CN116064812A - 一种肝癌基因甲基化水平检测试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝癌基因甲基化水平检测试剂及其应用,所述检测试剂包括能够特异性检测生物样本中SEQ ID NO:37和/或SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂。本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂以DNA甲基化异常作为检测对象,基于数字PCR技术,可在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增,获取荧光信号进行统计学分析,彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数,提高实验结果在批内和批间的稳定性,实现对起始样品的绝对定量,同时提高核酸检测方法的灵敏度,有效减少假阴性的出现,适用于临床检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种肝癌基因甲基化水平检测试剂及其应用。
背景技术
肝癌是高发且危害极大的恶性肿瘤。肝癌起病隐匿,早期患者一般没有症状或者症状不典型,当出现腹胀、呕吐、腹泻、乏力和消瘦、黄疸等非特异性临床表现时,经常已处于中晚期。随着现代医学的发展,肝癌治疗方法包括手术切除、局部消融、肝内局部区域治疗、肝移植等,在各方面都取得了进展,但肝切除始终被认为是最好的治疗方法,其5年复发率约为70%,但仅约10%-30%的早期肝癌患者符合肝切除的手术条件。因此建立灵敏度高,特异性强的肝癌早期预警和筛查的方法,使肝癌患者及早进行肝切除手术是实现防控肝癌的重要手段。
现阶段肝癌的检查诊断方法主要分为两大类:(1)肝癌血清标志物检查。①血清甲胎蛋白(AFP)测定:是目前用于肝癌诊断和疗效检测常用且重要的检测方式,通过放射免疫法测定持续血清,在排除妊娠、慢性或活动性肝病等时,即高度提示肝癌。但该方法灵敏度和特异度不高,且大部分小肝癌患者血清中的AFP表达为阴性,无法与良性肝病相鉴别。②血液酶学及其他肿瘤标志物检查:通过检查患者血清中γ-谷氨酰转肽酶及其同功酶、异常凝血酶原、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶同功酶对肝癌进行诊断,但该方法缺乏特异性。(2)影像学检查:①常规检查:目前临床上肝癌患者诊断、治疗及随访一般依赖于MRI检查、B超检查和CT检查,准确性较高,但这些方法对较小的肿瘤不够灵敏,无法作为肝癌的早期筛查技术;②选择性腹腔动脉或肝动脉造影检查和肝穿刺行针吸细胞学检查:这两种方法的准确性较CT等检查高,但对患者创伤性很大,不易被患者所接受,一般用于对高度怀疑肝癌患者的进一步确诊。因此有必要开发灵敏、特异的新型肝癌标识物和检测技术,提高肝癌早癌检出率,使肝癌患者得到尽早干预和及早治疗,从而大大降低肝癌患者的死亡率。
DNA的甲基化是最常见的表观遗传学修饰方式,其可调控细胞增殖、凋亡与分化,且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。多项研究表明肿瘤的发生常伴随着DNA的异常甲基化,异常甲基化修饰通常先于明显的病症,在肿瘤形成的早期阶段发挥着重要作用,是癌症早筛指标的“潜力股”,DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
近年来DNA甲基化检测成为研究热点,通过对特定位点的DNA甲基化进行检测,可明确具体的甲基化状态和甲基化水平的改变。常用的检测方法有:1)甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)对样本的要求较低、检测时长较短、结果易于判读,但仅能定性检测已知基因甲基化状态。2)荧光定量法(MethyLight):即MSP与荧光定量PCR技术相结合的检测方法,该方法虽实现了DNA甲基化水平定量测定,但需要构建标准曲线对样本甲基化水平进行半定量或绝对定量,在检测低浓度的核酸样本时灵敏度仍存不足,容易产生假阴性。3)甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法:可检测出单个甲基化的发生,分析样本的平均甲基化水平,具有高通量、灵敏度高、重复性好、不受检测位点局限等优势,但该方法只能考察DNA片段整体的甲基化程度,无法检测特定位点的DNA甲基化情况,且对仪器要求较高,需要带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪。4)亚硫酸氢盐测序法:是DNA甲基化检测的“金标准”。可明确DNA甲基化的确切位置和甲基化程度,准确性高,易于直观进行判读,但该方法检测单个甲基化位点需要挑取大量的克隆进行测序,操作繁琐,耗时长且检测成本高。5)焦磷酸测序技术:可对已知短序列进行实时测序分析,操作简便、可检测大量样本,且准确性极高。但该方法仅能用于较短DNA片段的分析。6)数字PCR(Digital PCR,dPCR):dPCR是继一代普通PCR(end point PCR)、二代荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)之后的第三代PCR技术。通过对稀释后样本核酸模板随机分配到大量规律排列的微小反应单元中进行扩增,在反应结束后依次对每个反应单元的阳性信号进行统计,实现对核酸分子的定量检测。与PCR和qPCR相比,数字PCR对样本需求量更少、可以实现对起始样品的绝对定量,具有更高的检测灵敏度和准确性,有效减少假阴性的出现。
因此,本发明通过筛选肝癌相关甲基化基因,建立基于数字PCR的肝癌基因甲基化检测方法,期望获取具有更高灵敏度、特异性和准确性的检测试剂,实现肝癌的早期筛查与诊断。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种肝癌基因甲基化水平检测试剂。
本发明还提出一种具有上述肝癌基因甲基化水平检测试剂的试剂盒。
本发明还提出一种肝癌基因甲基化水平检测试剂或试剂盒的应用。
根据本发明的一个方面,提出了一种肝癌基因甲基化水平检测的试剂,包括能够特异性检测生物样本中以下(a)-(e)中至少一种目标核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂:
(a)SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域;
(b)与SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域;
(c)SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域;
(d)与SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域;
(e)与(a)、(b)、(c)或(d)至少80%以上同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中,与(a)、(b)、(c)或(d)至少80%以上同一性的核苷酸序列进一步可以是至少81%、85%、90%、95%、97%、98%、99%的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中,所述互补序列是与SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应互补所形成的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中,所述(a)或(b)中的任意部分区域为SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列或其互补序列中包括CpG二核苷酸位点的区域。
在本发明的一些实施方式中,所述部分区域的核苷酸序列长度为小于802bp。
在本发明的一些实施方式中,所述部分区域的核苷酸序列长度为小于700bp、600bp、500bp、200bp、180bp、150bp、120bp、100bp、70bp、50bp、40bp……。
在本发明的一些实施方式中,所述部分区域的核苷酸序列中具有至少1个、2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个、20个……CpG二核苷酸位点。
在本发明的一些实施方式中,所述(a)或(b)中的任意部分区域为如SEQ ID NO:39-41所示的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中,所述(c)或(d)中的部分区域为SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列或其互补序列中包括CpG二核苷酸位点的区域。
在本发明的一些实施方式中,所述部分区域的核苷酸序列长度为小于739bp。
在本发明的一些实施方式中,所述部分区域的核苷酸序列长度为小于600bp、500bp、400bp、200bp、180bp、150bp、120bp、100bp、70bp、50bp、40bp……。
在本发明的一些实施方式中,所述部分区域的核苷酸序列中具有至少1个、2个、3个、4个、5个、8个、10个、15个、20个……CpG二核苷酸位点。
在本发明的一些实施方式中,所述(c)或(d)中的部分区域为如SEQ ID NO:42-44所示的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂包括核酸分子。
在本发明的一些实施方式中,所述核酸分子包括可PCR扩增所述(a)-(e)中至少一种所示核苷酸序列的引物对。
在本发明的一些实施方式中,所述引物对选自以下组中的至少一组:
(1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核酸分子;
(2)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核酸分子;
(3)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示的核酸分子;
(4)SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示的核酸分子;
(5)SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26所示的核酸分子;
(6)SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中,(1)~(6)所述的核酸分子为甲基化引物。
在本发明的一些实施方式中,所述引物对选自以下组中的至少一组:
1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核酸分子;
2)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核酸分子;
3)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的核酸分子;
4)SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的核酸分子;
5)SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示的核酸分子;
6)SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示的核酸分子。
在本发明的一些实施方式中,序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35所示的核酸分子为非甲基化引物。
在本发明的一些实施方式中,所述核酸分子包括可标记所述(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示核苷酸序列的探针。
在本发明的一些实施方式中,所述探针选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中,所述探针选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中,所述SEQ ID NO:3所示的探针序列为与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核酸分子相匹配的荧光序列;所述SEQ ID NO:6所示的探针序列为与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的核酸分子相匹配的序列;所述SEQ ID NO:9所示的探针序列为与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核酸分子相匹配的序列;所述SEQ ID NO:12所示的探针序列为与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11所示的核酸分子相匹配的荧光序列;所述SEQID NO:15所示的序列为与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示的核酸分子相匹配的荧光序列;所述SEQ ID NO:18所示的探针序列为与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示的核酸分子相匹配的荧光序列;所述SEQ ID NO:21所示的探针序列为与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示的核酸分子相匹配的序列;所述SEQ ID NO:24所示的探针序列为与SEQ ID NO:22、SEQID NO:23所示的核酸分子相匹配的荧光序列;所述SEQ ID NO:27所示的序列为与SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26所示的核酸分子相匹配的荧光序列;所述SEQ ID NO:30所示的探针序列为与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29所示的核酸分子相匹配的荧光序列;所述SEQ ID NO:33所示的探针序列为与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的核酸分子相匹配的荧光序列。
在本发明的一些实施方式中,所述引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5,探针SEQ ID NO:3、SEQ ID NO.6均为针对区域SEQ ID NO:39设计的序列。
在本发明的一些实施方式中,所述引物对SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11,探针SEQ ID NO:9、SEQ ID NO.12均为针对区域SEQ ID NO:40设计的序列。
在本发明的一些实施方式中,所述引物对SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17,探针SEQ ID NO:15、SEQ ID NO.18均为针对区域SEQ ID NO:41设计的序列。
在本发明的一些实施方式中,所述引物对SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:23,探针SEQ ID NO:21、SEQ ID NO.24均为针对区域SEQ ID NO:42设计的序列。
在本发明的一些实施方式中,所述引物对SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29,探针SEQ ID NO:27、SEQ ID NO.30均为针对区域SEQ ID NO:43设计的序列。
在本发明的一些实施方式中,所述引物对SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:35,探针SEQ ID NO:33、SEQ ID NO.36均为针对区域SEQ ID NO:44设计的序列。
在本发明的一些实施方式中,所述探针的5’端包含有5’基团,包括FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中,所述探针的3’端包含有3’基团,包括MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB-NFQ中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。
在本发明的一些实施方式中,这些试剂可以将未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶,而已经甲基化的胞嘧啶则保持不变。
在本发明的一些实施方式中,所述反应试剂为亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐或肼盐、酶或其他。在本发明的一些实施方式中,所述生物样本选自肝癌组织、血液、血清或血浆。
在本发明的第二方面,提出了一种试剂盒,所述试剂盒包括上述试剂。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
在本发明的一些实施方式中,所述阳性对照为人肝癌细胞株。
在本发明的一些实施方式中,所述阴性对照为正常人外周血血液样本。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒还包括微滴发生油和缓冲液。
在本发明的一些实施方式中,所述缓冲液为数字PCR反应预混液。
在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒还包括无核酸酶的水。
在本发明的第三方面提出了上述试剂或试剂盒的应用,所述应用为在制备肝癌检测中的应用。
在本发明的一些实施方式中,所述肝癌检测产品的检测包括如下步骤:
S1、将待测样品中目标基因的核酸中未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶,获得经修饰的待测样品;
S2、利用上述试剂或试剂盒对步骤S1经修饰的待测样品进行甲基化情况检测。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S2中的检测采用微滴数字PCR进行。
在本发明的一些实施方式中,所述肝癌基因甲基化情况检测的判断标准为:检测样本的总微滴数大于10,000判断该次反应有效;受检样本甲基化拷贝数和非甲基化拷贝数之和≥100,则该样本检测结果有效;如果小于100,则该样本检测无效,需要重新检测。
在本发明的一些实施方式中,所述样本的甲基化比例由下列公式计算:甲基化比例=甲基化拷贝数/[(甲基化拷贝数+非甲基化拷贝数)]×100%,目的基因甲基化比例≥2%,判读结果阳性;目的基因甲基化比例<2%,判读为结果阴性。
在本发明的一些实施方式中,所述微滴数字PCR的扩增反应体系为:
在本发明的一些实施方式中,所述微滴数字PCR的扩增程序为:
92-97℃ 8-12min
92-97℃ 25-35s 40-50cycles
56-62℃ 0.5-1.5min 40-50cycles
95-99℃ 8-12min。
在本发明的一些实施方式中,所述肝癌基因为EVX1基因和EID3基因。本发明方案的EVX1基因和EID3基因均可以用于作为肝癌的早期检测的生物标志物。
根据本发明的实施方式,至少具有以下有益效果:本发明提供的肝癌基因甲基化检测试剂以DNA甲基化异常作为检测对象,基于数字PCR技术进行检测,可在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增,获取荧光信号进行统计学分析,彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数,提高实验结果在批内和批间的稳定性,实现对起始样品的绝对定量,同时提高核酸检测方法的灵敏度,有效减少假阴性的出现,可以准确的检测肝癌,适用于临床检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明,其中:
图1为本发明实施提供的肝癌基因甲基化数字PCR检测的典型检测结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
实施例1一种肝癌基因甲基化水平检测试剂
通过对癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)(http://cancergenome.nih.gov/)获取与肝癌相关的甲基化芯片数据及其对应的转录组测序数据,筛选具有显著差异的甲基化位点,最终筛选出EVX1、EID3作为肝癌的甲基化差异候选基因。根据上述EVX1、EID3基因及其启动子区的核酸序列进行甲基化引物和探针的设计,发明人经过反复设计和比较,确定EVX1的基因甲基化检测区域所在基因组位置为Chr 7:27242000-27242801(GRCh38.p14),EID3的基因甲基化检测区域所在基因组位置为Chr12:104303000-104303738(GRCh38.p14)。
EVX1的基因甲基化检测区域Chr 7:27242000 -27242801(GRCh38.p14)的原始序列如下(5’-3’):
CTTAAGGCCATCTAGATGGGAAGGAGGTATTTAAAAGAAATCAGCACACACTCTTACAGAAGCCAAGGCGGGTCTTTAAATTAAAAAATAATAATAAGGTATTTATTTCTTGCCCCTTAGGGAAGAAAAATAGCAAAGTTTGGTTCGCAGGAGTAAGGAGACAGAGGTGGGTAGGGAGAGGGAGGAGAAAAGAGGAAAAGATGGCCCAGCCTCAAGCTCTCCAGTCAACTTGGGGCGGGGGAATACATTTTTCCGTAGCTTGTAAAAAGACTTTTCAGCCAGTTTGAGGTTAGCTGCCAGGGGCAGACAGTTGTAATAATGCCGACAGAATTGAGGCTTGTAAGCCGGGCTTCACACTTCTAAAATGCAGTTATGGATTCTTTCATCGGTGTTAGATCAAGGCACCAAGTTAAGAAAACAAAAGTCAAAACAACAATAAAAGAAAAAATCAAAAGCTTATTTAATTACCGAGTCCCGCTGCCCCTGCGGAACTCGCCGCGCGCGTTAAGCTCTCTTTTCTTTCTGCGGAATTCCATTTGCATCCCCTCTGCCTGGGTGTCTCCCTCTCTCAGTGTGTGTGTCTCTCTGTCTGTTTTCACACTCTCCTCCCCAATCGAGCGAGGCCCACACCTGGCGCATCACTGCCGAGCCATTAGCTGCGGGTTTCCTTTCATCTTCGCTGTGGCAGACGTTTCTATTTATCCACTTGCGCTCGCCGAGTGGCGTCACCAGCGGTACTGTAATGACGATTGCAGCAGGAGGATGACAGCTTAGAAAGAAGAGGGCAATGGGGCTTCCTCCC(SEQ ID NO:37)。
EID3的基因甲基化检测区域Chr12:104303000-104303738(GRCh38.p14)的原始序列如下:
GTTACTACCCATTCAGTGTCGGTGGCCTTTAGCTGTTGGCAAGCTTCCAAGTAAATAGCTCTTTTGCAGAGATCTCTACCCATTCTATTCTTCCACTCCTGGGTAGTGGAGAACCAAAGTTCACCTGAGTAATGCCCGTGCCCAGCACCCAGTTTCCTGCAGGGGTTAGCACGGATATTGGAGGCTCCCCCGATCCCACAGATACTCAGGATGGGTATTGGAGGGGGCTTGGTTTTTAAGAGGACATGTGAAAGTAATTAACCCGATTTACATTTGTATAATGAGTCCAAACACCACCTTGCAAAAGAACTGAGAGTTTAGCCTGCTTAATGGAGTTTCTGCTTTTCACGGTCCTTGGCCTTACCGACGGTTTACAGTCCAGCCAGATTTAGTTCACAAAAAACCAAAACCAGGTCGACCTCACTGCAGTATATGATGGCAGCGAGCGTTTTAAAGCGCAGGACCTTTAGTCTCCTCAATAGTTTTGTGTAAAGTTGTCCAAAAGTGTTTTTTTTTAAAGTGAGGTGATCCAGTCGGTAAACGCTTTGAAAAAGAATAGCTGTCCCCTGAGCGGGCATTAGTCGCGTGTGAGGTCAGGGCCCATCATTGCGCGTGTTGGGAGCGCCGCGCTGGTCTATGAGCGAGCGCCTCGGCTTGTGGCTGGGCCGGGCCGGGGCGGGGCTGTCTTCCCGCGGAGCGTGCTGGGGGCGGGTCGCGCCGGGCCGGGCCGCTAGTGCGC(SEQ ID NO:38)。
1、检测区域的选择
由于同一个基因的甲基化状态和分布并不均匀,因此对于同一个基因来说,选择不同的区域设计的甲基化引物、探针检测体系对同一样本,同一肿瘤的诊断检测效能并不一样,甚至有时候选择的区域不合适造成对肿瘤完全没有诊断效果,发明人经过反复的研究和比较后,筛选得到EVX1的基因甲基化检测区域Chr 7:27242000 -27242801和EID3的基因甲基化检测区域Chr12:104303000-104303738,再从EVX1的基因甲基化检测区域筛选得到检测EVX1基因甲基化最好的3个靶区域序列(区域1-3),从EID3的基因甲基化检测区域筛选得到检测EID3基因甲基化最好的3个靶区域序列(区域4-6),具体原始序列如表1所示:
表1
2、引物探针序列的设计与选择
针对上述两个基因区域经重亚硫酸盐处理后的序列作为模板,分析不同检测区域的扩增产物长度、退火温度、特异性等一系列参数,设计筛选得到针对区域1的EVX1基因引物探针组合1,设计筛选得到针对区域2的EVX1基因引物探针组合2,设计筛选得到针对区域3的EVX1基因引物探针组合3,设计筛选得到针对区域4的EID3基因引物探针组合1,设计筛选得到针对区域5的EID3基因引物探针组合2,设计筛选得到针对区域6的EID3基因引物探针组合3,序列如表2所示。所设计的引物探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其中,“M”代表甲基化引物,“U”为非甲基化引物。
表2甲基化检测的引物、探针序列
其中,上述探针序列的两端标记有修饰基团,包括5’基团及3’基团,其中5’基团可以选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任一种,在本实施例中5’基团选用FAM。3’基团可以选自MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、MGB-NFQ中的任一种,在本实施例中选用BHQ-1。
针对表2中不同的引物探针组合,采用肝癌确诊患者以及健康人的外周血血液DNA样本进行重亚硫酸氢盐处理后作为模板进行筛选测试,采用针对表1中不同区域设计得到的引物探针组合分别进行扩增。
反应体系:2×数字PCR反应预混液(伯乐,货号:1863023)10μL,10μM上述引物探针组合中(甲基化引物或非甲基化)引物各0.5μL,10μM(甲基化探针或非甲基化)探针各0.2μL,4μLBis-DNA(重亚硫酸氢盐处理后外周血血液DNA样本),补水至20μL。
微滴制备:将上述每个20μL的反应体系中加入已含有70μL微滴发生油(伯乐,货号:1863005)的微滴发生卡上并置于微滴发生器上生成微滴,一般2分钟之内完成,将生成的微滴转移至96孔板中,之后用预热好的PX1热封仪对其进行封膜,封好膜后应该在30分钟之内进行PCR反应,其中,PCR反应条件如表3所示。
表3
退火温度依据各引物组合的TM值在56-62℃选择。
微滴读取及信号分析:将反应完成的PCR 96孔板放入微滴读取仪中进行结果分析,按照样本量及样本布局,建立样本模块信息,设置完成后运行。数据读取完成后,调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。
检测结果判读如下:检测样本的总微滴数大于10,000判断该次反应有效。受检样本甲基化拷贝数和非甲基化拷贝数之和≥100,则该样本检测结果有效,可以继续结果分析;如果小于100,则该样本检测无效,需要重新检测。样本的甲基化比例由下列公式计算:甲基化比例=[甲基化拷贝数/(甲基化拷贝数+非甲基化拷贝数)]×100%,经试验研究结果确定:目的基因甲基化比例≥2%,判读结果阳性;目的基因甲基化比例<2%,判读为结果阴性,肝癌基因甲基化数字PCR检测的典型检测结果图如图1所示。
表4
表5
结果如表4和表5所示,从表4中可以看出,无论EVX1基因引物探针组合1、2、3检测同一正常人外周血血液样本时,EVX1基因甲基化比例均<2%,检测结果均为阴性,而在检测同一肝癌病患的外周血血液时,引物探针组合3检测得到甲基化拷贝数明显少于引物探针组合1、2,其检测得到的EVX1基因甲基化比例仅为18.75%,明显低于引物探针组合1(25.35%)、引物探针组合2(24.60%),因此将选用EVX1基因引物探针组合1、2进行进一步后续试验。从表5可以看出,EID3基因引物探针组合1、2、3在检测同一正常人外周血血液样本时,EID3基因甲基化比例均<2%,检测结果均为阴性,而在检测同一肝癌病患的外周血血液时,引物探针组合1检测得到甲基化拷贝数明显少于引物探针组合2、3,其检测得到的EID3基因甲基化比例仅为18.07%,明显低于引物探针组合2(26.14%)、引物探针组合3(25.20%),因此将选用引物探针组合2、3进行进一步后续试验。
实施例2一种肝癌检测试剂盒
本实施例制备了一种用于肝癌相关基因甲基化检测的微滴数字PCR试剂盒,包括实施例1筛选得到的EVX1基因引物探针组合1和/或EVX1基因引物探针组合2、EID3基因引物探针组合2和/或EID3基因引物探针组合3、内参基因GAPDH引物探针组合、2×数字PCR反应预混液(伯乐,货号:1863023)、无酶无菌水、阳性对照(人肝癌细胞株)和阴性对照(正常人外周血血液样本)。
实施例3肝癌的临床检测
本实施例检测了实施例2中制备得到的试剂盒对肝癌的检出率,将试剂盒根据引物分为EVX1单基因组(EVX1-1、EVX1-2)、EID3单基因组(EID3-2、EID3-3)与EVX1基因和EID3单基因混合检测组(EVX1-1和EID3-2组、EVX1-1和EID3-3组、EVX1-2和EID3-2组、EVX1-2和EID3-3组)。
1、生物样本的获取
本发明中所有样本均为外周血血液标本,其中肝癌患者标本60例,正常样本40例。
2、样本前处理
(a)将离心机预冷至4℃。
(b)取一用EDTA抗凝管采集的外周血样本(6-8mL,晨起空腹采集,未发生溶血),静置5min。
注:采集受试者外周血样本后应及时将样本放到4℃冰箱冷藏,禁止放入-20℃冰箱,避免样本解冻后发生溶血。
(c)设置水平离心机参数为1600rpm,4℃,将含血液样本的EDTA抗凝管放置在离心机上离心15min。
(d)用移液器小心吸取EDTA抗凝管样本的上清液分装到1.5mL离心管中。为避免吸到中层白细胞,EDTA抗凝管内剩余血浆上清约1mL时应停止吸取。
(e)调整水平离心机参数设定为10000rpm,4℃,将分装的1.5mL离心管置于离心机中离心15min。
(f)离心后,用移液器小心吸取离心管的上层血浆,重新分装到新的1.5mL离心管中备用。吸取过程中应避免吸到上面的脂肪层及管底的蛋白质层。
(g)将获得的血清样本置于-80℃冰箱保存。
3、DNA样本提取(在样本处理区开展)
通过实用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(通用型)提取样本血浆中的DNA,试验开始前应提前按照试剂瓶上的标签在漂洗液1(Buffer PD)和漂洗液2(Buffer PW)中加入无水乙醇,并置于4℃冰箱保存。具体步骤如下:
(a)取10mL离心管,依次加入1500μL待检样本和150μL的胰脂肪酶(Buffer LP),漩涡震荡,充分混匀后室温放置5min。
(b)向离心管中加入150μL的蛋白酶(Proteinase K)和2700μL的裂解液(BufferA),漩涡震荡,充分混匀,短暂离心,70℃水浴15min。
(c)短暂离心,向离心管中加入1500μL预冷的异丙醇(自备),漩涡震荡,充分混匀(可能会出现絮状沉淀,属正常现象),短暂离心以去除管盖内壁的液滴,-20℃下静置5min。
(d)将上述步骤c的溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),13,000rpm离心1min,倒掉废液,收集管重复利用。
(e)向吸附柱中加入600μL配置好的漂洗液1(Buffer PD)(4℃预冷),13,000rpm离心1min,弃废液。
(f)向吸附柱中加入600μL配置好的漂洗液2(Buffer PW)(4℃预冷),13,000rpm离心1min,弃废液。
(g)将吸附柱放入一支洁净的1.5mL离心管(自备)中,13,000rpm离心3min,弃离心管及废液。
(h)将吸附柱放入一支洁净的1.5mL离心管中,打开管盖,晾干3min。
(i)向吸附柱中间位置悬空滴加55μL洗脱液(Elution Buffer),室温放置3min,13,000rpm离心1min 30sec,收集DNA到离心管中。
(j)将第一次洗脱的洗脱液重新加到吸附柱中,进行二次洗脱,收集到的DNA保存到-20℃冰箱。
4、亚硫酸氢盐转化
通过使用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(离心柱型)(货号:ME100)对步骤所得基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化,具体步骤如下:
(a)取45μL待测DNA样本(若提取的DNA样本浓度高于45ng/μL,用TE缓冲液稀释至45ng/μL,适当进行稀释,使DNA总投入量为2μg;低于45ng/μL样本则取45μL参与转化)于新的1.5mL离心管中并加入5μL转化缓冲液,置于金属浴37℃恒温孵育15min;
(b)孵育完成后,向每个样本中加入100μL预先制备的转化液,混匀并短暂离心,金属浴50℃避光孵育12-16h;
(c)样本置于冰上(0-4℃)孵育10min;
(d)将吸附柱置于收集管中,向吸附柱中加入400μL结合液;
(e)将步骤c中的样本加入吸附柱中(含有结合液),盖紧管盖上下颠倒混匀数次,全速(14000rpm)离心30s,弃废液;
(f)向吸附柱中加入100μL漂洗液,全速离心30s,弃废液;
(g)向吸附柱中加入200μL脱磺液,室温(20℃-30℃)孵育20min,之后全速离心30s,弃废液;
(h)向吸附柱中加入200μL漂洗液,全速离心30s,重复加入200μL漂洗液,全速离心30s,弃废液及收集管;
(i)将吸附柱放入1.5mL无菌离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加30μL洗脱液,洗脱转化DNA,全速离心1min,收集Bis-DNA,-20℃保存。
3、PCR扩增进一步筛选引物探针组合:
反应体系:2×数字PCR反应预混液10μL,10μM的GAPDH引物及探针各0.1μL,10μM上述引物探针组合中引物各0.5μL,探针各0.2μL,4μL Bis-DNA,补水至20μL。
微滴制备:将上述每个20μL的反应体系中加入已含有70μL微滴发生油的微滴发生卡上并置于微滴发生器上生成微滴,一般2分钟之内完成,将生成的微滴转移至96孔板中,之后用预热好的PX1热封仪对其进行封膜,封好膜后应该在30分钟之内进行PCR反应,反应条件同实施例1一致。
微滴读取及信号分析:将反应完成的PCR 96孔板放入微滴读取仪中,打开QuantaSoftTM软件,按照样本量及样本布局,建立样本模块信息,设置完成后运行。数据读取完成后,自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。样本调整划分阈值,甲基化数据收集和分析显示在QuantaSoftTM软件界面中。
检测结果判读如下:检测样本的总微滴数大于10,000判断该次反应有效。受检样本甲基化拷贝数和非甲基化拷贝数之和≥100,则该样本检测结果有效,可以继续结果分析;如果小于100,则该样本检测无效,需要重新检测。样本的甲基化比例由下列公式计算:甲基化比例=[甲基化拷贝数/(甲基化拷贝数+非甲基化拷贝数)]×100%,经试验研究结果确定:目的基因甲基化比例≥2%,判读结果阳性;目的基因甲基化比例<2%,判读为结果阴性,肝癌基因甲基化数字PCR检测的典型检测结果图如图1所示。
(1)单基因单重核酸检测结果
表6单基因单重核酸检测结果
单基因单重核酸检测结果如表6所示,从表中可以看出,EVX1基因引物探针组合1检测EVX1基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出56例,EVX1基因引物探针组合2检测EVX1基因甲基化在40例正常人样本中检出3例,在60例肝癌中检出54例;EID3基因引物探针组合2检测EID3基因甲基化在40例正常人样本中检出2例,在60例肝癌中检出55例,EID3基因引物探针组合3检测EID3基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出57例,即EVX1基因引物探针组合1、2和EID3基因引物探针组合2、3的检测灵敏度在90%-95%之间,检测特异性在92.5%-97.5%,具备良好的检测灵敏度与特异性,结果说明本发明所选甲基化标志物EVX1基因和EID3均可为临床肝癌进行辅助诊断。
(2)双基因两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果,当两个引物探针组合任一检测结果为阳性判断检测结果阳性。
表7
双基因两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果如表7所示,从表中可以看出,EVX1-1和EID3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出2例,在60例肝癌中检出57例,EVX1-1和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出2例,在60例肝癌中检出57例;EVX1-2和EID3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出3例,在60例肝癌中检出56例,EVX1-2和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出4例,在60例肝癌中检出58例,即此条件下,本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在93%-97%之间,检测特异性在90%-95%,检测灵敏度高于单一引物探针组合单重核酸检测,但检测特异性有所下降。
(3)以双基因中两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果,当两个引物探针组合检测结果均为阳性判断检测结果阳性
表8
结果如表8所示,从表中可以看出,EVX1-1和EID3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出0例,在60例肝癌中检出54例,EVX1-1和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出56例;EVX1-2和EID3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出2例,在60例肝癌中检出53例,EVX1-2和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出54例,说明此条件下,本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在88%-94%之间,检测特异性在95%-100%,检测灵敏度略低于单一引物探针组合单重核酸检测,但检测特异性得到了提升。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在提高特异性的同时可能会导致灵敏度的下降。
(4)单基因两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果,当两个引物探针组合任一检测结果为阳性判断检测结果阳性
表9
结果如表9所示,从表9中可以看出,EVX1-1和EVX1-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出3例,在60例肝癌中检出58例,EID3-2和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出3例,在60例肝癌中检出59例,即在此条件下,本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在96%-99%之间,检测特异性在92%-93%,检测灵敏度高于单一引物探针组合单重核酸检测,但检测特异性有所下降。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在提高灵敏度的同时可能会导致特异性的下降。
(5)单基因两个不同引物探针组合单重核酸检测结果叠加统计判断检测结果,当两个引物探针组合检测结果均为阳性判断检测结果阳性
表10
结果如表10所示,从表10中可以看出,EVX1-1和EVX1-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出0例,在60例肝癌中检出54例,EID3-2和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出55例,即在此条件下,本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在90%-92%之间,检测特异性在97%-100%,检测灵敏度略低于单一引物探针组合单重核酸检测,但检测特异性得到了提升。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在提高特异性的同时可能会导致灵敏度的下降。
(6)双基因双重核酸检测结果,以任一基因核酸检测为阳性判断检测结果阳性
表11
检测结果如表11所示,从表中可以看出,EVX1-1和EID3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出2例,在60例肝癌中检58例,EVX1-1和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出57例;EVX1-2和EID3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出3例,在60例肝癌中检出56例,EVX1-2和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出3例,在60例肝癌中检出58例,即在此条件下,本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在93%-97%之间,检测特异性在92%-97%,检测特异性与单一引物探针组合单重核酸检测相当,但具备了更高的检测灵敏度。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在维持与单一引物探针组合单重核酸检测相当的特异性的同时有效地提升了检测灵敏度。
(7)以双基因核酸检测均为阳性判断检测结果阳性
表12
检测结果如表12所示,从表中可以看出,EVX1-1和EID3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出55例,EVX1-1和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出56例;EVX1-2和EID3-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出2例,在60例肝癌中检出54例,EVX1-2和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出54例,即在此条件下,本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在90%-94%之间,检测特异性在95%-98%,虽然其特异性得到了维持甚至略有提升,但其灵敏度要比单一引物探针组合单重核酸检测低。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在提高特异性的同时可能会导致灵敏度的下降。
(8)单管单基因双引物探针组合双重核酸检测结果:在单一测试管中针对单一基因的两组不同的引物探针组合双重核酸检测,当两个引物探针组合任一检测结果为阳性判断检测结果阳性。
表13
单基因双重引物探针核酸检测结果如表13所示,从表13中可以看出,EVX1-1和EVX1-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出3例,在60例肝癌中检出57例,EID3-2和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出2例,在60例肝癌中检出58例,即在此条件下,本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在95%-97%之间,检测特异性在93%-95%,检测特异性与单一引物探针组合单重核酸检测相当,但具备了更高的检测灵敏度。表明此条件下本发明提供的引物探针组合在维持与单一引物探针组合单重核酸检测相当的特异性的同时,有效地提升了检测灵敏度。
(9)单管单基因双引物探针组合双重核酸检测结果:在单一测试管中针对单一基因的两组不同的引物探针组合双重核酸检测,当两个引物探针组合检测结果均为阳性判断检测结果阳性。
表14
结果如表14所示,从表14中可以看出,EVX1-1和EVX1-2引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出1例,在60例肝癌中检出53例,EID3-2和EID3-3引物探针组合检测目标基因甲基化在40例正常人样本中检出0例,在60例肝癌中检出54例,说明本申请方案的引物探针组合均可以有效的检测肝癌,结果表明,在此条件下,本发明提供的引物探针组合的检测灵敏度在88%-90%之间,检测特异性在98%-100%之间,检测灵敏度略低于单一引物探针组合单重核酸检测,但检测特异性得到了提升,达到100%。表明此条件下本发明提供的引物探针组合检测灵敏度虽然略有下降,但特异性却得到了极大的提升。
从上述结果的判断方案可以看出,本发明试剂盒可准确用于肝癌的检测。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种肝癌基因甲基化水平检测的试剂,其特征在于,包括能够特异性检测生物样本中以下(a)-(e)中至少一种目标核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂:
(a)SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域;
(b)与SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域;
(c)SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域;
(d)与SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域;
(e)与(a)、(b)、(c)或(d)至少80%以上同一性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述互补序列是与SEQ ID NO:37或SEQ IDNO:38所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应互补所形成的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,(a)或(b)中的任意部分区域为SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列或其互补序列中包括CpG二核苷酸位点的区域;优选地,所述(a)或(b)中的部分区域为如SEQ ID NO:39-41所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,(c)或(d)中的任意部分区域为SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列或其互补序列中包括CpG二核苷酸位点的区域;优选地,所述(c)或(d)中的部分区域为如SEQ ID NO:42-44所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂还包括核酸分子。
6.根据权利要求5所述的试剂,其特征在于,所述核酸分子包括可PCR扩增所述(a)-(e)中至少一种所示核苷酸序列的引物对;优选地,所述引物对选自以下组中的至少一组:
(1)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核酸分子;
(2)SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核酸分子;
(3)SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示的核酸分子;
(4)SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20所示的核酸分子;
(5)SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26所示的核酸分子;
(6)SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的核酸分子。
7.根据权利要求5所述的试剂,其特征在于,所述核酸分子包括可标记所述(a)-(e)中至少一种所示核苷酸序列的探针;优选地,所述探针选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33中的一种或多种。
8.一种试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-7任一项所示的试剂。
9.权利要求1-7任一项所述的试剂或权利要求8所述的试剂盒在制备肝癌检测产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述肝癌检测产品的检测包括如下步骤:
S1、将待测样品中目标基因的核酸中未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶,获得经修饰的待测样品;
S2、利用权利要求1-7任一项所述的试剂或权利要求8所述的试剂盒对步骤S1经修饰的待测样品进行甲基化情况检测。
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Legal Events
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---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20230505 |