KR20090117901A - 핵산 증폭 판정 방법 및 핵산 증폭 판정 장치 - Google Patents

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Abstract

핵산 증폭 처리가 행해진 처리후의 샘플에 대하여 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 판단할 수 있는 증폭 판정 방법을 제공한다. 각 온도에서의 핵산 증폭 처리후의 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 준비하여 가장 큰 시그널값(A)를 검색한다. 한편, 상기 각 온도에서의 상기 시그널값에 대하여 연속하는 2점 사이를 미분하여 미분값을 얻고, 상기 미분값에 대하여 연속하는 4점 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는다. 상기 2회 미분값 중, 상기 증폭 목적 핵산의 Tm값을 포함하는 소정 온도 범위에서의 2회 미분값에서 최대의 2회 미분값(Dmax')과 최소의 2회 미분값(Dmin')을 선택하여, 식 (B)=(Dmax')-(Dmin')로부터 2회 미분값의 최대차(B)를 얻는다. 식 X=(B)/(A)를 연산하여, 상기 X가 [X>소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 정상, 상기 X가 [X≤소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 불량이라고 판단한다.

Description

핵산 증폭 판정 방법 및 핵산 증폭 판정 장치{NUCLEIC-ACID AMPLIFICATION JUDGING METHOD AND NUCLEIC-ACID AMPLIFICATION JUDGING DEVICE}
본 발명은, 핵산 증폭 판정 방법, 핵산 증폭 판정 시스템, 핵산 증폭 판정 장치, 상기 판정 방법을 컴퓨터 상에서 실행 가능한 컴퓨터 프로그램 및 그것을 저장한 전자 매체에 관한 것이다.
최근, 유전자의 다형(多型)이나 변이 등을 검출하는 방법으로서, 표적 핵산과 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해 곡선을 해석하는 방법(융해 곡선 해석 방법)이 널리 채택되고 있다. 상기 융해 곡선 해석 방법에 의하면, 상기 융해 곡선에 대하여, 상기 이중쇄의 융해 온도(Tm: melting temperature)에서의 피크의 유무를 해석함으로써, 유전자의 다형(유전자형)의 판단이나 변이의 유무 검출이 가능해진다.
Tm은 일반적으로 이하와 같이 정의되고 있다. 이중쇄 핵산을 포함하는 용액을 가열해 가면 260 ㎚에서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 이중쇄 핵산에서의 양쇄 사이의 수소 결합이 가열에 의해 풀어져, 단일쇄 핵산으로 해리(이중쇄 핵산의 융해)되는 것이 원인이다. 그리고, 모든 이중쇄 핵산이 해리되어 단일쇄 핵산이 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(이중쇄 핵산만의 흡광도)의 약 1.5배 정도 를 나타내고, 이에 의해 융해가 완료되었다고 판단할 수 있다. 이 현상에 기초하여, 융해 온도 Tm(℃)는 일반적으로 흡광도가 흡광도 전체 상승분의 50%에 도달했을 때의 온도로 정의된다.
이중쇄 핵산의 이와 같은 특성을 이용하면, 예를 들어 이하와 같이 하여 표적 부위에서의 다형이나 변이의 검출이 가능하다. 즉, 변이형의 표적 부위를 포함하는 표적 핵산 서열에 상보적인 변이형 검출용 프로브를 이용하여, 분석 대상인 단일쇄 핵산과 상기 프로브의 이중쇄 핵산을 형성하고, 형성된 이중쇄 핵산에 가열 처리를 실시하여, 온도 상승에 따른 이중쇄의 해리를 흡광도 등의 시그널 측정에 의해 검출하고, 이 검출 결과에 기초하여 Tm값에서의 상기 시그널의 거동에 의해 표적 부위에서의 변이의 유무를 판단하는 방법이다(비특허문헌 1, 특허문헌 1참조). Tm값은, 이중쇄 핵산의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아진다. 따라서, 변이형의 표적 부위를 포함하는 표적 핵산 서열과 그것에 100% 상보적인 변이형 검출용 프로브의 이중쇄 DNA, 및, 상기 표적 부위가 야생형인 핵산 서열과 상기 변이형 검출용 프로브의 이중쇄 DNA 각각에 대하여, 미리 평가 기준이 되는 Tm값을 구해 둔다. 상술한 바와 같이, 상동성이 높을수록 Tm값은 높아지므로, 전자, 즉 표적 부위가 변이형인 경우의 Tm값(이하, 「Tmm값」이라고도 함)은 상대적으로 높고, 후자, 즉 표적 부위가 야생형인 경우의 Tm값(이하, 「Tmw값」이라고도 함)은 상대적으로 낮아진다. 그리고, 분석 대상인 단일쇄 핵산과 상기 변이형 검출용 프로브로 형성되는 이중쇄 핵산의 융해 곡선을 작성하고, 미리 구한 Tmm값 및 Tmw값 중 어디에 시그널의 피크가 존재하는지를 확인한다. 그 결과, Tmm값 부근에 피크가 존재하는 경우, 상기 변이형 검출용 프로브와 100% 매치하기 때문에, 분석 대상인 단일쇄 핵산은 변이형의 다형이라고 판단할 수 있다. 한편, Tmw값 부근에 피크가 존재하는 경우, 상기 변이형 프로브와 1염기 미스매치하기 때문에, 분석 대상인 단일쇄 핵산은 야생형의 다형이라고 판단할 수 있다. 또, 다형이 호모 접합성인지 헤테로 접합성인지에 대해서도 판단할 수 있다. 즉, 한쌍의 대립 유전자의 분석에서, Tmm값 부근과 Tmw값 부근 양쪽에 피크가 존재하는 경우 헤테로 접합성으로 판단할 수 있고, 한편, Tmm값 부근에만 피크가 존재하는 경우는 변이형의 호모 접합성이고, Tmw값 부근에만 피크가 존재하는 경우는 야생형의 호모 접합성이라고 판단할 수 있다.
이러한 융해 곡선 해석을 할 때에는, 통상 RNA나 DNA를 포함하는 샘플에 대하여 상기 표적 핵산 서열의 증폭 처리를 행하여, 얻어진 증폭 산물에 대해 상술한 바와 같은 프로브와의 이중쇄 형성이나 가열에 의한 해리가 행해진다. 그러나, 증폭 처리에서 상기 표적 핵산 서열을 충분히 증폭할 수 없는 경우, 다형을 오판단한다는 문제가 있다. 따라서, 종래의 방법에서는, 상기 증폭 처리후의 샘플에 대하여, 각 온도와, 상기 각 온도에서의 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값 또는 시그널값의 미분값(이하, 「시그널 미분값」이라 함)의 관계를 나타내는 융해 곡선의 그래프를 작성하여, 상기 표적 핵산 서열의 Tmm값 또는 Tmw값 부근에 피크가 존 재하는지의 여부를 육안으로 판단하였다. 그러나, 이러한 유전자 해석에서의 판단에는 전문적 지식이 필요하기 때문에, 예컨대, 용이하게 피크인지의 여부를 판단하는 것이 곤란하다. 또, 육안으로 판단하는 경우, 판단 기준에 개인차가 생기는 것도 문제시되고 있다. 이 때문에, 종래의 방법에서는, 핵산 증폭이 정상적으로 이루어지지 않은 샘플에 대해서도, 최종적인 융해 곡선 해석까지 행하게 되어 그 수고가 문제시되고 있다. 또, 이러한 이유 때문에, 일반적인 분석이나 진단의 현장에, 융해 곡선 해석을 이용한 유전자 분석ㆍ유전자 진단의 용도를 확대하는 것이 어려운 상황이다. 또한, 복수의 검체를 일괄적으로 분석하는 것도, 그 전문성 등 때문에 곤란하였다.
비특허문헌 1 : 크리니컬ㆍ케미스트리, 2000년, 제46호, 제5호, p631­635,
특허문헌 1 : 일본 특허 공개 제2005-58107호 공보
따라서, 본 발명은 핵산 증폭 처리가 행해진 처리후의 샘플에 대하여 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 판단하는 것이 가능한 증폭 판정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은, 그와 같은 증폭 판정 방법을 실행하기 위한 증폭 판정 시스템, 증폭 판정 장치, 프로그램 및 전자 매체의 제공을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 증폭 판정 방법은, 핵산 증폭 처리가 행해진 처리후의 샘플에 대하여 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 판정하는 증폭 판정 방법으로서,
각 온도에서의 상기 처리후 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 준비하는 시그널값 준비 공정,
상기 각 온도에서의 상기 시그널값에서 최대값(A)를 검색하는 최대값(A) 검색 공정,
상기 각 온도에서의 상기 시그널값에 대하여, 연속하는 시그널값 사이를 미분하여 미분값을 얻는 미분 연산 공정,
상기 공정에서 얻어진 미분값에 대하여, 연속하는 미분값 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는 2회 미분 연산 공정,
상기 공정에서 얻어진 2회 미분값 중, 상기 목적 핵산의 Tm값을 포함하는 소정 온도 범위에서의 2회 미분값에서 최대의 2회 미분값(Dmax')과 최소의 2회 미분값(Dmin')을 선택하여, 하기 식으로부터 2회 미분값의 가장 큰 차(B)를 얻는 최대차(B) 연산 공정,
B=(Dmax')-(Dmin')
상기 최대값(A) 및 상기 최대차(B)를 이용하여 하기 식을 연산하는 연산 공정
X=(B)/(A)
및
상기 X가 [X>소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 정상이라고 판단하고, 상기 X가 [X≤소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 불량이라고 판단하는 판정 공정
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 상술한 바와 같은 2회 미분 등의 연산을 이용함으로써, 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 용이하게 판정할 수 있다. 이 때문에, 예컨대 종래와 같이, 판정을 하는 개인의 판정 기준의 차이나, 전문적 지식이 필요한 문제를 회피하는 것이 가능해진다. 또, 목적 핵산의 증폭 유무를 용이하게 판단할 수 있기 때문에, 예를 들어, 유전자형의 오판단의 원인이 되는 증폭 불량을 나타내는 샘플에 대해서는, 그 이후의 융해 곡선 해석을 중지할 수 있다. 이에 따라, 최종적으로, 융해 곡선 해석을 보다 용이하게, 높은 신뢰성으로 행하는 것이 가능해진다. 특히, 종래의 유전자 해석 장치 등에 본 발명의 시스템을 설치함으로써, 예를 들어, 증폭 유무의 확인은 물론, 핵산의 증폭부터 유전자형의 판단까지 전자동화하여 행하는 것도 가능해진다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 일반적인 분석이나 진단의 현장에서도 사용 용도가 확대되고, 다량의 검체에 대해서도 용이한 해석을 가능하게 하기 때문에, 특히 유전자 해석의 분야에서 매우 유용한 기술이라 할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 시스템을 이용한 스탠드얼론형 장치의 일례의 전체 구성도이다.
도 2는, 본 발명의 시스템을 이용한 네트워크 이용형 장치의 일례의 전체 구성도이다.
도 3은, 상기 스탠드얼론형 장치의 기기 구성의 일례를 나타내는 블록도이 다.
도 4는, 상기 네트워크형 장치의 기기 구성의 일례를 나타내는 블록도이다.
도 5는, 본 발명의 시스템을 실시하기 위한 플로우차트의 일례이다.
도 6은, 본 발명의 실시형태에서의 융해 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 7은, 본 발명의 실시형태에서의 미분 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 8은, 본 발명의 실시형태에서의 2회 미분 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 9는, 본 발명의 실시형태에서의 X=(B)/(A)를 나타내는 그래프이다.
본 발명에서 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널은, 예를 들어, 상기 샘플의 비융해에 의해 발생하고, 상기 샘플의 융해에 의해 발생이 억제되는 것이어도 되고, 반대로, 상기 샘플의 비융해에 의해 발생이 억제되고, 상기 샘플의 융해에 의해 발생하는 것이어도 된다. 본 발명에서 시그널 미분값은, 예를 들어, 「dF/dT」로 나타내도 되고, 「-dF/dT」로 나타내도 된다. dF는 시그널값의 변화량, dT는 온도의 변화량을 나타낸다. 샘플의 융해에 의해 시그널의 발생이 억제되는 경우, 시그널 미분값을 「dF/dT」로 나타낸 융해 곡선에서 피크는 계곡형이 되고, 시그널 미분값을 「-dF/dT」로 나타낸 융해 곡선에서 피크는 산형이 된다. 또, 상기 샘플의 융해에 의해 시그널이 발생하는 경우, 시그널 미분값을 「dF/dT」로 나타낸 융해 곡선에서 피크는 산형이 되고, 시그널 미분값을 「-dF/dT」로 나타낸 융해 곡선에서 피크는 계곡형이 된다. 시그널이 샘플의 융해 및 비융해의 어느 것에서 발생하더라도, 또 시그널 미분값을 어떤 식으로 나타낸 경우라도, 피크의 크기는 시그 널 미분값의 절대값의 크기로 평가할 수 있다.
본 발명에서 시그널값의 종류는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 흡광도(흡수 강도), 형광 강도 등을 들 수 있다. 상기 시그널의 구체예로는, 예를 들어 상술한 바와 같은, 이중쇄의 융해에 의해 증가하는 260 ㎚에서의 흡광도를 들 수 있다. 또, 상기 시그널값은, 형광 물질을 사용한 경우, 상기 형광 물질에 따른 여기광에 의해 방사되는 형광의 강도이어도 된다. 상기 형광 물질은, 상술한 바와 같이, 이중쇄의 형성(비융해)에 의해 형광을 발하는 것이어도 되고, 이중쇄의 융해에 의해 형광을 발하는 것이어도 된다. 형광 물질의 구체예로서, 에티듐브로마이드나 SYBR(등록상표) Green과 같은 인터컬레이터를 들 수 있다. 이들은, 일반적으로 이중쇄의 형성(비융해)에 의해 형광을 발하고, 이중쇄의 융해에 의해 형광의 발생이 억제된다. 또, 상기 형광 물질은, 예를 들어, 이중쇄 핵산을 구성하는 적어도 한쪽의 단일쇄 핵산에 결합되어 있어도 된다. 상기 형광 물질이 결합된 단일쇄 핵산으로서는, 예를 들어, 구아닌 소광(消光) 프로브로서 알려져 있는 QProbe(등록상표)와 같은 소위 형광 소광 프로브를 들 수 있다. 상기 형광 소광 프로브는, 일반적으로 이중쇄의 형성에 의해 형광이 소광하고, 이중쇄의 융해에 의해 형광이 발생한다. 본 발명은, 시그널값의 처리에 특징이 있으며, 시그널의 종류 등에는 전혀 제한되지 않는다.
<증폭 판정 방법>
본 발명의 증폭 판정 방법에 대하여, 일례로서, 증폭시키는 목적 핵산(이하, 「표적 핵산」이라 함)이 표적 부위에 다형을 갖는 핵산이며, 상기 목적 핵산의 Tm 값이, 상기 표적 부위에 다형을 갖는 핵산과 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산(이하, 「검출용 핵산」이라 함)으로 구성되는 이중쇄 핵산의 Tm값인 예를 들어 설명한다. 본 발명은 이것에 제한되지는 않는다.
시그널값 준비 공정
우선, 각 온도에서의 상기 처리후 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 준비한다.
상기 시그널값의 온도 간격은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 0.1∼5℃의 간격이며, 바람직하게는 0.2∼3℃의 간격, 보다 바람직하게는 0.8∼1.2℃의 간격이다. 또, 상기 온도 간격은, 예를 들어, 상이해도 되지만, 등간격인 것이 바람직하다.
시그널값은, 예를 들어, Tm값을 포함하는 온도 범위에 대하여 준비하는 것이 바람직하다. 상기 표적 부위가 다형을 갖는 경우, 후술하는 바와 같이, 상기 표적 핵산과 상기 검출용 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 Tm값으로는, 상대적으로 높은 온도인 TmH값과 상대적으로 낮은 온도인 TmL값이 상정된다. 따라서, 시그널값은, 예를 들어, TmH값 및 TmL값 모두를 포함하는 광역의 온도 범위에 대하여 준비하는 것이 바람직하다. 상기 온도 범위로는, 예를 들어, 하한이 TmL값보다 1∼20℃ 낮은 온도인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 TmL값보다 1∼10℃ 낮은 온도이며, 상한이 TmH값보다 1∼20℃ 높은 온도인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 TmH값보 다 1∼10℃ 높은 온도이다. 구체예로서, 상기 온도 범위는 [TmL값-5]℃∼[TmH값+5]℃인 것이 바람직하다.
상기 표적 부위가 다형을 갖는 경우, 상기 표적 핵산으로는, 상기 표적 부위가 야생형인 표적 핵산(이하, 「야생형 표적 핵산」이라 함)과 상기 표적 부위가 변이형인 표적 핵산(이하, 「변이형 표적 핵산」이라 함)을 생각할 수 있다. 상기 야생형 표적 핵산과 변이형 표적 핵산은, 통상 상기 표적 부위에서 1염기만이 상이하기 때문에, 상기 이중쇄 핵산의 Tm값으로는, 예를 들어, 상기 검출용 핵산과 100% 매치하는 이중쇄의 TmH값과, 상기 검출용 핵산과 1염기 미스매치하는 이중쇄의 TmL값을 들 수 있다. Tm값은, 이중쇄의 상동성이 상대적으로 높을수록 높아지고, 상대적으로 낮을수록 낮아지기 때문에, 전자의 TmH값은 후자의 TmL값보다 높은 온도가 된다. 구체예로서, 예를 들어, 변이형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 검출용 핵산(이하, 「변이형 검출용 핵산」이라 함)을 사용하는 경우에는, 변이형 표적 핵산과 상기 변이형 검출용 핵산의 이중쇄 핵산의 Tm값과, 야생형 표적 핵산과 상기 변이형 검출용 핵산의 이중쇄 핵산의 Tm값을 들 수 있다. 이 경우, 전자의 Tm값이 TmH값이 되고, 후자의 Tm값이 TmL값이 된다. 반대로, 야생형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 검출용 핵산(이하, 「야생형 검출용 핵산」이라 함)을 사용하는 경우에는, 야생형 표적 핵산과 상기 야생형 검출용 핵산의 이중쇄 핵산의 Tm값과, 변이형의 표적 핵산과 상기 야생형 검출용 핵산의 이중쇄 핵산의 Tm값을 들 수 있 다. 이 경우, 전자의 Tm값이 TmH값이 되고, 후자의 Tm값이 TmL값이 된다. 상기 Tm값은, 상기 표적 핵산의 서열이나 상기 검출용 핵산의 서열 등에 따라 적절하게 결정할 수 있고, 구체적으로는, 예를 들어, 종래에 공지된 MELTCALC 소프트웨어(http://www.meltcalc.com/) 등에 의해 산출할 수 있고, 또 최근접 염기쌍법(Nearest Neighbor Method)에 의해 결정할 수 있다(이하, 동일). 본 실시형태에서, 상기 처리후 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값은, 예를 들어, 상기 처리후 샘플에서의 상기 표적 핵산의 증폭물과 상기 표적 핵산에 하이브리다이즈 가능한 검출용 핵산으로 이루어지는 이중쇄 핵산의 융해 상태를 나타내는 시그널값일 수도 있다.
최대값 (A) 검색 공정
다음으로, 상기 각 온도에서의 상기 시그널값에서 최대값(A)를 검색한다. 이 때, 최대값(A)를 검색할 수 없는 경우는 증폭 불량으로 판단할 수 있다.
미분 연산 공정
다음으로, 상기 각 온도에서의 상기 시그널값에 대하여, 연속하는 시그널값 사이를 미분하여 미분값을 얻는다. 상기 미분은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 연속하는 2점 사이∼10점 사이의 미분인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 연속하는 2점 사이∼5점 사이이며, 특히 바람직하게는 연속하는 2점 사이의 미분이다. 예를 들어, 2점 사이를 미분하는 경우, 임의의 점(p)에서의 미분값(Dp)은, 임의의 점(p)의 시그널값(Sp)과 근접하는 점(p+1)의 시그널값(Sp +1) 사이에서의 미분값이 어도 되고, 임의의 점(p)의 시그널값(Sp)과 근접하는 점(p-1)의 시그널값(Sp -1) 사이에서의 미분값이어도 되지만, 각 점에서 동일하게 하여 미분값을 구하는 것이 바람직하다. 전자의 경우 p는 양의 정수이고, 후자의 경우 p는 2 이상의 양의 정수이다.
2회 미분 연산 공정
또한, 상기 공정에서 얻어진 미분값에 대하여, 연속하는 복수점 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는다. 상기 미분값의 미분은, 예를 들어, 연속하는 2∼10점 사이에서 행하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3∼7점 사이이며, 더욱 바람직하게는 3∼5점 사이이며, 특히 바람직하게는 4점 사이이다. 구체예로서, 4점 사이를 미분하는 경우, 임의의 점(p)에서의 2회 미분값(Dp')은, 예를 들어, 하기 예 1∼예 3 중 어느 것이어도 되지만, 각 점에 대하여 동일하게 하여 2회 미분값을 구하는 것이 바람직하다. 임의의 점(p)의 2회 미분값(Dp')은, 예 1로서, 예를 들어, 점(p), (p+1), (p+2), (p+3)의 계 4점 사이의 미분에 의해 산출해도 되고, 예 2로서, 점(p-1), (p), (p+1), (p+2)의 계 4점 사이의 미분에 의해 산출해도 되고, 예 3으로서, 점(p-2), (p-2), (p), (p+1)의 계 4점 사이의 미분에 의해 산출해도 된다. 상기 p는 상기 예 1의 경우 양의 정수이며, 상기 예 2의 경우 p는 2 이상의 양의 정수이며, 상기 예 3의 경우 p는 3 이상의 양의 정수이다.
최대차 (B) 연산 공정
상기 공정에서 얻어진 2회 미분값 중, 상기 증폭 목적 핵산의 Tm값을 포함하 는 소정 온도 범위에서의 2회 미분값에서 최대의 2회 미분값(Dmax')과 최소의 2회 미분값(Dmin')을 선택하여, 하기 식으로부터 최대차(B)를 얻는다.
(B)=(Dmax')-(Dmin')
상기 소정 온도 범위로는, 상기 증폭 목적 핵산의 Tm값을 포함하고 있으면 되지만, 본 실시형태에서는, 예를 들어, 상술한 바와 같이 TmH값 및 TmL값 모두를 포함하는 온도 범위이다. 구체예로서, 상기 온도 범위의 하한은, TmL값보다 1∼20℃ 낮은 온도인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 TmL값보다 1∼10℃ 낮은 온도이며, 더욱 바람직하게는 [TmL값-5]℃이다. 상기 온도 범위의 상한은, TmH값보다 1∼20℃ 높은 온도인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 TmH값보다 1∼10℃ 높은 온도이며, 더욱 바람직하게는 [TmH값+5]℃이다. 본 공정에서는, 상기 소정 온도 범위에서의 2회 미분값에서 상기 최대값과 최소값을 선택하면 된다. 이 때문에, 예를 들어, 상술한 2회 미분 연산 공정에서는, 상기 소정 온도 범위의 2회 미분값을 얻는 것만으로 충분하다. 또, 상술한 미분 연산 공정에서도, 상기 소정 온도 범위의 2회 미분값을 얻을 수 있는 범위에서 미분값을 얻는 것만으로도 충분하다.
X의 연산 공정
상기 최대값(A) 및 상기 최대차(B)를 이용하여 하기 식을 연산한다.
X=(B)/(A)
판정 공정
상기 X가 [X>소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 정상이라고 판단하고, 상기 X가 [X≤소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 불량이라고 판단한다. 본 발명에서 증폭이 정상이라는 것은, 예를 들어, 표적 핵산이 증폭되어 있고, 신뢰성 있는 유전자 해석을 행하는 것이 가능하다고 생각되는 상태를 의미하며, 증폭이 불량이라는 것은, 예를 들어, 증폭되지 않은, 거의 증폭되지 않은, 또는 다른 핵산이 증폭되어 있는 경우 등이며, 신뢰성 있는 유전자형 해석을 행할 수 없는, 또는 그 우려가 있는 상태를 의미한다.
상기 임계값은, 예를 들어, 시그널의 종류, 시그널의 검출 파장, 시그널(형광)을 발하는 형광 물질의 종류, 증폭 목적 핵산이나 상기 핵산의 표적 부위에서의 다형의 종류, 검출용 핵산의 서열, 이중쇄 핵산을 형성할 때의 반응 용액 조성 등에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 본 발명은, 임계값의 구체적인 값이나 그 설정 방법이 특징이 아니며, 이들에 의해 제한되지 않는다. 임계값의 설정 방법의 일례에 관해서는 후술한다.
본 발명의 증폭 판정 방법은, 예를 들어, 얻어진 판정 결과의 정보를 출력하는 출력 공정을 더 갖는 것이 바람직하다. 상기 판정 결과로는, 예를 들어, 증폭이 정상인지의 여부라는 항목을 들 수 있다. 출력시에는, 예를 들어, 판정 결과만이 출력되어도 되고, 상기 X의 값이나, 온도와 미분값이 플롯된 융해 곡선의 그래프, 온도와 2회 미분값이 플롯된 그래프 등도, 상기 판정 결과와 함께 출력되어도 된다.
또, 상기 시그널값 준비 공정에서의 시그널값은, 예를 들어, 미리 검출에 의해 얻어진 데이터를 사용해도 되지만, 예를 들어, 시그널값 준비 공정에 앞서 시그널값을 검출함으로써 준비해도 된다. 구체적으로는, 상기 시그널값 준비 공정에 앞서, 증폭 처리후의 샘플(예를 들어, 이중쇄 핵산)의 온도를 변화시키는 온도 변화 공정, 및, 온도 변화 시에서의 상기 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 연속적 또는 단속적으로 검출하는 검출 공정을 더 가져도 된다. 상기 온도 변화 공정은, 예를 들어, 상기 샘플을 가열하는 가열 공정이어도 되고, 가열된 샘플을 냉각시키는 냉각 공정이어도 되지만, 상기 가열 공정이 바람직하다.
또, 상기 온도 변화 공정에 앞서, 샘플의 핵산 증폭 처리를 하는 핵산 증폭 공정을 포함해도 된다. 이 때, 상술한 검출용 핵산은, 예를 들어, 핵산 증폭 처리후의 샘플에 첨가해도 되지만, 처리를 연속적으로 행하는 것이 가능하기 때문에, 핵산 증폭 처리에 앞서, 처리전의 샘플에 상기 검출용 핵산을 첨가하는 것이 바람직하다.
더욱 구체적으로, 도 6∼8에 나타내는 그래프를 예를 들어 본 발명의 증폭 판단 방법을 설명한다. 도 6은 온도와 시그널값의 관계를 나타내는 그래프(융해 곡선), 도 7은 온도와 시그널 미분값의 관계를 나타내는 그래프(미분 곡선), 도 8은 온도와 2회 미분값의 관계를 나타내는 그래프(2회 미분 곡선)이다. 도 6에서 Y축은 시그널값, 도 7에서 Y축은 시그널 미분값, 도 8에서 Y축은 2회 미분값이며, 각 도면에서 X축은 온도이다. 또, 상대적으로 낮은 TmL값을 50℃, 상대적으로 높은 TmH값 을 56℃로 하고, 상기 최대차(B) 연산 공정에서의 온도 범위를 45℃(TmL값-5℃)∼61℃(TmH값+5℃)로 설정했다. 이들은 예시이며 본 발명을 제한하지 않는다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 온도와 각 온도에서의 시그널값의 관계를 나타내는 그래프를 준비하여, 최대값(A)를 검색한다. 한편, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 시그널값을 미분하여, 온도와 각 온도에서의 미분값의 관계를 나타내는 그래프를 작성한다. 다음으로, 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 미분값을 미분하여, 상기 온도 범위 45∼61℃와 각 온도에서의 2회 미분값의 관계를 나타내는 그래프를 작성한다. 이어서, 상기 도 8의 그래프에서, 최대의 2회 미분값(Dmax')과 최소의 2회 미분값(Dmin')을 선택하여, 식 (B)=(Dmax')-(Dmin')로부터 2회 미분값의 최대차(B)를 연산한다. 그리고, 상기 최대값(A)와 상기 최대차(B)를 이용하여 식 「X=(B)/(A)」를 연산한다. 얻어진 X가 [X>소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭은 정상이라고 판단하고, [X≤소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭은 불량이라고 판단한다. 증폭이 정상이라고 판단된 상기 핵산 증폭 처리후의 샘플에 대해서만, 예를 들어, 후술하는 바와 같은 융해 곡선 해석을 행하여 다형을 판정하면 된다.
상기 도 6∼8은, 온도 상승에 의한 이중쇄 핵산의 해리에 따라 시그널값이 증가하는 예이지만, 온도 상승에 의한 이중쇄 핵산의 해리에 따라 시그널값이 감소하는 경우에도, 마찬가지로 시그널값의 최대값(A), 2회 미분값의 최대차(B)를 구하여 상기 X를 연산함으로써, 증폭이 정상인지 불량인지를 판단할 수 있다. 또, 이 예에서는 3종류의 그래프를 예시했지만, 본 발명에서는 각종 그래프의 작성은 필수 는 아니다.
본 발명에서 상술한 바와 같이, 상기 X의 임계값은 전혀 제한되지 않고, 표적 핵산(유전자)의 종류나 다형의 종류 등에 따라 적절하게 결정할 수 있다. 이하에 임계값의 설정 방법에 관해 예시하지만, 본 발명은 이것에 제한되지 않는다.
X의 임계값은, 예를 들어, 이하와 같이 결정할 수 있다. 우선, 복수의 핵산 검체에 대하여 핵산 증폭 처리를 하여, 목적 표적 핵산의 증폭이 정상인지 불량인지를 확인한다. 그리고, 각 핵산 검체로부터 얻어진 증폭물과 검출용 핵산의 이중쇄에 대하여 각 온도에서의 시그널값을 검출하고, 상술한 것과 동일하게 하여, 상기 최대값(A) 및 상기 최대차(B)의 결정, 그리고 X=(B)/(A)의 연산을 행한다. 그리고, 각 핵산 검체에 대한 X를 플롯한 그래프를 작성한다. 이 그래프의 일례를 도 9에 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 증폭이 정상인 핵산 검체(■)와 증폭이 불량인 핵산 검체(◆)에서는, 상기 X의 값이 분명히 상이하다. 따라서, 이 그래프로부터 증폭 정상과 증폭 불량의 X의 임계값을 구하여, 상기 임계값으로서 결정하면 된다.
본 발명의 증폭 판정 방법에서, 상기 목적 핵산은, 상술한 바와 같은 2개의 Tm값이 상정되는 상기 표적 부위에 다형을 갖는 표적 핵산에는 한정되지 않는다. Tm값이 하나인 경우, 상기 최대차(B) 연산 공정에서의 Tm값을 포함하는 온도 범위는, 예를 들어, 하한이 Tm값보다 1∼20℃ 낮은 온도인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Tm값보다 1∼10℃ 낮은 온도이며, 더욱 바람직하게는 [Tm값-5]℃이다. 상기 온도 범위의 상한은, Tm값보다 1∼20℃ 높은 온도인 것이 바람직하고, 보다 바 람직하게는 Tm값보다 1∼10℃ 높은 온도이며, 더욱 바람직하게는 [Tm값+5]℃이다.
본 발명의 증폭 판정 방법은, 상기 핵산 증폭 처리후의 샘플의 융해 곡선을 해석하여, 소정 온도 범위에 피크가 존재하는지의 여부를 판정하는 융해 곡선 해석 공정을 더 포함해도 된다. 이에 의해, 증폭 정상으로 판단된 샘플에 대해서만 융해 곡선 해석을 하여, 예를 들어 다형의 해석(유전자형의 해석)을 행할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 증폭 불량인 샘플에 대한 융해 곡선 해석을 제외할 수 있으므로, 종래보다 더욱 신속하고 효율적으로 융해 곡선 해석을 행할 수 있다. 또, 본 발명이 융해 곡선 해석 공정을 포함함으로써, 예를 들어, 핵산 증폭의 판정부터, 증폭 정상으로 판정된 샘플에 대한 융해 곡선 해석 및 다형(유전자형)의 판정까지, 연속하여 행할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 증폭 판정 방법은, 예를 들어, 융해 곡선 해석 방법 또는 다형 해석 방법(또는 유전자형 해석 방법)이라고도 할 수 있다.
본 발명의 증폭 판정 방법은, 예를 들어, 후술하는 본 발명의 증폭 판정 시스템, 본 발명의 증폭 판정 장치, 본 발명의 컴퓨터 프로그램의 실행 등에 의해 실현할 수 있다.
<증폭 판정 시스템>
본 발명의 증폭 판정 시스템은, 핵산 증폭 처리가 행해진 처리후의 샘플에 대하여 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 판정하는 증폭 판정 시스템으로서,
각 온도에서의 상기 처리후 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 입력하 는 시그널값 입력부,
상기 시그널값 입력 공정에 의해 입력된 상기 각 온도에서의 상기 시그널값에서 최대값(A)를 검색하는 최대값(A) 검색부,
상기 각 온도에서의 상기 시그널값에 대하여, 연속하는 시그널값 사이를 미분하여 미분값을 얻는 미분 연산부,
상기 미분 연산부에 의해 얻어진 미분값에 대하여, 연속하는 미분값 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는 2회 미분 연산부,
상기 2회 미분 연산부에 의해 얻어진 2회 미분값 중, 상기 증폭 목적 핵산의 Tm값을 포함하는 소정 온도 범위에서의 2회 미분값에서 가장 큰 2회 미분값(Dmax')과 가장 작은 2회 미분값(Dmin')을 선택하여, 하기 식으로부터 2회 미분값의 가장 큰 차(B)를 얻는 최대차(B) 연산부,
B=(Dmax')-(Dmin')
상기 최대값(A) 및 상기 최대차(B)를 이용하여 하기 식을 연산하는 연산부
X=(B)/(A)
및
상기 X가 [X>소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 정상이라고 판단하고, 상기 X가 [X≤소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 불량이라고 판단하는 판정부
를 포함하는 것을 특징으로 한다. 특별히 나타내지 않는 한, 상술한 본 발명의 증폭 판정 방법과 동일하다.
본 발명의 증폭 판정 시스템은, 상기 미분 연산부에서, 예를 들어, 연속하는 2점 사이를 미분하여 미분값을 얻는 것이 바람직하고, 또 상기 2회 미분 연산부에서, 예를 들어, 연속하는 4점 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는 것이 바람직하다.
본 발명의 증폭 판정 시스템에서, 상기 목적 핵산은, 표적 부위에 다형을 갖는 핵산인 것이 바람직하다. 그리고, 상기 목적 핵산의 Tm값은, 상기 표적 부위에 다형을 갖는 핵산(표적 핵산)과 상기 검출용 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 Tm값인 것이 바람직하다. 상기 검출용 핵산이 야생형 검출용 핵산인 경우, 상기 증폭 목적 핵산의 Tm값은, 예를 들어, 상기 야생형 표적 핵산과 상기 야생형 검출용 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmH값, 및, 상기 변이형 표적 핵산과 상기 야생형 검출용 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmL값이다. 또, 상기 검출용 핵산이 변이형 검출용 핵산인 경우, 상기 증폭 목적 핵산의 Tm값은, 예를 들어, 상기 변이형 표적 핵산과 상기 변이형 검출용 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmH값, 및, 상기 야생형 표적 핵산과 상기 변이형 검출용 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmL값이다.
상기 최대차(B) 연산부에서, 상기 증폭 목적 핵산의 Tm값을 포함하는 소정 온도 범위는, 예를 들어, 하한이 TmL값보다 1∼20℃ 낮은 온도이며, 상한이 TmH값보다 1∼20℃ 높은 온도이며, 바람직하게는 [TmL값-5]℃∼[TmH값+5]℃의 온도 범위이 다.
본 발명의 증폭 판정 시스템은, 상기 핵산 증폭 처리후의 샘플을 온도 변화시키는 온도 변화부, 및, 온도 변화시의 상기 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 연속적 또는 단속적으로 검출하는 검출부를 더 가져도 된다. 상기 온도 변화부로는, 예를 들어, 샘플을 가열하는 가열부이어도 되고, 가열된 샘플을 냉각시키는 냉각부이어도 된다. 상기 온도 변화부로는, 예를 들어, 온도 조절이 가능한 온도 조절기, 히터, 서멀 사이클러 등을 들 수 있고, 상기 검출부로는, 예를 들어, 분광 광도계나 형광 광도계 등을 들 수 있다. 또, 양자를 구비한 부로는, 예를 들어, 리얼타임 PCR에 사용하는 측정기 등을 들 수 있다. 상기 시그널은, 예컨대 형광이며, 상기 검출부는 형광을 검출하는 것이 바람직하다.
본 발명의 증폭 판정 시스템은, 샘플의 핵산 증폭 처리를 행하는 핵산 증폭부를 더 포함해도 된다.
본 발명의 증폭 판정 시스템은, 상기 목적 핵산이 표적 부위에 다형을 갖는 핵산인 경우, 상기 샘플에, 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산을 첨가하는 첨가부를 가져도 된다.
본 발명의 증폭 판정 시스템은, 상기 핵산 증폭 처리후의 샘플의 융해 곡선을 해석하여, 소정 온도 범위에 피크가 존재하는지의 여부를 해석하는 융해 곡선 해석부를 더 포함해도 된다.
본 발명의 증폭 판정 시스템은, 예를 들어, 얻어진 판정 결과의 정보를 출력하는 출력부를 더 갖는 것이 바람직하다. 상기 판정 결과로는, 예를 들어, 증폭이 정상인지의 여부라는 항목을 들 수 있다. 출력시에는, 예를 들어, 판정 결과만이 출력되어도 되고, 상기 X의 값이나, 온도와 미분값이 플롯된 융해 곡선의 그래프, 온도와 2회 미분값이 플롯된 그래프 등도, 상기 판정 결과와 함께 출력되어도 된다.
<증폭 판정 네트워크 시스템 및 그것에 사용하는 단말>
본 발명의 증폭 판정 시스템은, 이하에 나타내는 단말과 서버를 갖는 네트워크 시스템이어도 된다. 특별히 나타내지 않는 한, 상술한 증폭 판정 시스템과 동일하다. 즉, 본 발명의 증폭 판정 시스템은, 핵산 증폭 처리가 행해진 처리후의 샘플에 대하여 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 해석하는 네트워크 증폭 판정 시스템으로서,
단말과 서버를 가지며,
상기 단말 및 상기 서버는 시스템 밖의 통신망을 통해 접속 가능하고,
상기 단말은,
각 온도에서의 상기 처리후 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 입력하는 시그널값 입력부,
상기 단말 내의 정보를 상기 통신망을 통해 상기 서버에 송신하는 단말측 송신부 및
상기 서버로부터 송신된 정보를 상기 통신망을 통해 수신하는 단말측 수신부를 가지며,
상기 서버는,
상기 서버 내의 정보를 상기 통신망을 통해 상기 단말에 송신하는 서버측 송신부,
상기 단말로부터 송신된 정보를 상기 통신망을 통해 수신하는 서버측 수신부,
상기 서버측 수신부에 의해 수신한 상기 각 온도에서의 상기 시그널값에서 최대값(A)를 검색하는 최대값(A) 검색부,
상기 각 온도에서의 상기 시그널값에 대하여, 연속하는 시그널값 사이를 미분하여 미분값을 얻는 미분 연산부,
상기 미분 연산부에 의해 얻어진 미분값에 대하여, 연속하는 미분값 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는 2회 미분 연산부,
상기 2회 미분 연산부에 의해 얻어진 2회 미분값 중, 상기 증폭 목적 핵산의 Tm값을 포함하는 소정 온도 범위에서의 2회 미분값에서 최대의 2회 미분값(Dmax')과 최소의 2회 미분값(Dmin')을 선택하여, 하기 식으로부터 2회 미분값의 가장 큰 차(B)를 얻는 최대차(B) 연산부,
(B)=(Dmax')-(Dmin')
상기 최대값(A) 및 상기 최대차(B)를 이용하여 하기 식을 연산하는 연산부
X=(B)/(A)
및
상기 X가 [X>소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 정상이라고 판단하고, 상 기 X가 [X≤소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 불량이라고 판단하는 판정부를 포함하며,
적어도 상기 각 온도에서의 상기 시그널값이 상기 단말측 송신부로부터 상기 서버측 수신부에 송신되고, 상기 증폭이 정상인지 불량인지의 판정 결과의 정보가 상기 서버측 송신부로부터 상기 단말측 수신부에 송신되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 단말은, 본 발명의 네트워크 증폭 판정 시스템에 이용하는 단말로서,
상기 단말은,
각 온도에서의 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 입력하는 미분값 입력부,
상기 단말 내의 정보를 상기 통신망을 통해 상기 서버에 송신하는 단말측 송신부 및
상기 서버로부터 송신된 정보를 상기 통신망을 통해 수신하는 단말측 수신부를 가지며,
적어도 상기 각 온도에서의 상기 시그널값이 상기 단말측 송신부로부터 상기 서버측 수신부에 송신되고, 상기 증폭이 정상인지 불량인지의 판정 결과의 정보가 상기 서버측 송신부로부터 상기 단말측 수신부에 송신되는 것을 특징으로 한다.
<증폭 판정 장치>
본 발명의 증폭 판정 장치는, 핵산 증폭 처리가 행해진 처리후의 샘플에 대하여 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 판정하는 증폭 판정 장치로서, 본 발명의 증폭 판정 시스템을 포함하는 것을 특징으로 한다.
<프로그램>
본 발명의 프로그램은 본 발명의 증폭 판정 방법을 컴퓨터 상에서 실행 가능한 컴퓨터 프로그램이다.
<전자 매체>
본 발명의 전자 매체는 본 발명의 컴퓨터 프로그램을 저장한 전자 매체이다.
이어서, 본 발명의 실시예에 관해 설명한다.
제1 시스템 구성예
도 1에, 본 발명의 시스템의 구성의 일례인 스탠드얼론형의 전체 구성도를 나타낸다. 도 1에 나타내는 시스템은, 본 발명의 증폭 판정 시스템(11)으로 구성되고, 증폭 판정 시스템(11)은, 데이터 입출력부(12)와 증폭 판정 계산부(13)로 구성된다. 도 3에, 스탠드얼론형의 증폭 판정 장치의 하드웨어 구성의 일례를 나타낸다. 도시한 바와 같이, 증폭 판정 시스템(11)은, 데이터 입출력부(12), 증폭 판정 계산부(13) 및 기억 장치(37)로 구성되어 있다. 상기 데이터 입출력부(12)는, 프로그램을 실행하는 CPU(31), 입출력 I/F(인터페이스)(32), 데이터를 입력하는 입력 장치(33), 데이터를 출력하는 출력 장치(34)를 갖는 컴퓨터 기기로 구성된다. 입력 장치(33)로는, 예를 들어, 키보드나 마우스 등을 들 수 있고, 출력 장치(34)로는, 예를 들어, 프린터나, LED 또는 액정 디스플레이 등을 들 수 있다. 증폭 판정 계산부는, 프로그램이 저장된 프로그램 저장부(36) 및 프로그램을 실행하는 CPU(35)를 갖는 컴퓨터 기기로 구성된다. 기억 장치(37)에는, 예를 들어, 각 온도에서의 시그 널값, 시그널 미분값, 2회 미분값, Tm값(TmH값, TmL값), Tm값을 포함하는 소정 온도 범위, 검출용 프로브의 서열이나 종류(야생형 검출용인지 변이형 검출용인지) 등의 데이터가 호출 가능한 상태로 기억된다. 기억 장치(37)로는, 예를 들어, ROM, HDD, HD 등을 들 수 있고, CPU의 제어하에 리드/라이트를 제어하여 데이터를 기억한다. 데이터 입출력부(12), 증폭 판정 계산부(13), 기억 장치(37)는 어디까지나 기능상의 것이며, 예를 들어, 1대의 컴퓨터 기기에 일체로 구성해도 되고, 복수대의 컴퓨터 기기에 별개로 구성해도 된다.
또, 본 발명의 시스템은, 샘플을 온도 변화시키는 온도 변화부(예를 들어, 가열 처리하는 가열 처리부), 온도 변화시의 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 연속적 또는 단속적으로 검출하는 검출부를 더 가져도 된다. 그리고, 상기 검출부에서 검출된 시그널값을 상기 데이터 입출력부에 의해 입력해도 된다. 온도 변화부는, 예를 들어, 가열 장치 등을 들 수 있다. 상기 검출부는, 예를 들어, 광학 광도계나 형광 광도계를 들 수 있다. 상기 가열 처리부 및 상기 검출부는, 각각, 예를 들어, 1대의 컴퓨터 기기로 일체로 구성해도 되고, 복수대의 컴퓨터 기기로 별개로 구성해도 된다.
또, 본 발명의 시스템은, 상기 핵산 증폭 처리후의 샘플의 융해 곡선을 해석하여, 소정 온도 범위에 피크가 존재하는지의 여부를 해석하기 위한, 융해 곡선 해석부를 더 구비해도 된다. 이에 의해, 본 발명의 시스템에 의해 증폭이 정상인지 불량인지를 판단할 뿐만 아니라, 정상으로 판단된 상기 샘플에 대하여 융해 곡선 해석을 행하여, 예를 들어, 피크의 존재 유무에 따라 표적 핵산의 다형(유전자형)을 판단할 수 있다. 또, 그 밖에도, 생체 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출부나, 핵산 증폭 반응을 행하는 증폭 처리부 등을 구비해도 된다. 이러한 구성으로 함으로써, 예를 들어, 핵산의 증폭부터 증폭의 판정, 또는, 핵산의 증폭부터 다형(유전자형)의 판정까지, 하나의 시스템으로 자동적으로 행할 수 있는 핵산 증폭 시스템을 제공할 수 있다.
제2 시스템 구성예
도 2에, 서버에서 처리하는 네트워크형 시스템의 전체 구성도를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 실시형태의 시스템은, 본 발명의 증폭 판정 시스템(21) 및 증폭 판정 계산부(23)로 구성되는 서버 시스템(24)으로 구성된다. 증폭 판정 시스템(21)은 데이터 입출력부(22)로 구성된다. 증폭 판정 시스템(21)과 서버 시스템(24)은, 예를 들어, TCP(Transmission Control Protocol)/IP(Internet Protocol)에 기초한 인터넷으로서 기능하는 공중망이나 전용선 등의 통신 회선(100)을 통해 접속되어 있다. 도 4에, 상기 네트워크형 시스템의 장치의 구성의 일례를 나타낸다. 증폭 판정 시스템(21)은, 데이터 입출력부(22) 및 통신 I/F(인터페이스)(47)로 구성되고, 통신 I/F(47)를 통해 통신 회선(100)에 접속되어 있다. 서버 시스템(24)은, 증폭 판정 계산부(23) 및 통신 I/F(48)로 구성되고, 통신 I/F(48)를 통해 통신 회선(100)에 접속되어 있다. 데이터 입출력부(22)는, 프로그램을 실행하는 CPU(41), 입출력 I/F(42), 데이터를 입력하는 입력 장치(43) 및 데이터를 출력하는 출력 장치(44)로 구성된다. 상기 데이터 입출력부(22) 및 통신 I/F(47)는 어디까지나 기능상의 것이며, 예를 들어, 1대의 컴퓨터 기기로 일체로 구성해도 되고, 복수대의 컴퓨터 기기로 별개로 구성해도 된다. 증폭 판정 계산부(23)는, 프로그램을 실행하는 CPU(45) 및 프로그램이 저장된 프로그램 저장부(46)로 구성된다. 증폭 판정 계산부(23) 및 통신 I/F(48)는 어디까지나 기능상의 것이며, 예를 들어, 1대의 컴퓨터 기기로 일체로 구성해도 되고, 복수대의 컴퓨터 기기로 별개로 구성해도 된다.
시스템의 기본적인 처리의 예
본 발명의 증폭 판정 시스템의 기본적인 처리의 예를 도 5의 플로우차트에 나타낸다. 이하, 도 5에 따라 처리의 흐름을 설명한다. 본 발명의 시스템에서의 각 처리 단계는, 예를 들어, CPU, 주메모리, 버스 또는 2차 기억 장치, 인쇄 장치나 디스플레이, 그 밖의 외부 주변 장치 등의 하드웨어 구성부나, 그 외부 주변 기기용의 입출력(I/O) 포트, 이들 하드웨어를 제어하기 위한 드라이버 프로그램이나 그 밖의 어플리케이션 프로그램 등을 적절하게 이용함으로써 실행할 수 있다.
[1] 각 온도에서의 시그널값을 입력한다.
[2] 가장 큰 값(A)을 검색한다.
[3] 각 온도에서의 시그널값을 미분한다.
[4] 시그널 미분값을 더 미분한다.
[5] 상기 2회 미분값에서 최대의 2회 미분값과 최소의 2회 미분값을 검색한다.
[6] 상기 최대 2회 미분값과 최소 2회 미분값의 차, 즉 최대차(B)를 얻는다.
[7] 상기 최대값(A) 및 상기 최대차(B)로부터 연산한 X가 [X>임계값]을 만족하는지를 판단한다.
[8 : Yes] 상기 [7]이 Yes인 경우 증폭은 정상으로 판단한다.
[9 : No] 상기 [7]이 No인 경우 증폭은 불량으로 판단한다.
이상과 같이, 본 발명에 의하면, 상술한 바와 같은 2회 미분 등의 연산을 이용함으로써, 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 용이하게 판정할 수 있다. 이 때문에, 예를 들어, 종래와 같이, 판정하는 개인의 판정 기준의 차이나, 전문적 지식이 필요로 되는 것과 같은 문제를 회피하는 것이 가능해졌다. 이와 같이, 목적 핵산의 증폭 유무를 용이하게 판단할 수 있기 때문에, 예를 들어, 유전자형의 오판단의 원인이 되는 증폭 불량을 나타내는 샘플에 대해서는, 그 이상의 융해 곡선 해석을 중지할 수 있다. 이 때문에, 최종적으로는, 융해 곡선 해석을 보다 용이하게 높은 신뢰성으로 행하는 것이 가능해졌다. 특히, 종래의 유전자 해석 장치 등에 본 발명의 시스템을 설치함으로써, 예를 들어, 증폭 유무의 확인은 물론, 핵산의 증폭부터 유전자형의 판단까지를 전자동화하여 행하는 것도 가능해진다, 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 일반적인 분석이나 진단의 현장에서도 사용할 수 있고, 다량의 검체에 대해서도 용이한 해석을 가능하게 하기 때문에, 특히 유전자 해석의 분야에서 매우 유용한 기술이라 할 수 있다.

Claims (19)

  1. 핵산 증폭 처리가 행해진 처리후의 샘플에 대하여 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 판정하는 증폭 판정 방법으로서,
    각 온도에서의 상기 처리후 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 준비하는 시그널값 준비 공정,
    상기 각 온도에서의 상기 시그널값에서 최대값(A)를 검색하는 최대값(A) 검색 공정,
    상기 각 온도에서의 상기 시그널값에 대하여, 연속하는 시그널값 사이를 미분하여 미분값을 얻는 미분 연산 공정,
    상기 공정에서 얻어진 미분값에 대하여, 연속하는 미분값 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는 2회 미분 연산 공정,
    상기 공정에서 얻어진 2회 미분값 중, 상기 목적 핵산의 Tm값을 포함하는 소정 온도 범위에서의 2회 미분값에서 최대의 2회 미분값(Dmax')과 최소의 2회 미분값(Dmin')을 선택하여, 하기 식으로부터 2회 미분값의 가장 큰 차(B)를 얻는 최대차(B) 연산 공정,
    (B)=(Dmax')-(Dmin')
    상기 최대값(A) 및 상기 최대차(B)를 이용하여 하기 식을 연산하는 연산 공정
    X=(B)/(A)
    및
    상기 X가 [X>소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 정상이라고 판단하고, 상기 X가 [X≤소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 불량이라고 판단하는 판정 공정
    을 포함하는 증폭 판정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미분 연산 공정에서, 연속하는 2점 사이를 미분하여 미분값을 얻는 증폭 판정 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 2회 미분 연산 공정에서, 연속하는 4점 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는 증폭 판정 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 목적 핵산이 표적 부위에 다형을 갖는 핵산인 증폭 판정 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 목적 핵산의 Tm값이, 상기 표적 부위에 다형을 갖는 핵산과 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 Tm값인 증폭 판정 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산이, 야생형의 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산인 경우,
    상기 목적 핵산의 Tm값은, 상기 표적 부위가 야생형인 핵산과 상기 야생형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmH값, 및, 상기 표적 부위가 변이형인 핵산과 상기 야생형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmL값이며,
    상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산이, 변이형의 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산인 경우,
    상기 목적 핵산의 Tm값은, 상기 표적 부위가 변이형인 핵산과 상기 변이형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmH값, 및, 상기 표적 부위가 야생형인 핵산과 상기 변이형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmL값인 증폭 판정 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 최대차(B) 연산 공정에서, 상기 목적 핵산의 Tm값을 포함하는 소정 온도 범위가, 하한이 TmL값보다 1∼20℃ 낮은 온도이며, 상한이 TmH값보다 1∼20℃ 높은 온도인 증폭 판정 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 온도 범위가 [TmL값-5]℃∼[TmH값+5]℃인 증폭 판정 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 시그널값 준비 공정에 앞서,
    상기 핵산 증폭 처리후의 샘플의 온도를 변화시키는 온도 변화 공정,
    및
    온도 변화시의 상기 처리후의 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 연속적 또는 단속적으로 검출하는 검출 공정을 더 갖는 증폭 판정 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 목적 핵산이 표적 부위에 다형을 갖는 핵산이며,
    상기 온도 변화 공정에 앞서, 상기 샘플에, 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산을 첨가하는 첨가 공정을 갖는 증폭 판정 방법.
  11. 핵산 증폭 처리가 행해진 처리후의 샘플에 대하여 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 판정하는 증폭 판정 시스템으로서,
    각 온도에서의 상기 처리후 샘플의 융해 상태를 나타내는 시그널값을 입력하는 시그널값 입력부,
    상기 시그널값 입력 공정에 의해 입력된 상기 각 온도에서의 상기 시그널값에서 최대값(A)를 검색하는 최대값(A) 검색부,
    상기 각 온도에서의 상기 시그널값에 대하여, 연속하는 시그널값 사이를 미분하여 미분값을 얻는 미분 연산부,
    상기 미분 연산부에 의해 얻어진 미분값에 대하여, 연속하는 미분값 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는 2회 미분 연산부,
    상기 2회 미분 연산부에 의해 얻어진 2회 미분값 중, 상기 목적 핵산의 Tm값을 포함하는 소정 온도 범위에서의 2회 미분값에서 최대의 2회 미분값(Dmax')과 최소의 2회 미분값(Dmin')을 선택하여, 하기 식으로부터 2회 미분값의 가장 큰 차(B)를 얻는 최대차(B) 연산부,
    B=(Dmax')-(Dmin')
    상기 최대값(A) 및 상기 최대차(B)를 이용하여 하기 식을 연산하는 연산부
    X=(B)/(A)
    및
    상기 X가 [X>소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 정상이라고 판단하고, 상기 X가 [X≤소정 임계값]을 만족하는 경우 증폭이 불량이라고 판단하는 판정부
    를 포함하는 증폭 판정 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 상기 미분 연산부에서 연속하는 2점 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는 증폭 판정 시스템.
  13. 제11항에 있어서, 상기 2회 미분 연산부에서 연속하는 4점 사이를 미분하여 2회 미분값을 얻는 증폭 판정 시스템.
  14. 제11항에 있어서, 상기 목적 핵산이 표적 부위에 다형을 갖는 핵산인 증폭 판정 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 목적 핵산의 Tm값이, 상기 표적 부위에 다형을 갖는 핵산과 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 Tm값인 증폭 판정 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산이, 야생형의 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산인 경우,
    상기 목적 핵산의 Tm값은, 상기 표적 부위가 야생형인 핵산과 상기 야생형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmH값, 및, 상기 표적 부위가 변이형인 핵산과 상기 야생형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmL값이며,
    상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산이, 변이형의 상기 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산인 경우,
    상기 목적 핵산의 Tm값은, 상기 표적 부위가 변이형인 핵산과 상기 변이형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmH값, 및, 상기 표적 부위가 야생형인 핵산과 상기 변이형의 표적 부위에 하이브리다이즈 가능한 핵산으로 구성되는 이중쇄 핵산의 TmL값인 증폭 판정 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 상기 최대차(B) 연산부에서, 상기 목적 핵산의 Tm값을 포함하는 소정 온도 범위가, 하한이 TmL값보다 1∼20℃ 낮은 온도이며, 상한이 TmH값보다 1∼20℃ 높은 온도인 증폭 판정 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 상기 온도 범위가 [TmL값-5]℃∼[TmH값+5]℃인 증폭 판정 시스템.
  19. 핵산 증폭 처리가 행해진 처리후의 샘플에 대하여 목적 핵산의 증폭이 행해졌는지의 여부를 판정하는 증폭 판정 장치로서,
    제11항에 기재된 증폭 판정 시스템을 포함하는 증폭 판정 장치.
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