KR20110117208A - 광학 검출 장치의 성능 확인 방법 및 그것에 이용하는 표준 시약 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광학 검출 유닛 및 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치에 대해, 광학 시그널의 검출 및 온도 제어가 정확히 행해지고 있는지의 여부, 이들의 성능을 간이하고 또한 높은 신뢰성으로 확인할 수 있는 방법을 제공한다. 피검체의 광학 시그널을 검출하는 광학 검출 유닛과, 피검체의 온도를 제어하는 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치에 대해, 하기 방법에 의해 광학 시그널의 검출 성능 및 온도 제어 성능을 확인한다. 우선, 광학 시그널 강도와 Tm치가 알려진 핵산 서열과 상보쇄를 포함하는 표준 샘플을 준비하고, 상기 온도 제어 유닛에 의해 상기 표준 샘플의 온도를 상승 혹은 하강시키고 또한, 상기 검출 유닛에 의해 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도를 측정한다. 한편, 온도 변화에 따르는 상기 광학 시그널 강도의 변동으로부터, 상기 표준 샘플의 융해 온도를 결정한다. 측정한 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도와 상기 표준 샘플의 알려진 광학 시그널 강도 및 결정한 상기 표준 샘플의 융해 온도와 상기 표준 샘플의 알려진 융해 온도를, 각각 비교하여, 상기 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능이 정확한지의 여부를 확인한다.
Description
본 발명은 광학 검출 장치에 대해, 시료의 광학 시그널의 검출 및 상기 시료의 온도 제어를 정상적으로 행할 수 있는지, 이들의 성능을 확인하는 방법 및 그것에 이용하는 표준 시약에 관한 것이다.
최근, 유전자의 다형이나 점돌연변이 등의 새로운 검출 방법으로서, 핵산의 융해 온도(Tm: melting temperature)를 해석하는 방법이 실용화되어있다. 이 해석 방법은, 예컨대, 상기 핵산의 융해 곡선의 해석에 의해 행해지기 때문에 융해 곡선 해석, 또는, Tm 해석이라고도 불리고 있다.
Tm치는, 일반적으로, 이하와 같이 정의되어 있다. 이중쇄핵산을 포함하는 용액을 가열해 나가면, 260 nm에서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 이중쇄핵산에서의 양쇄간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어져, 단일쇄핵산으로 해리(핵산의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 이중쇄핵산이 해리하여 단일쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시 시의 흡광도(이중쇄핵산만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 따라 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. 이 현상에 기초하여, 융해 온도 Tm(℃)는 일반적으로, 흡광도가, 흡광도 전체 상승분의 50％에 달했을 시의 온도로 정의된다.
핵산의 이러한 특성을 이용하면, 예컨대, 이하와 같이 하여 표적 부위에 있어서의 다형이나 변이 등의 검출이 가능하다. 즉, 우선, 변이형의 표적 부위를 포함하는 표적 핵산 서열에 상보적인 변이형 검출용 프로브를 이용하여, 분석 대상의 단일쇄핵산과 상기 프로브와의 이중쇄핵산을 형성시키고, 형성된 이중쇄핵산에 가열 처리를 실시하여, 온도 상승에 따르는 상기 이중쇄핵산의 해리(융해)를 나타내는 시그널을 측정한다. 그리고, 측정한 시그널치의 거동으로부터 Tm치를 결정하여, 결정한 Tm치로부터, 표적 부위에 있어서의 변이의 유무를 판단하는 방법이다(비특허 문헌 1, 특허 문헌 1 참조). Tm치는, 이중쇄핵산의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮게 된다. 그래서, 변이형의 표적 부위를 포함하는 표적 핵산 서열과 그것에 100％ 상보적인 변이형 검출용 프로브의 이중쇄핵산 및 상기 표적 부위가 야생형인 핵산 서열과 상기 변이형 검출용 프로브와의 이중쇄핵산의 각각에 대해, 미리 평가 기준이 되는 Tm치를 구해 둔다. 전술한 바와 같이 상동성이 높을수록 Tm치는 높게 되기 때문에, 전자, 즉 표적 부위가 변이형인 경우의 Tm치(이하, 「Tmm치」라고도 함)는, 상대적으로 높고, 후자, 즉 표적 부위가 야생형인 경우의 Tm치(이하, 「Tmw치」)는, 상대적으로 낮게 된다. 그리고, 분석 대상의 단일쇄핵산과 상기 변이형 검출용 프로브에서 형성되는 이중쇄핵산에 대해, 전술한 바와 같이하여 시그널의 측정을 행하고, 예컨대, 작성한 융해 곡선으로부터 시그널 변동의 피크를 검출한다. 이 피크를 나타내는 온도, 즉, Tm치가, 미리 구한 Tmm치와 동일하면, 단일쇄핵산과 상기 프로브는 100％ 매치하고 있기 때문에, 즉, 분석 대상의 핵산은, 상기 표적 부위에 있어서의 다형이 변이형이라고 판단할 수 있다. 한편, 상기 피크를 나타내는 Tm치가, 미리 구한 Tmm치보다도 낮고, Tmw치와 동일 정도이면, 단일쇄핵산과 상기 프로브는 일염기 미스매치하고 있기 때문에, 분석 대상의 핵산은, 상기 표적 부위에 있어서의 다형이 야생형이라고 판단할 수 있다. 또한, 다형이 호모 접합성인지 헤테로 접합성인지에 대해서도, 판단할 수 있다. 즉, 한쌍의 대립 유전자를 분석할 때, 융해 곡선에 있어서, Tmm치 부근과 Tmw치 부근의 양쪽에 피크가 존재하는 경우, 헤테로 접합성이라고 판단할 수 있고, 한편, Tmm치 부근에만 피크가 존재하는 경우에는, 변이형의 호모 접합성이며, Tmw치 부근에만 피크가 존재하는 경우에는, 야생형의 호모 접합성이라고 판단할 수 있다.
이 해석에 있어서는, 상기 프로브로서, 예컨대, 형광 물질로 표지화한 프로브를 사용하여, 상기 형광 물질의 형광을 시그널로서 측정하는 수법이 널리 채용되고 있다. 이러한 Tm 해석을 이용한 검출 방법에는, 통상, 시료의 광학 시그널을 검출하는 검출 유닛과 상기 시료의 온도를 제어하는 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치가 사용되고 있고, 여러 가지 상품이 판매되고 있다.
전술한 바와 같이, Tm 해석에 있어서는, 온도 변화에 따르는 광학 시그널의 변동을 측정함으로써 Tm치를 결정하기 때문에, 상기 광학 검출 장치 내에서, 상기 시료의 온도가 정확하게 컨트롤되어 있는지, 또한, 상기 시료의 광학 시그널이 정상적으로 검출되어 있는지라고 하는, 이들 2점이 매우 중요해진다. 이 때문에, 상기 광학 검출 장치에 대해서는, 해석 결과의 신뢰성을 유지하기 위해, 광학 시그널의 검출 성능과 온도 제어 성능의 2개를 확인하는 것이 필수이다. 그래서, 광학 시그널의 검출에 대해서는, 예컨대, 알려진 형광 물질을 알려진 농도로 함유하는 용액을 준비하고, 상기 용액에 대해, 상기 형광 색소의 시그널 강도(형광 강도)를 소정의 온도 조건 하에서 측정하여, 광학 시그널이 정상적으로 측정되어 있는지의 여부를 확인하고 있다. 한편, 시료의 온도 제어에 관해서는, 시료를 상기 광학 검출 장치의 소정 부위(이하, 「시료 배치부」라고도 함)에 배치하여, 실제로, 상기 시료의 온도를 측정함으로써, 상기 장치의 온도 제어 유닛에 의해 상기 시료가 정확하게 온도 제어되어 있는지의 여부를 확인하고 있다.
그러나, 이러한 종래의 방법에서는, 하나의 광학 검출 장치에 대해, 광학 시그널의 검출 성능과 온도 제어 성능의 2개를 따로따로 확인하는 것이 필요하고, 시간이나 노동력이 든다. 또한, 광학 시그널의 검출 성능에 관해서는, 전술한 바와 같이, 소정 온도 조건 하에서의 확인 측정에 의해, 예컨대, 이론치와 동등한 신뢰성이 높은 측정치를 얻을 수 있었던 경우에도, 실제로 측정 시에 있어서의 온도가 정확한 것의 증명으로는 되지 않는다. 즉, 시료 배치부 혹은 거기에 배치된 시료가, 실제로 소정의 설정 온도로 되어 있는 것의 증명으로는 되지 않는다. 이 때문에, 형광 강도의 측정치가 「원하는 설정 온도」에 있어서 신뢰성이 높은 값을 나타내고 있다고 할 수 없고, 결과적으로는, 별도로, 온도 제어 성능의 확인이 필수가 된다. 한편, 상기 광학 검출 장치에 배치한 시료의 온도 측정은, 통상, 외부에서 온도 측정기를 도입하여 행해진다. 그러나, 상기 시료 배치부의 어느 쪽의 장소에서 측정을 행하는지에 따라, 온도가 다를 우려가 있다. 또한, 시료의 배치부는 미소하기 때문에, 외부에서 온도 측정기를 도입하는 것 자체에 의해, 실제의 온도에 영향이 미칠 우려가 있다. 이러한 이유로부터, 상기 광학 검출 장치에 배치한 시료의 실제의 온도를 정확하게 측정하는 것이 곤란하기 때문에, 결과적으로, 상기 온도 제어 유닛에 의해 상기 시료의 온도 제어가 정확하게 행해지고 있는지의 여부를 판단하기 어렵다.
[비특허 문헌 1] Clinical Chemistry 46:5 631-635(2000)
[특허 문헌 1] 일본 특허 공개 제2005-58107호 공보
그래서, 본 발명은 광학 검출 유닛 및 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치에 대해, 광학 시그널의 검출 및 온도 제어가 정확하게 행해지고 있는지의 여부, 이들의 성능을 간이하고 또한 높은 신뢰성으로 확인할 수 있는 방법의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 광학 검출 장치의 성능 확인 방법은, 시료의 광학 시그널을 검출하는 검출 유닛과, 상기 시료의 온도를 제어하는 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치에 대해, 상기 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능을 확인하는 방법으로서, 하기 (A)∼(D) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(A) 광학 시그널 강도와 융해 온도가 알려진 핵산 서열 및 그 상보쇄를 포함하는 표준 샘플을 준비하는 공정
(B) 상기 온도 제어 유닛에 의해, 상기 표준 샘플의 온도를 상승 혹은 하강시키고, 또한, 상기 검출 유닛에 의해, 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도를 측정하는 공정
(C) 온도 변화에 따르는 상기 광학 시그널 강도의 변동으로부터, 상기 표준 샘플의 융해 온도를 결정하는 공정
(D) 상기 (B) 공정에서 측정한 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도와 상기 표준 샘플의 알려진 광학 시그널 강도 및 상기 (C) 공정에서 결정한 상기 표준 샘플의 융해 온도와 상기 표준 샘플의 알려진 융해 온도를, 각각 비교하여, 상기 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능을 확인하는 공정.
본 발명의 제조 방법은, 시료의 광학 시그널을 검출하는 검출 유닛과, 상기 시료의 온도를 제어하는 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치의 제조 방법으로서, 본 발명의 성능 확인 방법에 의해, 상기 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능을 확인하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 표준 시약은, 본 발명의 광학 검출 장치의 성능 확인 방법에 사용하는 표준 시약으로서, 광학 시그널 강도와 융해 온도가 알려진 핵산 서열 및 그 상보쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 성능 확인 방법에 따르면, 평가 대상인 광학 검출 장치를 이용하여, 상기 표준 샘플을 사용한 Tm 해석을 행함으로써 상기 검출 유닛의 성능과 상기 온도 제어 유닛의 성능의 양쪽을 확인하는 것으로 할 수 있다. 구체적으로는, 상기 표준 샘플의 측정 결과와, 상기 표준 샘플의 알려진 조건(시그널 강도나 Tm치)을 비교하여, 예컨대, 거의 동일한 결과이면, 상기 검출 유닛 및 상기 온도 제어 유닛의 성능이 정상이라고 판단하고, 다른 결과이면 상기 성능이 이상이라고 판단할 수 있다. 본 발명은 핵산과 그 상보쇄에서 이중쇄가 형성(하이브리드 형성)되고, 가열 처리에 의해, 상기 이중쇄가 해리(단일쇄핵산에의 해리)하며, 또한, 이들의 서열에 기초하여 고유의 Tm치(℃)를 갖는다고 하는 성질을 이용한 기술이다. 그리고, 이중쇄의 형성, 이중쇄의 해리(단일쇄에의 해리) 및 Tm치의 신뢰성은, 당업자에 있어서 충분히 인식되어 있다. 따라서, 본 발명의 광학 검출 장치의 성능 확인 방법에 따르면, Tm 해석을 이용함으로써, 광학 검출 장치에 있어서의 검출 성능과 온도 제어 성능을 높은 신뢰성으로 평가할 수 있는 것은 분명하다. 또한, 이중쇄의 형성, 이중쇄의 해리 및 Tm치에 관해서는, 전술한 바와 같이 공지이지만, 종래는, 어디까지나 목적의 유전자의 서열, 변이 또는 다형 등을 해석하기 위해 이들의 성질을 이용하는 것에 지나지 않는다. 이들의 성질을 이용하여, 광학 검출 장치의 검출 성능 및 온도 제어 성능을 확인한다고 하는 기술적 사상은, 본 발명자 등이 처음으로 발견하여 확립한 것이다. 본 발명의 방법은, 본 발명의 표준 시약을 표준 샘플로서 사용함으로써, 용이하게 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 성능 확인 방법에 따르면, 종래와 같이, 외부에서 내부에, 별도 온도 측정기 등을 도입할 필요가 없기 때문에, 전술의 것과 같은 온도 측정기의 도입에 의한 문제도 생기지 않는다. 또한, 본 발명의 성능 확인 방법은, 광학 검출 장치의 제조에 있어서의 성능 검사 공정에 적용할 수도 있다. 이와 같이, 본 발명의 성능 확인 방법에 따르면, 간이하고 또한 간편하게, 광학 검출 장치에 있어서의 광학 시그널의 검출 성능 및 온도 제어 성능의 두개를 동일한 방법으로 확인할 수 있기 때문에, 매우 유효한 기술이라고 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 있어서의 Tm 해석의 결과를 도시하는 그래프이다.
[실시예]
<성능 확인 방법>
본 발명의 광학 검출 장치의 성능 확인 방법은, 시료의 광학 시그널을 검출하는 검출 유닛과, 상기 시료의 온도를 제어하는 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치에 대해, 상기 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능을 확인하는 방법으로서, 하기 (A)∼(D) 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
(A) 광학 시그널 강도와 융해 온도가 알려진 핵산 서열 및 그 상보쇄를 포함하는 표준 샘플을 준비하는 공정
(B) 상기 온도 제어 유닛에 의해, 상기 표준 샘플의 온도를 상승 혹은 하강시키고, 또한, 상기 검출 유닛에 의해, 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도를 측정하는 공정
(C) 온도 변화에 따르는 상기 광학 시그널 강도의 변동으로부터, 상기 표준 샘플의 융해 온도를 결정하는 공정
(D) 상기 (B) 공정에서 측정한 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도와 상기 표준 샘플의 알려진 광학 시그널 강도 및 상기 (C) 공정에서 결정한 상기 표준 샘플의 융해 온도와 상기 표준 샘플의 알려진 융해 온도를, 각각 비교하여, 상기 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능을 확인하는 공정.
상기 표준 샘플에 포함되는 핵산 서열과 그 상보쇄의 조합은, 어떠한 제한도 없고, 온도의 변동에 의해, 하이브리드의 형성(이중쇄핵산의 형성)과 하이브리드의 해리(단일쇄핵산에의 해리)가 행해지는 것이면 좋다. 본 발명에 있어서는, 온도 제어가 정확한지의 여부, 또한, 광학 시그널의 검출이 정확한지의 여부를 판단하기 위해, 상기 핵산 서열과 상기 상보쇄가 하이브리드화된 이중쇄핵산의 Tm치가 필요하다. Tm치는, 예컨대, 서열 정보, GC 함량, 염농도 등에 기초하여, 종래 공지의 방법에 의해 이론치를 산출할 수 있다. 상기 공지의 방법으로서는, 예컨대, 최근접염기쌍법(Nearest Neighbor Method)나, MeltCalc(http://www. meltcalc.de/) 등의 소프트웨어를 이용하는 방법을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 이 Tm치의 이론치를, 예컨대, 「알려진 Tm치」라고 할 수 있다. 또한, Tm치는, 예컨대, 반응액 중의 염농도 외에, 상기 핵산 서열 및 그 상보쇄의 농도, 컨쥬게이트(conjugated)기(예컨대, 비오틴이나 형광 색소 등)의 존재 등에 의해 영향을 받을 가능성이 있다. 그래서, 예컨대, 표준 샘플을 포함하는 반응액을 이용하여, 미리, 검출 성능 및 온도 제어 성능이 정상인 광학 검출 장치에 의해 Tm치를 측정해 두고, 이것을 알려진 Tm치로 하는 것이 바람직하다. 이 외에도, 예컨대, 이미 Tm치가 알려진 핵산 서열과 그 상보쇄를 조합하여 사용하여도 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산 서열과 그 상보쇄는, 온도 변화에 의해, 하이브리드 형성과 해리가 행해지는 것이면 좋다. 이 때문에, 상기 상보쇄는, 예컨대, 상기 핵산 서열과 완전히(100％) 상보적인 서열이라도 좋고, 부분적으로 다른 서열이라도 좋다. 또한, 상기 상보쇄는, 예컨대, 상기 핵산 서열에 상보적인 서열만으로 이루어지는 쇄라도 좋고, 상기 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함하는 쇄라도 좋으며, 상기 핵산 서열의 부분 서열에 상보적인 서열만으로 이루어지는 쇄라도 좋다.
상기 핵산 서열 및 상기 상보쇄로서는, 예컨대, 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. 각각의 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 10∼100 mer 정도가 바람직하다.
본 발명에 사용하는 시점에 있어서, 상기 표준 샘플에 있어서의 상기 핵산 서열과 상보쇄는, 하이브리드를 형성한 상태(이중쇄핵산)라도 좋고, 상기 양자가 해리한 상태라도 좋다.
상기 핵산 서열과 상보쇄의 조합의 구체예로서는, 광학 시그널의 검출 감도를 향상할 수 있기 때문에, 예컨대, 광학 시그널을 발하는 표지화 물질로 표지화된 프로브(이하, 「표지화 프로브」라고도 함)와 그 상보쇄의 조합이 바람직하다. 상기 표지화 프로브로서는, 예컨대, 단독으로 시그널을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내지 않는 표지화 프로브, 또는, 단독으로 시그널을 나타내지 않고 또한 하이브리드 형성에 의해 시그널을 나타내는 표지화 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 상보쇄와 하이브리드(이중쇄)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않고, 가열에 의해 하이브리드가 해리하여 표지화 프로브가 유리하면 시그널을 나타낸다. 또한, 후자의 프로브이면, 상보쇄와 하이브리드(이중쇄)를 형성함으로써 시그널을 나타내고, 가열에 의해 하이브리드가 해리하여 표지화 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 이러한 표지화 프로브와 상보쇄를 포함하는 표준 샘플을 사용하는 경우, 상기 (B) 공정에 있어서, 예컨대, 표지화 물질의 종류에 따른 조건으로, 광학 시그널을 측정하면 좋다. 상기 (B) 공정에 있어서의 광학 시그널의 측정 방법은, 예컨대, 표지화 물질의 종류에 따라 적절하게 결정할 수 있고, 특별히 제한되지 않지만, 흡광도(흡수 강도) 측정이나 형광 강도 측정 등을 들 수 있다. 상기 표지화 프로브를 사용하여, 그 표지화 물질의 시그널을 측정하는 것에 의해서도, 전술의 이중쇄핵산(미표지)의 융해 상태를 나타내는 260 nm에서의 흡광도와 동일하게, 융해의 진행 및 Tm치의 결정을 행할 수 있다. 또한, 본 발명은 광학 검출 장치의 성능을 확인하는 방법이기 때문에, 상기 표지화 프로브를 사용할 때에는, 예컨대, 상기 광학 검출 장치에서의 측정이 상정되는 표지화 물질(측정 예정의 표지화 물질)을 사용하여, 광학 시그널의 검출 성능을 확인하는 것이 특히 바람직하다.
상기 표지화 물질로서는, 전술한 바와 같이 특별히 제한되지 않지만, 널리 이용되어 있기 때문에, 형광 물질이 바람직하고, 예컨대, 형광 색소(형광단)를 들 수 있다. 구체예로서는, 예컨대, 단독으로 형광을 나타내고 또한 하이브리드 형성에 의해 형광이 감소(예컨대, 소광)하는 프로브가 바람직하다. 이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로, 형광 소광 프로브라고 불린다. 그 중에서도, 상기 표지화 프로브는, 프로브(폴리뉴클레오티드)의 3'말단 혹은 5'말단이 형광 색소로 표지화되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 표지화되는 상기 말단의 염기 또는 그것에 인접하는 염기가, 시토신(C)인 것이 바람직하다. 상기 인접하는 염기는, 예컨대, 상기 말단의 염기로부터 1∼3번째의 염기인 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 표지화 프로브가 하이브리다이즈하는 상보쇄의 서열에 있어서, 상기 표지화 프로브의 말단 염기 C 또는 인접하는 염기 C와 쌍을 이루는 염기가 G가 되도록, 상기 표지화 프로브와 상보쇄의 염기 서열을 설계하는 것이 바람직하다. 이러한 프로브는, 일반적으로 구아닌소광 프로브라고 불리고, 소위 QProbe(등록 상표)로서 알려져 있다. 이러한 구아닌소광 프로브가 상보쇄에 하이브리다이즈하면, 형광 색소로 표지화된 표지화 프로브의 말단의 C가, 상기 상보쇄의 G에 근접하는 것에 따라, 상기 형광 색소의 발광이 약해진다(형광 강도가 감소함)고 하는 현상을 나타낸다. 이러한 표지화 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다.
상기 형광 색소로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예컨대, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴색소 유도체 등을 들 수 있다. 시판의 형광 색소로서는 예컨대, BODIPY FL(상표명, 몰레큘러·프로브(molecular probes)사제), Fluore Prime(상품명, 아마샴파마시아(Amersham Pharmacia)사제), Fluoredite(상품명, 미리포아사제), FAM(ABI사제), Cy3 및 Cy5(아마샴파마시아사제), TARMA(몰레큘러·프로브사제) 등을 들 수 있다.
또한, 상기 핵산 서열과 상보쇄의 조합으로서는, 예컨대, 표지화되어 있지 않은 핵산 서열과 그것에 상보적인 핵산 서열이 조합하고 있더라도 좋다. 전술한 바와 같이 이중쇄핵산은, 온도 변화에 의해, 파장 260 nm에 있어서의 흡광도가 변화된다. 따라서, 이와 같이 표지화하지 않는 핵산 서열과 상보쇄를 사용하는 경우에는, 상기 (B) 공정에 있어서, 광학 시그널로서 200∼350 nm(바람직하게는 260 nm)의 흡광도를 측정하는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 핵산 서열과 상보쇄의 길이도, 특별히 제한되지 않고, 전술과 동일하다.
상기 표준 샘플은, 그 외에, 예컨대, 인터컬레이터를 포함하고 있어도 좋다. 특히, 전술의 것과 같은 표지화 프로브를 사용하지 않는 경우는, 미표지의 핵산 서열과 상보쇄에 부가하여, 상기 인터컬레이터를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 인터컬레이터로서는, 예컨대, 인터컬레이터성(性) 형광 물질이 바람직하고, 이것은, 일반적으로, 이중쇄핵산에 인터컬레이션함으로써 형광 특성이 변화되는 색소로서 알려져 있다. 이러한 형광 색소는, 이중쇄핵산에 인터컬레이션함으로써, 형광 특성이 변화되는 것이면 특별히 제한은 없다. 그 중에서도, 인터컬레이션에 의해 형광 강도가 증가하는 것이 바람직하고, 예컨대, 에튬브로마이드, 티아졸오렌지, 옥사졸옐로우나 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 이와 같이 상기 인터컬레이터를 포함하는 표준 샘플인 경우에는, 상기 (B) 공정에 있어서, 상기 표준 샘플에 여기광을 조사하여, 상기 인터컬레이터에서 발생하는 형광의 강도를 측정하면 좋다.
본 발명에 있어서는, 예컨대, 2종 이상의 다른 표준 샘플을 이용하여, 2회 이상의 성능 확인을 행하여도 좋다. 전술한 바와 같이, 핵산 서열과 상보쇄로 형성되는 하이브리드는, 고유의 Tm치를 갖고 있다. 따라서, 다른 Tm치를 나타내는 표준 샘플을 복수 사용하면, 이들의 각 샘플에 대해, 정확한 온도 제어 및 광학 시그널의 검출이 행해지고 있는지의 여부를 평가할 수 있다. 이와 같이하면, 더 많은 온도 범위에 대해 성능의 확인을 행할 수 있기 때문에, 결과적으로, 광학 검출 장치에 의한 해석의 신뢰성을 한층 더 향상하는 것이 가능해진다.
또한, 동일하게, 상기 표지화 프로브에 있어서의 표지화 물질의 종류만을 바꾼 2종 이상의 다른 표준 샘플을 이용하여 성능 확인을 행하여도 좋다. 예컨대, 광학 검출을 이용한 실제의 측정에 있어서, 검출 파장이 다른 2종 이상의 형광 물질을 사용하는 경우, 하나의 광학 검출 장치에 있어서, 2개 이상의 다른 파장으로 형광 강도를 검출하는 것이 된다. 이러한 경우, 형광 물질이 다른 2종 이상의 표준 샘플을 사용하여, 형광 검출 장치의 성능 확인을 행해두면, 예컨대, 복수의 파장에 대해서도, 높은 신뢰성으로 측정을 행할 수 있게 된다. 구체예로서, 예컨대, 전술의 Q-프로브를 이용한 해석법이나, 하이브리다이제이션법 등에 있어서, 복수 파장에서의 해석을 행하기 전에, 본 발명의 성능 확인 방법을 실행하면, 매우 신뢰성이 높은 해석이 가능하게 된다고 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 광학 시그널의 종류는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 상기 핵산 서열의 표지화의 유무나, 인터컬레이션의 유무에 따라, 형광 강도나 흡광도 등을 들 수 있다.
본 발명의 성능 확인 방법을 채용할 수 있는 광학 검출 장치는, 시료의 광학 시그널을 검출하기 위한 광학 검출 유닛 및 온도 제어 유닛을 구비하는 장치이면 좋고, 예컨대, 상기 각 유닛의 구조, 크기, 배치 부위, 그 외의 구성 등은 어떠한 제한도 없다. 구체예로서는, 예컨대, Tm 해석 장치, PCR(Polymerase Chain Reaction) 장치, 리얼타임 PCR 장치 등, 종래 공지의 광학 검출 장치에의 적용을 예시할 수 있다.
본 발명의 성능 확인 방법에 대해, 형광 색소로 표지화된 표지화 프로브와 그 상보쇄를 포함하는 표준 샘플을 사용하는 일례를 들어 설명한다. 또한, 본 발명은 이 예에는 어떠한 제한도 없다.
(A) 공정: 표준 샘플의 준비
우선, 전술과 같은 표지화 프로브와 그 상보쇄를 포함하는 표준 샘플을 준비한다. 상기 Tm 해석에는, 일반적으로, 액체 시료를 사용하기 때문에, 상기 표준 샘플은, 상기 표지화 프로브와 상보쇄를 포함하는 액체인 것이 바람직하다. 상기 표준 샘플의 용매는, 어떠한 제한도 없지만, 예컨대, 물, 글리신, 시트르산, 초산, 인산, 트리스 등의 각종 완충액을 들 수 있고, pH는, 예컨대, 5∼9의 범위가 바람직하다. 또한, 이들 외에, 예컨대, 염, 알콜, 계면활성제 등을 포함하여도 좋다.
상기 표준 샘플에 있어서의 표지화 프로브와 상보쇄의 하이브리드의 Tm치(알려진 Tm치)는, 전술의 것과 같은 방법에 의해, 미리 결정할 수 있다.
상기 표준 샘플에 있어서의 알려진 광학 시그널 강도는, 예컨대, 이하와 같이 설정할 수 있다. 예컨대, 미리, 광학 검출 유닛의 검출 성능 및 온도 제어 성능이 정상인 광학 검출 장치를 이용하여, 후술하는 성능 확인 시와 동일한 조건으로, 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도를 측정해 둔다. 그리고, 이것을 알려진 광학 시그널 강도로 한다. 구체예로서, 형광 색소로 표지화된 프로브를 사용하는 경우에는, 예컨대, 표준 샘플의 조성, 형광 색소의 종류, 표준 샘플 중의 표지화 프로브 및 상보쇄의 농도, 표지화 프로브 및 상보쇄의 서열, 여기광의 광원의 종류(예컨대, 파장, 광량 등), 검출측의 종류(예컨대, 파장, 검출 감도 등), 검출 온도등을 특정하여 형광 시그널 강도를 측정한다. 이 측정치를, 알려진 형광 시그널 강도로 할 수 있다. 그리고, 알려진 형광 시그널 강도의 결정과 동일한 측정 조건으로, 동일한 표준 샘플을 이용하여, 성능을 확인하는 대상의 피검 장치에 의해, 상기 표준 샘플의 형광 시그널 강도를 측정한다. 이 측정치와 상기 알려진 형광 시그널 강도를 비교하여, 동일 정도의 값인지의 여부를 판단하면, 검출 성능을 확인할 수 있다. 이와 같이, 동일한 표준 샘플을 사용하여, 동일한 조건으로 확인의 측정을 행하면, 예컨대, 정기적으로 성능을 확인할 때, 광학 검출 유닛의 성능을 계속적으로 높은 신뢰성으로 확인하는 것도 가능하다.
(B) 공정: 광학 시그널 강도의 측정
이어서, 준비한 상기 표준 샘플을, 성능을 확인하는 대상의 피검 장치(광학 검출 장치)에 있어서의 소정의 시료 배치부(시료 배치 유닛)에 공급한다.
계속해서, 광학 검출 장치의 작동 방법에 따라, 상기 장치 내부에 배치한 표준 샘플의 온도를 상승 또는 하강시킨다. 개시 온도나 최종 온도는, 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 사용하는 표준 샘플의 알려진 Tm치에 따라 결정할 수 있다. 알려진 Tm치보다도 낮은 온도에서 개시하는 경우, 통상, 상기 핵산 서열과 상보쇄는 하이브리드를 형성하고 있다. 이 때문에, 예컨대, 상기 표준 샘플의 온도를, 시간 경과적으로 알려진 Tm치보다도 높은 온도에까지 향상시켜, 하이브리드를 해리시키는 것이 바람직하다. 한편, Tm치보다도 높은 온도에서 개시하는 경우, 통상, 상기 핵산 서열과 상보쇄 서열은 해리하고 있다. 이 때문에, 예컨대, 상기 표준 샘플의 온도를, 시간 경과적으로 알려진 Tm치보다도 낮은 온도에까지 하강시켜, 하이브리드를 형성시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 표준 샘플의 온도 조정과 병행하여, 온도 변화에 따르는 상기 표준 샘플의 형광 강도를, 광학 검출 장치의 작동 방법에 따라 측정한다. 형광 강도의 측정은, 예컨대, 연속적이라도 단속적이라도 좋지만, 본 발명은 성능의 확인이기 때문에, 연속적으로 측정하는 것이 바람직하다.
(C) 공정: Tm치의 결정
상기 (B) 공정에서 측정한, 온도 변화에 따르는 상기 형광 강도의 변동으로부터, 상기 표준 샘플의 융해 온도를 결정한다. 구체적으로는, 예컨대, 측정한 형광 강도의 변동 결과로부터, 그것에 기초하는 Tm치(Tm1)를 결정한다.
상기 Tm치(Tm1)는, 예컨대, 단위 시간당의 광학 시그널 강도 변화량으로부터 결정할 수 있다. 구체적으로는, 예컨대, 우선, 상기 (B) 공정에서 측정한 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도로부터, 각 온도에 있어서의 단위 시간당의 광학 시그널 강도 변화량을 구한다. 이 변화량은, 예컨대, 식 「-d 형광 강도 변화량/dt」 또는 「형광 강도 변화량/dt」에 의해 산출할 수 있다. 그리고, 상기 광학 시그널 강도 변화량의 절대치가 가장 큰 값을 나타내는 점(온도)을, 상기 표준 샘플의 Tm치(Tm1)로서 결정할 수 있다. 또한, 이것에는 제한되지 않는다.
(D) 공정: 성능 확인
그리고, 결정한 Tm치의 결과 및 측정한 상기 표준 샘플의 형광 강도와, 상기 표준 샘플의 알려진 Tm치(Tm0) 및 알려진 형광 강도(F0)를 비교한다. 구체적으로는, 예컨대, 측정한 형광 강도의 변동 결과로부터, 전술한 바와 같이, 그것에 기초하는 Tm치(Tm1) 및 상기 온도(Tm1)에 있어서의 형광 강도(F1)를 구하여, 이들을 알려진 값(Tm0, F0)과 비교한다. 그 결과, Tm0≒ Tm1, F0≒ F1이면, 광학 검출 장치에 있어서의 광학 검출 유닛의 검출 성능 및 온도 제어 유닛의 온도 제어 성능은, 정상이라고 판단할 수 있다. 한편, Tm≠ Tm1, F0≠ F1이면, 광학 검출 장치에 있어서의 광학 검출 유닛의 검출 성능 및 온도 제어 유닛의 온도 제어 성능은, 이상이라고 판단할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서는, 측정 결과의 Tm1이나 F1과, 알려진 값 Tm0, F0이, 어느 정도 근사하고 있는 경우에 정상이라고 판단하고, 어느 정도 다른 경우에 이상이라고 판단하는가라는 점에 대해서는, 어떠한 제한도 없다. 본 발명은 Tm 해석에 따라, 성능을 확인할 수 있는 것을 발견한 점이 특징이고, 예컨대, 성능에 관해 정상인지 이상인지의 판단 기준(평가의 구분)은 광학 검출 장치의 확인을 행하는 사람이, 원하는 기준으로 설정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표준 샘플의 알려진 시그널 강도란, 예컨대, 소망 온도에 있어서의 단위 시간당의 광학 시그널 강도 변화량이라도 좋다. 이 경우, 상기 (D) 공정에 있어서, 상기 (B) 공정에서 측정한 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도로부터, 소망 온도에 있어서의 단위 시간당의 광학 시그널 강도 변화량을 구하여, 이것과, 상기 표준 샘플의 상기 소망 온도에 있어서의 단위 시간당의 알려진 광학 시그널 강도 변화량을 비교하면 좋다. 구체예로서는, 예컨대, 측정한 형광 강도로부터 소망 온도에 있어서의 단위 시간당의 형광 강도 변화량을, 식 「-d 형광 강도 변화량/dt」 또는 「형광 강도 변화량/dt」에 의해 구할 수 있다.
<제조 방법>
본 발명의 제조 방법은, 시료의 광학 시그널을 검출하는 검출 유닛과, 상기 시료의 온도를 제어하는 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치의 제조 방법으로서, 본 발명의 성능 확인 방법에 의해, 상기 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능을 확인하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 제조 공정의 일환으로서, 본 발명의 성능 확인 방법에 의해 제조에 따른 광학 검출 장치의 성능을 확인하는 것이 특징으로서, 그 외의 구성이나 조건은, 어떠한 제한도 없다.
<표준 시약>
본 발명의 표준 시약은, 시료의 광학 시그널을 검출하는 광학 검출 유닛과 상기 시료의 온도를 제어하는 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치에 대해, 상기 광학 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능을 확인하기 위해 사용하는 표준 시약으로서, 광학 시그널 강도와 Tm치가 알려진 핵산 서열과 그 상보쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 표준 시약은, 본 발명의 성능 확인 방법에 있어서의 표준 샘플로서 사용할 수 있다. 상기 핵산 서열과 그 상보쇄는 전술한 바와 동일하고, 또한, 상기 표준 시약의 조성이나 사용 방법 등은 상기 표준 샘플과 동일하다.
다음으로, 본 발명의 실시예에 대해 설명한다. 단, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1
우선, 표준 샘플(표준 시약)로서, 하기 표지화 프로브 및 상기 표지화 프로브에 상보적인 상보쇄 DNA를 포함하는 하기 조성의 반응액을 조제했다. 하기 표지화 프로브의 5'말단의 (BODIPY FL)는 형광 색소이고, 3'말단의(P)는 인산화를 나타낸다.
[표 1]
(반응액)
증류수 19.5
10×Gene Taq buffer* 2.5
5 μM 표지화 프로브 1.0
5 μM 상보쇄 DNA 2.0
합계 25.0 μL
* 상품명 Gene Taq FP: 일본유전자사제
(표준 샘플)
표지화 프로브5'-(BODIPY FL)-caccccctgaatccaggtaagg-P-3'(서열 번호 1)
상보쇄 DNA5'-ttggccttacctggattcagggggtgcttacaatcctgat-3'(서열 번호 2)
미리, 상기 반응액의 알려진 Tm치 및 알려진 형광 강도를, 이하와 같이 하여 결정했다. 성능 평가의 대상인 후술하는 형광 검출 장치와 동일한 형으로서, 미리, 광학 검출 유닛의 검출 성능 및 온도 제어 성능이 정상인 것이 확인된 광학 검출 장치(상품명 Smart Cycler, Cepheld사제)를 준비했다. 그리고, 이 광학 검출 장치를 이용하여, 후술하는 성능 확인할 때와 동일한 조건으로, 소정의 온도 범위(45∼95℃)에 있어서의 형광치(형광 강도)를 측정했다. 또한, 이 형광치로부터 형광 강도의 변화량을 나타내는 미분치 「-d 형광 강도 증가량/dt」를 구했다. 이 결과, 상기 반응액의 Tm치는, 70.6℃이고, 80℃에 있어서의 형광치는, 1072였다. 이들을, 각각 알려진 Tm치 및 알려진 형광 강도로 했다. 또한, 본 발명에 있어서는, 어느쪽의 온도에 있어서의 형광치를 알려진 형광 강도로 하여도 좋다. 예컨대, 하기 표 2에 복수의 온도에 있어서의 형광치(알려진 형광 강도)를 나타낸다.
그리고, 성능 평가의 대상인 형광 검출 장치, 즉, 광학 시그널의 검출 성능 및 온도 제어 성능이 불명인 형광 검출 장치(상품명 Smart Cycler, Cepheid사제)를 준비하여, 상기 반응액에 대해 Tm 해석을 행했다. 측정 파장은 450∼495 nm(Excitation), 505∼537 nm(Emission)로 했다. 이 결과를, 도 1에 도시한다. 도 1은 온도 상승에 따르는 형광 강도의 변화를 나타내는 Tm 해석의 그래프이고, 종축의 미분치란 「-d 형광 강도 증가량/dt」을 나타낸다. 또한, 복수의 온도에 있어서의 형광치(측정 형광 강도)를 하기 표 2에 나타낸다.
[표 2]
도 1에 도시한 바와 같이, 형광 강도의 미분치가 피크를 나타내는 온도는 70.6℃이고, 상기 알려진 Tm치 70.9℃와 동일한 정도였다. 또한, 80℃에 있어서의 형광치는 984이고, 알려진 형광치 1072와 거의 동일한 정도였다. 이상의 결과로부터, 형광 강도의 검출 및 온도 제어의 어느쪽의 성능도 문제가 없는 것을 알았다. 이와 같이, 본 실시예의 방법에 따르면, 1회의 Tm 해석의 결과로부터, 형광 강도의 검출 및 온도 제어의 어느쪽의 성능에 대해서도 확인하는 것이 가능하다.
[산업상 이용 가능성]
이상과 같이, 본 발명의 방법에 따르면, 성능의 평가 대상인 광학 검출 장치에 의해, 표준 샘플을 이용하여 Tm 해석을 행함으로써 상기 광학 검출 유닛의 성능과 온도 제어 유닛의 성능의 양쪽에 대해 확인하는 것이 가능해진다. 구체적으로는, 표준 샘플의 측정 결과와, 상기 표준 샘플의 알려진 조건(강도나 Tm치)을 비교함으로써, 예컨대, 거의 동일한 결과이면 광학 검출 장치의 성능은 정확하고, 다른 결과이면, 상기 성능은 부정확하다고 판단할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 따르면, 온도 측정을 위해, 종래와 같이 외부에서 온도 측정기 등을 도입할 필요도 없다. 이와 같이, 본 발명의 성능 확인 방법에 따르면, 간이하고 또한 간편하며, 광학 검출 장치에 있어서의 광학 시그널의 검출 성능 및 온도 제어 성능의 두가지를 동일한 방법으로 확인할 수 있기 때문에, 매우 유효한 기술이라고 할 수 있다.
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agent for use therein
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<213> Artificial
<220>
<223> probe
<400> 1
caccccctga atccaggtaa gg 22
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> complementary oligonucleotide
<400> 2
ttggccttac ctggattcag ggggtgctta caatcctgat 40
Claims (1)
- 시료의 광학 시그널을 검출하는 검출 유닛과, 상기 시료의 온도를 제어하는 온도 제어 유닛을 구비하는 광학 검출 장치에 대해, 상기 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능을 확인하는 방법으로서,
(A) 광학 시그널 강도와 융해 온도가 알려진 핵산 서열 및 그 상보쇄를 포함하는 표준 샘플을 준비하는 공정,
(B) 상기 온도 제어 유닛에 의해, 상기 표준 샘플의 온도를 상승 혹은 하강시키고, 또한, 상기 검출 유닛에 의해, 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도를 측정하는 공정,
(C) 온도 변화에 따르는 상기 광학 시그널 강도의 변동으로부터, 상기 표준 샘플의 융해 온도를 결정하는 공정,
(D) 상기 (B) 공정에서 측정한 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도와 상기 표준 샘플의 알려진 광학 시그널 강도, 및 상기 (C) 공정에서 결정한 상기 표준 샘플의 융해 온도와 상기 표준 샘플의 알려진 융해 온도를, 각각 비교하여, 상기 검출 유닛에 의한 광학 시그널의 검출 성능 및 상기 온도 제어 유닛에 의한 온도 제어 성능을 확인하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는 광학 검출 장치의 성능 확인 방법이며,
상기 (D) 공정에 있어서,
상기 (B) 공정에서 측정한 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도가, 상기 알려진 광학 시그널 강도를 포함하는 소정의 범위 내이고, 또한 상기 (C) 공정에서 결정한 상기 표준 샘플의 융해 온도가, 상기 알려진 융해 온도를 포함하는 소정의 범위 내인 경우에, 대상의 광학 검출 장치의 성능을 정상이라고 판단하고,
상기 (B) 공정에서 측정한 상기 표준 샘플의 광학 시그널 강도가, 상기 알려진 광학 시그널 강도를 포함하는 소정의 범위 밖이며, 또는 상기 (C) 공정에서 결정한 상기 표준 샘플의 융해 온도가, 상기 알려진 융해 온도를 포함하는 소정의 범위 밖인 경우에, 대상의 광학 검출 장치의 성능을 이상이라고 판단하는 것인 성능 확인 방법.
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