TWI839307B - 利用電腦評估肝癌患者治療後病變進展及預後的方法 - Google Patents
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Abstract
本揭示提供一種肝癌患者治療後病變進展及預後的方法，包含分別測定一肝癌患者的生物樣品中的多個DNA甲基化標記物的甲基化程度，再依據這些DNA甲基化標記物的甲基化程度計算出MMTR指數和MMEP指數，以評估肝癌患者在治療後會病變進展的風險以及在治療前評估肝癌早期進展至晚期的風險。
Description
本揭示有關於癌症之生物標記，特別是有關於肝癌之生物標記。
肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)在全球範圍內具有高發病率和死亡率，因此成為重要的癌症之一。對於HCC患者，預後和治療通常是根據巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona Clinical Liver Cancer，BCLC)分期系統的腫瘤負擔、腫瘤分期和肝功能來確定的。對於中期(BCLC B期)的患者，推薦首選治療方法是經動脈灌流化學栓塞治療(transarterial chemoembolization，TACE)。最近，越來越多的證據支持在局部和不可切除的HCC中擴大使用局部區域治療(locoregional therapy，LRT)，包括帶有或不帶有局部消融之TACE，以改善臨床結果。然而，LRT治療效果的不確定性仍然是HCC治療的一個巨大挑戰。由於治療不完全，病變進展可能沿著治療區的邊緣發生，因為在HCC結節周圍經常觀察到微小血管病變或未治療的病變發展。
在LRT後，約有40%的HCC患者屬於早期復發。早期復發被認為與肝內局部復發有關，許多研究揭示了早期復發與根治性治療後HCC患者的不良
預後密切相關。因此，識別早期復發的風險因素並及時進行再介入治療對於管理易於早期復發的患者至關重要。
已知與肝內復發有關的幾個風險因素，包括腫瘤大小、腫瘤數量、血清腫瘤標記物、不適當的位置和低分化的腫瘤。然而，僅依靠目前的影像學檢查技術，如超聲波(ultrasound,US)、電腦斷層掃描(computed tomography,CT)和磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)，很難準確地確定治療反應。這些影像學檢查技術還存在一些缺點，如暴露於輻射下或造影劑的腎毒性。此外，這些影像學檢查對於小型HCC的檢測靈敏度及專一性並不高。
除了影像檢查外，血清腫瘤標記物常被用於肝癌監測和治療反應評估，尤其是α-胎兒蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)，又稱甲型胎兒蛋白。α-胎兒蛋白是一種廣泛使用的生物標記物，因為具有成本效益、客觀性和便捷性等優點。然而，AFP的靈敏度和專一性尚不足以滿足臨床使用的要求，只有三分之一的患者AFP血清程度明顯升高。其他血清腫瘤標記物，如AFP-L3%(結合值物凝集素的AFP)和異常凝血酶原PIVKA-II(Protein induced by vitamin K absence or antagonist)，PIVKA-II是人體內因缺乏維生素K或由拮抗劑-II所誘導而合成的一種蛋白質，是一種異常的凝血酶原，正常人的血液中是不存在異常凝血酶原的，不過在慢性肝病或惡性肝腫瘤患者體內，其濃度會升高起來。然而，超過30%的小型肝癌患者無法通過任何現有的腫瘤標記物檢測出來。這些事實限制了這些腫瘤標記在血清AFP或PIVKA-II程度正常的肝癌患者中的臨床可行性。
在癌症的發展過程中，DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳調節方式，用於調控基因表達，在癌症的每個階段都發揮著基本作用。這些異常甲
基化的基因潛在地可以作為癌症的診斷和預後的預測標誌。然而，到目前為止，沒有任何報告顯示使用甲基化標記對接受LRT的肝癌患者的治療反應進行評估的可能性。本發明首次揭露對於LRT的患者，利用甲基化標記評估治療效果及預後的方法。
承上所述，本揭示提供一種利用電腦評估經局部區域治療的肝癌患者之病變進展風險的方法，包含下述步驟。取得一肝癌患者在治療前第0天(即治療前1天)之一第一生物樣品。取得該肝癌患者在治療後第30天之一第二生物樣品。一電腦分析該第一生物樣品和該第二生物樣品中之與肝癌相關的複數個DNA甲基化標記物的甲基化程度，其中該些DNA甲基化標記物包含RASSF1A、miR-203、COX2、APC、ALX3、cg12582777、TBX4、TSPYL5、cg12714719和cg08643930，其中每個DNA甲基化標記物的甲基化程度的計算公式為：DNA甲基化標記物的甲基化程度=2^[Ct(β-actin)-Ct(DNA甲基化標記物)]×1000，Ct為PCR的迴圈數閾值。所述電腦分別計算出該些DNA甲基化標記物在第0天(即治療前1天)和第30天(即治療後第30天)之間的甲基化程度的差值。所述電腦依據該些DNA甲基化區域的甲基化程度，計算腫瘤治療的甲基化預測模型(methylation prediction model for tumor response,MMTR)指數，MMTR指數的計算公式為：MMTR指數=1.457+0.035×(RASSF1A的△甲基化程度)-0.002×(APC的△甲基化程度)+0.068×(cg12714719的△甲基化程度)+0.038×(cg08643930的△甲基化程度)+0.017×(miR203的△甲基化程度)-0.047×(COX2的△甲基化程度)-0.049×(ALX3的△甲基化程度)-0.069×(TSPYL5
的△甲基化程度)+0.032×(cg12582777的△甲基化程度)+0.147×(TBX4的△甲基化程度)，其中「△甲基化程度」為該些DNA甲基化標記物之第0天(即治療前1天)和第30天(即治療後第30天)之甲基化程度的差值。當MMTR指數大於預先確認之一參考值時，表示該肝癌患者在接受局部區域治療後會有病變進展的風險。
依據本揭示一實施例，上述第一生物樣本和第二生物樣本例如可為血液、血漿、血清、肝組織、唾液、痰、精液、腸道消化液、呼吸道灌洗液、糞便等。在一實施例中，上述樣本可為血漿或血清。
依據本揭示一實施例，該參考值為0.7003。
依據本揭示另一實施例，更包含將α-胎兒蛋白(AFP)的腫瘤標記與MMTR指數組合使用來評估該肝癌患者在接受局部區域治療後會有病變進展的風險。
依據本揭示又一實施例，更包含將異常凝血酶原(PIVKA-II)的腫瘤標記與MMTR指數組合使用來評估該肝癌患者在接受局部區域治療後會有病變進展的風險。
本揭示還提供一種利用電腦對未接受治療的肝癌患者評估在治療後的病變進展風險的方法，包含下述步驟。取得一肝癌患者在治療前第0天(即治療前1天)之一生物樣品。一電腦分析該生物樣品中之與肝癌相關的複數個DNA甲基化標記物的甲基化程度，該些DNA甲基化標記物包含RASSF1A、miR-203、COX2、APC、ALX3、cg12582777、TBX4、TSPYL5、cg12714719和cg08643930，其中每個DNA甲基化標記物的甲基化程度的計算公式為：DNA甲基化標記物的甲基化程度=2^[Ct(β-actin)-Ct(DNA甲基化標
記物)]×1000，Ct為PCR的迴圈數閾值。所述電腦依據該些DNA甲基化標記物的甲基化程度，計算腫瘤預後的甲基化預測模型(methylation prediction model for early progression,MMEP)指數，MMEP指數的計算公式為：MMEP指數=-4.333-0.064×(RASSF1A的D0甲基化程度)-0.058×(miR203的D0甲基化程度)+0.001×(COX2的D0甲基化程度)+0.176×(APC的D0甲基化程度)+2.121×(ALX3的D0甲基化程度)-0.035×(cg12582777的D0甲基化程度)-0.139×(TBX4的D0甲基化程度)+0.01×(TSPYL5的D0甲基化程度)-0.044×(cg12714719的D0甲基化程度)+0.138×(cg08643930的D0甲基化程度)，其中「D0甲基化程度」代表該些DNA甲基化標記物之治療前1天的甲基化程度。當MMEP指數大於預先確認之一參考值時，表示該肝癌患者在接受局部區域治療後會有較高病變進展的風險。
依據本揭示一實施例，上述生物樣本例如可為血液、血漿、血清、肝組織、唾液、痰、精液、腸道消化液、呼吸道灌洗液、糞便等。在一實施例中，上述樣本可為血漿或血清。
依據本揭示一實施例，該參考值為0.2570。
依據本揭示另一實施例，更包含將α-胎兒蛋白(AFP)的腫瘤標記與MMEP指數組合使用來評估該肝癌患者在經局部區域治療後是否會有病變進展的風險。
依據本揭示又一實施例，更包含將異常凝血酶原(PIVKA-II)的腫瘤標記與MMEP指數組合使用來評估該肝癌患者在經局部區域治療後是否會有病變進展的風險。
本揭示還提供利用電腦評估肝癌患者之兩年無病存活率的方法，包含下述步驟。取得一肝癌患者在治療前第0天(即治療前1天)之一生物樣品。一電腦分析該生物樣品中之與肝癌相關的複數個DNA甲基化標記物的甲基化程度，該些DNA甲基化標記物包含RASSF1A、miR-203、COX2、APC、ALX3、cg12582777、TBX4、TSPYL5、cg12714719和cg08643930，其中每個DNA甲基化標記物的甲基化程度的計算公式為：DNA甲基化標記物的甲基化程度=2^[Ct(β-actin)-Ct(DNA甲基化標記物)]×1000，Ct為PCR的迴圈數閾值。所述電腦依據該些DNA甲基化標記物的甲基化程度，計算腫瘤預後的甲基化預測模型(methylation prediction model for early progression,MMEP)指數，MMEP指數的計算公式為：MMEP指數=-4.333-0.064×(RASSF1A的D0甲基化程度)-0.058×(miR203的D0甲基化程度)+0.001×(COX2的D0甲基化程度)+0.176×(APC的D0甲基化程度)+2.121×(ALX3的D0甲基化程度)-0.035×(cg12582777的D0甲基化程度)-0.139×(TBX4的D0甲基化程度)+0.01×(TSPYL5的D0甲基化程度)-0.044×(cg12714719的D0甲基化程度)+0.138×(cg08643930的D0甲基化程度)，其中「D0甲基化程度」代表該些DNA甲基化標記物之治療前1天的甲基化程度。當MMEP指數大於預先確認之一參考值時，表示該肝癌患者兩年無病存活率較低。
依據本揭示一實施例，該參考值為0.2570。
本揭示還提供一種利用電腦評估肝癌患者之兩年總存活率的方法，包含下述步驟。取得一肝癌患者在治療前第0天(即治療前1天)之一生物樣品。一電腦分析該生物樣品中之與肝癌相關的複數個DNA甲基化標記物的甲基化程度，該些DNA甲基化標記物包含RASSF1A、miR-203、COX2、
APC、ALX3、cg12582777、TBX4、TSPYL5、cg12714719和cg08643930，其中每個DNA甲基化標記物的甲基化程度的計算公式為：DNA甲基化標記物的甲基化程度=2^[Ct(β-actin)-Ct(DNA甲基化標記物)]×1000，Ct為PCR的迴圈數閾值。所述電腦依據該些DNA甲基化標記物的甲基化程度，計算腫瘤預後的甲基化預測模型(methylation prediction model for early progression,MMEP)指數，MMEP指數的計算公式為：MMEP指數=-4.333-0.064×(RASSF1A的D0甲基化程度)-0.058×(miR203的D0甲基化程度)+0.001×(COX2的D0甲基化程度)+0.176×(APC的D0甲基化程度)+2.121×(ALX3的D0甲基化程度)-0.035×(cg12582777的D0甲基化程度)-0.139×(TBX4的D0甲基化程度)+0.01×(TSPYL5的D0甲基化程度)-0.044×(cg12714719的D0甲基化程度)+0.138×(cg08643930的D0甲基化程度)，其中「D0甲基化程度」代表該些DNA甲基化標記物之治療前1天的甲基化程度。當MMEP指數大於預先確認之一參考值時，表示該肝癌患者兩年總存活率較低。
依據本揭示一實施例，該參考值為0.2570。
由上述可知，本揭示DNA甲基化標記物的指數顯示出多個技術優點。首先，無論肝癌患者體內的AFP或PIVKA-II表達情況如何，DNA甲基化標記物的指數在患者中具有更高的可行性，能夠對所有患者進行評估。其次，這些標記物的指數在預測肝癌患者的狀況和治療反應方面表現優異，並與常規腫瘤標記物結合時預測能力進一步提高。第三，這些指數可用於治療監測和預後評估，為高風險肝癌患者提供有用的工具，以在局部區域治療後進行密切監測或輔助治療，並預測腫瘤進展，改善治療策略和預後結果。最後，相比於影像工具，DNA甲基化標記物的指數提供更全面的評估方式，對血清腫瘤標
記正常的患者提供更多有價值的信息。總體而言，DNA甲基化標記物的指數具有成為更有效的腫瘤標記的潛力，並顯示出在肝癌管理中的重要應用價值。
為了讓本揭示之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下。
圖1顯示經局部區域治療後完全緩解的一位代表患者在局部區域治療前後的游離DNA甲基化變化。
圖2顯示經局部區域治療後病變進展的一代表位患者在局部區域治療前後的游離DNA甲基化變化。
圖3顯示DNA甲基化標記物的MMTR指數對局部區域治療後反應的預測表現。
圖4顯示組合標記物AFP+PIVKA-II+MMTR指數對局部區域治療後反應的預測表現。
圖5顯示DNA甲基化標記物的MMEP指數對肝癌病人在治療前的預測表現。
圖6顯示組合標記物AFP+PIVKA-II+MMEP指數對肝癌病人在治療前的預測表現。
承上所述，以前沒有任何研究提到在經過肝癌局部區域治療後，DNA甲基化標記物可做為腫瘤生物標記物的應用。在這項研究中，檢查了使用
DNA甲基化標記物預測肝癌在局部區域治療後的反應和預後的可行性，並將其表現與目前的腫瘤標記物進行比較。
本揭示收納了110例未接受治療的初發BCLC B期肝癌(HCC)患者，其中53例患者完全緩解，38例患者疾病穩定或部分緩解，19例患者病變進展。在中位追蹤2.4年的情況下，最後納入了72例完全緩解或病變進展的患者進行結果分析。其中，包括53例男性和19例女性，年齡中位數為68.5歲，範圍從45歲到94歲。
這些患者最初接受了包括經動脈灌流化學栓塞治療在內的局部區域治療，有些患者還進行了射頻消融的治療。在治療前，根據美國肝病學研究協會的指南，要使用增強型電腦斷層掃描或核磁共振成像對HCC診斷和TACE適應症進行評估。診斷需要至少兩種動態影像學模式。對於影像學研究中具有非典型血管形態且血清中α-胎兒蛋白程度低的患者，在其身上進行組織病理學檢查。
經動脈灌流化學栓塞治療(TACE)是一種透過血管插管將化療藥物和栓塞劑注入腫瘤供應的動脈血管，以達到局部區域治療和血流阻斷的方法，尤其適用於無法進行手術切除或局部區域治療的患者。在進行TACE治療時，選擇肝癌的供血血管，常規使用微導管，在腹部血管攝影下進行亞段置管(subsegmental catheterization)。根據腫瘤大小，使用2-10毫升碘化油(iodized oil)和10-40毫克艾黴素的鹽酸鹽(Adriblastina；Pfizer，意大利米蘭)的乳劑進行TACE治療，直到動脈血流停滯。治療成功的判斷依據為栓塞後腹腔動脈攝影
或肝門脈攝影中沒有可見的殘留腫瘤灶。如果在TACE後仍然發現存活的腫瘤，則在TACE執行3天後，再進行射頻消融(Radiofrequency Ablation,RFA)治療。
RFA是一種局部區域治療方法，在RFA治療中，將高頻電流通過針狀電極傳遞到腫瘤內部，產生高溫熱能，從而摧毀腫瘤細胞。所有患者在超音波影像的引導下進行穿刺RFA。RFA治療成功的判斷依據為即時CT影像中已經看不到HCC並保留0.5-1.0公分的安全邊緣。
在進行上述局部區域治療前和局部區域治療後一個月，患者接受了DNA甲基化標記物、α-胎兒蛋白(AFP)和異常凝血酶原(PIVKA-II)程度檢查和對比成像研究(動態CT或動態MRI)的檢查。我們還記錄了人口統計資料、腫瘤特徵和生化數據。上述各種數據包括年齡、性別、乙型肝炎表面抗原、抗丙型肝炎病毒抗體、腫瘤大小、腫瘤數量、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、白蛋白、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、肌酐程度(creatinine levels,CRE)和血小板計數。追蹤影像檢查每3個月進行一次，持續兩年。腫瘤復發的診斷按照美國肝病研究協會指南的相同標準進行。根據固體腫瘤修訂的反應評估標準，病變進展被定義為目標病灶的直徑總和增加至少20%，或新病灶的出現。
使用EZ DNA甲基化套件(Zymo Research)將血漿樣本中的細胞外DNA進行亞硫酸鹽轉換，並通過使用螢光探針的即時定量甲基化專一性PCR(qMSP)進行DNA擴增。每個反應使用總體積為20μl的1x Kapa Probe
Fast qPCR Master Mix，每個引子使用0.5μM，每個探針使用0.25μM。DNA擴增使用QuantStudio 5即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific)進行。
基於我們先前的研究成果，我們選擇了10個HCC特定的甲基化區域作為DNA甲基化的候選標記物，包括RASSF1A、miR-203、COX2、APC、類似Aristaless的homeobox 3基因(Aristaless-like homeobox 3,ALX3)、T-box轉錄因數4(T-box transcription factor 4,TBX4)、睪丸專一性Y編碼蛋白5(testis-specific Y-encoded-like protein 5,TSPYL5)、cg08643930、cg12582777和cg12714719，以測試這些DNA的DNA甲基化標記物在局部區域治療前後的甲基化程度。用來偵測上述RASSF1A、miR-203、COX2、APC、ALX3、TBX4、TSPYL5、cg08643930、cg12582777和cg12714719目標基因之甲基化所使用之引子對與探針，列於下面的表1中。
DNA甲基化標記物的甲基化程度的計算公式如下面所示，其中Ct為聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction；PCR)的迴圈數閾值(cycle threshold)，β-肌動蛋白抗體(β-actin)為參考基因。
DNA甲基化標記物的甲基化程度=2^[Ct(β-actin)-Ct(DNA甲基化標記物)]×1000
治療前後DNA甲基化程度的差異使用成對樣本t檢定來確定之，觀察治療後30天的變化。使用邏輯回歸模型建立兩個預測模型，分別用於治療反應和預後的預測。為了評估診斷效果，使用受試者操作特徵曲線(Receiver operating characteristic curve,ROC Curve)分析來估計曲線下面積、閾值(cutoff value)、靈敏度和專一性。使用單變量COX回歸分析評估每個變數與生存之間的關聯。通過Kaplan-Meier方法計算生存曲線，並使用對數-等級檢定(log-rank test)進行分布比較。從診斷日期開始計算無疾病存活時間，直到復發或追蹤結束。從診斷日期開始計算整體存活時間，直到因疾病而死亡或追蹤結束。多變量分析使用Cox比例風險模型，估計風險比(Hazard Ratio,HR)及其95%信賴區間(confidence interval,CI)。在所有測試中，統計顯著性標準為P<0.05。
發現完全緩解(CR)患者和病變進展(PD)患者的甲基化程度呈現完全不同的模式。
圖1顯示經局部區域治療後完全緩解的一位代表患者在局部區域治療前後的游離DNA甲基化變化。從圖1可知，在完全緩解(CR)的患者
中，相較於治療前1天(第0天)，在局部區域治療(LRT)後一個月(第30天)的追蹤中，候選標記物的甲基化程度有下降的趨勢。
圖2顯示經局部區域治療後病變進展的一代表位患者在局部區域治療前後的游離DNA甲基化變化。從圖2可知，病變進展(PD)患者之候選標記物的甲基化程度在第30天反而有上升的趨勢。這些結果暗示DNA甲基化標記物可能可以作為評估LRT療效的生物標記物。
因此，通過對治療前和治療後一個月的甲基化程度進行邏輯回歸分析，構建了用於腫瘤治療的甲基化預測模型(methylation prediction model for tumor response,MMTR)，可用來評估HCC的治療效果。計算方法如下：MMTR指數=1.457+0.035×(RASSF1A的△甲基化程度)-0.002×(APC的△甲基化程度)+0.068×(cg12714719的△甲基化程度)+0.038×(cg08643930的△甲基化程度)+0.017×(miR203的△甲基化程度)-0.047×(COX2的△甲基化程度)-0.049×(ALX3的△甲基化程度)-0.069×(TSPYL5的△甲基化程度)+0.032×(cg12582777的△甲基化程度)+0.147×(TBX4的△甲基化程度)「△甲基化程度」代表第0天(即治療前1天)和第30天之DNA甲基化標記物的甲基化程度的差值。
接著，基於局部區域治療反應的甲基化預測模型，獨立計算了每個HCC患者的MMTR指數，並通過接收者操作特徵曲線(receiver operating characteristic,ROC)分析評估其性能。比較完全緩解(CR)患者和病變進展(PD)患者的MMTR指數，經由ROC的分析後，可以得到MMTR指數的閾值為
0.7003。當一位肝癌病患的MMTR指數大於0.7003時，表示其在接受局部區域治療後會具有病變進展的風險。
下面以AFP、PIVKA-II、MMTR指數三個腫瘤標記或其組合來測試其對局部區域治療後反應的預測表現。首先，先看單一腫瘤標記AFP、PIVA-II、MMTR指數對局部區域治療後反應的預測表現。
在表2中，列出通過ROC分析確定之腫瘤標記和甲基化預測模型對治療反應的靈敏度和專一性。先看單一腫瘤標記AFP、PIVKA-II、MMTR指數對局部區域治療後反應的預測表現。在表2中，AFP的AUC為0.717(95% CI：0.572-0.862，P=0.002)，靈敏度為59.1%，專一性為82.2%。PIVKA-II的AUC為0.708(95% CI：0.565-0.852，P=0.006)，靈敏度為72.2%，專一性為69.4%。MMTR指數的AUC為0.759(95% CI：0.641-0.877，P=0.002)，靈敏度為72.2%，專一性為62.5%。
其次，再看將腫瘤標記AFP、PIVKA-II、MMTR指數任意組合後對局部區域治療後反應的預測表現。在表2中，組合標記物AFP+PIVKA-II的AUC為0.796(95%CI：0.678-0.915，P<0.001)，靈敏度為75.0%，專一性為66.7%。組合標記物AFP+MMTR指數的AUC為0.895(95%CI：0.812-0.977，P<0.001)，靈敏度為83.3%，專一性為81.2%。組合標記物PIVKA-II+MMTR指數的AUC為0.803(95%CI：0.691-0.914，P=0.001)，靈敏度為71.7%，專一性為76.9%。組合標記物AFP+PIVKA-II+MMTR指數的AUC為0.880(95%CI：0.786-0.973，P<0.001)，靈敏度為83.0%，專一性為76.9%。
從表2可以看到將MMTR指數分別與AFP或PIVKA-II相結合後，AUC分別可顯著提高至0.895或0.803，且其中組合標記物AFP+MMTR指數在局部區域治療反應的預測評估中具有最佳表現。
AFP：α-胎兒蛋白；PIVKA-II：異常凝血酶原；MMTR：腫瘤治療的甲基化預測模型；AUC：曲線下面積。
AFP作為最廣泛使用的HCC標記物，已被報告與HCC的腫瘤生物學相關，腫瘤生物學與腫瘤分化、血管侵犯、進展和生存有關。然而在充分的證據基礎上，顯示AFP的表現無法提供適當的表現。相比之下，DNA甲基化標記物可以用於評估本研究中接受局部區域治療的所有患者。此外，對治療後反應的評估，MMTR指數的表現(AUC=0.759，P=0.002)也優於AFP(AUC=0.717，P=0.002)和PIVKA-II(AUC=0.708，P=0.006)。根據標記物相互組合的結果，相較於AFP對於預測局部區域治療反應的效果，我們發現PIVKA-II較差。MMTR/AFP、MMTR/PIVKA-II和MMTR/AFP/PIVKA-II的
AUC分別為0.895、0.803和0.880。這些結果表明，僅檢測AFP和DNA甲基化標記物可能就能夠實現最佳的治療反應預測能力。
肝動脈化學栓塞術無效和中期HCC患者的早期進展到晚期是常見且難以在LRT之前預測的情況，這通常導致預後不良。在HCC的早期階段，即使沒有任何症狀，也可以觀察到DNA異常甲基化的現象。甲基化標記可能有助於定義微小殘留腫瘤。在兩年的追蹤中，72名患者中有20名患者在一年內迅速進展到晚期，並伴有血管侵犯或遠處轉移的現象，且預後不良，而其他52名患者未出現上述現象。
我們使用治療前的甲基化程度建立了早期進展的治療前甲基化預測模型(methylation prediction model for early progression,MMEP)，計算如下：MMEP指數=-4.333-0.064×(RASSF1A的D0甲基化程度)-0.058×(miR203的D0甲基化程度)+0.001×(COX2的D0甲基化程度)+0.176×(APC的D0甲基化程度)+2.121×(ALX3的D0甲基化程度)-0.035×(cg12582777的D0甲基化程度)-0.139×(TBX4的D0甲基化程度)+0.01×(TSPYL5的D0甲基化程度)-0.044×(cg12714719的D0甲基化程度)+0.138×(cg08643930的D0甲基化程度)其中「D0甲基化程度」代表治療前DNA甲基化標記物的甲基化程度。
基於肝癌病人從早期進展至晚期階段的預測模型，獨立計算了每個HCC患者的MMEP指數，並通過接收者操作特徵曲線(receiver operating characteristic,ROC)分析評估其預測效果。比較治療後一年內疾病進展較快的患者和治療後效果較佳的患者之MMEP指數，經由ROC的分析後，可以得到MMEP指數的閾值為0.2570。當一位肝癌病患的MMEP指數大於0.2570時，表示其一年內具有較高疾病進展的風險。
下面以AFP、PIVKA-II、MMEP指數三個腫瘤標記或其組合來測試其對局部區域治療後反應的預測表現。首先，先看單一腫瘤標記AFP、PIVKA-II、MMEP指數對肝癌病人從早期進展至晚期階段的預測表現。
在表3中，列出通過ROC分析確定之腫瘤標記和甲基化預測模型對肝癌病人在治療前的預測表現之靈敏度和專一性。在表3中，AFP的AUC為0.758(95% CI：0.636-0.880，P<0.001)，靈敏度為76.0%，專一性為70.4%。PIVKA-II的AUC為0.714(95% CI：0.583-0.844，P=0.005)，靈敏度為66.7%，專一性為62.3%。PIVKA-II的AUC為0.794(95% CI：0.681-0.908，P<0.001)，靈敏度為73.7%，專一性為69.8%。
其次，再將腫瘤標記AFP、PIVKA-II、MMEP指數任意組合後對肝癌病人的治療前預測表現。在表3中，組合標記物AFP+PIVKA-II的AUC為0.830(95% CI：0.723-0.937，P<0.001)，靈敏度為83.3%，專一性為69.6%。組合標記物AFP+MMEP指數的AUC為0.857(95% CI：0.762-0.952，P<0.001)，靈敏度為78.9%，專一性為73.6%。組合標記物PIVKA-II+MMEP指數的AUC為0.857(95% CI：0.736-0.977，P<0.001)，靈敏度為84.6%，專一性
為68.6%。組合標記物AFP+PIVKA-II+MMEP指數的AUC為0.922(95% CI：0.848-0.995，P<0.001)，靈敏度為92.3%，專一性為72.5%。
從表3可知，在治療之前，將MMEP指數、AFP和PIVKA-II結合起來，可能對預後效果的預測會是一個非常有用的工具。
AFP：α-胎兒蛋白；PIVKA-II：異常凝血酶原；MMEP：早期進展的治療前甲基化預測模型；AUC：曲線下面積。
根據我們的臨床數據，26.4%的患者在局部區域治療後迅速發展到晚期。這可能是由於影像工具的限制和目前腫瘤標記物的效果不佳，無法進行準確的手術前評估所導致的。在治療前的預後預測中，DNA甲基化標記物的MMEP指數也表現出優越的能力。相比AFP和PIVKA-II，MMEP指數結合AFP和PIVKA-II表現相同的性能(AUC=0.857)，表明PIVKA-II的預後能力與AFP相當。結合MMEP指數、AFP和PIVKA-II的AUC可達到0.922
(P<0.001)。這些結果可能反映了DNA甲基化標記物的生物學特性，在症狀出現之前，DNA甲基化標記物的甲基化程度已經發生變化。影像工具和有效生物標記物的整合提供了一種精確的監測和預後評估工具，幫助醫生制定更有效的治療策略，包括更早地應用輔助治療和更頻繁地監測。
為了研究在局部區域治療(LRT)治療反應和早期病變進展評估中有哪些重要的預測因子，進行了單變量和多變量的邏輯迴歸分析。在單變量和多變量的邏輯迴歸分析中，檢測了幾個臨床病理因素、腫瘤標記物和DNA甲基化標記物。這些被檢測的項目包括腫瘤大小、腫瘤數量、TBIL、AST、ALT、PLT、CRE、Child-Pugh評分、血清白蛋白-膽紅素(ALBI)評分、up-to-7標準、AFP、PIVKA-II和上述MMTR指數。
對於LRT治療反應的評估分析結果列在表4中。在單變量分析中，up-to-7標準(HR=0.281，95% CI：0.088-0.896，P=0.032)、AFP(HR=0.178，95% CI：0.059-0.537，P=0.002)和MMTR指數(HR=209.950，95% CI：5.125-8600.352，P=0.005)顯示出對於肝癌患者經過LRT後是否會有病變進展風險的影響具有顯著性。在多變量分析中，AFP(HR=0.104，95% CI：0.024-0.443，P=0.002)和MMTR指數(HR=1452.153，95% CI：9.180-229712.946，P=0.005)被確定為對於肝癌患者經過LRT後是否會有病變進展風險的影響具有顯著性。
因此，不論是在單變量還是多變量的邏輯迴歸分析中，在對於肝癌患者經過LRT後是否會有病變進展的風險預測因子中，血清腫瘤標記物AFP和DNA甲基化標記物的MMTR指數都顯示具有明顯的影響力。
HR(hazard ratio)：風險比(HR=1對風險無影響，HR>1增加風險，HR<1減少風險)；CI：信賴區間；TBIL：總膽紅素；ALT：丙氨酸轉氨酶；AST：天冬氨酸轉氨酶；PLT：血小板；CRE：肌酸酐；ALBI：白蛋白-膽紅素；AFP：α-胎兒蛋白；PIVKA-II：缺乏維生素K或拮抗劑-II誘導的蛋白質；MMTR指數：腫瘤反應的甲基化預測模型。
對於預測腫瘤的早期進展，分析結果列在表5中。在單變量分析中，腫瘤大小(HR=1.320，95% CI：1.051-1.656，P=0.017)、腫瘤數量(HR=1.746，95% CI：0.999-3.052，P=0.051)、PLT(HR=1.008，95% CI：1.001-1.015，P=0.032)、up-to-7標準(HR=8.381，95% CI：2.586-27.17，P<0.001)和MMEP指數(HR=175.057，95% CI：8.876-33452.494，P=0.001)顯示出顯著性。多變量分析顯示PLT(HR=1.011，95% CI：1.000-1.022，P=0.044)、up-to-7標準(HR=10.369，95% CI：1.205-89.23，P=0.033)和MMEP指數(HR=240.760，95% CI：4.888-11858.991，P=0.006)與早期腫瘤進展高度相關。
因此，不論是在單變量還是多變量的邏輯迴歸分析中，在治療前對於肝癌患者之風險預測因子中，血小板PLT、up-to-7標準和DNA甲基化標記物的MMEP指數都具有明顯的影響力。
HR(hazard ratio)：風險比(HR=1對風險無影響，HR>1增加風險，HR<1減少風險)；CI：信賴區間；TBIL：總膽紅素；ALT：丙氨酸轉氨酶；AST：天冬氨酸轉氨酶；PLT：血小板；CRE：肌酸酐；ALBI：白蛋白-膽紅素；AFP：α-胎兒蛋白；PIVKA-II：缺乏維生素K或拮抗劑-II誘導的蛋白質；MMEP：治療前的甲基化預測模型。
這些結果進一步證明，與血清腫瘤標記物AFP和PIVKA-II相比，DNA甲基化標記物的MMTR指數在預後追蹤LRT治療反應和MMEP指數在治療前預測治療效果都具有更優越的能力，可以作為理想的生物標記物。
下面採用Cox比例風險回歸模型確定肝癌病人的兩年無病存活率(disease free survival,DFS)和兩年總存活率(overall survival,OS)的潛在風險因素。
無病存活率DFS分析的結果列在表6中。根據單變量分析結果，腫瘤大小(HR=1.161，95% CI：1.030-1.310，P=0.015)、PLT(HR=1.004，95% CI：1.000-1.009，P=0.041)、ALBI評分(HR=1.923，95% CI：1.026-3.603，P=0.041)、PIVKA-II(HR=1.000，95% CI：1.000-1.000，P<0.001)和MMEP指數(HR=14.101，95% CI：3.691-53.867，P<0.001)具有顯著性。在多變量分析中，ALBI評分(HR=2.671，95% CI：1.281-5.566，P=0.009)和MMEP(HR=7.426，95% CI：1.263-43.611，P=0.027)是兩年DFS的顯著獨立風險因素。
因此，不論是在單變量還是多變量的邏輯迴歸分析中，在對於肝癌患者的兩年無病存活率DFS之風險預測因子中，ALBI評分和DNA甲基化標記物的MMEP指數都具有明顯的影響力。當MMEP指數大於0.2570時，表示該肝癌患者兩年無病存活率較低。
HR(hazard ratio)：風險比(HR=1對風險無影響，HR>1增加風險，HR<1減少風險)；CI：信賴區間；TBIL：總膽紅素；ALT：丙氨酸轉氨酶；AST：天冬氨酸轉氨酶；PLT：血小板；CRE：肌酸酐；ALBI：白蛋白-膽紅素；AFP：α-胎兒蛋白；PIVKA-II：異常凝血酶原；MMEP：治療前的甲基化預測模型。
上述預測因子對於肝癌患者的兩年總存活率OS之影響力的評估分析結果列在表7中。在兩年OS分析中，腫瘤大小(HR=1.185，95% CI：1.018-1.380，P=0.028)、TBIL(HR=1.959，95% CI：1.030-3.728，P=0.041)、AST(HR=1.011，95% CI：1.002-1.019，P=0.017)、PIVKA-II(HR=1.000，95%
CI：1.000-1.000，P=0.008)和MMEP指數(HR=37.683，95% CI：2.897-490.086，P=0.006)具有顯著性。在多變量分析中，只有MMEP指數(HR=267.609，95% CI：1.725-41526.047，P=0.030)具有顯著性。
因此，不論是在單變量還是多變量的邏輯迴歸分析中，在對於肝癌患者的兩年總存活率OS之風險預測因子中，只有DNA甲基化標記物的MMEP指數具有明顯的影響力。當MMEP指數大於0.2570時，表示該肝癌患者兩年總存活率較低。
HR(hazard ratio)：風險比(HR=1對風險無影響，HR>1增加風險，HR<1減少風險)；CI：信賴區間；TBIL：總膽紅素；ALT：丙氨酸轉氨酶；AST：天冬氨酸轉氨酶；PLT：血小板；CRE：肌酸酐；ALBI：白蛋白-膽紅素；AFP：α-胎兒蛋白；PIVKA-II：異常凝血酶原；MMEP：治療前的甲基化預測模型。
這些結果揭示了與目前的臨床病理因素和血清標記物相比，DNA甲基化標記物在評估DFS和OS方面具有令人印象深刻的預後能力。
整體而言，72名患者中有41人(56.9%)在20ng/mL的閾值下AFP為陰性，65名患者中有27人(41.5%)在40mAU/mL的閾值下PIVKA-II為陰性。除了影像工具外，無法對這些血清腫瘤標記正常的患者進行評估。相反地，所有患者都可以獲得上述DNA甲基化標記物的MMTR指數和MMEP指數。這意味著DNA甲基化標記物的指數具有成為一種更有效之腫瘤標記的潛力，更有益處。因此，已證明DNA甲基化標記物的指數對於那些沒有AFP或PIVKA-II表達的患者而言是一種更好的腫瘤標記。
此外，我們注意到在LRT後，DNA甲基化標記物的甲基化程度會發生變化並且可以通過其表達程度來反應治療狀況。這種現象在以前的文獻回顧中從未被提及。來自10個DNA甲基化標誌的MMTR指數首次證實了對所有肝癌患者的臨床可行性。其預測能力不亞於AFP和PIVKA-II，並且與常
規腫瘤標記相結合時，預測能力提高至0.880的AUC，靈敏度和特異度分別為75.0%和66.7%。
本揭示之研究是第一個證明DNA甲基化標記物在局部區域治療反應和預後評估中的臨床應用價值。其性能優於目前的血清腫瘤標記物，包括AFP和PIVKA-II。這些結果表明，DNA甲基化標記物潛在地為管理易於高風險的HCC患者提供了一個有用的工具，可以在局部區域治療後進行密切監測或輔助治療，甚至可以在治療前精確預測腫瘤進展，以制定適當的治療策略，改善HCC的預後結果。
因此，本揭示至少具有下述技術功效：
1.DNA甲基化標記物的指數擁有更高的臨床可行性：相比於血清腫瘤標記物AFP和PIVKA-II，DNA甲基化標記物的指數在患者中的檢測結果更為全面，所有肝癌患者都可以獲得DNA甲基化標記物的指數，無論AFP或PIVKA-II是否有在肝癌患者體內表達出來。
2.DNA甲基化標記物的指數預測能力較高：這些DNA甲基化標記物的指數在預測肝癌患者的狀況和治療反應方面表現出色，其預測能力不亞於常規的AFP和PIVKA-II指標。此外，當DNA甲基化標記物與常規腫瘤標記物結合時，預測能力還可進一步提高。
3.可用於治療監測和預後評估：DNA甲基化標記物的指數被證明肝癌患者在局部區域治療後，以及治療前對腫瘤進展進行預測上具有價值。這使得其成為管理高風險肝癌患者的有用工具，可以幫助醫生在肝癌治療後進行密切監測或輔助治療，並幫助制定更加精確的治療策略，以改善患者的預後結果。
4.比影像工具更全面：除了對影像工具進行檢測外，DNA甲基化標記物的指數提供了一種更全面的評估方式，特別是對於那些血清腫瘤標記正常的患者，這樣可以提供更多有價值的信息。
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Claims (8)
- 一種利用電腦評估經局部區域治療的肝癌患者的病變進展風險的方法，包含：取得一肝癌患者在治療前1天之一第一生物樣品；取得該肝癌患者在治療後第30天之一第二生物樣品；一電腦分析該第一生物樣品和該第二生物樣品中之與肝癌相關的複數個DNA甲基化標記物的甲基化程度，其中該些DNA甲基化標記物包含RASSF1A、miR-203、COX2、APC、ALX3、cg12582777、TBX4、TSPYL5、cg12714719和cg08643930，其中各個該些DNA甲基化標記物的甲基化程度=2^[Ct(β-actin)-Ct(各個該些DNA甲基化標記物)]×1000，Ct為PCR的迴圈數閾值；該電腦分別計算出該些DNA甲基化標記物在治療前1天和治療後第30天之甲基化程度的差值；該電腦依據該些DNA甲基化區域的甲基化程度，計算腫瘤治療的甲基化預測模型(methylation prediction model for tumor response,MMTR)指數，MMTR指數的計算公式為：MMTR指數=1.457+0.035×(RASSF1A的△甲基化程度)-0.002×(APC的△甲基化程度)+0.068×(cg12714719的△甲基化程度)+0.038×(cg08643930的△甲基化程度)+0.017×(miR203的△甲基化程度)-0.047×(COX2的△甲基化程度)-0.049×(ALX3的△甲基化程度)-0.069×(TSPYL5的△甲基化程度)+0.032×(cg12582777的△甲基化程度)+0.147×(TBX4的△甲基化程度)，其中「△甲基化程度」為該些DNA甲基化標記物之治療前1天和治療後第30天之甲基化程度的差值；以及 當MMTR指數大於預先確認之一參考值時，表示該肝癌患者在接受局部區域治療後會有病變進展的風險。
- 如請求項1所述之利用電腦評估經局部區域治療的肝癌患者的病變進展風險的方法，其中該參考值為0.7003。
- 一種利用電腦對未接受治療的肝癌患者評估在治療後的病變進展風險的方法，包含：取得一肝癌患者在治療前1天之一生物樣品；一電腦分析該生物樣品中之與肝癌相關的複數個DNA甲基化標記物的甲基化程度，該些DNA甲基化標記物包含RASSF1A、miR-203、COX2、APC、ALX3、cg12582777、TBX4、TSPYL5、cg12714719和cg08643930，其中各個該些DNA甲基化標記物的甲基化程度=2^[Ct(β-actin)-Ct(各個該些DNA甲基化標記物)]×1000，Ct為PCR的迴圈數閾值；該電腦依據該些DNA甲基化標記物的甲基化程度，計算腫瘤預後的甲基化預測模型(methylation prediction model for early progression,MMEP)指數，MMEP指數的計算公式為：MMEP指數=-4.333-0.064×(RASSF1A的D0甲基化程度)-0.058×(miR203的D0甲基化程度)+0.001×(COX2的D0甲基化程度)+0.176×(APC的D0甲基化程度)+2.121×(ALX3的D0甲基化程度)-0.035×(cg12582777的D0甲基化程度)-0.139×(TBX4的D0甲基化程度)+0.01×(TSPYL5的D0甲基化程度)-0.044×(cg12714719的D0甲基化程度)+0.138×(cg08643930的D0甲基化程度)，其中「D0甲基化程度」代表該些DNA甲基化標記物之治療前1天的甲基化程度；以及 當MMEP指數大於預先確認之一參考值時，表示該肝癌患者在接受局部區域治療後會有較高病變進展的風險。
- 如請求項3所述之利用電腦對未接受治療的肝癌患者評估在治療後的病變進展風險的方法，其中該參考值為0.2570。
- 一種利用電腦評估肝癌患者之兩年無病存活率的方法，包含：取得一肝癌患者在治療前1天之一生物樣品；一電腦分析該生物樣品中之與肝癌相關的複數個DNA甲基化標記物的甲基化程度，該些DNA甲基化標記物包含RASSF1A、miR-203、COX2、APC、ALX3、cg12582777、TBX4、TSPYL5、cg12714719和cg08643930，其中各個該些DNA甲基化標記物的甲基化程度=2^[Ct(β-actin)-Ct(各個該些DNA甲基化標記物)]×1000，Ct為PCR的迴圈數閾值；以及該電腦依據該些DNA甲基化標記物的甲基化程度，計算腫瘤預後的甲基化預測模型(methylation prediction model for early progression,MMEP)指數，MMEP指數的計算公式為：MMEP指數=-4.333-0.064×(RASSF1A的D0甲基化程度)-0.058×(miR203的D0甲基化程度)+0.001×(COX2的D0甲基化程度)+0.176×(APC的D0甲基化程度)+2.121×(ALX3的D0甲基化程度)-0.035×(cg12582777的D0甲基化程度)-0.139×(TBX4的D0甲基化程度)+0.01×(TSPYL5的D0甲基化程度)-0.044×(cg12714719的D0甲基化程度)+0.138×(cg08643930的D0甲基化程度)，其中「D0甲基化程度」代表該些DNA甲基化標記物之治療前1天的甲基化程度；以及 當MMEP指數大於預先確認之一參考值時，表示該肝癌患者的兩年無病存活率較低。
- 如請求項5所述之利用電腦評估肝癌患者之兩年無病存活率的方法，其中該參考值為0.2570。
- 一種利用電腦評估肝癌患者之兩年總存活率的方法，包含：取得一肝癌患者在治療前1天之一生物樣品；一電腦分析該生物樣品中之與肝癌相關的複數個DNA甲基化標記物的甲基化程度，該些DNA甲基化標記物包含RASSF1A、miR-203、COX2、APC、ALX3、cg12582777、TBX4、TSPYL5、cg12714719和cg08643930，其中各個該些DNA甲基化標記物的甲基化程度=2^[Ct(β-actin)-Ct(各個該些DNA甲基化標記物)]×1000，Ct為PCR的迴圈數閾值；以及該電腦依據該些DNA甲基化標記物的甲基化程度，計算腫瘤預後的甲基化預測模型(methylation prediction model for early progression,MMEP)指數，MMEP指數的計算公式為：MMEP指數=-4.333-0.064×(RASSF1A的D0甲基化程度)-0.058×(miR203的D0甲基化程度)+0.001×(COX2的D0甲基化程度)+0.176×(APC的D0甲基化程度)+2.121×(ALX3的D0甲基化程度)-0.035×(cg12582777的D0甲基化程度)-0.139×(TBX4的D0甲基化程度)+0.01×(TSPYL5的D0甲基化程度)-0.044×(cg12714719的D0甲基化程度)+0.138×(cg08643930的D0甲基化程度)，其中「D0甲基化程度」代表該些DNA甲基化標記物之治療前1天的甲基化程度；以及當MMEP指數大於預先確認之一參考值時，表示該肝癌患者的兩年總存活率較低。
- 如請求項7所述之利用電腦評估肝癌患者之兩年總存活率的方法，其中該參考值為0.2570。
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Bedon, L., Dal Bo, M., Mossenta, M., Busato, D., Toffoli, G., & Polano, M A novel epigenetic machine learning model to define risk of progression for hepatocellular carcinoma patients International Journal of Molecular Sciences 22(3), 1075 https://www.mdpi.com/ 22 January 2021 https://www.mdpi.com/1422-0067/22/3/1075/pdf?version=1611306176 |
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