CN112553328A

CN112553328A - 检测基因表达水平的产品及其在制备重度抑郁症诊断工具中的应用

Info

Publication number: CN112553328A
Application number: CN202011614366.XA
Authority: CN
Inventors: 李明定; 赵舒; 杨忠丽
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112553328B

Abstract

本发明公开了检测基因表达水平的产品及其在制备重度抑郁症诊断工具中的应用，所述产品包括芯片或试剂盒，所述的基因包括：TPST1、ARG1、KLRB1、WWC3、AKR1C3、MAFG。本发明临床前验证结果确切，AUC达到83％。有效提高了检测能力和效率，降低了检测成本。

Description

检测基因表达水平的产品及其在制备重度抑郁症诊断工具中的应用

技术领域

本申请涉及生物医药术领域，尤其涉及检测基因表达水平的产品在制备重度抑郁症诊断工具中的应用。

背景技术

抑郁症是一种常见的精神疾病，以显著而持久的心境低落与兴趣减少为主要临床特征。抑郁症是中国乃至世界发病率较高的一种精神类疾病，它是导致全球疾病负担的一个重大因素。与一般人群相比，重度抑郁症(Major Depressive Disorder；MDD)患者的自杀风险显著增加。与其他精神疾病一样，抑郁症的病因复杂，缺乏特异的症诊断工具。而临床使用精神分析量表的方法诊断会受到患者主观意识的影响，且依赖医生的主管判断，容易导致诊断出现偏差。

另外，由于精神疾病的特殊性，无法通过脑组织活检进行病理性诊断。因此，临床上需要一种客观且可行的诊断方法，以加强抑郁症的防治，提高患者的生存质量。而外周血取样无创、安全、简便，有望作为脑组织活检的替代物用于抑郁症等中枢神经系统疾病的诊断。外周血基因标志物在抑郁症领域被广泛研究，但是将其用作抑郁症的诊断还面临着问题——不同研究得到的标志物不尽相同，且诊断模型不具备普适性。

发明内容

本申请实施例的目的是提供检测基因表达水平的产品及其在制备重度抑郁症诊断工具中的应用，以解决目前临床上缺乏客观抑郁症诊断产品的问题。

根据本申请实施例的第一方面，提供检测基因表达水平的产品在制备重度抑郁症诊断工具中的应用，所述的基因包括：TPST1、ARG1、KLRB1、WWC3、AKR1C3、MAFG。

进一步地，所述的基因还包括KCNE1、TSPAN1、GPR17、HSP90AA1、MMP9、RPL9、PGBD4、CLTCL1、WWC3、NDFIP2、MPO、FCER1A、EOMES、FCAR、CSTF3、MXD3、CEACAM8、NANOS3、RSL24D1、ELANE、MKNK1、GAB2、KREMEN1、MX2、SLC47A1、ERMP1、MYO9A、CASD1、OLFM4、GZMA、UTP20、TMEM117、SLC25A37、MRPS28、METTL7B、GPR84、ZNF22、RGR、CRYZ、HERC2、TMEM38B、ACTR8、DTYMK、KIFC3、AMPD3、TMEM170A、MATN4、AK3、WDR70、HUS1B、DDX27、YLPM1、MYO10、GARS、EHD2、VNN3、PGS1、SLC12A2、TULP4、CDKN1C、TRIO、RPS9、RHOC、FKBP2、ATP6V1G1中的一个或多个。

进一步地，所述产品包括：通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测基因表达水平用产品。

进一步地，所述产品包括特异性识别基因的探针；或特异性扩增基因的引物。

进一步地，所述引物包括：

TPST1的正向引物序列为5'-CCATCACCGGATAGAGGAACG-3'，TPST1的反向引物序列为5'-TCGGGGAATGACCCTGGTT-3'；

ARG1的正向引物序列为5'-GTGGAAACTTGCATGGACAAC-3'，ARG1的反向引物序列为5'-AATCCTGGCACATCGGGAATC-3'；

KLRB1的正向引物序列为5'-TGGCATCAATTTGCCCTGAAA-3'，KLRB1的反向引物序列为5'-TCCAAGGGTTGACAGTGTGAG-3'；

WWC3的正向引物序列为5'-CAAGAGCGCATGTTGAAGGAA-3'，WWC3的反向引物序列为5'-CGCTGCTGCTTAATCTGGTAGA-3'；

AKR1C3的正向引物序列为5'-GTCATCCGTATTTCAACCGGAG-3'，AKR1C3的反向引物序列为5'-CCACCCATCGTTTGTCTCGTT-3'；

MAFG的正向引物序列为5'-GTGTGAGAGCGCCTGCT-3'，MAFG的反向引物序列为5'-GCTCCCGCTTCACCTTCAA-3'。

根据本申请实施例的第二方面，提供检测基因表达水平的产品，所述产品包括芯片或试剂盒，所述的基因包括：TPST1、ARG1、KLRB1、WWC3、AKR1C3、MAFG。

进一步地，所述芯片包括基因芯片，所述基因芯片包括针对所述基因的寡核苷酸探针或引物。

进一步地，所述试剂盒包括基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括所述基因的特异性扩增引物、探针或芯片。

进一步地，所述引物包括：

进一步地，所述基因检测试剂盒还包括选自以下的一种或多种物质：阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂、溶剂。

进一步地，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法检测基因表达水平的试剂。

进一步地，所述用qRT-PCR法检测70基因表达水平的试剂包括如表1所示的特异性扩增70基因的引物序列。

表1：70基因及其扩增引物

进一步地，所述用qRT-PCR法检测70基因表达水平的试剂还包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对；所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

进一步，所述扩增管家基因为GAPDH，扩增GAPDH的正向引物序列为5'-GGTAGAGGTCGGAGTCAACG-3',GAPDH的反向引物序列为5'-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3'。

本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

由上述实施例可知，本申请与目前已有的诊断技术相比，本发明结合GEO数据库中不同的芯片数据，选出的基因至少包括：TPST1、ARG1、KLRB1、WWC3、AKR1C3、MAFG。本发明临床前验证结果确切，AUC达到83％(表3)。对比单个基因的诊断，本发明的产品具有更高的诊断效力(图1-6)，能很好以解决目前临床上缺乏客观抑郁症诊断产品的问题。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。

图1是根据一示例性实施例示出的6个单基因模型与SVM诊断模型在进行MDD诊断的效果比较图，其中模型的数据集来自Leday et al.,2018；

图2是根据一示例性实施例示出的6个单基因模型与SVM诊断模型在进行MDD诊断的效果比较图，其中模型的数据集来自Spijker et al.,2011；

图3是根据一示例性实施例示出的6个单基因模型与SVM诊断模型在进行MDD诊断的效果比较图，其中模型的数据集来自Savitz et al.,2013；

图4是根据一示例性实施例示出的6个单基因模型与SVM诊断模型在进行MDD诊断的效果比较图，其中模型的数据集来自Liu et al.,2014；

图5是根据一示例性实施例示出的6个单基因模型与SVM诊断模型在进行MDD诊断的效果比较图，其中模型的数据集来自Miyata et al.,2016；

图6是根据一示例性实施例示出的6个单基因模型与SVM诊断模型在进行MDD诊断的效果比较图，其中模型的数据集来自Belzeaux et al.,2012。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的装置和方法的例子。

在本申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

本发明实施例结合GEO数据库中不同的芯片数据，通过分析，发现70基因在重度抑郁症患者中呈现差异性表达，该70基因组合可作为检测指标应用于重度抑郁症的临床诊断。

在本发明实施例的上下文中，“70基因”包括：MAFG、KCNE1、KLRB1、TPST1、TSPAN1、ARG1、GPR17、HSP90AA1、MMP9、RPL9、PGBD4、CLTCL1、WWC3、NDFIP2、MPO、FCER1A、EOMES、FCAR、CSTF3、MXD3、CEACAM8、NANOS3、RSL24D1、ELANE、MKNK1、GAB2、KREMEN1、MX2、SLC47A1、ERMP1、MYO9A、CASD1、OLFM4、GZMA、UTP20、TMEM117、SLC25A37、MRPS28、METTL7B、GPR84、AKR1C3、ZNF22、RGR、CRYZ、HERC2、TMEM38B、ACTR8、DTYMK、KIFC3、AMPD3、TMEM170A、MATN4、AK3、WDR70、HUS1B、DDX27、YLPM1、MYO10、GARS、EHD2、VNN3、PGS1、SLC12A2、TULP4、CDKN1C、TRIO、RPS9、RHOC、FKBP2、ATP6V1G1，以及这些基因的任何功能等同物的多核苷酸。

其中“TPST1、ARG1、KLRB1、WWC3、AKR1C3、MAFG”为必要基因，组合中的其他基因包括但不限于“KCNE1、TSPAN1、GPR17、HSP90AA1、MMP9、RPL9、PGBD4、CLTCL1、WWC3、NDFIP2、MPO、FCER1A、EOMES、FCAR、CSTF3、MXD3、CEACAM8、NANOS3、RSL24D1、ELANE、MKNK1、GAB2、KREMEN1、MX2、SLC47A1、ERMP1、MYO9A、CASD1、OLFM4、GZMA、UTP20、TMEM117、SLC25A37、MRPS28、METTL7B、GPR84、ZNF22、RGR、CRYZ、HERC2、TMEM38B、ACTR8、DTYMK、KIFC3、AMPD3、TMEM170A、MATN4、AK3、WDR70、HUS1B、DDX27、YLPM1、MYO10、GARS、EHD2、VNN3、PGS1、SLC12A2、TULP4、CDKN1C、TRIO、RPS9、RHOC、FKBP2、ATP6V1G1”(例如，其他与重度抑郁症相关的基因)。上述的70基因可以从GeneBank中获得。

本发明实施例的实用性并不局限于对本发明实施例的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。本领域技术人员知道，进行生物信息学分析时，通常会将测序序列和已知的基因进行比对，只要有关序列可以比对到相关基因上，就可以看做是该基因的表达，因此，在提及差异表达的基因时，该基因的不同的转录本、突变型或其片段也包含在本发明实施例中。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明实施例的重要方面。本发明实施例可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。

本发明实施例的70基因的表达水平使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸扩增技术、核酸测序、核酸杂交。

核酸扩增技术的示例性非限制性实施例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成cDNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序、二代测序(深度测序/高通量测序)。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA的不稳定性且在实验中容易被降解，因此在测序前通常将RNA逆转录成cDNA。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

本发明实施例中检测70基因表达水平的产品可以包括芯片或试剂盒。

在本发明实施例中芯片包括基因芯片；所述基因芯片包括固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于70基因的部分或全部序列。

本发明实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测70基因的表达水平，包含用于70基因检测和/或定量的引物、寡核苷酸探针、配体、和/或芯片。选自下组的一种或多种物质：阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明实施例的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断、对治疗方案进行选择。

本发明实施例中诊断重度抑郁症的产品可用于检测70个基因的表达水平，将重度抑郁症的多个标志物同时进行检测，可大大提高重度抑郁症诊断的准确率。

在本发明实施例的具体实施例中，基因RNA提取自外周血。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：筛选与重度抑郁症相关的基因标志物

1、GEO(Gene Expression Omnibus)数据检索

GEO(Gene Expression Omnibus)数据库是由NCBI(美国国立生物技术信息中心)开发维护，GEO数据库作为最大的基因表达数据的数据库，该数据库以芯片数据为主，此外亦包含一些非芯片类型的数据如SAGE(基因表达系列分析)数据、SARST(核糖体序列标签连续分析)数据、MS(质谱)数据、蛋白质组数据和新一代高通量测序数据(MPSS，大规模平行测序技术)等。

(1)检索关键词：

“MDD”,“Major Depressive Disorders”,“Depressive Disorders”,“DepressiveSyndromes”,“Depression”,“blood”,“peripheral blood”,“PB”

(2)研究中的样本筛选策略：

限制研究类型为“Expression profiling by array”,物种为“Homo sapiens”。将符合以下标准的数据集将纳入研究：①数据来自于重度抑郁症病例组和对照组；②不患有其他重大疾病；③没有进行治疗。

1、MDD基因芯片数据Meta分析

对于来自Illumina平台和Agilent平台的芯片数据，使用Quantile法对数据进行标准化，并基于相应平台信息对探针信息进行注释。对于来自Affymetrix

平台的数据集，则下载原始的CEL数据，然后使用RMA(Robust Multi-ArrayAverage)算法和“Oligo”软件包对数据进行标准化和探针信息注释。我们排除了丢失超过50％数据的基因。通过IQR(Inter-Quartile Range)方法排除对应于同一基因的冗余探针。排除QC过后基因数少于10000的数据集。

使用R包“MetaQC”计算并评价数据集质量，排除质量差的数据集。最终确定6组数据(表2)。将样本数最少的一组作为独立验证，其余5组进入下一步meta分析筛选差异表达基因。

表2：纳入meta分析的数据集的基本信息

使用R包“MetaOmics”对5套数据进行差异表达基因的筛选，设定p≤0.01，共筛选出114个差异表达基因。

2、利用随机森林算法进行特征基因筛选

使用样本最多的数据集作为训练集，得到108个特征基因。为了方便临床应用，我们计算了10-108个基因在5个数据集中的平均分类效果，发现在70基因时达到最高平均准确率84.2％。

实施例2：建立基于70基因的SVM诊断模型

采用机器学习的方法，利用特征基因建立MDD诊断模型；其中，特征基因为上述70个基因。该模型通过利用机器学习方法中的支持向量机算法，将一组已知MDD病例和对照组的样本作为训练集进行训练学习，从而建立符合一定规律的模型。

在一种优选的实施例中，采用支持向量机的方法建立MDD诊断模型包括：采用训练集样本的70个基因的logTPM(TPM全称为transcripts per million reads)作为输入，使用R包“caret”进行训练；训练集样本包括MDD病例的样本和对照组的样本。最终得到的模型参数为C＝0.5,sigma＝0.0092。在不同数据集中均有较好的分类效果(表3)，平均AUC达到83％。独立数据集验证得到AUC为78％。

表3：SVM模型的分类效果

实施例3:使用基于70基因的SVM模型诊断重度抑郁症

在一种优选的实施例中，采用所述模型进行患病诊断时包括：用测试集样本的70个基因的logTPM(TPM全称为transcripts per million reads)作为输入，输出为患病概率值。

1、RNA提取

采用市售核酸提取试剂盒提取总RNA，提取完成后电泳检测RNA降解程度，利用Nanodrop检测RNA的污染情况。

2、Ribo-zero-kit去除核糖体RNA(rRNA)

由于在提取得到的总RNA中rRNA的比例超过95％，因此首先需要通过实验手段去除rRNA对转录组有效数据的影响，利用Ribo-zero-kit特异性去除rRNA。

3、文库构建

总RNA在去除rRNA后，依此进行一链和二链的合成得到双链cDNA，然后进行cDNA片段的末端修复，加A，加接头等步骤，最后通过PCR引入index并扩增得到最终的转录组文库。

4、文库质控与上机测序

构建好的文库在上机测序前进行2100检测和QPCR定量，检测插入片段大小、计算有效片段的浓度，根据有效片段的浓度和需要的上机数据量pooling每个待测文库。

5、数据分析

使用STAR软件将测序得到的序列与人类基因组hg19进行比对，使用STAR软件对比对后的bam文件进行定量，得到每个基因的基因的Count数。根据基因的Counts值计算该基因的TPM值。计算方法如下：

(1)根据基因长度矫正Count值，假设某基因的Count值为R1，基因长度为L1，则矫正后Count值为R1/(L1/1000)；

(2)计算total矫正后的Count值，即所有基因的矫正后Count值总和R总；

(3)计算TPM，TPM的结果为R1*1000*1000000/(L1*R总)。

6、预测样本

采用样本的70个基因的logTPM作为输入，使用所述SVM诊断模型，得到患病概率，以判断测试样本是否为MDD患者。

如图1-6所示，SVM诊断模型的AUC均高于6个单基因模型在MDD诊断的效果。所以，对比单个基因的诊断，本发明的产品具有更高的诊断效力(图1-6)，能很好以解决目前临床上缺乏客观抑郁症诊断产品的问题。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的公开后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims

1.检测基因表达水平的产品在制备重度抑郁症诊断工具中的应用，其特征在于，所述的基因包括：TPST1、ARG1、KLRB1、WWC3、AKR1C3、MAFG。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因还包括KCNE1、TSPAN1、GPR17、HSP90AA1、MMP9、RPL9、PGBD4、CLTCL1、WWC3、NDFIP2、MPO、FCER1A、EOMES、FCAR、CSTF3、MXD3、CEACAM8、NANOS3、RSL24D1、ELANE、MKNK1、GAB2、KREMEN1、MX2、SLC47A1、ERMP1、MYO9A、CASD1、OLFM4、GZMA、UTP20、TMEM117、SLC25A37、MRPS28、METTL7B、GPR84、ZNF22、RGR、CRYZ、HERC2、TMEM38B、ACTR8、DTYMK、KIFC3、AMPD3、TMEM170A、MATN4、AK3、WDR70、HUS1B、DDX27、YLPM1、MYO10、GARS、EHD2、VNN3、PGS1、SLC12A2、TULP4、CDKN1C、TRIO、RPS9、RHOC、FKBP2、ATP6V1G1中的一个或多个。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测基因表达水平用产品。

4.根据权利要求1所述的应用，所述产品包括特异性识别基因的探针；或特异性扩增基因的引物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物包括：

6.检测基因表达水平的产品，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒，所述的基因包括：TPST1、ARG1、KLRB1、WWC3、AKR1C3、MAFG。

7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述芯片包括基因芯片，所述基因芯片包括针对所述基因的寡核苷酸探针或引物。

8.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括所述基因的特异性扩增引物、探针或芯片。

9.根据权利要求7或8所述的产品，其特征在于，所述引物包括：

10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述基因检测试剂盒还包括选自以下的一种或多种物质：阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂、溶剂。