡ　２３（２）配列番号７についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ、２２ （Ｂ）型・　核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）　分子型゛ （Ａ）記述、　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしく１ｖ）アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ３２゜ （Ｘｌ）配列の記述：　配列番号ニア ＣＡＣＴＴＣＡＣＴＧ　ＣＡＡＧＡＣＡＴＡＧ　ＡＡ　２２（２）配列番号８に ついての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４６ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型。

（Ａ）記述、　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列、　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー　ＨＰＶ’＋８゜ （Ｘｌ）配列の記述：　配列番号、８ ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＧ　ＣＡＣＴＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＧＴＧＴ　ＣＴＣ ＣＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＴＣ（２）配列番号９についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２５ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）　ｊｉの数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしく１ｖ）アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ５３゜ （ｘｌ）配列の記述：　配列番号・９ ＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴ　ＡＣＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧ　２５（２）配列番号 １０についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４９ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス；　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ５４゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝１０（２）配列番号１１についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２１ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ６９゜ （ｘｉ）　配列の記述、　配列番号：１１ＣＴＧＡＡＣＡＣＴＴ　ＣＡＣＴＧＣ ＡＡＧＡ　Ｃ２１（２）配列番号１２についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２３ （Ｂ）型、　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）分子型・ （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ７３゜ （ｘｌ）配列の記述：　配列番号：１２ＣＡＧＴＴＡＴＧＣＡ　ＣＡＧＡＧＣＴ ＧＣＡ　ＡＡＣ、２３（２）配列番号１３についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　２３ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列；　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ７４゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝１３ＧＴＴＡＴＧＣＡＣＡ　ＧＡＧＣＴＧ ＣＡＡＡ　ＣＡＡ　２３（２）配列番号］４についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２０ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ７７゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝１１＋ＣＡＡＧＣＡＡＣＡＧ　ＴＴＡＣＴ ＧＣＧＡＣ２０（２）配列番号１５についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２０ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰ　ＶＢ２゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号：１５ＡＧＣＡＡＣＡＧＴＴ　ＡＣＴＧＣＧ ＡＣＧＴ　２０（２）配列番号１６についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２３ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列；　なしく１ｖ）アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ９０゜ （ｘｉ）　配列の記述；　配列番号＝１６ＧＣＡＣＡＧＡＧＣＴ　ＧＣＡＡＡＣ ＡＡＣＴ　ＡＴＡ　２３（２）配列番号１７についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２３ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（１ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ９Ｌ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝１７ＡＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣ ＴＡＴ　ＡＣＡ　２３（２）配列番号１８についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝５１ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ９２゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号：１８ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ ＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＣＴＴＴＴ　ＣＴＴＣＡＧＧＡＣＡ　ＣＡＧＴＧＧＣＴＴＴ 　Ｔ（２）配列番号１９についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝５０ （Ｂ）盟：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジｍ：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティヵル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ９３゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝１９ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ ＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧ　ＧＡＣＡＣＡＧＴＧＧ（ ２）配列番号２０についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：５０ （Ｂ）盟：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ９１１゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号：２゜（２）配列番号２１についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：５０ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー　ＤＮＡ合成装置 （ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ９５゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝２１（２）配列番号２２についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：５０ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー、　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述コ　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティヵル配列ｚ　なしくｉｖ）　アンチセンス、　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ９６゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号：２２（２）配列番号２３についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２３ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）　ｊｌＯ数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ＋０１゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号：２３ＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡ　ＡＣＡＡＣＴ ＡＴＡＣＡＴＧ　２３（２）配列番号２８についてのｆｆ１報（ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ・　１１９ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数、　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）分子型・ （Ａ）記述　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ１０６゜ （ｘｉ　）　配列の記述：　配列番号：２４（２）配列番号２５についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、Ａｌ９ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）　＠の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述、　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティヵル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス、　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶｉ０７゜ （Ｘｌ）配列の記述：　配列番号＝２５ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＴＧＴＡ　ＧＧＴＧＴＡＴＣＴ（２） 配列番号２６についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２３ （Ｂ）型、　核酸 （Ｃ）鎖の数：　一本紙 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型゛ （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセテイカル配列：　なしく１ｖ）アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー、ＤＮＡ合成装置 （１ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ１１８゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号：２６ＡＧＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡ ＣＡＴ　ＧＡＴ　２３（２）配列番号２７についての情報 ＜ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝ｌＪ９ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数、　一本紙 （Ｄ）トポロジー、　直鎖状 （ｉｉ）　分子型。

（Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス、　なし くｖｉｉ）　直接起源・ （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ１２０．　５’　末端におけるファージＴ７のＲＮ Ａポリメラーゼ結合部位。ＨＰＶ−１６／１８配列がこれに続く（ｘｉ）　配列 の記述、　配列番号：２７（２）配列番号２８についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝４８ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　一本紙 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列・　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ１２９゜ （ｘｉ）　配列の記述・　配列番号：２８ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣ ＴＡＴ　ＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴ　ＡＧＧＴＧＴＡ：ｒｃＴ　ＧＧＡＴＧＣＡＴ　 ４８（２）配列番号２９についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ、２３ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　一本紙 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述、　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列、　なしくｉｖ）　アンチセンス・　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー　ＤＮＡ合成装置 （ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー　ＨＰＶ１３Ｌ （ｘｌ）配列の記述；　配列番号、２つＡＡＡＣＡＡＣＴＡＴ　ＡＣＡＴＧＡＴ ＡＴＡ　ＡＴＡ　２３（２）配列番号３０についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ、４９ （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数：　一本紙 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型。

（Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（１ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：　ＨＰＶ１３６．　５″末端におけるファージＴ７のＲＮＡ ポリメラーゼ結合部位。ＨＰＶ−１６／１Ｂ配列がこれに続く（ｘｉ）　配列の 記述：　配列番号；３０ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ：ＡＣＴＡＴ　ＡＧＧ ＧＡＡＴＧＴＡ　ＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＡ（２）配列番号３］ についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、４つ （Ｂ）盟・　核酸 （Ｃ）鎖の数二　一本紙 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）分子型・ （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列、　なし（ｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（１ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー　ＨＰＶＩ３７゜ （Ｘｌ）配列の記述：　配列番号：３１ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴ　ＡＧＧＧＡＴＧＴＡＧ　ＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＡＴＧＡＴ（２） 配列番号３２についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２１ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス、　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー・　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー　ＨＰ　Ｖ２１１５゜（ｘｉ）　配列の記述：　配列番号、３ ２ＴＧＡＡＴＴＡＡＣＴ　ＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡ　２１（２）配列番号３３に ついての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２７ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジｍ：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＣＡ　Ｐ　２５０゜（ｘｉ）　配列の記述：　配列番号： ３３ＴＧＴＡＴＴＡＡＣＴ　ＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡ　２７（２） 配列番号３４についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝３１ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）　ｊＪＩの数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー　ＤＮＡ合成装置 （ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＣＡＰ２５３゜ （Ｘｌ）配列の記述：　配列番号・３４ＴＧＴＡＴＴＡＡＣＴ　ＧＴＣＡＡＡＡ ＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　Ａ　３＋（２）配列番号３５についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、２＋４ （Ｂ）型・　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）分子型。

（Ａ）記述、　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（１ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：　ＣＡＰ２６５゜ （ｘｌ）配列の記述・　配列番号：３５ＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴ ＡＡ　ＡＡＡＡ　３１１（２）配列番号３６についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２４ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）　ｌの数、　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型・ （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列、　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー　ＤＮＡ合成装置 （１ｘ）特徴 （Ａ）名称／キー：ＣＡＰ２６７゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝３６ＧＴＧＣＣＴＧＣＧＧ　ＴＧＣＣＡＧ ＡＡＡＡ　ＡＡＡＡ　２１１（２）配列番号３７についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数、　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス、　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー・　ＤＥＴ５９゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号：３７ＧＡＣＡＧＴＡＴＴＧ　ＧＡＡＣＴＴ ＡＣＡＧ　２０（２）配列番号３８についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２１ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述、　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス、　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー　ＤＮＡ合成装置 （ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＤＥＴ９８゜ 特表千７−５０８８９１　（１８） （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号＝３８ＴＴＡＧＡＡＴＧＴＧ　ＴＧＴＡＣＴ ＧＣＡＡ　Ｇ　２１（２）配列番号３９についての情報 （１）配列の特徴 （Ａ）長さ：２１ ＣＢ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー、　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス；　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＤＥＴ２５５゜ （ｘｌ）配列の記述：　配列番号＝３９ＣＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴ ＧＡ　Ｇ　２１（２）配列番号ｉｌＯについての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティヵル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源・ （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＤＥＴ２５６゜ （ｘｉ）　配列の記述、　配列番号、４０ＴＴＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＡＧＧＴ 　１７（２）配列番号４１についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１８ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）　ｊｉＯ数、　−重鎖 （Ｄ）トポロジー、　直鎖状 （１１）分子型： （Ａ）記述・　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス−なし くｖｉｉ）　直接起源 （Ａ）ライブラリー　ＤＮＡ合成装置 （ＩＸ）特徴 （Ａ）名称／キー、ＤＥＴ２６０゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号：４１ＧＴＡＴＡＴＴＧＣＡ　ＡＧＡＣＡＧ ＴＡ　１８（２）配列番号４２についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源。

（Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＰＨＣ２７１゜ （ｘｉ）　配列の記述：　配列番号：４２ＴＧＴＣＴＴＧＣＡＡ　ＴＡＴＡＣＡ ＡＡＡＡ　２０（２）配列番号４３についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ、２１ （Ｂ）型、　核酸 （Ｃ）　Ｉの数−−重鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｉ）　分子型： （Ａ）記述：　他の核酸、合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：　なしくｉｖ）　アンチセンス：　なし くｖｉｉ）　直接起源： （Ａ）ライブラリー：　ＤＮＡ合成装置（ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　Ｐ　ＨＣ２７２゜（ｘｌ）配列の記述：　配列番号：ｌｌ ３ＣＴＣＡＣＧＴＣＧＣＡＧＴＡＡＡＡＡＡＡ　Ａ　２１（２）配列番号４１１ についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２５ （Ｂ）型：　核酸 （Ｃ）鎖の数二　−重鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｘｌ）配列の記述：　配列番号＝４４ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴ　ＡＧＧＧＡ　２５ｔｏ／３ＰＡＵＬＳｘＴ　１５°／、５ＯＲＥ３＋３１ 　１１８ １’３４−ｂ　１３６−９０１３６−７４　１３６−７、）（Ｃ−１４４９８２ ＰＭ　Ｏ，＋９３　０．５３２　０．５８４　２．９３２０．０９３一丁 ９２−９１−−ｆ− ◆Ｔ Ｔ −丁 ９６−９１””−ｍ　ｅ／ 十丁 一丁 一丁 ９５−９１　−一　拳−―　−■Ｉ ４Ｔ Ｔ −丁 ２時間　３ＳＲ ７Ｐ度　４５・ＣＩｓ　Ｂｅ　３３０／ＮＨＥＬＡ　Ｉ　ＦＭ ｌｏ”ＣＩ、５時間 Ｂ５１ ＮＡＳｅ ＳＩＨ０１Ｑ’／ｃ、ＤＭＳＯ１０％ＰＥＧ　ｔｏ°７０ＧＬＹ・丁 捕捉プローブ２４５最適温度 温度 −ＤＥＴ　２５１　＋ＤＥＴ　２５２→←ＤＥＴ　２５４捕捉ブＯ−ブ２５０最 適、星度 温度 ＤＥＴ　２５１　＋ＤＥＴ２５２−惨−ＤＥＴ　２５４捕捉プローブ２４０を用 いた 温度 −ＤＥＴ　９８→ＤＥＴ　２５１→−ＤＥＴ　２５２−←ＤＥＴ　２５４温度 −ＤＥＴ　９Ｂ　−ＤＥＴ　２５１−１−ＤＥＴ　２５２−ＤＥＴ　２５４ＨＰ Ｖ捕捉及び検出プローブ 捕捉ブロープロ２４５四２５００２５３ＨＰＶ１６検出ブロ一ブハイブリダイゼ ーシコン温度捕捉プローブ２５〇 一９８３°アミノ−４−２５４５”チオ＋２５１５’チオ−Ｉｌｌ−２５５３’ アミノ−＋４−２５６３°アミノ÷２５６５°チオ−４−２５７Ｆｉｇ、１８ ＨＰＶ１６検出プローブハイブリダイゼーション温度捕捉プローブ２５０ 検出プローブ ー＋２５６−←２５７ １’４Ｂ　＝Ｉ！１ＢｓＡ、　０．１！１ＰＶＰ、　５　Ｘ５ＳＣ５Ｐ／１８　 ＝５％ＰＥＧ、　＋％ＢＳＡ、　Ｏ，Ｉ％ＰＶＰ、　５ｘＳＳＣ２＋４−２４７ （−Ｔ） １度対信号 ビオチン化補捉オリゴ ストレブトアビノン １５％−−一１、　行７ ５９（旧）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．頚管の異形成、悪性腫瘍細胞又は前癌細胞と関連したヒト乳頭腫ウイルスの タイプのうち少なくとも１つによってコードされたメッセンジャーＲＮＡを含有 すると疑われるヒト標本のアッセイであって、 （１）該標本を、少なくとも１０個のヌクレオチドによって分離された２つのプ ライマーであってそれらのうち少なくとも１つが転写プロモーターを含むもので あるプライマーを利用して、自己保持配列転写によって核酸増幅に付し、 該第１のプライマーを該メッセンジャーＲＮＡの標的領域上のその相補的配列に アニーリングさせ、補因子とヌクレオチド三リン酸との存在下に鎖延長ポリメラ ーゼの作用によって該プライマーの３′末端を延長させ、 形成されたばかりのＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を酵素リポヌクレアーゼＨ の作用によって消化し、該第２のプライマーを、該得られた一本鎖ｃＤＮＡ上の その相補的配列にアニーリングさせ、鎖延長ポリメラーゼの作用によって該プラ イマーの３′末端を延長させ、 ヌクレオシド三リン酸の存在下に転写酵素によって該二本鎖ＤＮＡを転写し、そ して、 この新たに合成された転写物を新たな標的として利用して増幅を反復し、 （２）増幅されたメッセンジャーＲＮＡを遊離の、ビオチン化した、該増幅され たＲＮＡの第１の部分に相補的である配列を有する試薬捕捉プローブに溶液中に おいてハイプリダイズさせて試薬捕捉複合体を形成し、 （３）固相の表面に共有結合により結合させたストレプトアビジンと該捕捉プロ ーブのビオチン残基の反応によって該捕捉複合体を該固相に取り付け、 （４）該結合させた捕捉複合体を洗浄して未結合及び未反応の試薬を除去し、 （５）ウイルスのタイプに特異的な、レポーターを接合させた、該増幅されたＲ ＮＡの第２の部分に相補的であって第１のそのようなＲＮＡ部分の配列と重なら ない配列を有する検出プローブをハイプリダイズさせて固相結合捕捉プローブ− 標的配列−検出プローブ複合体を形成し、 （６）該複合体を洗浄してハイプリダイズしなかった検出プローブを除去し、そ して （７）蛍光原性又は色原性の酵素基質を加えそして該接合させた酵素を反応させ て検出可能な蛍光体又は色原体を生成させること、を含む方法。 ２．頚管標本中の、頚管の異形成又は前癌若しくは悪性腫瘍細胞に関連したヒト 乳頭腫ウイルスを検出するためのアッセイであって、 （１）該標本中に含有されるウイルスのＥ６／Ｅ７領域に含まれる標的たるヒト 乳頭腫ウイルスメッセンジャーＲＮＡをコードする配列を自己支持配列複製によ って増幅し、（２）該増幅されたメッセンジャー配列を、液体ハイブリダイゼー シヨンによって、それに相補的な配列を有するビオチン化された捕捉プローブに よって捕捉し、 （３）該ハイブリダイズされた捕捉プローブをストレプトアビジンで被覆した固 相と反応させ、 （４）洗浄して未結合のハイブリダイズされた捕捉プローブを除去し、 （５）検出プローブを該標的配列にハイプリダイズさせ、（６）該固相を洗浄し 、そして （７）該検出プローブを検出すること、を含むアッセイ。 ３．頚管標本中の、頚管の異形成又は前癌若しくは悪性腫瘍細胞に関連したヒト 乳頭腫ウイルスを検出するためのアッセイであって、 （１）該標本中に含有されている、ヒト乳頭腫ウイルスタイプのそれぞれＥ６／ Ｅ７遺伝子又はそれらの一部分をコードしている配列を有する複数の腫瘍原性の ヒト乳頭腫ウイルスタイプのメッセンジャーＲＮＡを同時増幅し、 （２）該増幅されたメッセンジャーＲＮＡ配列を、それに相補的な配列を有する ビオチン化された捕捉プローブにより液体ハイブリダイゼーションによって捕捉 し、 （３）該ハイプリダイズされた捕捉プローブをストレプトアビジンで被覆した固 相と反応させ、 （４）洗浄して未結合のハイプリダイズされた捕捉プローブを除去し、 （５）検出プローブを該標的配列にハイブリダイズさせ、（６）該固相を洗浄し 、そして （７）該検出プローブを検出すること、を含むアッセイ。 ４．該捕捉プローブがＣＡＰ２４５、ＣＡＰ２５０、ＣＡＰ２５３、ＣＡＰ２６ ５及びＣＡＰ２６７よりなる群より選ばれるものである、請求項１、２又は３の アッセイ。 ５．自己支持配列複製のための該ヒト乳頭腫ウイルス１６のプライマーが、ヒト 乳頭腫ウイルス１６の、１２０−２９、１２０−９０、１５−１９、１５−２０ 、１５−７７、１５−５３、１５−８９、１５−２９、１２９−２９、１２９− ７４、１２９−７３、１２９−１１８、１２９−１３０、１２９−１３１、１３ ６−９１、１３６−２９、１３６−９０、１３６−７４、１３６−７３、１３６ −１３０、１３７−２９、１３７−９０、１３７−７４、１３７−７３、１３７ −１１８、９３−７３、９３−９１、８５−７７、９５−１０１、９５−９１、 ９６−９１、９６−７３、１３６−１３１、９４−９１よりなるプライマー対の 群より選ばれるものである、請求項１のアッセイ。 ６．該検出プローブがＤＥＴ２５６、ＤＥＴ２５５、ＤＥＴ９８及びＤＥＴ２６ ０よりなる群より選ばれるものである、請求項１、２又は３のアッセイ。 ７．頚管の異形成又は前癌性の若しくは悪性腫瘍頚管細胞に関連したヒト乳頭腫 ウイルス１６のＥ６／Ｅ７領域の自己支持配列増幅のためのプライマー対であっ て、１５−１９、１５−２０、１５−７７、１５−５３、１５−８９、１５−２ ９、１３６−９１、１３６−２９、１３６−９０、１３６−７４、１３６−７３ 、１３６−１３０、１３６−１３１、１３６−１１８、９６−９１、９６−７３ 、及び９４−９１よりなるプライマー対。 ８．ヒト乳頭腫ウイルスＥ６／Ｅ７領域の増幅されたＲＮＡ標的配列を捕捉する ための、ＣＡＰ２６５及びＣＡＰ２６７よりなる捕捉プローブ。 ９．ＤＥＴ２５６、ＤＥＴ２５５、ＤＥＴ９８及びＤＥＴ２６０の配列を有する 、酵素を接合させたプローブよりなる、ヒト乳頭腫ウイルスのＥ６／Ｅ７領域に ハイプリダイズする検出プローブ。 １０．頚管の異形成又は前癌性の若しくは悪性腫瘍細胞に関連したヒト乳腺種ウ イルス１８のＥ６／Ｅ７領域の自己支持配列増幅のためのプライマー対であって 、５４−６９、５４−７０、５４−３２よりなるプライマー対。 １１．自己支持配列複製のための該ヒト乳頭腫ウイルス１８プライマーが、５４ −３２、５４−６９、５４−７０、４８−３２、２１４−６９、２１４−２４４ 、２１４−２１４、２１４−７０よりなるプライマー対の群より選ばれるもので ある、請求項１のアッセイ。 １２．請求項７又は１０のいずれかのプライマー対と請求項８のいずれかの捕捉 プローブとそして請求項９のいずれかの検出プローブとを含む、頚管の異形成、 前癌性の又は悪性の頚管細胞に関連したヒト乳頭腫ウイルスの検出のためのキッ ト。 １３．自己支持配列複製による該核酸増幅が熱的保護剤の存在下に約５０℃の高 められた温度において実施されるものである、請求項１のアッセイ。 １４．該標的ＲＮＡの該増幅が熱的保護剤の存在下に約５０℃の高められた温度 において実施されるものである、請求項２のアッセイ。 １５．該複数のＲＮＡの該同時増幅が熱的保護剤の存在下に約５０℃の高められ た温度において実施されるものである、請求項３のアッセイ。 １６．該患者サンプルがヒト乳頭腫ウイルス１６又は１８のＥ６／Ｅ７スプライ ス領域によってコードされたメッセンジャーＲＮＡを含有すると疑われるもので ある、請求項１のアッセイ。 １７．該ウイルスのＥ６／Ｅ７領域がヒト乳頭腫ウイルス１６又は１８からのも のである、請求項２のアッセイ。 １８．該Ｅ６／Ｅ７遺伝子をコードしている該配列がヒト乳頭腫ウイルス１６又 は１８の該Ｅ６／Ｅ７スプライス領域に特異的である、請求項３のアッセイ。