JP5542439B2 - 核酸増幅判定方法および核酸増幅判定装置 - Google Patents

Description

本発明は、核酸増幅判定方法、核酸増幅判定システム、核酸増幅判定装置、前記判定方法をコンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラムならびにそれを格納した電子媒体に関する。

近年、遺伝子の多型や変異等を検出する方法として、標的核酸とプローブとから形成される二本鎖核酸の融解曲線を解析する方法（融解曲線解析方法）が広く採用されている。前記融解曲線解析方法によれば、前記融解曲線について、前記二本鎖の融解温度（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）におけるピークの有無を解析することで、遺伝子の多型（遺伝子型）の判断や変異の有無の検出が可能になる。

Ｔｍは、一般的に、以下のように定義されている。二本鎖核酸を含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖核酸における両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖核酸に解離（二本鎖核酸の融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖核酸が解離して一本鎖核酸になると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖核酸のみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍ（℃）とは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。

二本鎖核酸のこのような特性を利用すれば、例えば、以下のようにして標的部位における多型や変異の検出が可能である。すなわち、変異型の標的部位を含む標的核酸配列に相補的な変異型検出用プローブを用いて、分析対象の一本鎖核酸と前記プローブとの二本鎖核酸を形成させ、形成された二本鎖核酸に加熱処理を施し、温度上昇に伴う二本鎖の解離を吸光度等のシグナル測定により検出し、この検出結果に基づいてＴｍ値における前記シグナルの挙動によって、標的部位における変異の有無を判断する方法である（非特許文献１、特許文献１参照）。Ｔｍ値は、二本鎖核酸の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。そこで、変異型の標的部位を含む標的核酸配列とそれに１００％相補的な変異型検出用プローブとの二本鎖ＤＮＡ、および、前記標的部位が野生型である核酸配列と前記変異型検出用プローブとの二本鎖ＤＮＡのそれぞれについて、予め評価基準となるＴｍ値を求めておく。前述のように、相同性が高い程Ｔｍ値は高くなるため、前者、すなわち標的部位が変異型である場合のＴｍ値（以下、「Ｔｍ_ｍ値」ともいう）は、相対的に高く、後者、すなわち標的部位が野生型である場合のＴｍ値（以下、「Ｔｍ_ｗ値」ともいう）は、相対的に低くなる。そして、分析対象の一本鎖核酸と前記変異型検出用プローブとから形成される二本鎖核酸の融解曲線を作成し、予め求めたＴｍ_ｍ値およびＴｍ_ｗ値のいずれにシグナルのピークが存在するかを確認する。その結果、Ｔｍ_ｍ値付近にピークが存在する場合、前記変異型検出用プローブと１００％マッチしているため、分析対象の一本鎖核酸は、変異型の多型であると判断できる。他方、Ｔｍ_ｗ値付近にピークが存在する場合、前記変異型変異用プローブと１塩基ミスマッチしているため、分析対象の一本鎖核酸は、野生型の多型であると判断できる。また、多型が、ホモ接合性であるか、ヘテロ接合性であるかについても判断することができる。すなわち、一対の対立遺伝子の分析において、Ｔｍ_ｍ値付近とＴｍ_ｗ値付近の両方においてピークが存在する場合、ヘテロ接合性と判断でき、他方、Ｔｍ_ｍ値付近にのみピークが存在する場合は、変異型のホモ接合性であり、Ｔｍ_ｗ値付近にのみピークが存在する場合は、野生型のホモ接合性であると判断することができる。

このような融解曲線解析を行うにあたっては、通常、ＲＮＡやＤＮＡを含むサンプルについて、前記標的核酸配列の増幅処理を行い、得られた増幅産物について、前述のようなプローブとの二本鎖形成や加熱による解離が行われる。しかしながら、増幅処理において前記標的核酸配列を十分に増幅できなかった場合、多型を誤判断するという問題がある。そこで、従来法では、前記増幅処理後のサンプルについて、各温度と、前記各温度におけるサンプルの融解状態を表すシグナル値またはシグナル値の微分値（以下、「シグナル微分値」という）との関係を示す融解曲線のグラフを作成し、目視によって、前記標的核酸配列のＴｍ_ｍ値またはＴｍ_ｗ値付近にピークが存在するか否かを判断していた。しかし、このような遺伝子解析における判断には、専門的知識が必要とされるため、例えば、容易にピークか否かを判断することが困難である。また、目視判断の場合、判断基準に個人差が生じることも問題視されている。このため、従来の方法では、核酸増幅が正常に行われていないサンプルについても、最終的な融解曲線解析まで行うことになり、労力が問題視されている。また、このような理由から、一般的な分析や診断の現場に、融解曲線解析を利用した遺伝子分析・遺伝子診断の用途を広げることが難しい状況である。さらに、複数の検体を一括に分析することも、その専門性等から困難となっている。
クリニカル・ケミストリー、２０００年、第４６号、第５号、ｐ６３１‐６３５、 特開２００５−５８１０７号公報

そこで、本発明は、核酸増幅処理が行われた処理後のサンプルについて、目的核酸の増幅が行われたか否かを判断することが可能な増幅判定方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、そのような増幅判定方法を実行するための増幅判定システム、増幅判定装置、プログラムおよび電子媒体の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の増幅判定方法は、核酸増幅処理が行われた処理後のサンプルについて、目的核酸の増幅が行われたか否かを判定する増幅判定方法であって、
各温度における前記処理後サンプルの融解状態を示すシグナル値を準備するシグナル値準備工程、
前記各温度における前記シグナル値から、最大値（Ａ）を検索する最大値（Ａ）検索工程、
前記各温度における前記シグナル値について、連続するシグナル値間の微分を行って微分値を得る微分演算工程、
前記工程において得られた微分値について、連続する微分値間の微分を行って二回微分値を得る二回微分演算工程、
前記工程において得られた二回微分値のうち、前記目的核酸のＴｍ値を含む所定の温度範囲における二回微分値から、最大の二回微分値（Ｄ_ｍａｘ’）と最小の二回微分値（Ｄ_ｍｉｎ’）とを選択し、下記式から二回微分値の最も大きい差（Ｂ）を得る最大差（Ｂ）演算工程、
Ｂ＝（Ｄ_ｍａｘ’）−（Ｄ_ｍｉｎ’）
前記最大値（Ａ）および前記最大差（Ｂ）を用いて下記式の演算を行う演算工程
Ｘ＝（Ｂ）／（Ａ）
および
前記Ｘが［Ｘ＞所定閾値］を満たす場合、増幅が正常であると判断し、前記Ｘが［Ｘ≦所定閾値］を満たす場合、増幅が不良であると判断する判定工程
を含むことを特徴とする。

本発明によれば、前述のような二回微分等の演算を利用することにより、目的核酸の増幅が行われたか否かを容易に判定できる。このため、例えば、従来のように、判定を行う個人の判定基準の違いや、専門的知識が必要とされるというような問題を回避することが可能となる。また、目的核酸の増幅の有無を容易に判断できることから、例えば、遺伝子型の誤判断の原因となる増幅不良を示すサンプルについては、それ以降の融解曲線解析を中止できる。これにより、最終的に、融解曲線解析をより容易に、高い信頼性で行うことが可能となる。特に、従来の遺伝子解析装置等に本発明のシステムを組みこむことで、例えば、増幅の有無の確認はもちろんのこと、核酸の増幅から遺伝子型の判断までを全自動化して行うことも可能となる。したがって、本発明は、例えば、一般的な分析や診断の現場においても使用の用途が広がり、多量の検体についても容易な解析を可能とすることから、特に、遺伝子解析の分野において、極めて有用な技術といえる。

図１は、本発明のシステムを用いたスタンドアローン型の装置の一例の全体構成図である。 図２は、本発明のシステムを用いたネットワーク利用型の装置の一例の全体構成図である。 図３は、前記スタンドアローン型の装置の機器構成の一例を示すブロック図である。 図４は、前記ネットワーク型の装置の機器構成の一例を示すブロック図である。 図５は、本発明のシステムを実施するためのフローチャートの一例である。 図６は、本発明の実施形態における融解曲線を示すグラフである。 図７は、本発明の実施形態における微分曲線を示すグラフである。 図８は、本発明の実施形態における二回微分曲線を示すグラフである。 図９は、本発明の実施形態におけるＸ＝（Ｂ）／（Ａ）を示すグラフである。

本発明において、サンプルの融解状態を示すシグナルは、例えば、前記サンプルの非融解によって発生し、前記サンプルの融解によって発生が抑制されるものでもよいし、反対に、前記サンプルの非融解によって発生が抑制され、前記サンプルの融解によって発生するものであってもよい。本発明において、シグナル微分値は、例えば、「ｄＦ／ｄＴ」で表してもよいし、「−ｄＦ／ｄＴ」で表してもよい。ｄＦは、シグナル値の変化量、ｄＴは、温度の変化量を示す。サンプルの融解によってシグナルの発生が抑制される場合、シグナル微分値を「ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは谷型となり、シグナル微分値を「−ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは山型となる。また、前記サンプルの融解によってシグナルが発生する場合、シグナル微分値を「ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは山型となり、シグナル微分値を「−ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは谷型となる。なお、シグナルがサンプルの融解および非融解のいずれで発生しても、また、シグナル微分値をいずれの式で表した場合も、ピークの大きさは、シグナル微分値の絶対値の大きさで評価可能である。

本発明において、シグナル値の種類は、特に制限されず、例えば、吸光度（吸収強度）、蛍光強度等があげられる。前記シグナルの具体例としては、例えば、前述のような、二本鎖の融解により増加する、２６０ｎｍにおける吸光度があげられる。また、前記シグナル値は、蛍光物質を使用した場合、前記蛍光物質に応じた励起光により放射される蛍光の強度であってもよい。前記蛍光物質は、前述のように、二本鎖の形成（非融解）により蛍光を発するものでも、二本鎖の融解により蛍光を発するものでもよい。蛍光物質の具体例として、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎのようなインターカレーターがあげられる。これらは、一般的に、二本鎖の形成（非融解）により蛍光を発し、二本鎖の融解によって蛍光の発生が抑制される。また、前記蛍光物質は、例えば、二本鎖核酸を構成する少なくとも一方の一本鎖核酸に結合していてもよい。前記蛍光物質が結合した一本鎖核酸としては、例えば、グアニン消光プローブとして知られているＱＰｒｏｂｅ（登録商標）のようないわゆる蛍光消光プローブがあげられる。前記蛍光消光プローブは、一般的に、二本鎖の形成により蛍光が消光し、二本鎖の融解によって蛍光が発生する。なお、本発明は、シグナル値の処理に特徴があり、シグナルの種類等には何ら制限されない。

＜増幅判定方法＞
本発明の増幅判定方法について、一例として、増幅させる目的核酸（以下、「標的核酸」という）が標的部位に多型を有する核酸であり、前記目的核酸のＴｍ値が、前記標的部位に多型を有する核酸と前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸（以下、「検出用核酸」という）とから構成される二本鎖核酸のＴｍ値である例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。

シグナル値準備工程
まず、各温度における前記処理後サンプルの融解状態を示すシグナル値を準備する。

前記シグナル値の温度間隔は、特に制限されないが、例えば、０．１〜５℃の間隔であり、好ましくは０．２〜３℃の間隔、より好ましくは０．８〜１．２℃の間隔である。また、前記温度間隔は、例えば、異なっていてもよいが、等間隔であることが好ましい。

シグナル値は、例えば、Ｔｍ値を含む温度範囲について準備することが好ましい。前記標的部位が多型を有する場合、後述するように、前記標的核酸と前記検出用核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍ値としては、相対的に高い温度のＴｍ_Ｈ値と相対的に低い温度のＴｍ_Ｌ値とが想定される。したがって、シグナル値は、例えば、Ｔｍ_Ｈ値およびＴｍ_Ｌ値の両方を含む広域の温度範囲について準備することが好ましい。前記温度範囲としては、例えば、下限が、Ｔｍ_Ｌ値よりも１〜２０℃低い温度であることが好ましく、より好ましくは、Ｔｍ_Ｌ値よりも１〜１０℃低い温度であり、上限が、Ｔｍ_Ｈ値よりも１〜２０℃高い温度であることが好ましく、より好ましくは、Ｔｍ_Ｈ値よりも１〜１０℃高い温度である。具体例として、前記温度範囲は、［Ｔｍ_Ｌ値−５］℃〜［Ｔｍ_Ｈ値＋５］℃であることが好ましい。

前記標的部位が多型を有する場合、前記標的核酸としては、前記標的部位が野生型である標的核酸（以下、「野生型標的核酸」という）と、前記標的部位が変異型である標的核酸（以下、「変異型標的核酸」という）とが考えられる。前記野生型標的核酸と変異型標的核酸とは、通常、前記標的部位において一塩基のみが異なることから、前記二本鎖核酸のＴｍ値としては、例えば、前記検出用核酸と１００％マッチする二本鎖のＴｍ_Ｈ値と、前記検出用核酸と１塩基ミスマッチする二本鎖のＴｍ_Ｌ値とがあげられる。Ｔｍ値は、二本鎖の相同性が相対的に高いほど高くなり、相対的に低いほど低くなることから、前者のＴｍ_Ｈ値は、後者のＴｍ_Ｌ値よりも高い温度となる。具体例として、例えば、変異型の標的部位にハイブリダイズ可能な検出用核酸（以下、「変異型検出用核酸」という）を使用する場合には、変異型標的核酸と前記変異型検出用核酸との二本鎖核酸のＴｍ値と、野生型標的核酸と前記変異型検出核酸との二本鎖核酸のＴｍ値とがあげられる。この場合、前者のＴｍ値がＴｍ_Ｈ値となり、後者のＴｍ値がＴｍ_Ｌ値となる。反対に、野生型の標的部位にハイブリダイズ可能な検出用核酸（以下、「野生型検出用核酸」という）を使用する場合には、野生型の標的核酸と前記野生型検出用核酸との二本鎖核酸のＴｍ値と、変異型の標的核酸と前記野生型検出核酸との二本鎖核酸のＴｍ値とがあげられる。この場合、前者のＴｍ値がＴｍ_Ｈ値となり、後者のＴｍ値がＴｍ_Ｌ値となる。なお、前記Ｔｍ値は、前記標的核酸の配列や前記検出用核酸の配列等に応じて適宜決定でき、具体的には、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）によって決定できる（以下、同様）。本実施形態において、前記処理後サンプルの融解状態を示すシグナル値とは、例えば、前記処理後サンプルにおける前記標的核酸の増幅物と前記標的核酸にハイブリダイズ可能な検出用核酸とからなる二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値ということもできる。

最大値（Ａ）検索工程
つぎに、前記各温度における前記シグナル値から、最大値（Ａ）を検索する。この際、最大値（Ａ）が検索できない場合は、増幅不良と判断できる。

微分演算工程
つぎに、前記各温度における前記シグナル値について、連続するシグナル値間の微分を行って微分値を得る。前記微分は、特に制限されないが、例えば、連続する２点間〜１０点間の微分であることが好ましく、より好ましくは、連続する２点間〜５点間であり、特に好ましくは連続する２点間の微分である。例えば、２点間の微分を行う場合、任意の点（ｐ）における微分値（Ｄ_ｐ）は、任意の点（ｐ）のシグナル値（Ｓ_ｐ）と近接する点（ｐ＋１）のシグナル値（Ｓ_ｐ＋１）との間における微分値でもよいし、任意の点（ｐ）のシグナル値（Ｓ_ｐ）と近接する点（ｐ−１）のシグナル値（Ｓ_ｐ−１）との間における微分値でもよいが、各点において、同様にして微分値を求めることが好ましい。前者の場合、ｐは、正整数であり、後者の場合、ｐは、２以上の正整数である。

二回微分演算工程
さらに、前記工程において得られた微分値について、連続する複数点間の微分を行って二回微分値を得る。前記微分値の微分は、例えば、連続する２〜１０点間で行うことが好ましく、より好ましくは、３〜７点間であり、さらに好ましくは、３〜５点間であり、特に好ましくは４点間である。具体例として、４点間の微分を行う場合、任意の点（ｐ）における二回微分値（Ｄ_ｐ’）は、例えば、下記例１〜例３のいずれであってもよいが、各点について、同様にして二回微分値を求めることが好ましい。任意の点（ｐ）の二回微分値（Ｄ_ｐ’）は、例１として、例えば、点（ｐ）、（ｐ＋１）、（ｐ＋２）、（ｐ＋３）の計４点間の微分により算出してもよく、例２として、点（ｐ−１）、（ｐ）、（ｐ＋１）、（ｐ＋２）の計４点間の微分により算出してもよく、例３として、点（ｐ−２）、（ｐ−２）、（ｐ）、（ｐ＋１）の計４点間の微分により算出してもよい。前記ｐは、前記例１の場合、正整数であり、前記例２の場合、ｐは、２以上の正整数であり、前記例３の場合、ｐは、３以上の正整数である。

最大差（Ｂ）演算工程
前記工程において得られた二回微分値のうち、前記増幅目的の核酸のＴｍ値を含む所定の温度範囲における二回微分値から、最大の二回微分値（Ｄ_ｍａｘ’）と最小の二回微分値（Ｄ_ｍｉｎ’）とを選択し、下記式から最大差（Ｂ）を得る。
（Ｂ）＝（Ｄ_ｍａｘ’）−（Ｄ_ｍｉｎ’）

前記所定の温度範囲としては、前記増幅目的の核酸のＴｍ値を含んでいればよいが、本実施形態においては、例えば、前述のように、Ｔｍ_Ｈ値およびＴｍ_Ｌ値の両方を含む温度範囲である。具体例として、前記温度範囲の下限は、Ｔｍ_Ｌ値よりも１〜２０℃低い温度であることが好ましく、より好ましくは、Ｔｍ_Ｌ値よりも１〜１０℃低い温度であり、さらに好ましくは、［Ｔｍ_Ｌ値−５］℃である。前記温度範囲の上限は、Ｔｍ_Ｈ値よりも１〜２０℃高い温度であることが好ましく、より好ましくは、Ｔｍ_Ｈ値よりも１〜１０℃高い温度であり、さらに好ましくは、［Ｔｍ_Ｈ値＋５］℃である。本工程においては、前記所定の温度範囲における二回微分値から、前記最大値と最小値とを選択すればよい。このため、例えば、前述の二回微分演算工程においては、前記所定の温度範囲の二回微分値を得るのみでも足りる。また、前述の微分演算工程においても、前記所定の温度範囲の二回微分値が得られる範囲で、微分値を得るのみでも足りる。

Ｘの演算工程
前記最大値（Ａ）および前記最大差（Ｂ）を用いて下記式の演算を行う。
Ｘ＝（Ｂ）／（Ａ）

判定工程
前記Ｘが［Ｘ＞所定閾値］を満たす場合、増幅が正常であると判断し、前記Ｘが［Ｘ≦所定閾値］を満たす場合、増幅が不良であると判断する。なお、本発明において、増幅が正常とは、例えば、標的核酸が増幅されており、信頼性ある遺伝子解析を行うことが可能と思われる状態を意味し、増幅が不良とは、例えば、増幅されていない、ほとんど増幅されていない、または、異なる核酸が増幅されている場合等であって、信頼性ある遺伝子型解析を行うことができない、もしくは、そのおそれがある状態を意味する。

前記閾値は、例えば、シグナルの種類、シグナルの検出波長、シグナル（蛍光）を発する蛍光物質の種類、増幅目的の核酸や前記核酸の標的部位における多型の種類、検出用核酸の配列、二本鎖核酸を形成する際の反応溶液組成等に応じて適宜設定できる。本発明は、閾値の具体的な値やその設定方法が特徴ではなく、それらによって制限されるものではない。なお、閾値の設定方法の一例については後述する。

本発明の増幅判定方法は、例えば、得られた判定結果の情報を出力する出力工程をさらに有することが好ましい。前記判定結果としては、例えば、増幅が正常か否かという項目があげられる。出力の際には、例えば、判定結果のみが出力されてもよいし、前記Ｘの値や、温度と微分値とがプロットされた融解曲線のグラフ、温度と二回微分値とがプロットされたグラフ等も、前記判定結果とともに出力されてもよい。

また、前記シグナル値準備工程におけるシグナル値は、例えば、予め検出により得られたデータを使用してもよいが、例えば、シグナル値準備工程に先立って、シグナル値の検出を行うことにより準備してもよい。具体的には、前記シグナル値準備工程に先立って、さらに、増幅処理後のサンプル（例えば、二本鎖核酸）の温度を変化させる温度変化工程、および、温度変化時における前記サンプルの融解状態を示すシグナル値を連続的または断続的に検出する検出工程を有してもよい。前記温度変化工程は、例えば、前記サンプルを加熱する加熱工程であってもよいし、加熱されたサンプルを冷却する冷却工程でもよいが、前記加熱工程が好ましい。

また、前記温度変化工程に先立って、サンプルの核酸増幅処理を行う核酸増幅工程を含んでもよい。この際、前述の検出用核酸は、例えば、核酸増幅処理後のサンプルに添加してもよいが、処理を連続的に行うことが可能であることから、核酸増幅処理に先立って、処理前のサンプルに前記検出用核酸を添加することが好ましい。

さらに具体的に、図６〜８に示すグラフを例にあげて、本発明の増幅判断方法を説明する。図６は、温度とシグナル値との関係を示すグラフ（融解曲線）、図７は、温度とシグナル微分値との関係を示すグラフ（微分曲線）、図８は、温度と二回微分値との関係を示すグラフ（二回微分曲線）である。図６において、Ｙ軸はシグナル値、図７において、Ｙ軸はシグナル微分値、図８において、Ｙ軸は二回微分値であり、各図において、Ｘ軸は温度である。また、相対的に低いＴｍ_Ｌ値を５０℃、相対的に高いＴｍ_Ｈ値を５６℃とし、前記最大差（Ｂ）演算工程における温度範囲を４５℃（Ｔｍ_Ｌ値−５℃）〜６１℃（Ｔｍ_Ｈ値＋５℃）に設定した。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。

図６に示すように、温度と各温度におけるシグナル値との関係を示すグラフを準備し、最大値（Ａ）を検索する。一方、図７に示すように、前記シグナル値の微分を行い、温度と各温度における微分値との関係を示すグラフを作成する。つぎに、図８に示すように、前記微分値を微分し、前記温度範囲４５〜６１℃と各温度における二回微分値との関係を示すグラフを作成する。続いて、前記図８のグラフにおいて、最大の二回微分値（Ｄ_ｍａｘ’）と最小の二回微分値（Ｄ_ｍｉｎ’）とを選択し、式（Ｂ）＝（Ｄ_ｍａｘ’）−（Ｄ_ｍｉｎ’）から二回微分値の最大差（Ｂ）を演算する。そして、前記最大値（Ａ）と前記最大差（Ｂ）を用いて式「Ｘ＝（Ｂ）／（Ａ）」の演算を行う。得られたＸが［Ｘ＞所定閾値］を満たす場合、増幅は正常と判断し、［Ｘ≦所定閾値］を満たす場合、増幅は不良と判断する。増幅が正常と判断された前記核酸増幅処理後のサンプルについてのみ、例えば、後述するような融解曲線解析を行い、多型の判定を行えばよい。

なお、前記図６〜８は、温度上昇による二本鎖核酸の解離に伴い、シグナル値が増加する例であるが、温度上昇による二本鎖核酸の解離に伴い、シグナル値が減少する場合においても、同様に、シグナル値の最大値（Ａ）、二回微分値の最大差（Ｂ）を求め、前記Ｘを演算することによって、増幅が正常であるか不良であるかを判断することができる。また、この例においては、３種類のグラフを例示したが、本発明においては、各種グラフの作成は必須ではない。

本発明において、前述のように、前記Ｘの閾値は何ら制限されず、標的核酸(遺伝子)の種類や多型の種類等に応じて適宜決定できる。以下に、閾値の設定方法について例示するが、本発明は、これに制限されない。

Ｘの閾値は、例えば、以下のようにして決定できる。まず、複数の核酸検体について核酸増幅処理を行い、目的の標的核酸の増幅が正常であるか不良であるかを確認する。そして、各核酸検体から得られた増幅物と検出用核酸との二本鎖について、各温度におけるシグナル値を検出し、前述と同様にして、前記最大値（Ａ）および前記最大差（Ｂ）の決定、ならびに、Ｘ＝（Ｂ）／（Ａ）の演算を行う。そして、各核酸検体についてのＸをプロットしたグラフを作成する。このグラフの一例を図９に示す。同図に示すように、増幅が正常であった核酸検体（■）と、増幅が不良であった核酸検体（◆）とでは、前記Ｘの値が明らかに異なる。そこで、このグラフから、増幅正常と増幅不良とのＸの臨界値を求め、前記閾値として決定すればよい。

本発明の増幅判定方法において、前記目的核酸は、前述のような、２つのＴｍ値が想定される前記標的部位に多型を有する標的核酸には限定されない。Ｔｍ値が１つの場合、前記最大差（Ｂ）演算工程における、Ｔｍ値を含む温度範囲は、例えば、下限が、Ｔｍ値よりも１〜２０℃低い温度であることが好ましく、より好ましくは、Ｔｍ値よりも１〜１０℃低い温度であり、さらに好ましくは、［Ｔｍ値−５］℃である。前記温度範囲の上限は、Ｔｍ値よりも１〜２０℃高い温度であることが好ましく、より好ましくは、Ｔｍ値よりも１〜１０℃高い温度であり、さらに好ましくは、［Ｔｍ値＋５］℃である。

本発明の増幅判定方法は、さらに、前記核酸増幅処理後のサンプルの融解曲線を解析して、所定の温度範囲にピークが存在するか否かを判定する融解曲線解析工程を含んでもよい。これによって、増幅正常と判断されたサンプルのみについて、融解曲線解析を行い、例えば、多型の解析（遺伝子型の解析）を行うことができる。このように、本発明の方法によれば、増幅不良なサンプルについての融解曲線解析を除外することができるため、従来よりも、より迅速に効率良く融解曲線解析を行うことができる。また、本発明が融解曲線解析工程を含むことによって、例えば、核酸増幅の判定から、増幅正常と判定されたサンプルについての融解曲線解析ならびに多型（遺伝子型）の判定までを、連続して行うことができる。このため、本発明の増幅判定方法は、例えば、融解曲線解析方法または多型解析方法（もしくは遺伝子型解析方法）ということもできる。

本発明の増幅判定方法は、例えば、後述する本発明の増幅判定システム、本発明の増幅判定装置、本発明のコンピュータプログラムの実行等によって実現できる。

＜増幅判定システム＞
本発明の増幅判定システムは、核酸増幅処理が行われた処理後のサンプルについて、目的の核酸の増幅が行われたか否かを判定する増幅判定システムであって、
各温度における前記処理後サンプルの融解状態を示すシグナル値を入力するシグナル値入力部、
前記シグナル値入力工程により入力された前記各温度における前記シグナル値から、最大値（Ａ）を検索する最大値（Ａ）検索部、
前記各温度における前記シグナル値について、連続するシグナル値間の微分を行って微分値を得る微分演算部、
前記微分演算部により得られた微分値について、連続する微分値間の微分を行って二回微分値を得る二回微分演算部、
前記二回微分演算部により得られた二回微分値のうち、前記増幅目的の核酸のＴｍ値を含む所定の温度範囲における二回微分値から、最も大きい二回微分値（Ｄ_ｍａｘ’）と最も小さい二回微分値（Ｄ_ｍｉｎ’）とを選択し、下記式から二回微分値の最も大きい差（Ｂ）を得る最大差（Ｂ）演算部、
Ｂ＝（Ｄ_ｍａｘ’）−（Ｄ_ｍｉｎ’）
前記最大値（Ａ）および前記最大差（Ｂ）を用いて下記式の演算を行う演算部
Ｘ＝（Ｂ）／（Ａ）
および
前記Ｘが［Ｘ＞所定閾値］を満たす場合、増幅が正常であると判断し、前記Ｘが［Ｘ≦所定閾値］を満たす場合、増幅が不良であると判断する判定部
を含むことを特徴とする。なお、特に示さない限り、前述の本発明の増幅判定方法と同様である。

本発明の増幅判定システムは、前記微分演算部において、例えば、連続する２点間の微分を行って微分値を得ることが好ましく、また、前記二回微分演算部において、例えば、連続する４点間の微分を行って二回微分値を得ることが好ましい。

本発明の増幅判定システムにおいて、前記目的核酸は、標的部位に多型を有する核酸であることが好ましい。そして、前記目的核酸のＴｍ値は、前記標的部位に多型を有する核酸（標的核酸）と前記検出用核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍ値であることが好ましい。前記検出用核酸が、野生型検出用核酸である場合、前記増幅目的の核酸のＴｍ値は、例えば、前記野生型標的核酸と前記野生型検出用核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍ_Ｈ値、および、前記変異型標的核酸と前記野生型検出用核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍ_Ｌ値である。また、前記検出用核酸が、変異型検出用核酸である場合、前記増幅目的の核酸のＴｍ値は、例えば、前記変異型標的核酸と前記変異型検出用核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍ_Ｈ値、および、前記野生型標的核酸と前記変異型検出用核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍ_Ｌ値である。

前記最大差（Ｂ）演算部において、前記増幅目的の核酸のＴｍ値を含む所定の温度範囲は、例えば、下限がＴｍ_Ｌ値よりも１〜２０℃低い温度であり、上限がＴｍ_Ｈ値よりも１〜２０℃高い温度であり、好ましくは［Ｔｍ_Ｌ値−５］℃〜［Ｔｍ_Ｈ値＋５］℃の温度範囲である。

本発明の増幅判定システムは、さらに、前記核酸増幅処理後のサンプルを温度変化させる温度変化部、および、温度変化時における前記サンプルの融解状態を示すシグナル値を連続的または断続的に検出する検出部を有してもよい。記温度変化部としては、例えば、サンプルを加熱する加熱部でもよいし、加熱されたサンプルを冷却する冷却部であってもよい。前記温度変化部としては、例えば、温度調節が可能な温度調節器、ヒーター、サーマルサイクラー等があげられ、前記検出部としては、例えば、分光光度計や蛍光光度計等があげられる。また、両者を備えた部としては、例えば、リアルタイムＰＣＲに使用する測定器等があげられる。前記シグナルは、例えば、蛍光であり、前記検出部は、蛍光を検出することが好ましい。

本発明の増幅判定システムは、さらに、サンプルの核酸増幅処理を行う核酸増幅部を含んでもよい。

本発明の増幅判定システムは、前記目的核酸が、標的部位に多型を有する核酸である場合、前記サンプルに、前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸を添加する添加部を有してもよい。

本発明の増幅判定システムは、さらに、前記核酸増幅処理後のサンプルの融解曲線を解析して、所定の温度範囲にピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析部を含んでもよい。

本発明の増幅判定システムは、例えば、得られた判定結果の情報を出力する出力部をさらに有することが好ましい。前記判定結果としては、例えば、増幅が正常か否かという項目があげられる。出力の際には、例えば、判定結果のみが出力されてもよいし、前記Ｘの値や、温度と微分値とがプロットされた融解曲線のグラフ、温度と二回微分値とがプロットされたグラフ等も、前記判定結果とともに出力されてもよい。

＜増幅判定ネットワークシステムおよびそれに用いる端末＞
本発明の増幅判定システムは、以下に示す端末とサーバーとを有するネットワークシステムであってもよい。なお、特に示さない限りは、前述の増幅判定システムと同様である。すなわち、本発明の増幅判定システムは、核酸増幅処理が行われた処理後のサンプルについて、目的の核酸の増幅が行われたか否かを解析するネットワーク増幅判定システムであって、
端末と、サーバーとを有し、
前記端末および前記サーバーは、システム外の通信網を介して接続可能であり、
前記端末は、
各温度における前記処理後サンプルの融解状態を示すシグナル値を入力するシグナル値入力部、
前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバーに送信する端末側送信部、および、
前記サーバーから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信部を有し、
前記サーバーは、
前記サーバー内の情報を前記通信網を介して前記端末に送信するサーバー側送信部、
前記端末から送信された情報を前記通信網を介して受信するサーバー側受信部、
前記サーバー側受信部により受信した前記各温度における前記シグナル値から、最大値（Ａ）を検索する最大値（Ａ）検索部、
前記各温度における前記シグナル値について、連続するシグナル値間の微分を行って微分値を得る微分演算部、
前記微分演算部により得られた微分値について、連続する微分値間の微分を行って二回微分値を得る二回微分演算部、
前記二回微分演算部により得られた二回微分値のうち、前記増幅目的の核酸のＴｍ値を含む所定の温度範囲における二回微分値から、最大の二回微分値（Ｄ_ｍａｘ’）と最小の二回微分値（Ｄ_ｍｉｎ’）とを選択し、下記式から二回微分値の最も大きい差（Ｂ）を得る最大差（Ｂ）演算部、
（Ｂ）＝（Ｄ_ｍａｘ’）−（Ｄ_ｍｉｎ’）
前記最大値（Ａ）および前記最大差（Ｂ）を用いて下記式の演算を行う演算部
Ｘ＝（Ｂ）／（Ａ）
および
前記Ｘが［Ｘ＞所定閾値］を満たす場合、増幅が正常であると判断し、前記Ｘが［Ｘ≦所定閾値］を満たす場合、増幅が不良であると判断する判定部を含み、
少なくとも前記各温度における前記シグナル値が、前記端末側送信部から前記サーバー側受信部に送信され、且つ、前記増幅が正常であるか不良であるかの判定結果の情報が、前記サーバー側送信部から前記端末側受信部に送信されることを特徴とする。

本発明の端末は、本発明のネットワーク増幅判定システムに用いる端末であって、
前記端末は、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値を入力する微分値入力部、
前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバーに送信する端末側送信部、および、
前記サーバーから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信部を有し、
少なくとも前記各温度における前記シグナル値が、前記端末側送信部から前記サーバー側受信部に送信され、且つ、前記増幅が正常であるか不良であるかの判定結果の情報が、前記サーバー側送信部から前記端末側受信部に送信されることを特徴とする。

＜増幅判定装置＞
本発明の増幅判定装置は、核酸増幅処理が行われた処理後のサンプルについて、目的の核酸の増幅が行われたか否かを判定する増幅判定装置であって、本発明の増幅判定システムを含むことを特徴とする。

＜プログラム＞
本発明のプログラムは、本発明の増幅判定方法をコンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラムである。

＜電子媒体＞
本発明の電子媒体は、本発明のコンピュータプログラムを格納した電子媒体である。

つぎに、本発明の実施例について説明する。

第１のシステム構成例
図１に、本発明のシステムの構成の一例であるスタンドアローン型の全体構成図を示す。図１に示すシステムは、本発明の増幅判定システム１１から構成され、増幅判定システム１１は、データ入出力部１２と増幅判定計算部１３から構成される。図３に、スタンドアローン型の増幅判定装置のハードウェア構成の一例を示す。図示のように、増幅判定システム１１は、データ入出力部１２、増幅判定計算部１３および記憶装置３７から構成されている。前記データ入出力部１２は、プログラムを実行するＣＰＵ３１、入出力Ｉ／Ｆ（インターフェース）３２、データの入力を行う入力装置３３、データの出力を行う出力装置３４を有するコンピュータ機器で構成される。入力装置３３としては、例えば、キーボードやマウス等があげられ、出力装置３４としては、例えば、プリンターや、ＬＥＤまたは液晶ディスプレイ等があげられる。増幅判定計算部は、プログラムが格納されたプログラム格納部３６およびプログラムを実行するＣＰＵ３５を有するコンピュータ機器で構成される。記憶装置３７には、例えば、各温度におけるシグナル値、シグナル微分値、二回微分値、Ｔｍ値（Ｔｍ_Ｈ値、Ｔｍ_Ｌ値）、Ｔｍ値を含む所定の温度範囲、検出用プローブの配列や種類（野生型検出用であるか変異型検出用であるか）等のデータが呼び出し可能な状態で記憶される。記憶装置３７としては、例えば、ＲＯＭ、ＨＤＤ、ＨＤ等があげられ、ＣＰＵの制御下、読みこみ／書きこみを制御し、データを記憶する。なお、データ入出力部１２、増幅判定計算部１３、記憶装置３７は、あくまでも機能上のものであり、例えば、１台のコンピュータ機器で一体に構成してもよいし、複数台のコンピュータ機器で個別に構成してもよい。

また、本発明のシステムは、さらに、サンプルを温度変化させる温度変化部（例えば、加熱処理する加熱処理部）、温度変化時におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値を連続的または断続的に検出する検出部を有してもよい。そして、前記検出部において検出されたシグナル値を前記データ入出力部により入力してもよい。温度変化部は、例えば、加熱装置等があげられる。前記検出部は、例えば、光学光度計や蛍光光度計があげられる。前記加熱処理部および前記検出部は、それぞれ、例えば、１台のコンピュータ機器で一体に構成してもよいし、複数台のコンピュータ機器で個別に構成してもよい。

また、本発明のシステムは、さらに、前記核酸増幅処理後のサンプルの融解曲線を解析して、所定の温度範囲にピークが存在するか否かを解析するための、融解曲線解析部を備えてもよい。これによって、本発明のシステムにより、増幅が正常であるか不良であるかを判断するだけでなく、正常と判断された前記サンプルについて、さらに融解曲線の解析を行い、例えば、ピークの存在の有無によって標的核酸の多型（遺伝子型）の判断を行うことができる。また、この他にも、生体試料から核酸を抽出するための核酸抽出部や、核酸増幅反応を行う増幅処理部等を備えてもよい。このような構成とすることで、例えば、核酸の増幅から増幅の判定、または、核酸の増幅から多型（遺伝子型）の判定までを、一つのシステムで自動的に行うことができる核酸増幅システムを提供できる。

第２のシステム構成例
図２に、サーバーで処理するネットワーク型のシステムの全体構成図を示す。図２に示すように、本実施形態のシステムは、本発明の増幅判定システム２１、および、増幅判定計算部２３から構成されるサーバーシステム２４で構成される。増幅判定システム２１は、データ入出力部２２から構成される。増幅判定システム２１とサーバーシステム２４は、例えば、ＴＣＰ（Transmission Control Protocol）／ＩＰ（Internet Protocol）に基づくインターネットとして機能する公衆網や専用線等の通信回線１００を介して接続されている。図４に、前記ネットワーク型システムの装置の構成の一例を示す。増幅判定システム２１は、データ入出力部２２および通信Ｉ／Ｆ（インターフェース）４７から構成され、通信Ｉ／Ｆ４７を介して通信回線１００に接続されている。サーバーシステム２４は、増幅判定計算部２３および通信Ｉ／Ｆ４８から構成され、通信Ｉ／Ｆ４８を介して通信回線１００に接続されている。データ入出力部２２は、プログラムを実行するＣＰＵ４１、入出力Ｉ／Ｆ４２、データの入力を行う入力装置４３およびデータの出力を行う出力装置４４から構成される。前記データ入出力部２２および通信Ｉ／Ｆ４７は、あくまでも機能上のものであり、例えば、１台のコンピュータ機器で一体に構成してもよいし、複数台のコンピュータ機器で個別に構成してもよい。増幅判定計算部２３は、プログラムを実行するＣＰＵ４５およびプログラムが格納されたプログラム格納部４６で構成される。増幅判定計算部２３および通信Ｉ／Ｆ４８は、あくまでも機能上のものであり、例えば、１台のコンピュータ機器で一体に構成してもよいし、複数台のコンピュータ機器で個別に構成してもよい。

システムの基本的な処理の例
本発明の増幅判定システムの基本的な処理の例を、図５のフローチャートに示す。以下、同図にしたがって、処理の流れを説明する。なお、本発明のシステムにおける各処理ステップは、例えば、ＣＰＵ、主メモリ、バス、あるいは、二次記憶装置、印刷装置やディスプレイ、その他の外部周辺装置等のハードウェア構成部や、その外部周辺機器用の入出力（Ｉ／Ｏ）ポート、それらハードウェアを制御するためのドライバプログラムやその他のアプリケーションプログラムなどを適宜利用することで実行できる。

［１］
各温度におけるシグナル値を入力する。
［２］
最も大きい値（Ａ）を検索する。
［３］
各温度におけるシグナル値を微分する。
［４］
シグナル微分値をさらに微分する。
［５］
前記二回微分値から、最大の二回微分値と最小の二回微分値を検索する。
［６］
前記最大二回微分値と最小二回微分値の差、すなわち最大差（Ｂ）を得る。
［７］
前記最大値（Ａ）および前記最大差（Ｂ）から演算したＸが、［Ｘ＞閾値］を満たすか判断する。
［８：Ｙｅｓ］
前記［７］がＹｅｓの場合、増幅は正常と判断する。
［９：Ｎｏ］
前記［７］がＮｏの場合、増幅は不良と判断する。

以上のように、本発明によれば、前述のような二回微分等の演算を利用することにより、目的の核酸の増幅が行われた否かを容易に判定することができる。このため、例えば、従来のように、判定を行う個人の判定基準の違いや、専門的知識が必要とされるというような問題を回避することが可能となった。このように、目的核酸の増幅の有無を容易に判断できるため、例えば、遺伝子型の誤判断の原因となる増幅不良を示すサンプルについては、それ以上の融解曲線解析を中止することができる。このため、最終的には、融解曲線解析を、より容易に高い信頼性で行うことが可能となった。特に、従来の遺伝子解析装置等に本発明のシステムを組みこむことで、例えば、増幅の有無の確認はもちろんのこと、核酸の増幅から遺伝子型の判断までを全自動化して行うことも可能となる、したがって、本発明は、例えば、一般的な分析や診断の現場においても使用することができ、多量の検体についても容易な解析を可能とすることから、特に、遺伝子解析の分野において、極めて有用な技術といえる。

Claims (19)

1. 核酸増幅処理が行われた処理後のサンプルについて、目的核酸の増幅が行われたか否かを判定する増幅判定方法であって、
   各温度における前記処理後サンプルの融解状態を示すシグナル値を準備するシグナル値準備工程、
   前記各温度における前記シグナル値から、最大値（Ａ）を検索する最大値（Ａ）検索工程、
   前記各温度における前記シグナル値について、連続するシグナル値間の微分を行って微分値を得る微分演算工程、
   前記工程において得られた微分値について、連続する微分値間の微分を行って二回微分値を得る二回微分演算工程、
   前記工程において得られた二回微分値のうち、前記目的核酸のＴｍ値を含む所定の温度範囲における二回微分値から、最大の二回微分値（Ｄｍａｘ’）と最小の二回微分値（Ｄｍｉｎ’）とを選択し、下記式から二回微分値の最も大きい差（Ｂ）を得る最大差（Ｂ）演算工程、
   （Ｂ）＝（Ｄｍａｘ’）−（Ｄｍｉｎ’）
   前記最大値（Ａ）および前記最大差（Ｂ）を用いて下記式の演算を行う演算工程
   Ｘ＝（Ｂ）／（Ａ）
   および
   前記Ｘが［Ｘ＞所定閾値］を満たす場合、増幅が正常であると判断し、前記Ｘが［Ｘ≦所定閾値］を満たす場合、増幅が不良であると判断する判定工程
   を含む増幅判定方法。
2. 前記微分演算工程において、連続する２点間の微分を行って微分値を得る、請求項１記載の増幅判定方法。
3. 前記二回微分演算工程において、連続する４点間の微分を行って二回微分値を得る、請求項１記載の増幅判定方法。
4. 前記目的核酸が、標的部位に多型を有する核酸である、請求項１から３のいずれか一項に記載の増幅判定方法。
5. 前記目的核酸のＴｍ値が、前記標的部位に多型を有する核酸と前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍ値である、請求項４記載の増幅判定方法。
6. 前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸が、野生型の前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸である場合、
   前記目的核酸のＴｍ値は、前記標的部位が野生型の核酸と前記野生型の標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍＨ値、および、前記標的部位が変異型の核酸と前記野生型の標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍＬ値であり、
   前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸が、変異型の前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸である場合、
   前記目的核酸のＴｍ値は、前記標的部位が変異型の核酸と前記変異型の標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍＨ値、および、前記標的部位が野生型の核酸と前記変異型の標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍＬ値である、請求項５記載の増幅判定方法。
7. 前記最大差（Ｂ）演算工程において、前記目的核酸のＴｍ値を含む所定の温度範囲が、下限がＴｍＬ値よりも１〜２０℃低い温度であり、上限がＴｍＨ値よりも１〜２０℃高い温度である、請求項６記載の増幅判定方法。
8. 前記温度範囲が、［ＴｍＬ値−５］℃〜［ＴｍＨ値＋５］℃である、請求項７記載の増幅判定方法。
9. 前記シグナル値準備工程に先立って、さらに、
   前記核酸増幅処理後のサンプルの温度を変化させる温度変化工程、
   および、
   温度変化時における前記処理後のサンプルの融解状態を示すシグナル値を連続的または断続的に検出する検出工程を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の増幅判定方法。
10. 前記目的核酸が、標的部位に多型を有する核酸であり、
    前記温度変化工程に先立って、前記サンプルに、前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸を添加する添加工程を有する、請求項９記載の増幅判定方法。
11. 核酸増幅処理が行われた処理後のサンプルについて、目的核酸の増幅が行われたか否かを判定する増幅判定システムであって、
    各温度における前記処理後サンプルの融解状態を示すシグナル値を入力するシグナル値入力部、
    前記シグナル値入力部により入力された前記各温度における前記シグナル値から、最大値（Ａ）を検索する最大値（Ａ）検索部、
    前記各温度における前記シグナル値について、連続するシグナル値間の微分を行って微分値を得る微分演算部、
    前記微分演算部により得られた微分値について、連続する微分値間の微分を行って二回微分値を得る二回微分演算部、
    前記二回微分演算部により得られた二回微分値のうち、前記目的核酸のＴｍ値を含む所定の温度範囲における二回微分値から、最大の二回微分値（Ｄｍａｘ’）と最小の二回微分値（Ｄｍｉｎ’）とを選択し、下記式から二回微分値の最も大きい差（Ｂ）を得る最大差（Ｂ）演算部、
    Ｂ＝（Ｄｍａｘ’）−（Ｄｍｉｎ’）
    前記最大値（Ａ）および前記最大差（Ｂ）を用いて下記式の演算を行う演算部
    Ｘ＝（Ｂ）／（Ａ）
    および
    前記Ｘが［Ｘ＞所定閾値］を満たす場合、増幅が正常であると判断し、前記Ｘが［Ｘ≦所定閾値］を満たす場合、増幅が不良であると判断する判定部
    を含む増幅判定システム。
12. 前記微分演算部において、連続する２点間の微分を行って微分値を得る、請求項１１記載の増幅判定システム。
13. 前記二回微分演算部において、連続する４点間の微分を行って二回微分値を得る、請求項１１記載の増幅判定システム。
14. 前記目的核酸が、標的部位に多型を有する核酸である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の増幅判定システム。
15. 前記目的核酸のＴｍ値が、前記標的部位に多型を有する核酸と前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍ値である、請求項１４記載の増幅判定システム。
16. 前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸が、野生型の前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸である場合、
    前記目的核酸のＴｍ値は、前記標的部位が野生型の核酸と前記野生型の標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍＨ値、および、前記標的部位が変異型の核酸と前記野生型の標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍＬ値であり、
    前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸が、変異型の前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸である場合、
    前記目的核酸のＴｍ値は、前記標的部位が変異型の核酸と前記変異型の標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍＨ値、および、前記標的部位が野生型の核酸と前記変異型の標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから構成される二本鎖核酸のＴｍＬ値である、請求項１５記載の増幅判定システム。
17. 前記最大差（Ｂ）演算部において、前記目的核酸のＴｍ値を含む所定の温度範囲が、下限がＴｍＬ値よりも１〜２０℃低い温度であり、上限がＴｍＨ値よりも１〜２０℃高い温度である、請求項１６記載の増幅判定システム。
18. 前記温度範囲が、［ＴｍＬ値−５］℃〜［ＴｍＨ値＋５］℃である、請求項１７記載の増幅判定システム。
19. 核酸増幅処理が行われた処理後のサンプルについて、目的の核酸の増幅が行われたか否かを判定する増幅判定装置であって、
    請求項１１から１８のいずれか一項に記載の増幅判定システムを含む増幅判定装置。

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