CN118147309A - 用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或组合及其应用 - Google Patents
用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或组合及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118147309A CN118147309A CN202410449233.3A CN202410449233A CN118147309A CN 118147309 A CN118147309 A CN 118147309A CN 202410449233 A CN202410449233 A CN 202410449233A CN 118147309 A CN118147309 A CN 118147309A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- methylation
- chr12
- bladder cancer
- lymph node
- node metastasis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 167
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 165
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 93
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 93
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 93
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 title claims abstract description 90
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 23
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 238000012164 methylation sequencing Methods 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 claims description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 5
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 claims description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 claims 1
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 49
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 238000012549 training Methods 0.000 description 8
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 8
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 102100026278 Cysteine sulfinic acid decarboxylase Human genes 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 101000855583 Homo sapiens Cysteine sulfinic acid decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- 101000632056 Homo sapiens Septin-9 Proteins 0.000 description 2
- 108010076800 Kisspeptin-1 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010038111 Recurrent cancer Diseases 0.000 description 2
- 102100028024 Septin-9 Human genes 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- KJLPSBMDOIVXSN-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[2-[4-(3,4-dicarboxyphenoxy)phenyl]propan-2-yl]phenoxy]phthalic acid Chemical compound C=1C=C(OC=2C=C(C(C(O)=O)=CC=2)C(O)=O)C=CC=1C(C)(C)C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=C(C(O)=O)C(C(O)=O)=C1 KJLPSBMDOIVXSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027765 Atlastin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010018612 Gonorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101000936988 Homo sapiens Atlastin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100333758 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ERP3 gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006578 abscission Effects 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000001786 gonorrhea Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物及其用途。所述的甲基化生物标志物选自以下中的至少一种：chr12:49726834‑49727076、chr12:9393053‑9393068、chr15:101513454‑101513815、chr5:140892863‑140893102、和chr7:1100306‑1100309。本发明提供的甲基化生物标记物可以用于诊断膀胱癌淋巴结转移，具有良好的准确度和区分能力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物及其应用。
背景技术
膀胱癌（Bladder Cancer，BCa）发生于膀胱黏膜上，是泌尿系统常见的恶性肿瘤。膀胱癌位居全球癌症死亡率第9位，其致死的主要原因是发生转移，而淋巴转移是主要和首发的方式。一旦发生淋巴转移，5年生存率只有25-35%。并且，淋巴结转移阴性患者复发的概率也远低于阳性患者的概率。因此，早期评估膀胱癌患者淋巴结转移风险对治疗策略的选择具有重要的指导作用，尤其对术前新辅助化疗的应用及术中盆腔淋巴清扫范围的选择等具有重要意义。
目前，膀胱癌患者的淋巴结状态主要依靠影像进行诊断，如CT和MRI，对淋巴结位置、大小、形状和内部结构进行观察，短径大于10mm是目前临床普遍认可的淋巴结转移的判别标准，但临床上很多正常大小的淋巴结已经发生转移。术前病理也常用于判断膀胱癌患者的淋巴结状态，但由于存在病理异质性，诊断结果存在较高的假阴性，术前诊断为阴性的膀胱癌患者中大约25%~30%已经发生淋巴结转移。因此探索新的、精准的方法对于膀胱癌患者淋巴结转移的评估以及准确诊断、精准治疗均具有重要意义。基于尿液脱落细胞的膀胱癌淋巴结转移标志物可有效用于评估膀胱癌患者淋巴结转移风险，解决现有精准辅助检查和诊断的临床痛点。
DNA甲基化通过调控基因的转录和表达，在细胞分化和疾病发生中发挥重要作用。过去几十年里，关于基因启动子区的甲基化研究迅速进展，并成功进入临床转化和应用，已初步显露其在肿瘤风险筛查和早期诊断的临床应用价值。DNA甲基化生物标记物在膀胱癌的早期诊断与复发监测中已经有相关应用，然而，迄今为止关于精准评估膀胱癌淋巴结转移风险的DNA甲基化标志物报道十分有限。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供了一种用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物，利用DNA甲基化生物标志物来进行膀胱癌淋巴结转移检测，通过单个或多个甲基化标志物组合的检测及精准预测的目的。
本发明的第一方面，提供了一种用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或其组合，所述的甲基化生物标志物选自以下中的至少一种： chr12:49726834-49727076、chr12:9393053-9393068、chr15:101513454-101513815、chr5:140892863-140893102、和chr7:1100306-1100309，所述甲基化位点比对到hg19对应的位置。
在一些实施方案中，所述的甲基化生物标志物的组合为：chr12:49726834-49727076和选自以下中的至少一种chr12:9393053-9393068、chr15:101513454-101513815、chr5:140892863-140893102、和chr7:1100306-1100309。
在一些实施方案中，所述的甲基化生物标志物的组合为：chr12:9393053-9393068和选自以下中的至少一种：chr12:49726834-49727076、chr15:101513454-101513815、chr5:140892863-140893102、和chr7:1100306-1100309。
在一些实施方案中，所述的甲基化生物标志物的组合为：chr15:101513454-101513815和选自以下中的至少一种：chr12:49726834-49727076、chr12:9393053-9393068、chr5:140892863-140893102、和chr7:1100306-1100309。
在一些实施方案中，所述的甲基化生物标志物的组合为以下中至少一种：
1）chr12:49726834-49727076，和chr12:9393053-9393068；
2）chr12:49726834-49727076，和chr15:101513454-101513815；
3）chr12:49726834-49727076，和chr5:140892863-140893102；
4）chr12:49726834-49727076，和chr7:1100306-1100309；
5）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068和chr5:140892863-140893102；
6）chr12:49726834-49727076，chr15:101513454-101513815，和chr5:140892863-140893102；
7）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，和chr5:140892863-140893102；
8）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，和chr7:1100306-1100309；
9）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309；
10）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309。
在一些实施方案中，所述的甲基化生物标志物的组合为以下中至少一种：
1）chr12:9393053-9393068，和chr15:101513454-101513815；
2）chr12:9393053-9393068，和chr5:140892863-140893102；
3）chr12:9393053-9393068，和chr7:1100306-1100309；
4）chr12:9393053-9393068，和chr15:101513454-101513815，chr5:140892863-140893102；
5）chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，和chr7:1100306-1100309；
6）chr12:9393053-9393068，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309；
7）chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309。
在一些实施方案中，所述的甲基化生物标志物的组合为为以下中至少一种：
1）chr15:101513454-101513815，和chr5:140892863-140893102；
2）chr15:101513454-101513815，和chr7:1100306-1100309；
3）chr15:101513454-101513815，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309。
在一些实施方案中，所述的甲基化生物标志物组合是chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309。
在一些实施方案中，所述的膀胱癌淋巴结转移为存在于受试者中的膀胱癌淋巴结转移。任选地，所述的受试者为哺乳动物；优选地，所述的哺乳动物为人。
在一些实施方案中，所述膀胱癌淋巴结转移选自各个时期的膀胱癌淋巴结转移。
在一些实施方案中，待测样本中所述甲基化生物标记物的甲基化水平，与来自膀胱癌无淋巴结转移的样本中所述甲基化生物标记物的甲基化水平存在差异，则指示所述待测样本对应的受试者存在膀胱癌淋巴结转移。
在本发明的第二方面，提供了上述甲基化生物标记物或其组合在制备诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂或试剂盒中的应用。
上述甲基化生物标记物或其组合的检测试剂在制备诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂盒中的应用。
在本发明的第三方面，提供了一种用于诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中上述任一项所述的甲基化生物标志物或其组合的甲基化水平的试剂。
在一些实施方案中，所述的试剂为选自以下的检测甲基化水平的方法中所使用的试剂；荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述的待测样本选自组织、全血、血浆、唾液、血清、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。优选地，所述的待测样本为组织、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清。
在一些实施方案中，所述的待测样本来自于受试者；任选地，所述的受试者是哺乳动物；优选地，所述的哺乳动物是人。
本发明的第四方面，提供了一种用于诊断膀胱癌淋巴结转移的系统，其中，所述系统包括检测装置、计算装置和输出装置；所述检测装置包括进样器和检测器，所述进样器用于采集来自受试者的样本，所述检测器用于检测所述样本中本发明第一方面中任一项所述的甲基化生物标记物的甲基化水平；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：所述样本中本发明第一方面中任一项所述的甲基化生物标记物的甲基化水平不同于来自膀胱癌无淋巴结转移的样本中测定的所述甲基化生物标记物的甲基化水平，则判别所述样本对应的受试者的存在膀胱癌淋巴结转移。
本发明找到5个甲基化生物标志物，其与膀胱癌淋巴结转移高度相关，这5个甲基化生物标志物可以用于诊断膀胱癌淋巴结转移，具有良好的准确度及区分能力。来自于这5个甲基化生物标志物的组合，具有更好的灵敏度和特异性，具有更稳定的检测效果，为临床诊断膀胱癌淋巴结转移提供更准确灵敏的检测服务。
附图说明
图1. 本发明5个甲基化标志物在膀胱癌组织样本的信号热图。
图2. 本发明5个甲基化标志物在膀胱癌组织样本训练集和验证集中的ROC曲线。
图3. 本发明5个甲基化标志物的组合在独立验证集膀胱癌组织样本的信号热图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning: A LaboratoryManual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在本发明中，“DNA甲基化位点”、“甲基化位点”是指可能发生DNA甲基化修饰的单个或多个碱基位置。例如CpG位点、CHG位点或CHH位点。在一些情况下，DNA甲基化位点等同于CpG位点。
本发明中，甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示（例如，表示甲基化频率、分数、比例、百分比等）。甲基化值可以用例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。
如本发明所用，“甲基化频率”或“甲基化百分比(％)”是指分子或基因座为甲基化的实例数相对于分子或基因座为未甲基化的实例数。例如，在一些实施方案中，甲基化百分比是指甲基化胞嘧啶的百分比，以β值表示，即β=携带甲基化胞嘧啶数量/(携带甲基化胞嘧啶数量+未携带甲基化胞嘧啶的数量)。
因此，甲基化状态描述核酸（例如，基因组序列）的甲基化的状态。此外，甲基化状态是指核酸片段在特定的基因组基因座处与甲基化相关的特性。此类特性包括但不限于：此DNA序列内的任何胞嘧啶(C)残基是否为甲基化的，甲基化C残基的位置，遍及核酸的任何特定区的甲基化C的频率或百分比，以及因例如等位基因来源中的差异而导致的甲基化中的等位基因差异。术语“甲基化状态”、“甲基化谱”和“甲基化状况”还指遍及生物样品中核酸的任何特定区的甲基化C或未甲基化C的相对、绝对浓度或模式。例如，如果使核酸序列内的胞嘧啶(C)残基甲基化，则其可称为“高甲基化”或具有“增加的甲基化”，而如果DNA序列内的胞嘧啶(C)残基未甲基化，则其可称为“低甲基化”或具有“降低的甲基化”。同样，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基与另一个核酸序列(例如，来自不同的区或来自不同的个体等)相比甲基化，则该序列被视为与另一个核酸序列相比高甲基化或具有增加的甲基化。或者，如果DNA序列内的胞嘧啶(C)残基与另一个核酸序列(例如，来自不同的区或来自不同的个体等)相比未甲基化，则该序列被视为与另一个核酸序列相比低甲基化或具有降低的甲基化。另外，如本文所用的术语“甲基化模式”是指在核酸的某个区上甲基化和未甲基化核苷酸的集体位点。两个核苷酸可具有相同的或相似的甲基化频率或甲基化百分比，但当甲基化和未甲基化核苷酸的数量在整个区中相同或相似但甲基化和未甲基化核苷酸的位置不同时具有不同的甲基化模式。当序列在甲基化的程度(例如，一个相对于另一个具有增加或降低的甲基化)、频率或模式不同时，将所述序列称为“差异甲基化的”或称为具有“甲基化差异”或具有“不同的甲基化状态”。术语“差异甲基化”是指在癌症阳性样品中的核酸甲基化水平或模式与在癌症阴性样品中的核酸甲基化水平或模式相比的差异。其还可以指在手术后癌症复发的患者与未复发的患者之间的水平或模式的差异。差异甲基化以及DNA甲基化的特定水平或模式是诊断和预测性生物标记物，例如，一旦定义正确的截止值或预测特性后。
如本发明所用，术语“差异甲基化区域”（Differentially Methylated Region,DMR）是指包含一个或多个差异甲基化位点的DNA区域。在选定的感兴趣的条件下，例如癌症状态，包括更多数量或频率的甲基化位点的DMR可以被称为高甲基化DMR。在选定的感兴趣的条件下，例如癌症状态，包括较少数量或频率的甲基化位点的DMR可以被称为低甲基化DMR。作为膀胱癌淋巴结转移甲基化生物标志物的DMR可称为膀胱癌淋巴结转移DMR。在一些情况下，DMR可以是单个核苷酸，该单个核苷酸是甲基化位点。
如本发明所用的术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，其指接收者操作特征（ROC）曲线下面积。ROC曲线是对于诊断测试的不同可能的块割点而言真阳性比率相对于假阳性比率的曲线图。其表明根据所选的切割点在灵敏性与特异性之间的折衷（灵敏性的任何增加将伴随特异性的下降）。ROC曲线下面积（AUC）是诊断测试的准确度的度量（面积越大越好；最佳为1；随机测试将具有面积为0.5的处于对角线上的ROC曲线；参见：J.P.Egan.(1975)Signal Detection Theory and ROC Analysis，Academic Press，NewYork）。
以下对于本发明的技术方案进行具体说明。
甲基化生物标记物:
本发明的一些方面，提供了一种用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标记物，其中，所述的甲基化生物标记物包括表2中提供的编号1~编号5的差异甲基化区域中的任一项或其任意组合。
在本发明的一些实施方案中，所述的甲基化生物标记物包括以下的差异甲基化区域中的任一项或其任意组合：chr12:49726834-49727076、chr12:9393053-9393068、chr15:101513454-101513815、chr5:140892863-140893102、chr7:1100306-1100309。
在一些实施方案中，一种差异甲基化区域与另一种差异甲基化区域的连续片段也可以组合使用，以构成上述描述的甲基化生物标记物的实施方案。
在本发明的一些实施方案中，所述膀胱癌淋巴结转移为来自受试者的膀胱癌淋巴结转移样本，所述的受试者是哺乳动物；优选地，所述的哺乳动物是人。
在本发明的一些实施方案中，待测样本中所述甲基化生物标记物的甲基化水平，与来自膀胱癌无淋巴结转移的样本中所述甲基化生物标记物的甲基化水平存在差异，则指示所述待测样本对应的受试者存在膀胱癌淋巴结转移。本领域技术人员已知用于检测样本中基因组DNA或游离DNA甲基化水平的方法，例如但不限于荧光定量PCR（qPCR）、甲基化特异性PCR（MSP）、数字PCR（ddPCR）、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）、DNA甲基化质谱（MassArray）中的一种或多种。
甲基化生物标记物的用途:
在本发明的一些方面中，提供了上述的甲基化生物标记物在制备用于诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂或试剂盒中的用途。
在本发明的另一些方面中，提供了确定上述的甲基化生物标记物的甲基化水平的试剂在制备用于诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂或试剂盒中的用途。
诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂盒:
在本发明的一些方面中，提供了用于诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中上述的甲基化生物标记物的甲基化水平的试剂。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述的试剂为选自以下的检测甲基化水平的方法中所使用的试剂：荧光定量PCR（qPCR）、甲基化特异性PCR（MSP）、数字PCR（ddPCR）、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序（Whole Genome BisulfiteSequencing, WGBS）、DNA甲基化质谱（MassArray）中的一种或多种。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述的待测样本选自组织、全血、血浆、唾液、血清、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。在本发明的一些优选实施方案中，所述的待测样本为组织、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的待测样本来自受试者，所述的受试者是哺乳动物。优选地，所述的哺乳动物是人。
诊断膀胱癌淋巴结转移系统:
本发明的一些方面提供了一种用于诊断膀胱癌淋巴结转移的系统，其中，所述系统包括检测装置、计算装置和输出装置；所述检测装置包括进样器和检测器，所述进样器用于采集来自受试者的样本，所述检测器用于检测所述样本中上述的甲基化生物标记物的甲基化水平；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：
所述样本中如上述的甲基化生物标记物的甲基化水平不同于来自膀胱癌无淋巴结转移的样本中测定的甲基化生物标记物的甲基化水平，则判别所述样本对应的受试者的存在膀胱癌淋巴结转移。
在一些具体的实施方案中，所述输出装置用于输出所述检测装置的检测结果和/或所述计算装置的判别结果，所述输出装置包括显示器、打印机和音频输出装置中的至少一种；所述计算装置包括电脑主机、中央处理器和网络服务器中的至少一种。
诊断膀胱癌淋巴结转移方法:
在本发明的一些方面，提供了一种膀胱癌淋巴结转移诊断方法，其包括以下步骤：
1. 获得受试者的样本；
2. 提取所述样本的基因组DNA和/或游离DNA；
3. 检测所述DNA中上述的甲基化生物标记物的甲基化水平；
4. 判别受试者是否存在膀胱癌淋巴结转移。
以下通过实施例与测试例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例与测试例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例与测试例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1全基因组范围内甲基化测序
对31例模型训练集和验证集膀胱癌组织样本（参见实施例3样本的信息）进行甲基化建库和全基因组甲基化测序，流程和步骤如下：
DNA提取及甲基化检测
1.1、DNA的提取
上述膀胱癌样本DNA的提取步骤按照QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit操作说明进行。
甲基化检测
采用Illumina TruSeq Methyl Capture EPIC Library Prep Kit按照说明书进行甲基化文库构建及甲基化靶向富集，具体检测流程如下：
1.1.1、DNA的片段化
取上述DNA 800ng，用打断Buffer（每5mL的RSB中添加10μL的0.5M EDTA配制而成）将体质补足至50μL，振荡混匀后转移至打断管；
离心后，置于Covaris打断仪中按照以下打断条件反应：
打断产物中加入80μL SPB，振荡混匀，室温孵育5min，磁力架静置，弃除上清，用500μL的80%乙醇清洗两次，弃除乙醇后磁珠室温干燥2-3min，加入60uL的RSB重悬，室温静置1min，将悬液转移至200μL PCR管中，进行下一步。
1.1.2、末端修复
向上步骤中的悬液中添加40μL的ERP3，移液器吹打混匀，短暂离心后置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
将反应后所有样本分别转移至新的1.5ml离心管中，每个样本分别加入120ulSPM，Vortex震荡混匀。室温孵育5min，短暂离心后置于磁力架静置5min，弃除上清，用500μL80%乙醇清洗两次，弃除乙醇后磁珠室温干燥2-3min，加入17.5uL的RSB重悬，室温静置1min，将悬液转移至200μL PCR管中，进行下一步。
1.1.3、3’末端腺苷化
向上步骤中的悬液中添加12.5μL的ATL2，移液器吹打混匀，短暂离心后置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.1.4、连接接头
将上步骤产物加入以下试剂中进行反应：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
反应结束后，加入5μL STL，混匀后加入43μL SPM，混匀，室温孵育5min。短暂离心后置于磁力架静置5min，弃除上清，用200μL 80%乙醇清洗两次，弃除乙醇后磁珠室温干燥2-3min，加入40uL的RSB依次重悬4个样本（4个不同index的样本），进行下一步。
1.1.5、杂交Ⅰ
将上步骤产物加入以下试剂中进行反应：
移液器吹打混匀，室温孵育5min，短暂离心后置于磁力架静置5min，弃除上清，用500μL 80%乙醇清洗两次，弃除乙醇后磁珠室温干燥2-3min，加入7.7μL 的CT4，重悬后静置2min，吸取7.5μL的上清加入装有2.5μL EHB2的PCR管中，离心后将产物置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.1.6、洗脱Ⅰ
10μL的杂交Ⅰ产物与250μL的SMB混合，室温孵育25min，短暂离心后置于磁力架上静置2min，弃除上清。
取200μL的EWS加入上一步离心管中，重悬，50℃孵育20min，短暂离心后置于磁力架上静置2min，弃除上清。重复一次EWS洗涤过程。
配制反应液，加入以下试剂：
上述混合液取30μL加入磁珠中，重悬后，室温孵育5min。短暂离心，置于磁力架上2min，吸取29μL上清液加入有5μL ET2的PCR管中，混匀，进行下一步。
1.1.7、杂交Ⅱ
将上步骤产物加入以下试剂中进行反应：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
；
1.1.8、洗脱Ⅱ
100μL的杂交Ⅱ产物与250μL的SMB混合，室温孵育25min，短暂离心后置于磁力架上静置2min，弃除上清。
取200μL的EWS加入上一步离心管中，重悬，50℃孵育30min，短暂离心后置于磁力架上静置2min，弃除上清。重复一次EWS洗涤过程。
配制反应液，加入以下试剂：
上述混合液取18μL加入磁珠中，重悬后，室温孵育5min。短暂离心，置于磁力架上2min，吸取17.1μL上清液加入有2.9μL ET2的PCR管中，混匀，进行下一步。
1.1.9、转化
向洗脱Ⅱ产物中加入130ul Lighting Conversion Reagent，混匀后置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
将上述反应后产物加入含有600μL M-Binding Buffer和10uL MagBinding Beads的1.5mL离心管中，混合后室温孵育5min。短暂离心，置于磁力架上2min，弃除上清。
加入400ul M-Wash Buffer洗涤磁珠。
磁珠中加入200ul L-Desulphonation Buffer，Vortex进行混匀，室温孵育15min，短暂离心后弃除上清。M-Wash Buffer洗涤磁珠两次。
开盖于50℃进行干燥4min。加入23μL RSB，吹打混匀，于50℃孵育4min。放置于磁力架上2min，直至液体变澄清，吸取20ul上清于200ul PCR管中。
1.1.10、文库富集
将上述转化后的20ul样本加入以下试剂进行反应：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.1.11、文库纯化
加入50μL SPB至上述产物中，振荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，置于磁力架静置5min。
弃除上清，用200μL 80%乙醇洗涤两次。
室温干燥2-3min，加入40μLRSB，重悬，室温静置5min，短暂离心后置于磁力架5min，吸取上清39μL于新的PCR管中。
1.2、采用Illumina公司的测序仪对杂交捕获后的样本进行测序，得到测序结果。
1.3、下机数据的分析
对测序获得的raw fastq原始文件使用fastp 0.19.6软件分析每批次数据测序质量，先过滤低质量(QC低，长度短、太多N等)的读长（reads），如批次数据 Q30 碱基占比高于75%则质控通过，并对测序读段去除建库过程中引入的接头序列和低质量的碱基片段，得到clean fastq文件。使用序列比对软件 bismark v0.22.1将这些clean reads比对到人类基因组（hg19）获得比对bam文件，统计亚硫酸盐处理的转化效率≥97%则质控通过。根据UMI对reads进行去重，得到去重后的比对bam文件后从bam文件中提取靶向目标区段内CpG位点的甲基化reads和未甲基化reads数量，计算甲基化reads/（甲基化reads+未甲基化reads）得到位点甲基化beta值。然后将靶向区域内的CpG位点的beta值取平均作为该样本甲基化标记物的甲基化水平，用于后续分析。
实施例2进行靶向甲基化测序
对新收集的16例模型独立验证集膀胱癌组织样本（参见实施例4样本的信息）进行甲基化建库和靶向甲基化测序，流程和步骤如下：
DNA提取及甲基化建库
2.1、DNA的提取
上述膀胱癌样本DNA的提取步骤按照QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit操作说明进行；
2.1.1、转化
将提取的DNA(50ng，对于不够input DNA量的样本，则混合另一样本DNA建库测量)进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo Research的EZ DNAMethylation-Lightning Kit说明书进行。
2.1.2、末端修复
将上述转化后的17ul样本加入以下试剂进行反应：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
当PCR反应第二步（95℃）达到5min时，立即将样本从PCR仪中取出，直接插入冰中，放置2min以上再进行下一步操作。
2.1.3、连接I
配制如下反应液：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
2.1.4、扩增I
配制如下反应液
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
2.1.5、纯化I
加入166ul 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads（需提前于室温平衡半小时）的对扩增I反应后的产物进行纯化，用21μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入166μl 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl 80% EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇，开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入21μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。
2.1.6、连接Ⅱ
配制如下反应液：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
2.1.7、Indexing PCR（扩增产物文库构建）
配制如下反应液：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
2.1.8、纯化Ⅱ
加入Agencourt AM Pure Beads（需提前于室温平衡半小时）对Indexing PCR反应后的产物进行纯化，用41μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入71μl未稀释的Agencourt AM PureBeads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl 80% EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复步骤一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇。开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入41μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。Qubit定量：取1μl用Qubit dsDNA HS Assay Kit对文库进行定量。
2.1.9、通过对已建库后的样本进行寡核苷酸（包含实施例3，表1所述5个甲基化标记物序列）捕获富集，得到特定区域的上机终文库。杂交捕获试剂盒为IDT公司的xGenLockdown Reagents，具体按照说明书进行操作。
2.2、采用Illumina公司的测序仪对杂交捕获后的样本进行测序，得到测序结果。
2.3、下机数据的分析
对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理，先通过fastp过滤低质量(QC低，长度短、太多N等)的读长（reads），然后去除reads双端的adapter、共有序列、PolyA/T，得到理想的插入片段序列(target区间)，使用bismark将这些reads比对hg19对应的位置后，根据UMI对reads进行去重，得到每份样本被寡核苷酸捕获得到的真实reads数据(bam file)，对bam文件进行统计和分析，得到甲基化数据，用于后续的数据再分析。
1.4、下机数据的分析
对测序获得的raw fastq原始文件使用fastp 0.19.6软件分析每批次数据测序质量，先过滤低质量(QC低，长度短、太多N等)的读长（reads），如批次数据 Q30 碱基占比高于75%则质控通过，并对测序读段去除建库过程中引入的接头序列和低质量的碱基片段，得到clean fastq文件。使用序列比对软件 bismark v0.22.1将这些clean reads比对到人类基因组（hg19）获得比对bam文件，统计亚硫酸盐处理的转化效率≥97%则质控通过。根据UMI对reads进行去重，得到去重后的比对bam文件后从bam文件中提取靶向目标区段内CpG位点的甲基化reads和未甲基化reads数量，计算甲基化reads/（甲基化reads+未甲基化reads）得到位点甲基化beta值。然后将靶向区域内的CpG位点的beta值取平均作为该样本甲基化标记物的甲基化水平，用于后续分析。
实施例3膀胱癌淋巴结转移甲基化标志物的、膀胱癌淋巴结转移模型的建立及验证
本实施例公开了一种用于检测膀胱癌淋巴结转移的甲基化特异性生物标记物。基于癌症公共数据库TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载的45例膀胱癌淋巴结转移样本和91例膀胱癌无淋巴结转移样本的甲基化数据，使用R软件的limma工具包进行两组别的甲基化谱差异检验分析，得到全基因组的差异甲基化位点DML（differentiallymethylated loci），并鉴定差异共甲基化区域，结合共甲基化情况和基因功能注释，找出5个甲基化标记物（以下简称marker）。
表1.5个甲基化标记物
共收集了31例经临床病理确诊为膀胱癌淋巴结转移患者或膀胱癌无淋巴结转移患者的组织样本（16例淋巴结转移和15例无淋巴结转移），其中训练集样本19例（10例淋巴结转移和9例无淋巴结转移），验证集样本12例（6例淋巴结转移和6例无淋巴结转移）。其临床信息统计详见表2。检测方法参考实施例1。
表2. 31例膀胱癌组织样本临床信息表。
5个甲基化标记物在膀胱癌组织样本中的甲基化信号热图见图1。甲基化标志物区分是否发生淋巴结转移的AUC值见表2。独立区分膀胱癌淋巴结转移的ROC曲线见图2。
表3. 5个甲基化标记物的区分性能。
使用上述甲基化标记物在训练集上建立逻辑回归模型并在验证集中验证性能。从5个甲基化标记物中任意2个、任意3个、任意4个、全部5个构建共26个逻辑回归模型，并评估这些模型在训练集和验证集中对膀胱癌淋巴结转移的检测能力。任意组合构建的模型，在训练集中AUC为0.89-1，准确度0.74-1，验证集中AUC为0.7-1，准确度0.67-0.83，其性能结果显示均有良好的膀胱癌淋巴结转移检测能力。大部分甲基化标志物组合构建的模型AUC和准确度在验证集中得到了验证，证明了模型良好的泛化能力。这一性能基本均优于已有文献报道的3个基因KISS1R，SEPT9和CSAD构建的甲基化panel在预测膀胱癌发生淋巴结转移的性能AUC为0.72。详细性能见表4。
表4. 不同marker数量和组合的模型性能。
/>
/>
；
本发明中的模型均选用训练集ROC曲线中使约登指数（Youden Index）最大时的阈值作为模型判断样本是否发生淋巴结转移的阈值，高于该阈值则判断为膀胱癌有淋巴结转移，低于该阈值则判断为膀胱癌无淋巴结转移。
实施例4膀胱癌淋巴结转移模型的独立验证
共收集了16例经临床病理确诊为膀胱癌淋巴结转移患者或无淋巴结转移患者的组织样本作为独立验证集，检测方法参考实施例2。包含8例淋巴结转移和8例无淋巴结转移，其临床信息统计详见表5。5个marker在上述样本中的甲基化信号热图见图3。
表5. 16例膀胱癌组织样本临床信息表。
使用实施例3中的模型对上述样本进行性能验证，其性能见表5。独立验证集中AUC为0.75-1，准确度0.69-1，性能结果显示模型在独立验证集中具有接近训练集和验证集的性能，再次验证了模型的稳定泛化能力，说明模型对膀胱癌淋巴结转移有稳定的检测能力。
表5. 26个不同组合模型对16例膀胱癌样本的区分性能。
/>
；
准确度：灵敏度和特异性的综合，即膀胱癌有淋巴结转移和无淋巴结转移模型判对的样本数除以所有样本数。
综上可见，利用该方法筛选出来的甲基化标记物与膀胱癌淋淋巴结转移的诊断有非常高的相关性，且性能均优于已有文献报道的3个基因KISS1R，SEPT9和CSAD构建的甲基化panel在预测膀胱癌发生淋巴结转移的性能AUC为0.72。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或其组合，其中，所述的甲基化生物标志物选自以下中的至少一种：chr12:49726834-49727076、chr12:9393053-9393068、chr15:101513454-101513815、chr5:140892863-140893102、和chr7:1100306-1100309，所述甲基化位点比对到hg19对应的位置。
2.根据权利要求1所述的用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或其组合，其中，所述的甲基化生物标志物的组合为：chr12:49726834-49727076和选自以下中的至少一种chr12:9393053-9393068、chr15:101513454-101513815、chr5:140892863-140893102、和chr7:1100306-1100309；或
所述的甲基化生物标志物的组合为：chr12:9393053-9393068和选自以下中的至少一种：chr12:49726834-49727076、chr15:101513454-101513815、chr5:140892863-140893102、和chr7:1100306-1100309；或
所述的甲基化生物标志物的组合为：chr15:101513454-101513815和选自以下中的至少一种：chr12:49726834-49727076、chr12:9393053-9393068、chr5:140892863-140893102、和chr7:1100306-1100309。
3.根据权利要求2所述的用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或其组合，其中，所述的甲基化生物标志物的组合为以下中的至少一种：
1）chr12:49726834-49727076，和chr12:9393053-9393068；
2）chr12:49726834-49727076，和chr15:101513454-101513815；
3）chr12:49726834-49727076，和chr5:140892863-140893102；
4）chr12:49726834-49727076，和chr7:1100306-1100309；
5）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068，和chr5:140892863-140893102；
6）chr12:49726834-49727076，chr15:101513454-101513815，和chr5:140892863-140893102；
7）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，和chr5:140892863-140893102；
8）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，和chr7:1100306-1100309；
9）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309；
10）chr12:49726834-49727076，chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309。
4.根据权利要求2所述的用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或其组合，其中，所述的甲基化生物标志物的组合为以下中至少一种：
1）chr12:9393053-9393068，和chr15:101513454-101513815；
2）chr12:9393053-9393068，和chr5:140892863-140893102；
3）chr12:9393053-9393068，和chr7:1100306-1100309；
4）chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，和chr5:140892863-140893102；
5）chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，和chr7:1100306-1100309；
6）chr12:9393053-9393068，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309；
7）chr12:9393053-9393068，chr15:101513454-101513815，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309。
5.根据权利要求2所述的用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或其组合，其中，所述的甲基化生物标志物的组合为以下中至少一种：
1）chr15:101513454-101513815，和chr5:140892863-140893102；
2）chr15:101513454-101513815，和chr7:1100306-1100309；
3）chr15:101513454-101513815，chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309。
6.根据权利要求1所述的用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或其组合，其中，所述的甲基化生物标志物组合是chr5:140892863-140893102，和chr7:1100306-1100309。
7.权利要求1-6任一项甲基化生物标记物或其组合在制备诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂或试剂盒中的应用；或
权利要求1-6任一项甲基化生物标记物或其组合的检测试剂在制备诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂盒中的应用。
8.一种用于诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂盒，其中，所述试剂盒包含用于检测待测样本中权利要求1-6任一项所述的甲基化生物标志物或其组合的甲基化水平的试剂。
9.根据权利要求8所述的用于诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂盒，其中，所述试剂为选自以下的检测甲基化水平的方法中的一种或多种中所使用的试剂：荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱。
10.根据权利要求8或9所述的用于诊断膀胱癌淋巴结转移的试剂盒，其中，
所述待测样本选自组织、全血、血浆、唾液、血清、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410449233.3A CN118147309A (zh) | 2024-04-15 | 2024-04-15 | 用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或组合及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410449233.3A CN118147309A (zh) | 2024-04-15 | 2024-04-15 | 用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或组合及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118147309A true CN118147309A (zh) | 2024-06-07 |
Family
ID=91285437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410449233.3A Pending CN118147309A (zh) | 2024-04-15 | 2024-04-15 | 用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或组合及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118147309A (zh) |
-
2024
- 2024-04-15 CN CN202410449233.3A patent/CN118147309A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2021128519A1 (zh) | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 | |
| JP2020505925A (ja) | マイクロサテライト座の安定性およびゲノム変化を同時に検出する次世代シークエンシングに基づく方法 | |
| CN112322736B (zh) | 一种用于检测肝癌的试剂组合，试剂盒及其用途 | |
| CN112375822B (zh) | 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用 | |
| CN112501293B (zh) | 一种用于检测肝癌的试剂组合，试剂盒及其用途 | |
| EP3658684B1 (en) | Enhancement of cancer screening using cell-free viral nucleic acids | |
| CN112280865B (zh) | 一种用于检测肝癌的试剂组合，试剂盒及其用途 | |
| CN113278693A (zh) | 早期结直肠癌和腺瘤的dna甲基化标志物、检测其的方法及其应用 | |
| CN114317736B (zh) | 用于泛癌种检测的甲基化标志物组合及其应用 | |
| WO2021180105A1 (zh) | 一种检测常见两性癌症的探针组合物 | |
| WO2021185274A1 (zh) | 一种检测6种中国高发癌症的探针组合物 | |
| CN115786459B (zh) | 一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法 | |
| CN112899359A (zh) | 用于肺结节良恶性检测的甲基化标记物或其组合及应用 | |
| CN107630093B (zh) | 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 | |
| CN115341031A (zh) | 一种泛癌甲基化生物标志物的筛选方法、生物标志物及应用 | |
| CN112259165B (zh) | 用于检测微卫星不稳定性状态的方法及系统 | |
| WO2023226939A1 (zh) | 用于检测结直肠癌淋巴结转移的甲基化生物标记物及其应用 | |
| CN118147309A (zh) | 用于诊断膀胱癌淋巴结转移的甲基化生物标志物或组合及其应用 | |
| WO2021185275A1 (zh) | 一种检测11种癌症的探针组合物 | |
| WO2021169874A1 (zh) | 一种检测3种管腔性器官肿瘤的探针组合物 | |
| CN116656830B (zh) | 用于胃癌辅助诊断的甲基化标志物、装置、设备和存储介质 | |
| CN117344014B (zh) | 一种胰腺癌早期诊断试剂盒、方法及其装置 | |
| WO2023078283A1 (zh) | 用于乳腺癌诊断的甲基化生物标记物及其应用 | |
| CN114150065B (zh) | 一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用 | |
| CN114657248B (zh) | 用于检测早期结直肠癌的血浆游离dna甲基化生物标记物或其组合物、应用及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |