CN1769486A - 脊髓型肌肉萎缩症的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明是有关于一种脊髓型肌肉萎缩症的鉴别方法，步骤包括：(a)提供一基因组核苷酸；(b)将基因组核苷酸与一引子对进行核酸序列的放大；以及(c)将放大后的一产物送入一DNA突变分析仪(Denaturing HighPer formance Liquid Chromato graphy，DHPLC)中；本发明方法不仅可用以区分受检者是否带有此疾病，更可用以鉴别脊髓型肌肉萎缩症的带原者。

Description

脊髓型肌肉萎缩症的鉴别方法

技术领域

本发明是关于一种基因检测方法，尤指一种检验脊髓型肌肉萎缩症基因与带原者的检测方法。

背景技术

运动神经元疾病(motor neuron disease，MND)是一种神经退化性疾病，其中脊髓型肌肉萎缩(Spinal muscular atrophy，SMA)是由于人体第五对染色体(5q13)上基因-运动神经元存活基因(survival motor neuron gene，SMN)发生突变，造成脊髓中的前角细胞，也就是运动神经细胞退化，而形成肌肉萎缩的症状，通常症状是先由手掌、指间肌肉开始萎缩，慢慢恶化到肩膀、颈部、舌头、吞咽与呼吸肌肉，最后造成吞咽困难与呼吸衰竭而死亡。在台湾，平均每一万名新生儿就有一名罹病，带原率大约是1％-3％。

人类体染色体为成对的，因此染色体上的每一个基因都有两份，如果在体染色体上有基因发生变异，产生了缺失，另外一份正常基因仍有可能制作出足够量的正常蛋白质，于是这种基因异常便不会有明显的临床症状，此即隐性遗传疾病；SMA即属隐性遗传疾病，带原者表现于外表型是正常的，其基因型属于异型合子(heterozygote)，如果亲代基因型均属于异型合子，子代同时由其亲代各获得一份异常的隐性疾病基因，则子代便会有该隐性遗传疾病的表征，基因型为同型合子(homozygote)，为SMA病患。

一般正常人的两条第5号染色体有两个同源性很高的SMN，包括靠近染色体末端(telomeric gene)的SMN1基因与靠近染色体中节(centromic gene)的SMN2基因；少数正常人只有SMN1基因，而无SMN2基因。这两个基因仅在3’端的区块有5个碱基对的差异，SMN1及SMN2基因虽然都会进行转录，但是SMN1基因转录转译出来的为稳定且具完整功能的蛋白质；而SMN2基因转录出来的mRNA大部分缺少exon 7，故转录出来的多为不稳定的蛋白质；因此，正常人如果因为SMN1与SMN2基因的间的删减或置换，而造成SMN1的缺失，即会发病，而SMN2的表现则与临床症状轻重相关。

目前临床上最常使用在SMA的检查的方法为PCR-RFLP(PolymeraseChain Reaction Restriction enzyme Fragment Length Polymorphism)，PCR所放大出的基因片段包含SMN1与SMN2，但只有SMN2基因具有被限制酶(restriction enzyme)辨认而切割的碱基，SMN1基因则无，因此，以限制酶进行基因片段切割处理后，再以电泳检测所携带的SMN1与SMN2基因，然而，这个方法反应所需的时间较长。

此外亦有一种鉴别SMA的方式，就是将含SMN序列的核苷酸进行定序，接着一一比对找出单一核苷酸的差异，此技术在定序方面虽然可以自动化进行，但是检验设备与耗材成本较高，结果的判读也需要一受到完整训练的技术人员进行，不仅耗时，繁琐又需花费大量人力与金钱，因而无法大量制式化施行检验。

由于SMA的医疗费用高，病患本身与家属常承受非常大的经济压力，而此医疗行为也是社会资源的庞大支出；最重要的是，传统检测只能在病人发病后加以确认是否为SMA，且无法找出SMA带原者；为此，如能有快速、准确、且经济的方法得以正确诊断出SMA基因的变异，或是给予产前遗传咨询或带原检验等，将有助于预防此罕见疾病的发生。

发明内容

本发明利用DNA突变分析仪(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)，来检测与脊髓型肌肉萎缩症相关的基因变异。DNA突变分析仪由美国史丹佛大学Peter Oefner教授研究团队所发展出的一新技术，利用自动化的侦测来找出微小甚至是单一核苷酸的突变，用以确认及辨认单一核苷酸的变化。此技术的原理为直接将PCR产物以加热的方式将DNA双螺旋松解，使得具错误配对的核苷酸能够与正常股得到区分，而经由HPLC管柱的分离而得到不同的管壁滞留时间(retentiontime)，之后经由UV的侦测可得到结果。

本发明提供一种脊髓型肌肉萎缩症鉴别方法，步骤包括：(a)提供一基因组核苷酸；(b)将基因组核苷酸与一引子对进行核酸序列的放大；以及(c)将放大后的一产物送入一DNA突变分析仪(Denaturing HighPerformance Liquid Chromatography，DHPLC)中。

于本发明中，放大基因组核苷酸基因以脊髓型肌肉萎缩症的相关基因片段-运动神经元存活基因(survival motor neuron gene，SMN)为主。为成功放大出目标基因，本发明方法步骤(b)中所使用的引子对含一正向引子，SEQ ID NO：1以及一负向引子，SEQ ID NO：2，或是任何一组可使放大后的产物含运动神经元存活基因的引子对；且步骤(b)的放大反应是聚合酶连锁反应。

本发明方法较佳可在步骤(c)之后还包括一步骤(d)，取自该DNA突变分析仪的结果与一运动神经元存活基因的标准品图谱进行比对，由于利用DNA突变分析仪可区分出只有少数碱基差异的SMN1与SMN2，因此标准品的制备是分别利用SMN1与SMN2进行DNA突变分析仪的分析，并以滞留时间(retention time)的差异来作比对的基础。

由于利用本发明方法先专一性的放大含SMN基因片段的核苷酸，再利用DNA突变分析仪的分析，可成功的区分出极小差异的SMN1与SMN2，而SMN1与SMN2的存在与否，或是两基因存在的比例，是影响一个体健康与否的主因，因此本发明方法不仅可用以区分受检者是否带有此疾病，还可用以鉴别脊髓型肌肉萎缩症的带原者。

附图说明

图1是SMN1与SMN2标准品的DHPLC图谱。

图2是单一碱基突变DHPLC图谱与定序结果比较图。

图3是SMN1与SMN2基因拷贝量分析的DHPLC图谱。

图4是带有SMA遗传疾病的家族谱系分析图。

图5是另一带有SMA遗传疾病的家族谱系分析图。

具体实施方式

实施例一

以受检者血液为检体，利用Puregene核酸萃取套组(Gentra Systems)抽取血液中的基因组DNA。

实施例二

利用聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)将SMN片段自基因组DNA中大量复制，以利检验的进行。

已知SMN1与SMN2的序列只有5个碱基对不同，因此由PCR反应放大出的产物将同时包含有SMN1与SMN2的序列，但是光以PCR产物，是无法分辨出受检者是含SMN1序列的健康个体，或是只有SMN2序列的患病个体。由于健康者所携带的SMN1基因转录出的蛋白质产物包含有exon7，因此exon7的存在是受检者患病与否的关键，所以本实施例中所用以进行PCR的引子对(primers)设计在SMN exon7附近，正向引子为SEQ ID NO：1，负向引子则为SEQ ID NO：2，由此增幅后的SMN基因片段，进行是否含有单一碱基突变的进一步分析。

PCR反应液中含有：基因组DNA 100ng，引子对(SEQ ID NO：1与SEQID NO：2)0.12μM，dNTPs 100μM，聚合酶0.5单位(AmpliTaq Gold^TM，PEApplied Biosystems)，10X缓冲液II(10mM Tris-HCl，pH＝8.3，50mM KCl)以及2mM MgCI₂的GeneAmp 2.5μL；所使用的聚合酶连锁反应仪为MBSthermocycler(ThermoHybaid)；进行聚合反应的条件为：首先于95℃环境下处理10分钟，接着进行35个循环，每个循环条件包括94℃-30秒，53℃-45秒，72℃-45秒，最后再增加一使DNA延展的时间，在72℃下处理10分钟。

实施例三

DNA突变分析仪(DHPLC)使用的是Transgenomic Wave核苷酸片段分析系统(Transgenomic Inc.)，其是在一自动化HPLC仪器上装配一DNASep管柱(Transgenomic Inc.)，管柱中含有2mm直径，非多孔性的苯乙烯-二乙烯基苯(Styrene divinylbenzene)粒子。因为碱基不同而有不同构型的DNA，在经HPLC分离后，可得到不同的管壁留置时间，之后经由UV侦测仪于260nm的吸光下进行分析；DHPLC仪器中使用的流动相(mobile phase)均为DHPLC级试剂，其中冲提液(eluent)A含0.1M三乙基醋酸铵(TEAA，Transgenomic^TM)与500μl乙腈(acetonitrile，9017-03 J.T.Baker)，冲提液B为含25％乙腈的0.1M TEAA。

取实施例二中完成增幅的DNA片段20μl，直接注射入DHPLC仪器中，条件设定一开始为5分钟的加热(95℃)，接着再以渐进式梯度降温的方式，在70分钟的内从95℃降至25℃，其中，冲提液B以0.9ml/min的速率渐进式的每分钟增加2％，共持续4.5分钟；一个测试约需10分钟。

实施例四

利用实施例三的DHPLC，先制备出标准品图谱，即SMN1与SMN2的个别的图谱，以利于与检体比对。

首先分别将SMN1与SMN2基因片段以PCR方式取得后，取5μlPCR产物，与pGEM^-TEasy Vector混合成一10μl的混合物后，置于4℃中一夜，进行基因片段与质体的接合(ligation)，接着取5接合后产物进行转形(transformation)实验，将接合完成的质体送入大肠杆菌(E.coli)中，再将菌种培养于含20μl筛选药物(ampicllin 50g/L)的培养基上，于37℃中培养一夜。经培养基的存活筛选后，长出的菌种即为质体接合成功者；接着将菌种培养增殖后，以Mini-M^TM质体抽取系统(Viogene)将菌种体内成功接合的质体抽取出，再依照实施例三的DHPLC条件，制备出SMN1与SMN2的个别的图谱，作为标准品。

SMN1与SMN2标准品图谱请见图1，图1a为SMN2标准品，留置时间还不到6分钟，图1b为SMN1标准品，留置时间大概在第6分钟左右。

实施例五

将实施例二的PCR产物进行定序，所使用的是PE Biosystems TaqDyeDeoxy terminator cycle sequencing kit，并于PE Biosystems 373A/3100定序仪中进行序列分析，以由定序结果来与实施例三的DHPLC图谱做比对。

实施例六

为进一步证实利用DHPLC亦可达成检测SMN1与SMN2基因拷贝数的目的，本实施例利用传统的TaqMan^TM技术，以实时定量聚合酶连锁反应(real-time PCR)法，将检体于96孔盘(MicroAmp optical plate，AppliedBiosystems)中以ABI Prism 7000的序列检测仪进行分析。

其中所用以放大SMN基因的引子对中，正向引子为SEQ ID NO：3，负向引子则为SEQ ID NO：4；并使用MGB(minor groove binder)探针，分别接上荧光染剂(5’-FAM)，以区分SMN1与SMN2基因中exon片段中第6个碱基位置的差异；SMN1的MGB探针序列为SEQ ID NO：5，SMN2的MGB探针序列为SEQ ID NO：6。

PCR反应液中含有：基因组DNA 50ng，引子对(SEQ ID NO：3与SEQID NO：4)0.3μM，Platinum^qPCR Supermix-UDG(Invitrogne)13μl，ROX(Invitrogne)0.5mM，2mM MgCl₂以及100nmol的MGB探针(SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6)。进行聚合反应的条件为：首先于50℃环境下处理2分钟，95℃环境下10分钟，接着进行40个循环，每个循环条件包括95℃-15秒，60℃-1分钟。分析软件为ABI37000SDS(Applied Biosystems)。

实施例七

在不同留置时间所出现的波峰，分别代表不同构型的DNA，透过控制DHPLC的加热温度，使DNA分子间结合力产生差异，而可明确的区分出序列不同的DNA分子，因此可轻易检测出SMN1与SMN2的单一碱基的差异。

请参考图2，与实施例五的定序结果相比较，可发现图2a图谱中同时带有SMN1与SMN2基因，且可从相对应的定序图中确认该波峰为单一碱基突变(胞嘧啶C/胸腺嘧啶T的点突变)所造成，属于异源双股DNA(heteroduplex)，而图2b(来自SMN2质体)与图2c(来自人类DNA检体)的图谱，则显示该检体DNA为只有胸腺嘧啶T的同源双股DNA(homoduplex)，即该DNA为SMN2基因片段；图2d(来自SMN1质体)与图2e(来自人类DNA检体)的图谱，则为只有胞嘧啶C的同源双股DNA(homoduplex)，即该DNA为SMN1基因片段。

实施例八

同时，在进行多个检体的DHPLC分析后，发现有许多结果是同时出现SMN1与SMN2基因的，而且各个检体呈现的波峰下的面积比例也与该检体进行定量PCR的结果相符，显示利用DHPLC的分析，也可以达到与定量PCR相同的效果，亦即可推知SMN1与SMN2的相对的基因拷贝量；本实验经多次重复，确认在DHPLC恒温器设定在52.5℃时，可清楚分析出SMN1与SMN2基因拷贝量。

请参考图3，由图3a-e可明显的判读出不同基因拷贝量的SMN1与SMN2，如图3a显示SMN1与SMN2的基因拷贝量比例相同，图3b的SMN1∶SMN2＝1∶2，图3c的SMN1∶SMN2＝1∶3，图3d的SMN1∶SMN2＝2∶1，图3e的SMN1∶SMN2＝3∶1。

实施例九

利用本发明检验与判读方法，进行2个已知带有SMA遗传疾病的家族进行谱系分析，结果如图4与图5。图4中父为带原者

母亦为带原者

所生出的两名男孩均为SMA的病患(■)，经由DHPLC的分析，可发现父的SMN1∶SMN2＝1∶3，母的SMN1∶SMN2＝1∶3，两名男孩的SMN1∶SMN2＝0∶4，因为SMN1基因的缺失而发病。

另一家族的谱系图请见图5，图5中父为带原者

母亦为带原者

所生出的四名子女中，两名男孩为SMA的病患(■)，另两名女孩中，一名为健康者(○)，另一名为带原者

此外，与健康女孩婚配的男孩亦为健康者；经由DHPLC的分析，可发现父的SMN1∶SMN2＝1∶3，母的SMN1∶SMN2＝1∶3，两名男孩的SMN1∶SMN2＝0∶4，带原者女孩的SMN1∶SMN2＝1∶3，健康女孩的SMN1∶SMN2＝2∶2，健康女孩婚配对象的SMN1∶SMN2＝2∶2。

本发明经过测试，将原本用以检测单一核苷酸变异的DNA突变分析仪成功运用于检测SMA病人与带原者。在测试结果图谱中，单一峰值的结果代表了同型合子的存在，而留置时间的变化，也就是峰值的变化，即表示异型的合子的存在。利用此方法可以有效区分同型合子及异型合子的存在，弥补直接序列分析在这方面耗时及昂贵的缺憾，可以在短时间内有效率、经济及准确地筛检出重症患者及带原者，相较于现行的方法，除了对于检验重症患者具有快速，准确及高敏感度的特性，对于带原者而言，可进一步对于带原者做快速准确的检验。

上述实施例仅为了方便说明而举例而已，本发明所主张的权利范围自应以申请专利范围所述为准，而非仅限于上述实施例。

                        序列表

<110>苏怡宁

<120>脊髓型肌肉萎缩症基因及其带原者之检测方法

<130>P7932/0619

<160>6

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人类

<400>1

tgtcttgtga aacaaaatgc tt                                               22

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人类

<400>2

aaaagtctgc tggtctgcct a                                                21

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人类

<400>3

aatgcttttt aacatccata taaagct                                          27

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人类

<400>4

ccttaattta aggaatgtga gcacc                                            25

<210>5

<211>16

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>人工合成MGB探针

<400>5

cagggtttca gacaaa                                                      16

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>人工合成MGB探针

<400>6

tgattttgtc taaaaccc                                                    18

Claims (8)

1.一种脊髓型肌肉萎缩症的鉴别方法，包括：

a)提供一基因组核苷酸；

b)将该基因组核苷酸与一引子对进行核酸序列的放大；以及

c)将放大后的一产物送入一DNA突变分析仪中。

2.如权利要求1所述的检验方法，其特征在于，其中步骤(b)中该引子对含一正向引子，为SEQ ID NO：1。

3.如权利要求1所述的检验方法，其特征在于，其中该步骤(b)中引子对含一负向引子，为SEQ ID NO：2。

4.如权利要求1所述的检验方法，其特征在于，其中该步骤(b)的放大反应是聚合酶连锁反应。

5.如权利要求1所述的检验方法，其特征在于，其中步骤(c)的该产物是包括脊髓型肌肉萎缩症的相关基因片段。

6.如权利要求5所述的检验方法，其特征在于，其中该脊髓型肌肉萎缩症的相关基因片段是运动神经元存活基因。

7.如权利要求1所述的检验方法，其特征在于，其中于步骤(c)之后还包括一步骤(d)，取自该DNA突变分析仪的结果与一运动神经元存活基因的标准品图谱进行比对。

8.如权利要求1所述的检验方法，其特征在于，其用于鉴别脊髓型肌肉萎缩症的带原者。

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