CN113215230A - 一种snp核酸质谱分型检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸质谱检测技术领域，具体地说，涉及一种SNP核酸质谱分型检测方法。其包括提取DNA模板步骤、分型检测步骤、扩增和纯化步骤以及分析步骤。本发明中通过波形图的波峰以及荧光标记相结合的形式对样本SNP位点进行确定，并通过波峰的移动实现对相应位点的追踪，从而解决最后分析时样本个别位点丢失无法寻找的问题，进而大大提高分型检测的精确度，另外，通过多重PCR反应的扩增，实现了多个位点的同步分析，具体的用于5‑30个SNP位点分析。
Description
技术领域
本发明涉及核酸质谱检测技术领域，具体地说，涉及SNP核酸质谱分型检测方法。
背景技术
目前DNA的分型检测已经被广泛应用，现有的分型检测首先通过PCR扩增含有SNP的基因组片段，然后通过序列特异性引物实现单碱基延伸，随后样品分析物与芯片基质共结晶后在真空管中受瞬时纳秒(10-9s)强激光激发，核酸分子因此解吸附成为单电荷离子，由于电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。
但在检测过程中SNP位点很容易丢失，丢失后无法及时获取位点的位置信息，从而导致整个检测失败。
发明内容
本发明的目的在于提供SNP核酸质谱分型检测方法，以解决上述背景技术中提出检测过程中SNP位点很容易丢失，丢失后无法及时获取位点的位置信息的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种SNP核酸质谱分型检测方法，包括如下方法步骤：
S1、提取DNA模板，并检测DNA模板的位点信息；
S2、利用位点信息对引物进行分型检测，以得出SNP位点；
S3、引物设计后，对位点的上下游进行扩增和纯化处理；
S4、扩增和纯化处理后对DNA模板的单碱基进行延伸和检测，并对检测形成的数据进行分析。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2中分型检测采用SNP分型检测，检测步骤如下：
S2.1、根据位点信息设计引物模板；
S2.2、对引物模板进行延伸，延伸过程中被标记的核酸掺入至引物模板中；
S2.3、根据被标记的核酸确定该延伸产物对应的SNP位点。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2.2中引物模板延伸一个碱基终止。
作为本技术方案的进一步改进，所述核酸包括ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddATP，并通过四种荧光对不同的核酸进行标记。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2.2中引物模板延伸过程中通过电泳使核酸序列分离，且引物模板分离后的核酸序列与被标记的核酸结合。
作为本技术方案的进一步改进，所述电泳使核酸序列分离后形成核酸波形图，根据波峰移动的位置确定引物模板延伸产物对应的SNP位点。
作为本技术方案的进一步改进，所述波峰的颜色与ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddATP相对应。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1中DNA模板包括PCR模板，PCR模板通过多重PCR反应获取，具体的：
多重PCR反应对DNA进行扩增。
作为本技术方案的进一步改进，所述引物模板分离后采用特征提取算法对特征进行提取，具体算法步骤如下：
首先提取DNA扩增后的样本，并将提取的样本定义为正样本，然后在正样本周围产生相应的负样本；
对正负样本进行提取，提取后的正负样本进行归一化处理，得到特征矩，而后根据特征矩对DNA扩增后的样本进行特征提取。
作为本技术方案的进一步改进，所述特征矩的计算公式如下：
其中：ηpq为p+q的特征矩；p为正样本；q为负样本；μpq为p+q的中心矩；
为p+q的初始矩；γ为DNA扩增量。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
该SNP核酸质谱分型检测方法中，通过波形图的波峰以及荧光标记相结合的形式对样本SNP位点进行确定，并通过波峰的移动实现对相应位点的追踪，从而解决最后分析时样本个别位点丢失无法寻找的问题，进而大大提高分型检测的精确度，另外，通过多重PCR反应的扩增，实现了多个位点的同步分析，具体的用于5-30个SNP位点分析。
附图说明
图1为本发明实施例1的整体步骤流程框图；
图2为本发明实施例1的检测步骤流程框图；
图3为本发明实施例1的特征提取算法步骤流程框图；
图4为本发明实施例1的延伸工作原理示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种SNP核酸质谱分型检测方法，请参阅图1-图3，包括如下方法步骤：
S1、提取DNA模板，并检测DNA模板的位点信息；
提取的DNA模板在低温环境下保存，具体的将提取的DNA模板保存至-20℃或-80℃低温冰箱中，并且在运输时通过液氮或者干冰进行运输，此外，DNA模板要求如下：
体积≥50ul，浓度≥50ng/ul，DNA总量≥2ug，纯度OD260/280在1.7～1.9之间，不含PCR抑制剂。
S2、利用位点信息对引物进行分型检测，以得出SNP位点；
S3、引物设计后，对位点的上下游进行扩增和纯化处理，通过纯化处理提高扩增过程中的质量；
S4、扩增和纯化处理后对DNA模板的单碱基进行延伸和检测，并对检测形成的数据进行分析。
本实施例中，S2中分型检测采用SNP分型检测，检测步骤如下：
S2.1、根据位点信息设计引物模板；
S2.2、对引物模板进行延伸，延伸过程中被标记的核酸掺入至引物模板中，且引物模板延伸一个碱基终止；
S2.3、根据被标记的核酸确定该延伸产物对应的SNP位点。
具体的，核酸包括ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddATP，并通过四种荧光对不同的核酸进行标记。
本实施例在工作时，请参阅图4所示，向引物模板中滴入测序酶(采用经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶)，经过测序酶的作用掺入至引物模板中的核酸，即ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddATP与其对应引物模板的核酸序列进行延伸，而由于ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddATP被四种荧光进行标记，此时通过电泳使核酸序列分离，具体的：
将引物模板置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸向阳极迁移，迁移速率受到所加电压、电场、电泳缓冲液等因素影响，在不同条件下电泳适当时间后，核酸片段将处在不同位置上，从而达到分离的目的，且引物模板分离后的核酸序列与被标记的核酸结合，电泳使核酸序列分离后形成核酸波形图，根据波峰移动的位置确定引物模板延伸产物对应的SNP位点，从而通过波形图的波峰以及荧光标记相结合的形式对样本SNP位点进行确定，并通过波峰的移动实现对相应位点的追踪，从而解决最后分析时样本个别位点丢失无法寻找的问题，进而大大提高分型检测的精确度。
值得说明的是，波峰的颜色与ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddATP相对应。
除此之外，S1中DNA模板包括PCR模板，PCR模板通过多重PCR反应获取，具体的：
多重PCR反应对DNA进行扩增，PCR扩增包括三个步骤，分别是变性、退火和延伸，基因组DNA变性：基因组DNA经加热至93℃左右一定时间后，双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，形成单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
基因组DNA与引物的退火：基因组DNA成单链后，温度降至55℃左右，引物与基因组DNA单链的互补序列配对结合；
引物的延伸：基因组DNA和引物的结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，然后重复循环上述三过程获得更多的“半保留复制链”，从而实现了基因组DNA的扩增，以便于后期通过应条带对基因组DNA进行测序，从而通过多重PCR反应的扩增，实现了多个位点的同步分析，具体的用于5-30个SNP位点分析。
进一步的，引物模板分离后采用特征提取算法对特征进行提取，具体算法步骤如下：
首先提取DNA扩增后的样本，并将提取的样本定义为正样本，然后在正样本周围产生相应的负样本；
对正负样本进行提取，提取后的正负样本进行归一化处理，得到特征矩，而后根据特征矩对DNA扩增后的样本进行特征提取。
再进一步的，特征矩的计算公式如下：
其中：ηpq为p+q的特征矩；p为正样本；q为负样本；μpq为p+q的中心矩；
为p+q的初始矩；γ为DNA扩增量。
本实施例在工作时，通过对正负样本特征矩的计算，得出样本之间的特征数据，并将该特征数据赋予负样本，此时对负样本进行分型检测，从而避免在检测过程中对正样本造成损伤，以降低检测的成本。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于，包括如下方法步骤：
S1、提取DNA模板，并检测DNA模板的位点信息；
S2、利用位点信息对引物进行分型检测，以得出SNP位点；
S3、引物设计后，对位点的上下游进行扩增和纯化处理；
S4、扩增和纯化处理后对DNA模板的单碱基进行延伸和检测，并对检测形成的数据进行分析。
2.根据权利要求1所述的SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于：所述S2中分型检测采用SNP分型检测，检测步骤如下：
S2.1、根据位点信息设计引物模板；
S2.2、对引物模板进行延伸，延伸过程中被标记的核酸掺入至引物模板中；
S2.3、根据被标记的核酸确定该延伸产物对应的SNP位点。
3.根据权利要求2所述的SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于：所述S2.2中引物模板延伸一个碱基终止。
4.根据权利要求2所述的SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于：所述核酸包括ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddATP，并通过四种荧光对不同的核酸进行标记。
5.根据权利要求4所述的SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于：所述S2.2中引物模板延伸过程中通过电泳使核酸序列分离，且引物模板分离后的核酸序列与被标记的核酸结合。
6.根据权利要求5所述的SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于：所述电泳使核酸序列分离后形成核酸波形图，根据波峰移动的位置确定引物模板延伸产物对应的SNP位点。
7.根据权利要求6所述的SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于：所述波峰的颜色与ddGTP、ddCTP、ddTTP和ddATP相对应。
8.根据权利要求1所述的SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于：所述S1中DNA模板包括PCR模板，PCR模板通过多重PCR反应获取，具体的：
多重PCR反应对DNA进行扩增。
9.根据权利要求5所述的SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于：所述引物模板分离后采用特征提取算法对特征进行提取，具体算法步骤如下：
首先提取DNA扩增后的样本，并将提取的样本定义为正样本，然后在正样本周围产生相应的负样本；
对正负样本进行提取，提取后的正负样本进行归一化处理，得到特征矩，而后根据特征矩对DNA扩增后的样本进行特征提取。
10.根据权利要求9所述的SNP核酸质谱分型检测方法，其特征在于：所述特征矩的计算公式如下：
其中：
为p+q的特征矩；p为正样本；q为负样本；
为p+q的中心矩；
为p+q的初始矩；γ为DNA扩增量。
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