JP7628085B2 - 鎖分離温度に基づくＤＮＡに対してＲＮＡ標的の優先的／選択的増幅のためのｄＩＴＰの利用 - Google Patents

Description

本開示は、核酸検出の分野に関する。この分野では、本発明は、サンプル中に存在し得る標的核酸の増幅、検出及び／又は定量に関し、特に、２’－デオキシイノシン５’－三リン酸（ｄＩＴＰ）をデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）として、プライマー及びプローブと共に利用する、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に対して標的リボ核酸（ＲＮＡ）の選択的かつ優先的な増幅、検出及び／又は定量に関する。本発明はさらに、ｄＩＴＰと、ＤＮＡに対してＲＮＡ（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡ）の選択的かつ優先的な増幅及び検出のためのプライマー及びプローブとを含有する反応混合物及びキットを提供する。

多くの生物学的サンプルは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）の両方を含む、いくつかの異なるタイプの核酸を含む。特定の状況では、１種類の核酸のみ（例えば、ＤＮＡではなくＲＮＡ、又は、ＲＮＡではなくＤＮＡ）を選択的かつ優先的に検出することが望ましく、又は有利であり得る。例えば、同じ生物学的サンプル中に存在し得る潜在的に干渉するＲＮＡを検出せずに、ゲノムＤＮＡを検出することが望ましく、又は有利であり得る。あるいは、同じ生物学的サンプル中に存在し得るいかなる潜在的に干渉するゲノムＤＮＡも検出せずに、ＲＮＡを検出することが望ましく、又は有利であり得る。

生物学的サンプルから望ましくない核酸を選択的かつ優先的に枯渇させるか、又は望ましい核酸を濃縮するための当技術分野で周知の方法がある。増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））において、例えば、生物学的サンプルから望ましくないＤＮＡを枯渇させ、それによってＲＮＡの選択性を改善するための既存の溶液の一例は、ＰＣＲサイクリングの前に、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素をサンプル調製材料に添加することである。この場合、ＤＮＡｓｅ酵素は、サンプル中で、ＲＮＡを無傷のままにしながら、ＤＮＡのみを選択的かつ優先的に分解する。しかしながら、この方法論には欠点がある。例えば、この方法は、反応にＤＮａｓｅを導入するリスクをもたらす。さらに、この方法は、残留ＤＮａｓｅによるＰＣＲ中のオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー、プローブ及びアンプリコン／増幅産物）の分解を防ぐために、ＰＣＲサイクルの前にサンプル中のＤＮａｓｅを除去する余分な工程を必要とする。ＤＮａｓｅが排除されず、ＰＣＲ反応に導入された場合、プライマー、プローブ及びアンプリコン／増幅産物などのオリゴヌクレオチドは分解され、ＰＣＲは成功しない。ＤＮＡに対する優先的かつ選択的なＲＮＡ増幅のための既存の解決策のさらに別の例は、ＲＮＡ内のポリＡテール領域の周りのＰＣＲアッセイを設計することである。しかしながら、全てのｍＲＮＡがポリＡテールを含有するので、この方法は、目的の特定のＲＮＡ標的を検出するのに充分に特異的ではない。

分子診断の分野では、核酸の増幅及び検出はかなり重要である。そのような方法は、任意の数のウイルス及び細菌のような微生物を検出するために使用することができる。最も顕著で広く使用されている増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。他の増幅技術としては、リガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、Ｇａｐ－ＬＣＲ、修復連鎖反応、３ ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）及びＱβ増幅が挙げられる。ＰＣＲに基づく分析のための自動化されたシステムは、しばしば、同じ反応容器におけるＰＣＲプロセス中の産物増幅のリアルタイム検出を利用する。そのような方法の鍵は、レポーター基又は標識を有する修飾オリゴヌクレオチドの使用である。

本発明は、既存の技術に対する改善を表す。本発明は、増幅反応においてデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）として２’－デオキシイノシン５’－三リン酸（ｄＩＴＰ）を利用することを含む、（ＤＮＡに対して）ＲＮＡを優先的及び／又は選択的に増幅及び検出する方法に関する。ｄＩＴＰの利用は、鎖分離温度の変化をもたらし、それにより、ＤＮＡ標的から容易に識別することができない、又はポリＡテール若しくはイントロン／エクソン・ジャンクションなどの明白な生物学的特性を利用することによっては標的化することができない、ＲＮＡ標的のＲＮＡ選択性の改善が可能になる。この場合、ｄＩＴＰは、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）類似体として挙動し、ｄＧＴＰと同様の化学構造を共有するが、ｄＧＴＰと比較して、ｄＩＴＰは２－アミノ基を欠いている（図１を参照）。この差は、塩基スタッキング相互作用及び水素結合の減少をもたらし、Ｔ_ｍ又は鎖分離温度の低下をもたらす。ｄＧＴＰをｄＩＴＰで置換すると、第一鎖及び第二鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成及びその後の新たに形成されるアンプリコンのＴ_ｍが低下し、それにより、鎖分離温度が天然の二本鎖ＤＮＡの融解に必要な温度よりも低くなるので、より低い温度での熱サイクルが可能になる。したがって、ｄＩＴＰを組み込むことは、二本鎖ＤＮＡの鎖分離を妨げることによってＲＮＡを優先的に増幅し、それによってポリメラーゼがＤＮＡ標的にアクセスして増幅することを妨げる。したがって、当技術分野では、核酸タイプの混合物（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）を含有し得るサンプル中のＲＮＡ標的を優先的に検出及び／又は増幅する迅速で信頼性の高い特異的方法が依然として必要とされている。

本発明は、ｄＩＴＰを利用することによる、ＲＮＡ標的の選択的及び／又は優先的な検出及び／又は増幅のための方法を提供する。これは、生物学的サンプルが多くの異なるタイプの核酸タイプ（例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ）を含有し、潜在的に干渉するＤＮＡではなくＲＮＡのみを検出することが望ましい状況で特に有用である。

本開示の特定の実施形態は、生物学的又は非生物学的サンプル中のＤＮＡよりも標的ＲＮＡを優先的に検出及び／又は定量するための方法に関する。そのような方法は、インビトロで実施され得る。実施形態は、増幅工程及びハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む、ＤＮＡよりも標的ＲＮＡを優先的に検出及び／又は定量するための方法を含む。さらに、実施形態は、ＤＮＡよりも標的ＲＮＡを優先的に検出及び／又は定量するように設計されたプライマー、プローブ、ポリメラーゼ（単数又は複数）、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＩＴＰを含む）、及びキットを含む。

一実施形態は、サンプル中の１つ以上の標的ＲＮＡをＤＮＡよりも選択的に検出及び／又は定量するための方法であって、（ａ）サンプルを提供することと、（ｂ）１つ以上のポリメラーゼを提供することと、（ｃ）少なくともｄＩＴＰを含むｄＮＴＰを提供することと、（ｄ）サンプルを、標的ＲＮＡに特異的な１組以上のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることを含む、増幅工程を実施することと、（ｅ）標的ＲＮＡがサンプル中に存在する場合に、増幅産物を１組以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズ工程を実施することと、（ｆ）検出工程を実施することであって、検出工程は、標的ＲＮＡの存在又は非存在を検出することを含み、増幅産物の存在は、サンプル中の標的ＲＮＡの存在を示し、増幅産物の非存在は、サンプル中の標的ＲＮＡの非存在を示す、検出工程を実施することと、を含み、ここで、増幅工程の間、１つ以上のポリメラーゼは、ｄＩＴＰを増幅産物中に組み込むことによって、サンプル中に存在する場合に標的ＲＮＡを増幅し、それにより、サンプル中のＤＮＡと比較して標的ＲＮＡを選択的に検出及び／又は定量する、方法に関する。一実施形態では、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰをさらに含む。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は、３：１、１：１、又は１：３である。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は３：１である。一実施形態では、ｄＮＴＰは等量の（ｉ）ｄＡＴＰと、（ｉｉ）ｄＴＴＰと、（ｉｉｉ）ｄＣＴＰと、（ｉｖ）ｄＧＴＰ＋ｄＩＴＰとを含む。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は、３：１、１：１、又は１：３である。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は３：１である。一実施形態では、サンプルはＲＮＡとＤＮＡの両方を含有する。一実施形態では、サンプルは、生物学的サンプルである。一実施形態において、生物学的サンプルは、血液、血漿又は尿である。一実施形態では、１つ以上のポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。一実施形態では、ｄＩＴＰの存在は、増幅産物の融解温度（Ｔ_ｍ）の低下をもたらす。一実施形態では、標的ＲＮＡはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡである。一実施形態では、１組以上のオリゴヌクレオチドプライマー及び１組以上のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号４を含む核酸配列にハイブリダイズする。一実施形態では、１組以上のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１及び配列番号２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、１組以上のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む。一実施形態では、ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。一実施形態では、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡは、ＨＢＶ共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の代用である。一実施形態では、定量されたＨＢＶ ｐｇＲＮＡの量は、サンプルの起源となる患者に関する処置決定のために考慮される因子である。

一実施形態は、サンプル中の１つ以上の標的ＲＮＡをＤＮＡよりも選択的に検出及び／又は定量するためのキットであって、（ａ）１つ以上のポリメラーゼと、（ｂ）少なくともｄＩＴＰを含むｄＮＴＰと、（ｃ）標的ＲＮＡに特異的な１組以上のオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｄ）１組以上のオリゴヌクレオチドプローブとを含むキットに関する。一実施形態では、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰをさらに含む。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は、３：１、１：１、又は１：３である。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は３：１である。一実施形態では、ｄＮＴＰは等量の（ｉ）ｄＡＴＰと、（ｉｉ）ｄＴＴＰと、（ｉｉｉ）ｄＣＴＰと、（ｉｖ）ｄＧＴＰ＋ｄＩＴＰとを含む。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は、３：１、１：１、又は１：３である。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は３：１である。一実施形態では、サンプルは、ＲＮＡとＤＮＡの両方を含有する。一実施形態では、サンプルは、生物学的サンプルである。一実施形態において、生物学的サンプルは、血液、血漿又は尿である。一実施形態では、１つ以上のポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。一実施形態では、ｄＩＴＰの存在は、増幅産物の融解温度（Ｔ_ｍ）の低下をもたらす。一実施形態では、標的ＲＮＡはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡである。一実施形態では、１組以上のオリゴヌクレオチドプライマー及び１組以上のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号４を含む核酸配列にハイブリダイズする。一実施形態では、１組以上のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１及び配列番号２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、１組以上のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む。一実施形態では、ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。一実施形態では、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡは、ＨＢＶ共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の代用である。一実施形態では、定量されたＨＢＶ ｐｇＲＮＡの量は、サンプルの起源となる患者に関する処置決定のために考慮される因子である。

別の実施形態は、サンプル中の１つ以上の標的ＨＢＶ ＲＮＡをＤＮＡよりも選択的に検出及び／又は定量するための方法であって、（ａ）サンプルを提供することと、（ｂ）１つ以上のポリメラーゼを提供することと、（ｃ）少なくともｄＩＴＰを含むｄＮＴＰを提供することと、（ｄ）増幅工程を実施することであって、増幅工程は、サンプルを、標的ＨＢＶ ＲＮＡに特異的な１組以上のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることを含み、１組以上のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１及び配列番号２の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを含む、増幅工程を実施することと、（ｅ）ハイブリダイズ工程を実施することであって、ハイブリダイズ工程は、標的ＨＢＶ ＲＮＡがサンプル中に存在する場合に、増幅産物を１組以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含み、１組以上のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを含む、ハイブリダイズ工程を実施することと、（ｆ）検出工程を実施することであって、検出工程は、標的ＨＢＶ ＲＮＡの存在又は非存在を検出することを含み、増幅産物の存在は、サンプル中の標的ＨＢＶ ＲＮＡの存在を示し、増幅産物の非存在は、サンプル中の標的ＨＢＶ ＲＮＡの非存在を示す、検出工程を実施することと、を含み、ここで、増幅工程の間、１つ以上のポリメラーゼは、ｄＩＴＰを増幅産物中に組み込むことによって、サンプル中に存在する場合に標的ＨＢＶ ＲＮＡを増幅し、それにより、サンプル中のＤＮＡと比較して標的ＲＮＡを選択的に検出及び／又は定量する、方法に関する。一実施形態では、ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰをさらに含む。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は、３：１、１：１、又は１：３である。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は３：１である。一実施形態では、ｄＮＴＰは等量の（ｉ）ｄＡＴＰと、（ｉｉ）ｄＴＴＰと、（ｉｉｉ）ｄＣＴＰと、（ｉｖ）ｄＧＴＰ＋ｄＩＴＰとを含む。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は、３：１、１：１、又は１：３である。一実施形態では、ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比は３：１である。一実施形態では、サンプルは、ＲＮＡとＤＮＡの両方を含有する。一実施形態では、サンプルは、生物学的サンプルである。一実施形態において、生物学的サンプルは、血液、血漿又は尿である。一実施形態では、１つ以上のポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。一実施形態では、ｄＩＴＰの存在は、増幅産物の融解温度（Ｔ_ｍ）の低下をもたらす。一実施形態では、１組以上のオリゴヌクレオチドプライマー及び１組以上のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号４を含む核酸配列にハイブリダイズする。一実施形態では、ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。一実施形態では、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡは、ＨＢＶ共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の代用である。一実施形態では、定量されたＨＢＶ ｐｇＲＮＡの量は、サンプルの起源となる患者に関する処置決定のために考慮される因子である。

一態様では、増幅は、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用することができる。したがって、ドナー蛍光部分及びアクセプター部分、例えばクエンチャーは、プローブの長さに沿って互いに５～２０ヌクレオチド（例えば、７又は１０ヌクレオチド）以内であり得る。別の態様では、プローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分との間の空間的近接をもたらし得る。この方法によれば、オリゴヌクレオチドプローブ上の第２の蛍光部分はクエンチャーであり得る。

本開示はまた、個体由来の生物学的サンプル中のＤＮＡよりも標的ＲＮＡを優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量する方法を提供する。これらの方法は、血液スクリーニング及び診断試験に使用するために、血漿中の標的ＲＮＡの存在又は非存在を検出するために使用することができる。さらに、ＤＮＡ核酸よりも優先的及び／又は選択的に標的ＲＮＡ核酸を検出及び／又は定量するために、尿及び他のサンプルタイプを評価するために当業者によって同じ試験が使用され得る。そのような方法は、一般に、増幅工程及び色素結合工程を含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む。典型的には、増幅工程は、核酸分子がサンプル中に存在する場合に１つ以上の増幅産物を生成する複数対のオリゴヌクレオチドプライマーとサンプルを接触させることを含み、色素結合工程は、増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の存在又は非存在を検出することを含み、結合の存在はサンプル中の標的ＲＮＡ核酸の存在を示し、結合の非存在はサンプル中の標的ＲＮＡ核酸の非存在を示す。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。他の核酸結合色素としては、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）、及びＹＯ－ＹＯ（登録商標）及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなどのシアニン色素が挙げられる。さらに、そのような方法はまた、増幅産物と二本鎖ＤＮＡ結合色素との間の融解温度を決定することを含むことができ、融解温度は標的ＲＮＡ核酸の存在又は非存在を確認する。

さらなる実施形態では、１つ以上の標的ＲＮＡ核酸を優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するためのキットが提供される。キットは、遺伝子標的の増幅に特異的な１組以上のオリゴヌクレオチドプライマー及び増幅産物の検出に特異的な１つ以上の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ、並びに、１つ以上のポリメラーゼ及びｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＩＴＰを含む）を含み得る。一態様では、キットは、ドナー部分及び対応するアクセプター部分、例えば、別の蛍光部分又はダーク・クエンチャーで既に標識されているオリゴヌクレオチドプローブを含むことができ、又はオリゴヌクレオチドプローブを標識するためのフルオロフォア部分を含むことができる。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ及び核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含むことができる。キットはまた、添付文書、並びに、サンプル中の標的ＲＮＡを優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するためのオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ及び蛍光色素部分の使用に関する説明書を含むことができる。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料が本主題の実施又は試験で使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合は、定義をも含む本明細書が優先する。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、図面及び発明を実施するための形態、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図１は、ｄＩＴＰとｄＧＴＰとの間の分子差を示す。

図２Ａは増幅曲線を示し、図２Ｂは融解曲線を示す。これらの図は、ＨＢＶ領域７アンプリコンのＴｍが、ｄＩＴＰ濃度が増加するにつれて低下することを示している。これらの実験を実施例２に記載する。 同上。

図３Ａ～図３Ｃは、２００μＭのｄＩＴＰを含むマスターミックスがより低い変性温度で性能を回復することを示すＰＣＲ増殖曲線を示す。これらの実験を実施例３に記載する。 同上。 同上。

図４Ａ～図４Ｃは、２００μＭのｄＩＴＰが、より低い変性温度で、改善された性能を有意に示すことを示すＰＣＲ増殖曲線及び融解曲線を示す。これらの実験を実施例３に記載する。 同上。 同上。

図５Ａ～図５Ｃは、２００μＭのｄＩＴＰを含む製剤が、より低い変性温度で、改善された性能を生じることを示すＰＣＲ増殖曲線及び融解曲線を示す。これらの実験を実施例３に記載する。 同上。 同上。

図６Ａ及び図６Ｂは、ＨＢＶインサート３（図６Ａ）及びＧＩＣ転写物（図６Ｂ）をＴａｑＭａｎプローブで二重化し、変性温度勾配で試験したことを示すＰＣＲ増殖曲線を示す。２００μＭのｄＩＴＰを含む製剤は、特により低い変性温度で改善された性能を生じた。これらの実験を実施例４に記載する。 同上。

図７Ａ～７Ｆは、６つの異なる臨床血漿サンプルからのＰＣＲ増殖曲線を示し、ｄＩＴＰを用いた反応は、ｄＩＴＰを用いない反応と比較した場合、ＤＮＡに対してＲＮＡの選択的増幅を実証したことを示す。これらの実験を実施例５に記載する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

図８Ａ～図８Ｄは、様々な実験条件下でのＰＣＲ増殖曲線を示し、Ｃｙ５．５チャネルにおいて、ＧＩＣマイナスｄＩＴＰ、マイナスＲＴ維持反応が予想外の増幅曲線を生成することを示す。ＲＴ活性は、ＲＴ維持が存在しない場合でさえ、これらの反応において依然として存在し得る。この現象は、プラスｄＩＴＰ、マイナスＲＴ維持反応では観察されない。これらの実験を実施例５に記載する。 同上。 同上。 同上。

標的ＲＮＡの（ＤＮＡよりも）優先的及び／又は選択的検出及び／又は定量のための方法、キット、及び反応混合物が本明細書に記載される。特に、標的ＲＮＡを優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するためのポリメラーゼ（単数又は複数）、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＩＴＰを含む）、プライマー及びプローブが提供され、そのような試薬を含む製造品又はキットも提供される。さらに、この技術は、血液スクリーニング並びに予後診断に使用することができる。

本明細書で使用される「増幅する」という用語は、鋳型核酸分子（例えば、ＨＢＶゲノムからのＲＮＡなどの核酸分子）の一方又は両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、及び増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）並びにポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液及び／又は補因子（例えば、ＭｇＣｌ_２及び／又はＫＣｌ）の存在が必要である。

本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる修飾オリゴヌクレオチドも指しており、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、そこに、３’から５’へのホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによってさらに「ヌクレオチド」が結合され得て、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される。

「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ以上のプローブのアニーリングを指す。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。

「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。

「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、すなわち、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及びメタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それにもかかわらず、必要に応じて酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに用いることもできる。

「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。

核酸に関して使用される場合の「伸長」又は「延長」という用語は、追加のヌクレオチド（又は他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、ヌクレオチドを取り込む生体触媒によって、例えば、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼによって、任意に伸長される。

２以上の核酸配列の文脈における「同一」又は「同一性」パーセントという用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は目視検査によって測定して最大の一致に関して比較及びアラインメントした場合に、同一又は特定パーセンテージの同一ヌクレオチドを有する２以上の配列又は部分配列を指す。パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に記載され、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

オリゴヌクレオチドの文脈における「修飾ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド中で置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、ｔ－ブチルベンジル、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシ－キサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボ－Ｕ、２’－０－メチルリボ－Ｃ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡ、５－プロピニルｄＵ、５－プロピニルｄＣ、７－デアザ－デオキシグアノシン（デアザＧ（ｕ－デアザ））などが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、又は当技術分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する修飾されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔ_ｍ）を改変する。さらに説明すると、特定の修飾ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅を減少させ（例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える）、意図する標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。他の修飾ヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチドの安定性を変化させ得るか、又は他の望ましい特徴を提供し得る。

「プローブ」という用語は、合成的又は生物学的に生成された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指し、これは、設計又は選択により、規定される所定のストリンジェンシーの下で特異的に（すなわち、優先的及び／又は選択的に）、「標的核酸」に、この場合はＲＮＡ（標的）核酸に、ハイブリダイズすることを可能にする、特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。

一部の実施形態では、記載されるプローブは、少なくとも１種の蛍光標識で標識され得る。一実施形態では、プローブは、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、及び対応するアクセプター部分、例えばクエンチャーで標識することができる。

プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブ又は一対のプローブを使用することができる。実施形態に応じて、使用するプローブ（単数又は複数）は、少なくとも１種の標識及び／又は少なくとも１種のクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常、同様の融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに充分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチド長である。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号及び同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技術を開示している。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。一部の実施形態において有用なプライマーは、記載されるＲＮＡ標的核酸配列内の核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、又は合成的に生成することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。

鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、２本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、又は酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、並びに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度及び核酸長などの反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、又は１．５分）行われる。

二本鎖の鋳型核酸が熱により変性された場合、反応混合物は、その標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却される。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進又は最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、鋳型核酸に相補的な産物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長産物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的な鋳型から伸長産物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、概して、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。

ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡ又はＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などの核酸を用いることができる。鋳型核酸は精製される必要はなく、ヒト細胞に含まれる標的ＲＮＡなどの複合混合物の微量画分であり得る。標的ＲＮＡ核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているものなどの日常的な技術によって生物学的サンプルから抽出され得る。核酸は、任意の数の供給源、例えばプラスミド、又は、細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、又は植物若しくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。

オリゴヌクレオチドプライマーを、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。そのようなＰＣＲ試薬としては、限定されないが、１つ以上のポリメラーゼ及びｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＩＴＰを含む）が挙げられる。例えば、鎖伸長反応には、一般に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇの変性された鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ及び１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＩＴＰ、又はそれらの１種以上の類似体を含有する。

新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。標的ＲＮＡ核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖分離、アニーリング、及び伸長の工程を必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用では、サイクリング工程の数は、例えば、サンプルの性質による。サンプルが核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となる。一般に、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、又は１００回繰り返してもよい。

蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号を参照）は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それを可視化することができ、又は他の方法で検出及び／又は定量することができるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。

一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分又は色素（例えば、ＨＥＸ又はＦＡＭ）と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で伝達されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャー（例えば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ）（ＢＨＱ－２など））とを含有することができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、及び同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーク・クエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ）（ＢＨＱ２など）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ、ミシガン州デクスタ）を包含する。

別の例では、それぞれが蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、標的ＲＮＡ標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。

蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラー及び特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、又は蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、又は蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、又は所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。

ドナー部分及び対応するアクセプター部分に関して本明細書で使用される場合、「対応する」とは、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分又はダーク・クエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動を行うことができる。

蛍光ドナー部分及び対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｅｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；及び（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、ドナー蛍光部分は、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍ又はアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、及び、その蛍光発光の対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するものを選択することができる。対応するアクセプター蛍光部分は、高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、及び可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有するものを選択することができる。

ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンミル１－ピレンブチレート、及び４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、又はテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。

ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、及び蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。

ＬＣ Ｒｅｄ ６４０などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ又はＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧなどの、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。

標的ＲＮＡ増幅産物（アンプリコン）の検出及び／又は定量
本開示は、生物学的又は非生物学的サンプル中の標的ＲＮＡを（ＤＮＡよりも）優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するための方法を提供する。提供される方法は、サンプルの汚染、偽陰性、及び偽陽性の問題を回避する。この方法は、１対以上の標的ＲＮＡプライマーを使用して、サンプルから標的ＲＮＡの一部を優先的及び／又は選択的に増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程と、ＦＲＥＴ検出工程とを行うことを含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。方法は、標的ＲＮＡプライマー及びプローブを使用して、標的ＲＮＡを（ＤＮＡよりも）優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するために実施することができ、標的ＲＮＡの存在及び標的ＲＮＡの検出は、サンプル中の標的ＲＮＡの存在を示す。

本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができる。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の存在又は非存在、したがって標的ＲＮＡの存在又は非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば１種の蛍光部分又は色素（例えばＨＥＸ又はＦＡＭ）と、蛍光性であってもなくてもよい１種のクエンチャー（例えば、ＢＨＱ－２）で標識された１つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブとを利用する。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分又はダーク・クエンチャーに移動する。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが互いに空間的に分離される。結果として、クエンチャーの非存在下において第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、サンプル中の標的ＲＮＡを（ＤＮＡよりも）優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するために本明細書に記載の方法を実施するのに適している。

ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分及び第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部位が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。

ＦＲＥＴ技術の別の一般的な形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ ６４０）又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ ７０５）に伝達する。次いで、アクセプター蛍光部分はより長い波長の光を放出し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ／ＲＮＡ分子の数（例えば、標的ＲＮＡ分子の数）と相関させることができる。標的ＲＮＡの増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。

一般に、ＦＲＥＴの存在はサンプル中の標的ＲＮＡの存在を示し、ＦＲＥＴの非存在はサンプル中の標的ＲＮＡの非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、又は特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウム又はアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功及び／又は精度に影響を及ぼし得る条件である。

本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的サンプルとしては、全血、呼吸器検体、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚及び軟部組織感染が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルの収集及び保存方法は、当業者に知られている。生物学的サンプルを（例えば、当技術分野で知られている核酸抽出方法及び／又はキットによって）処理して核酸（標的ＲＮＡなど）を放出させることができ、又は一部の場合では、生物学的サンプルをＰＣＲ反応成分及び適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させることができる。一部の例では、生物学的サンプルは全血である。全血を典型的に収集する場合、全血を適切な温度で保存することを可能にする、ヘパリン、クエン酸塩、又はＥＤＴＡなどの抗凝固剤を含む容器に収集することが多い。しかし、そのような条件下では、全血内の核酸はかなりの量の分解を受ける。したがって、核酸安定化溶液などの、核酸を含む全血成分を溶解、変性及び安定化する試薬に血液を回収することが有利であり得る。そのような場合、核酸は、後続の単離及びＰＣＲなどの核酸試験などによる分析のために、より良好に保存及び安定化され得る。そのような核酸安定化溶液は当技術分野で周知であり、これには、限定するものではないが、ｐＨ ７．５で４．２ Ｍグアニジニウム塩（ＧｕＨＣｌ）及び５０ ｍＭ Ｔｒｉｓを含有するｃｏｂａｓ（登録商標）ＰＣＲ培地が含まれる。

サンプルは、分析前にサンプルを適切に保持及び保存するように設計された任意の方法又は装置によって回収することができる。そのような方法及び装置は、当技術分野で周知である。サンプルが全血などの生物学的サンプルである場合、方法又は装置は、採血管を含むことができる。このような採血管は、当該技術において周知であり、例えば採血チューブを含むことができる。多くの場合、採血チューブを使用することが有利であり得、この場合、採血管は、サンプル取り込みのために意図された空間内で圧力下にあり、例えば、バキュテナー採血チューブのような、真空チャンバを有する血液管などである。真空チャンバを有するそのような採血チューブ、例えばバキュテナー採血チューブは、当技術分野で周知である。核酸を含む全血成分を溶解、変性、及び安定化する溶液、例えば核酸安定化溶液を内部に含む採血管内に、吸引される全血が採血管内の核酸安定化溶液と直ちに接触するように、真空チャンバの有無にかかわらず、血液を回収することがさらに有利であり得る。

融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含めることができる追加の工程である。融解曲線分析は、核酸二本鎖の半分が一本鎖に分離されている温度として定義される融解温度（Ｔ_ｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡ／ＲＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡ／ＲＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、Ｇ及びＣヌクレオチドが豊富な核酸分子は、Ａ及びＴヌクレオチドが豊富な核酸分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定することができる。標的ＲＮＡ増幅産物からの標的ＲＮＡプローブの融解温度（単数又は複数）は、サンプル中の標的ＲＮＡの存在又は非存在を確認することができる。

各サーモサイクラーを運転している間に、対照サンプルも同様にサイクルすることができる。陽性対照サンプルは、例えば、対照プライマー及び対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅することができる。陽性対照サンプルはまた、例えば、標的核酸分子を含むプラスミド構築物を増幅することができる。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマー及びプローブを使用して、内部で（例えば、サンプル中で）又は患者のサンプルと並んで実行される別々のサンプル中で増幅することができる。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション及び／又はＦＲＥＴ反応の成功又は失敗の指標である。各サーモサイクラー実行はまた、例えば、標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含むことができる。陰性対照は汚染を測定することができる。これにより、システム及び試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、並びにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定することができる。

一実施形態では、本方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減又は排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号及び同第５，９４５，３１３号に記載される。

ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施することができる。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを記載している：国際公開第９７／４６７０７号パンフレット、国際公開第９７／４６７１４号パンフレット及び国際公開第９７／４６７１２号パンフレット。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して動作させることができ、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴオペレーティングシステムを利用することができる。サンプルからのシグナルは、機械が光学ユニット上に毛細管を順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、全てのサンプルについて連続的に更新することができる。生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。

ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮ又はＳＹＢＲ（登録商標）ＧＯＬＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））のような二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。

当業者は、他の核酸又はシグナル増幅方法も使用され得ることを理解するであろう。そのような方法の例としては、限定されないが、分岐ＤＮＡシグナル増幅、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又はスマート増幅プロセスバージョン２（ＳＭＡＰ ２）が挙げられる。

本開示の実施形態は、１種以上の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。

製造品／キット
本開示の実施形態はさらに、（ＤＮＡよりも）標的ＲＮＡを優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するための製造品又はキットを提供する。製造品は、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＩＴＰを含む）を含む適切なパッケージング材料を用いて、標的ＲＮＡを優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するために使用されるプライマー及びプローブを含むことができる。標的ＲＮＡの（ＤＮＡよりも）優先的及び／又は選択的検出及び／又は定量のための代表的なプライマー及びプローブは、標的ＲＮＡ分子にハイブリダイズすることができる。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素及びＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション及び検出に必要な適切に包装された試薬及び材料を含み得る。プライマー及びプローブを設計する方法が本明細書に開示され、ＲＮＡ標的分子を優先的及び／又は選択的に増幅してハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表的な例が提供される。

製造品はまた、プローブを標識するための１種以上の蛍光部分を含むことができ、あるいは、キットと共に供給されるプローブを標識することができる。例えば、製造品は、標的ＲＮＡプローブを標識するためのドナー及び／又はアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分の例を上に提供する。

製造品はまた、添付文書、又は、サンプル中の標的ＲＮＡ を検出するための標的ＲＮＡプライマー及びプローブの使用に関する説明書を有する包装ラベルを含むことができる。製造品は、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、又は汚染を防止するための薬剤）をさらに含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１つに特異的であり得る。

本開示の実施形態はまた、サンプル中の標的ＲＮＡ を優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するための一組のプライマー及び１つ以上の検出可能なプローブを提供する。

本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。

以下の実施例及び図は、主題の理解を助けるために提供されており、その主題の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。以下の実施例の全てにおいて、使用したポリメラーゼは、例えば、米国特許第８，９６２，２９３号、米国特許第９，１０２，９２４号及び米国特許第９，７３８，８７６号に記載されているＺ０５ポリメラーゼのＤ５８０Ｇ変異体であるＺ０５Ｄポリメラーゼであった。

実施例１：Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）アッセイにおけるｄＩＴＰの効果を試験するアプローチ
ＨＢＶは、逆転写される一本鎖ＲＮＡプレゲノム（ｐｇＲＮＡ）をパッケージングする部分二本鎖ＤＮＡウイルスである。慢性ＨＢＶ感染の現在の処置には、ｐｇＲＮＡの逆転写を破壊してＤＮＡ合成を抑制するヌクレオシ（チ）ド類似体（ＮＡ）が含まれる。ＨＢＶ ｐｇＲＮＡはｃｃｃＤＮＡ（共有結合閉環状ＤＮＡ）の代用であり、ＨＢＶ ＤＮＡ産生が抑制されている場合でも血漿中に検出されることが示されている。処置された患者の半数未満に見られる重篤な副作用及び長期的な利益のために、処置中止についての患者のモニタリングが重要である。現在のモニタリング方法は、ＨＢＶ ＤＮＡ定量又はＨＢＶ抗原検出を含み、これらの両方には限界があると考えられている。ＮＡ療法はｃｃｃＤＮＡリザーバを直接排除しないので、これらのマーカーはｃｃｃＤＮＡ活性を反映するには不十分であり得る。したがって、ＮＡ療法を中断することによりＨＢＶ感染がリバウンドする可能性がある。ＨＢＶ ＲＮＡ粒子の継続的な存在はｃｃｃＤＮＡの活性な転写を示し得るので、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡは、処置中止の候補であり得る長期ウイルス抑制患者を同定するための潜在的なバイオマーカーであり得る。

したがって、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ定量的アッセイは、患者の処置中止を監視するのに有用である。しかしながら、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡアッセイを開発する際の重要な課題の１つは、ＨＢＶ ＲＮＡとウイルスＤＮＡ増幅を区別することである。ＨＢＶ ＤＮＡの排除は、標的化することができるＨＢＶ ｐｇＲＮＡとの配列及び構造の違いの数が限られているため、達成が困難である。したがって、ＨＢＶ定量アッセイの開発は、有用な方法でＲＮＡ選択性を確実にするためのｄＩＴＰの有用性を評価するためのプラットフォームを提供した。

ｄＩＴＰの効果を評価するために、ＨＢＶアッセイをＨＢＶ領域７で開発した。ＨＢＶ領域７アンプリコンはインサート３と呼ばれる。二価金属イオン調整（Ｍｎ（ＯＡｃ）_２）を回避する目的で、２．０ ｍＭの総ｄＮＴＰ濃度は一定のままであり、ｄＧＴＰ及びｄＩＴＰの比のみを変化させて、ＨＢＶ領域７及び一般的内部制御（ＧＩＣ）アッセイの最適濃度を決定した。ＧＩＣアッセイは、ＨＢＶ領域７アッセイと共に評価した。これは、ＧＩＣアッセイが、全てのｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００アッセイにおいて、完全工程制御（ＦＰＣ）、内部制御（ＩＣ）、及び内部定量標準（ＩＱＳ）として機能する一般的内部制御を検出するためである。最適なｄＧＴＰ：ｄＩＴＰ比は、プライマー、プローブ及びアンプリコンのＧＣ含有量に依存する。選択的ＲＮＡ増幅のための理想的な変性温度の決定は、組み込まれるｄＩＭＰの量及びアンプリコンの長さに依存する。ｄＩＴＰ誘導体であるｄＩＭＰは、ＤＮＡに組み込まれるｄＩＴＰのモノマー形態であることに留意されたい。ＨＢＶ領域７及びＧＩＣアッセイ配列、Ｔ_ｍ（℃）及びＧＣ含有量を、それぞれ以下の表１及び表２に列挙する。

ＳＹＴＯ ９インターカレーティング色素を用いて最初の実験を実行して、融解産物及びアンプリコン Ｔ_ｍに対するｄＩＴＰの効果を観察した。ＳＹＴＯ ９実験は、ＨＢＶインサート３転写物、ＨＢＶインサート３ ＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋ（ＨＢＶ転写物の配列と同一の二本鎖ＤＮＡ断片）、及びＧＩＣ転写物に対して行った。続いて、ＴａｑＭａｎプローブを用いたＨＢＶ及びＧＩＣ二重鎖反応を、変性及びアニーリング温度勾配にわたって様々なｄＧＴＰ：ｄＩＴＰ比で評価して、最適なｄＩＴＰ濃度及び熱サイクルパラメータを決定した。ＨＢＶインサート３ ＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋをスパイクしたＨＢＶインサート３転写物の性能評価を実行して、ＨＢＶ ＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋと比較してＨＢＶ ＲＮＡ標的の増幅効率及び特異性を調べた。ｄＩＴＰ濃度及び熱サイクル温度を最終決定した後、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００によって抽出された様々なウイルス量の臨床ＨＢＶ血漿サンプルを、最適化されたｄＩＴＰ条件で評価した。

実施例２：ｄＩＴＰの使用は Ｔ_ｍの低下をもたらす。
したがって、ＨＢＶ領域７アッセイを、ＳＹＴＯ ９によるｄＩＴＰ滴定を使用して行った。ＨＢＶインサート３アンプリコン Ｔ_ｍに対するｄＩＴＰの効果を、ＳＹＴＯ ９色素（１μＭ／反応）を利用して評価した。アッセイを最適化するために、ＨＢＶ領域７アッセイを異なる比のｄＧＴＰ：ｄＩＴＰで試験した。マスターミックス中の最終ｄＮＴＰ濃度は２．０ ｍＭであり、これは４００μＭのｄＡＴＰ、４００μＭのｄＣＴＰ、８００μＭのｄＵＴＰ及び４００ｕＭの（ｄＧＴＰ＋ｄＩＴＰ）からなる。ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００マスターミックスで様々なｄＧＴＰ及びｄＩＴＰ比の以下の５つの製剤を試験し、以下の表３に示す：

ＨＢＶインサート３転写物の滴定を、０．１、０．０１、及び０．００１ｎｇ／反応で試験した。一般的なｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００の熱プロファイル（９５℃及び９１℃の変性温度を含む）を、以下の表４に列挙した実験で試験した。

結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。増幅曲線を図２Ａに示す。図２Ｂに示される融解曲線は、全ての製剤にわたって、ｄＧＴＰが非存在のマスターミックスを除いて増幅曲線が生成されたことを示す。これは、試験した熱サイクル条件下で標的を増幅するために、少なくともいくらかのｄＧＴＰが必要であることを示す。アンプリコンのＴｍは、反応中のｄＩＴＰの濃度が増加するにつれて低下する。マイナスｄＩＴＰ反応の平均アンプリコンＴｍは８７．２℃である。３００μＭのｄＩＴＰを含む製剤のアンプリコンＴｍは７４．１℃に有意に低下した。この実験から、ＨＢＶインサート３アンプリコンに対するｄＩＴＰの効果は、結果として生じるＴｍの１３℃の低下によって実証された。したがって、これらの研究は、ｄＩＴＰの濃度が増加するにつれて、アンプリコンのＴｍが低下することを実証している。

実施例３：ＨＢＶ領域７並びにｇＢｌｏｃｋ及び一般的内部制御（ＧＩＣ）転写物に対するｄＩＴＰ性能評価
ＨＢＶ領域７転写物と同一の配列を有するｇＢｌｏｃｋ二本鎖ＤＮＡ断片を評価した。ウイルスＨＢＶ ＲＮＡ及びＨＢＶ ＤＮＡは非常に類似した配列を有するので、ＨＢＶ ｇＢｌｏｃｋ及びＨＢＶ転写物標的プールの評価は、ＨＢＶ ＲＮＡ増幅効率及び特異性を決定するために関心があった。ＳＹＴＯ ９色素を用いた最初の実験を、ＨＢＶ領域７転写物、ＨＢＶ領域７ ＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋ及びＧＩＣ転写物を用いて試験して、アンプリコン融解曲線及びＴ_ｍを確認した。１００μＭ及び２００μＭのｄＩＴＰを含有する２つのマスターミックス製剤を、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６において７９．０から８７．０℃の範囲の変性温度勾配にわたって３つ全ての標的で評価した。ＳＹＴＯ ９色素を１μＭで試験し、熱プロファイルの最後に融解工程を含めた。ＳＹＴＯ ９インターカレーティング色素が反応中に存在するので、全ての標的を単一プレックスで試験した。ＨＢＶインサート３転写物、ｇＢｌｏｃｋ、及びＧＩＣ転写物を１つの濃度で試験した。

結果は、２００μＭのｄＩＴＰ（及び２００μＭのｄＧＴＰ）を含むマスターミックス（図３Ｂ）が、わずか１００μＭのｄＩＴＰ（及び３００μＭのｄＧＴＰ）を含むマスターミックス（図３Ａ）と比較して、より低い変性温度で３つ全ての標的にわたってかなり改善された性能を示すことを示す。２００μＭのｄＩＴＰ（及び２００μＭのｄＧＴＰ）を含むマスターミックスは、ＨＢＶ領域７転写物を、８１．１℃まで下げた変性温度で確実に増幅し、これは、図３Ａ～図３Ｃに示されるように、上記の表３に示す一般的なｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００の熱プロファイルの変性温度よりも少なくとも１０℃低い。図４Ａ～図４Ｃ及び図５Ａ～図５Ｃに示すように、おそらく短い長さ（３１８ ｂｐ）に起因して、ＨＢＶ領域７ ｇＢｌｏｃｋの単一プレックス反応を増幅することもでき、ＧＩＣ転写物を約７９．０℃まで下げた変性温度で確実に検出することができる。
実施例４：ＨＢＶ領域７及びｄＩＴＰを用いたＧＩＣ二重性能評価

評価の大部分は、Ｔｍに対するｄＩＴＰの効果を調べるためにＳＹＴＯ ９色素を用いて行った。この実験では、ＨＢＶ及びＧＩＣアッセイをＴａｑＭａｎプローブで二重化し、７９から８４．０℃の変性温度勾配で評価した。１００μＭのｄＩＴＰ及び２００μＭのｄＩＴＰを含む２つのマスターミックス製剤を、ＨＢＶインサート３（図６Ａ）及びＧＩＣ転写物（図６Ｂ）の標的プールに対して試験した。ＨＥＸ及びＣｙ５．５ ＴａｑＭａｎプローブの両方がこの評価に存在した。

結果は、図６Ａ及び図６Ｂに示すように、変性温度勾配にわたって２つの製剤間にかなりの性能差があることを示す。２００μＭのｄＩＴＰ濃度は、より低い変性温度で性能を回復させ、一般的な ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００の熱プロファイルで利用される変性温度よりも最大１６℃低い７９．０℃でＨＢＶ ＲＮＡ標的を確実に検出することができた（図６Ａ）。チャネルＣｙ５．５のＧＩＣ転写物でも同様の傾向が観察された（図６Ｂ）。
実施例５：臨床ＨＢＶ血漿サンプルに対するｄＩＴＰの性能

さらなる滴定及び温度勾配実験の後、最適なヌクレオチド濃度及び熱サイクルパラメータは、３００μＭのｄＩＴＰ（及び１００μＭのｄＧＴＰ）、７８℃の変性（ＰＣＲサイクル中）及びＵＮＧ不活性化維持、及び５５℃のアニーリング温度維持（最適化データは示さず）であると決定された。一般的なｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００の熱プロファイルは、指定された温度変化以外は同じままであった。最終的なｄＩＴＰの熱サイクルプロファイルを以下の表５に列挙する。

熱サイクルプロファイルにおける逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ工程は、表４に列挙されるＵＮＧ不活性化工程後の５５、６０及び６５°Ｃの３つの温度維持を含む。ＲＴ－ＰＣＲは、相補的ＤＮＡの合成がＲＮＡから作り出されるＲＴ工程中に起こる。ＲＴ維持の有無で評価する目的は、ＤＮＡ（マイナスＲＴ維持）とＲＮＡ（プラスＲＴ維持）の増幅を比較することである。表４の熱プロファイルをＲＴ維持の有無で試験して、本明細書に記載の臨床ＨＢＶ血漿溶出液中のＲＮＡ及びＤＮＡ増幅を比較した。６つの臨床ＨＢＶ血漿サンプルを、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００及びＲｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔによって抽出した。臨床サンプルは、処置を受けた患者又は受けなかった患者にわたって採取した。これらの臨床サンプルにおけるＨＢＶウイルス量は、以下の表６に示すように、５．７Ｅ９の非常に高い力価から４．８Ｅ４までの範囲であった。

全サンプルを±ｄＩＴＰ（３００μＭの最適化された濃度）及び±ＲＴ維持で評価して、全核酸精製サンプル中のＲＮＡ及びＤＮＡ増幅を評価した。ｄＩＴＰ最適化熱プロファイル（７８℃の変性／ＵＮＧ不活性化及び５５℃のアニーリング温度を含む）を、プラスｄＩＴＰの反応で試験した。比較のために、一般的なｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００の一般的な熱プロファイル（９５℃及び９１℃の変性維持を含む）を用いて、マイナスｄＩＴＰの反応を試験した。

結果は、図７Ａ～図７Ｆに示すように、試験した全ての臨床血漿サンプル（合計６つのサンプル）にわたって、プラスｄＩＴＰの反応が有意に高い蛍光シグナルを生成し、±ＲＴ維持の反応間のΔＣｐがかなり大きかったことを示す。表６は、臨床ＨＢＶ血漿サンプルの平均Ｃｐｓを示す。表６は、表７に示すように、両方の抽出方法にわたって、プラスｄＩＴＰの反応が６．２及び５．７の平均ΔＣｐｓを生じ、これはマイナスｄＩＴＰの反応（平均ΔＣｐが１．９）と比較して著しく大きいことを明らかにする。

これは、ＨＢＶ ＲＮＡ特異性の改善を実証し、ｄＩＴＰの存在下でのＤＮＡに対するＲＮＡ標的の優先的及び／又は選択的増幅を示す。マイナスｄＩＴＰの反応は、±ＲＴ維持の間で最小のＣｐ遅延を生じ、これは、ＨＢＶ ＤＮＡの増幅効率がＨＢＶ ＲＮＡ標的と同等又はそれに近いことを示唆している。

Ｃｙ５．５チャネルでは、プラスｄＩＴＰの反応は一般にＧＩＣ増幅曲線を遅延させ、低い蛍光シグナルを生成した。ｄＩＴＰの利用では、ＧＩＣ目標濃度の調整が必要な場合がある。予想されるように、ＧＩＣ転写物プラスｄＩＴＰ／－ＲＴ維持は、図８Ｄに示されるように、いかなるＣｐコールも生成しない。マイナスｄＩＴＰ／マイナスＲＴ維持の反応は、増幅曲線及びＣｐコールを生成する。これは、ＲＴ維持が存在しない場合でさえ、これらの反応におけるＲＴ活性の存在に起因し得る。より高い温度での熱サイクルは、潜在的にこの結果に寄与し得る。

まとめると、これらの実施例は、ＨＢＶ ＤＮＡの代わりにＨＢＶ ＲＮＡ標的の優先的及び／又は選択的増幅が、ｄＩＴＰ化学を一体化し、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００マスターミックス製剤の変化を制限して熱サイクルプロファイルを変化させることによって、ＨＢＶ領域７アッセイで実証されたことを示した。これらの実施例は、天然のＤＮＡ標的から容易に識別することができないか、又はポリＡテール若しくはイントロン／エクソン・ジャンクションを利用することによって標的化することができないＲＮＡ標的の選択的ＲＮＡ増幅にこの方法を適用する可能性を実証する。

前述の発明を明確化及び理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術及び装置を、様々な組み合わせで使用することができる。本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献は、あたかも各個別の刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献が全ての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。

Claims (15)

1. サンプル中の１つ以上の標的Ｂ型肝炎ウイルスプレゲノムＲＮＡ（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ）をＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡよりも選択的に検出及び／又は定量するための方法であって、
   （ａ）サンプルを提供することと、
   （ｂ）１つ以上のポリメラーゼを提供することと、
   （ｃ）ｄＩＴＰを含むｄＮＴＰを提供することと、
   （ｄ）前記サンプルを前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡに特異的な１組以上のプライマーと接触させることを含む、鋳型核酸を変性することを含む増幅工程を実施することと、
   （ｅ）前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡが前記サンプル中に存在する場合に、増幅産物を１以上の標識されたプローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施することと、
   （ｆ）検出工程を実施することであって、前記検出工程は前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡの存在又は非存在を検出することを含み、前記増幅産物の存在は前記サンプル中の前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡの存在を示し、前記増幅産物の非存在は前記サンプル中の前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡの非存在を示す、前記検出工程を実施することと、を含み、
   前記ＨＢＶ ｐｇＲＮＡが、ＨＢＶ共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の代用であり、
   前記増幅工程の間、前記１つ以上のポリメラーゼは、前記ｄＩＴＰを前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ由来の増幅産物中に組み込んで、それによって前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ由来の増幅産物の融解温度（Tm）を低下させ、二本鎖ＨＢＶ ＤＮＡの鎖分離に必要な温度よりも低い温度で前記増幅工程中に前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ由来の増幅産物を変性させることを可能にすることによって、前記サンプル中に存在する場合に前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを増幅し、それによってポリメラーゼが二本鎖ＨＢＶ ＤＮＡ標的にアクセスして増幅させることを妨げ、サンプル中のＨＢＶ ＤＮＡと比較して標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを選択的に検出及び／又は定量する、
   前記方法。
2. 前記ｄＮＴＰが、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比が３：１、１：１又は１：３である、請求項２に記載の方法。
4. 請求項２に記載の方法であって、前記ｄＮＴＰが、等量の
   （ｉ）ｄＡＴＰと、
   （ｉｉ）ｄＴＴＰと、
   （ｉｉｉ）ｄＣＴＰと、
   （ｉｖ）ｄＧＴＰ＋ｄＩＴＰと、を含む、方法。
5. 前記１つ以上のポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記１組以上のプライマー及び前記１組以上のプローブが、配列番号４を含む核酸配列にハイブリダイズする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記１組以上のプライマーが、配列番号１及び配列番号２の核酸配列を有するプライマーを含み、前記１組以上のプローブが、配列番号３の核酸配列を有するプローブを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記検出工程（ｆ）が、前記１つ以上の標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを定量することをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記定量されたＨＢＶ ｐｇＲＮＡの量は、前記サンプルの起源となる患者に関する処置決定のために考慮される因子である、請求項８に記載の方法。
10. サンプル中の１つ以上の標的Ｂ型肝炎ウイルスプレゲノムＲＮＡ（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ）をＨＢＶ ＤＮＡよりも選択的に検出及び／又は定量するためのキットであって、
    （ａ）１つ以上のポリメラーゼと、
    （ｂ）ｄＩＴＰを含むｄＮＴＰと、
    （ｃ）前記標的ＨＢＶ ｐｇＲＮＡに特異的な１組以上のプライマーと、
    （ｄ）１つ以上の標識されたプローブと、を含み、
    １組のプライマーと１つの標識されたプローブが、配列番号４を含む核酸配列にハイブリダイズする、キット。
11. 前記ｄＮＴＰが、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰをさらに含む、請求項１０に記載のキット。
12. ｄＩＴＰ：ｄＧＴＰの比が３：１、１：１又は１：３である、請求項１１に記載のキット。
13. 請求項１１に記載のキットであって、前記ｄＮＴＰが、等量の
    （ｉ）ｄＡＴＰと、
    （ｉｉ）ｄＴＴＰと、
    （ｉｉｉ）ｄＣＴＰと、
    （ｉｖ）ｄＧＴＰ＋ｄＩＴＰと、を含む、キット。
14. 前記１つ以上のポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項１０から１３のいずれか一項に記載のキット。
15. 前記１組以上のプライマーが、配列番号１及び配列番号２の核酸配列を有するプライマーを含み、前記１組以上のプローブが、配列番号３の核酸配列を有するプローブを含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載のキット。