JP2008220291A - 等温条件下において行うｐｃｒ法 - Google Patents

Abstract

【課題】反応溶液量が微少容量である場合に、高精度かつ簡便にPCR増幅する方法の提供。
【解決手段】各工程を等温条件下において行うPCR法であって、a)標的塩基配列を有する鋳型核酸と前記標的塩基配列をPCR増幅するために用いられるプライマーからなるプライマーセットとPCRに供されるヌクレオチドを有するPCR反応溶液を調製する工程と、b)PCR反応溶液にアルカリ変性液を添加して攪拌することにより鋳型核酸を一本鎖に解離させる変性工程と、c)工程(b)により得られたPCR反応溶液に中和液を添加して攪拌することにより一本鎖の鋳型核酸とプライマーがアニーリング可能なpHに調整する中和工程と、d)工程(c)により得られたPCR反応溶液にDNAポリメラーゼ溶液を添加して攪拌することにより前記標的塩基配列をPCR増幅する増幅工程と、e)前記工程(b)〜(d)を2回以上繰り返す工程とを有し、前記攪拌が表面弾性波処理等であることを特徴とするPCR法。
【選択図】なし

Description

本発明は、微小容量であっても、各工程を等温条件下において行うことのできるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、該ＰＣＲ法に用いられるＰＣＲ装置、及び該ＰＣＲ法に用いられるＰＣＲ用キットに関する。

近年、ヒトや動植物等の生命現象を遺伝子レベルで解明するための研究が活発に続けられている。このような研究の重要な手段として、遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等がある。生物の遺伝情報は、遺伝子ＤＮＡに塩基配列として格納されており、このような塩基配列の解析を行うために、被分析サンプルのＤＮＡを多量に増幅する必要性が生じている。特に、一塩基多型（ＳＮＰ）検出や遺伝的変異の検出等の遺伝子解析では、被分析サンプルが微量である場合や、非常に多くの被分析サンプルを解析する場合が多いため、多数のサンプルを、微少容量で効率よくＤＮＡ増幅ができる簡便な手法の開発が望まれている。

ＤＮＡを多量に増幅する手段として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が１９８５年にマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らにより開発された。ＰＣＲ法は、解析の目的である標的塩基配列を挟んだ２種類のプライマーからなるプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡポリメラーゼ反応を繰り返すことにより、該標的塩基配列を数十万倍に増幅する方法である。該方法は、その後、耐熱性酵素Ｔａｑポリメラーゼを利用した方法に改良されたことで、効率の良いＰＣＲ法として確立された。ＰＣＲ法は基本的に、（１）変性工程、（２）アニーリング工程、及び（３）伸張工程の３つの工程１サイクルとし、該サイクルを２５〜３０回繰り返すことにより特定の標的塩基配列を増幅していく（例えば、非特許文献１参照。）。該ＰＣＲ反応によって、ｎサイクル後には理論的には標的塩基配列は２^ｎ倍に増幅されることになる。実際には、増幅が進むとともに、増幅塩基配列同士のアニーリングが起こるため、ＰＣＲ反応が頭打ちになり、数十万倍程度の増幅となる。

通常用いられているＰＣＲ法は、加熱変性式であり、具体的には、先ず、（１）９４℃付近で７分間加熱し、二本鎖ＤＮＡを熱変性により一本鎖に変性した後、Ｔａｑポリメラーゼを加える。続いて、（２）５４℃付近、３０秒間加熱し、一本鎖になったＤＮＡとプライマーとのアニーリングを行う。次に、（３）７２℃付近、１分間加熱し、ＴａｑポリメラーゼによりＤＮＡ鎖を伸長させる。次に、（４）再びＤＮＡ加熱変性を行うが、２回目以降のＤＮＡ加熱変性は９４℃付近で１分間加熱することにより行う。以上の工程（２）〜（３）〜（４）のサイクルを１サイクルとし、該サイクルを２９回繰り返すが、最後のサイクルでは工程（３）を７２℃付近、７分間加熱した後、ＰＣＲを終了する。

上記加熱変性式ＰＣＲ法では、変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程のそれぞれの工程毎に温度が大きく異なるため、ＰＣＲ反応溶液の温度を昇降させる必要がある。通常、温度制御のために特殊な装置や容器を用いてＰＣＲを行っているが、高精度にＰＣＲ反応溶液の温度制御を行うことは、困難である場合が多い。特に、９０〜９８℃の変性作業と、５０〜７０℃のアニーリング作業は、連続工程であり、アニーリング温度がＰＣＲ反応溶液に正確に伝達すること、すなわち、ＰＣＲ反応溶液の熱追従性を保たせることは難しい。各工程における反応時間を延長することにより、ＰＣＲ反応溶液の熱追従性の問題は解決できるが、総反応時間が長くなることに加え、ＤＮＡポリメラーゼに過剰な熱が加わるため、効率のよいＰＣＲ増幅反応を維持できるサイクル数が抑えられる、という問題が生じる。さらに、高温条件下でＰＣＲを行うため、ＰＣＲ反応溶液の水分の蒸発制御が困難であるという問題もある。

また、アニーリング工程では、各プライマーに適したアニーリング温度にする必要があるため、アニーリング温度が異なる場合には、それぞれ別個にＰＣＲ増幅を行わなければならない。
その他、上記加熱変性式ＰＣＲ法では、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用するが、該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、通常高価であり、経済的にはあまり好ましくない。該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、非耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、校正機能が劣るため、フィデリティが低いという問題もある。

加熱変性式以外のＰＣＲ法として、化学変性式、特にアルカリ変性式のＰＣＲ法が提案されている。アルカリ変性式ＰＣＲ法では、上記加熱変性式ＰＣＲ法の（１）変性工程及び（２）アニーリング工程を、加熱ではなく、ＰＣＲ反応溶液のｐＨを変動させることにより行うものである。例えば、まず、（１）変性工程において、ＰＣＲ反応溶液をアルカリ性とする。二本鎖ＤＮＡは、ｐＨが１０以上の環境において解離し、一本鎖に変性するためである。該変性はアルカリ変性と呼ばれている。次に、（２）アニーリング工程において、ＰＣＲ反応溶液のｐＨを中性とする。ｐＨを中性域の７付近にすると、一本鎖ＤＮＡとプライマーをアニーリングさせることができるためである。さらに、（３）伸張工程において、ＤＮＡポリメラーゼを添加することにより、ＤＮＡ鎖を伸長させることができる。

上記アルカリ変性式ＰＣＲ法では、高温条件下でＰＣＲを行う必要がないため、温度制御と水分蒸発制御が簡便である。全工程を等温条件下で行うことができるため、温度制御のための特殊な装置等を必要としない。また、各プライマーに応じて反応条件を変更する必要がないため、いずれのプライマーを用いる場合であっても、同時にＰＣＲ増幅することが可能である。さらに、校正機能に優れたフィデリティが高いＤＮＡポリメラーゼを選択して使用することができる。

しかしながら、上記アルカリ変性式ＰＣＲ法では、各工程において、アルカリ変性液、中和液、及びＤＮＡポリメラーゼ溶液を添加する必要があるため、操作が煩雑となり、多種類のサンプルを同時にＰＣＲ増幅することは困難である。このような操作の煩雑さを回避するために、例えば、化学変性によりＤＮＡ断片の増幅反応を行わせるための所定の方向に延長される第１の流路と、アルカリ変性試薬溶液を供給するための所定の方向に延長される第二の流路と、中和反応試薬溶液を供給するための所定の方向に延長される第三の流路を有し、所定量のアルカリ変性試薬溶液を秤取するための複数本の第四の流路を有し、所定量の中和反応試薬溶液を秤取するための複数本の第五の流路を有し、該流路と前記第一の流路とを連通するこれらの流路よりも細い第六の流路を有し、かつ、前記第五の流路は該流路と前記第一の流路とを連通するこれらの流路よりも細い第七の流路を有することを特徴とする化学変性ＤＮＡ断片増幅装置が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
服巻保行、「ＰＣＲ法の原理と実際」、ＤＮＡ診断と疾患の分子生物学、実験医学、羊土社、１９９１年、第９巻１０号 ｐ２８〜３４ 特開２００５−６５０４号公報

微少容量でＰＣＲ増幅を行う場合には、加熱変性式ＰＣＲ法では、ＰＣＲ反応溶液の水分の蒸発制御が特に問題となる。元来、熱効率が良く、ＰＣＲ反応溶液の熱追従性を保つことができるため、反応溶液量が微少容量であることが、反応効率及び速度の観点から好ましい。しかしながら、反応溶液量が微少容量である場合には、極微少な水分の蒸発も、反応効率上無視できず、極めて反応効率が悪くなる。ＰＣＲ容器の蓋に熱を持たせる等により、水分の蒸発を抑える工夫は取られているが、十分ではなく、１０μＬ以下の反応溶液量で、精度の良いＰＣＲは困難である。水分蒸発を防止するために、鉱物性の油滴でＰＣＲ反応溶液を被覆する方法もあるが、一般に鉱物油には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性に対する阻害物質が含有されているため、ＰＣＲ反応溶液量が微少容量である場合には、鉱物油内の阻害物質の影響が大きく、好ましくない。さらに、ＰＣＲ後の鉱物油の処理も問題となる。

一方、上記アルカリ変性式ＰＣＲ法では、反応溶液量が微少容量である場合には、当然各工程において適宜添加される各溶液も微少容量となるため、添加した各溶液をＰＣＲ反応溶液中に均一に拡散させることが困難であり、ＰＣＲ反応溶液のｐＨ追従性や反応効率が劣るという問題があった。

本発明は、反応溶液量が微少容量である場合に、高精度かつ簡便にＰＣＲ増幅することを可能とする方法、該方法に用いられるＰＣＲ装置、及び、該方法に用いられるＰＣＲ用キットを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＰＣＲ反応溶液全体を、表面弾性波（Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｗａｖｅ、ＳＡＷ）処理等することにより、反応溶液量が微少容量であっても、等温条件下において、アルカリ変性式ＰＣＲ法により、簡便にＰＣＲ増幅を行うことが可能であることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、各工程を等温条件下において行うＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法であって、（ａ） 標的塩基配列を有する鋳型核酸と、前記標的塩基配列をＰＣＲ増幅するために用いられるプライマーからなるプライマーセットと、ＰＣＲに供されるヌクレオチドを有するＰＣＲ反応溶液を調製する工程と、（ｂ） ＰＣＲ反応溶液に、アルカリ変性液を添加して攪拌することにより、鋳型核酸を一本鎖に解離させる変性工程と、（ｃ） 工程（ｂ）により得られたＰＣＲ反応溶液に、中和液を添加して攪拌することにより、一本鎖の鋳型核酸とプライマーがアニーリング可能なｐＨに調整する中和工程と、（ｄ） 工程（ｃ）により得られたＰＣＲ反応溶液に、ＤＮＡポリメラーゼ溶液を添加して攪拌することにより、前記標的塩基配列をＰＣＲ増幅する増幅工程と、（ｅ） 前記工程（ｂ）〜（ｄ）を１回以上繰り返す工程と、を有し、かつ、前記攪拌が、表面弾性波（Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｗａｖｅ、ＳＡＷ）処理、超音波処理、及びピペッティングからなる群より選ばれる１以上であることを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ａ）において調製されたＰＣＲ反応溶液の容量が５μＬ以下であることを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記アルカリ変性液、前記中和液、及び前記ＤＮＡポリメラーゼ溶液の容量が０．１〜１．０μＬであることを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、湿度調整下において行うことを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記湿度調整により、ＰＣＲ反応溶液の容量を１５μＬ以下に保つことを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記湿度調整を、乾燥手段及び／又は湿潤手段を用いることによって行うことを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記アルカリ変性液のｐＨが１０以上であり、かつ、前記中和液のｐＨが３以下であることを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記アルカリ変性液が、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸水素２ナトリウム溶液、炭酸２水素ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、及び水酸化アンモニウム溶液からなる群より選ばれる１以上の溶液であり、かつ、前記中和液が、塩酸、酢酸、及びクエン酸からなる群より選ばれる１以上の溶液であることを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼが、耐アルカリ性ＤＮＡポリメラーゼ、非耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びストランド置換型ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記等温が、１０〜４２℃であることを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記プライマーセットが、標識されたプライマーを有するプライマーセットであることを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記プライマーセットが、鎖長が３〜６０塩基であるプライマーを有するプライマーセットであることを特徴とするＰＣＲ法を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載のＰＣＲ法に供されるＰＣＲ装置であって、反応基板設置部、液吐出手段、攪拌手段、湿度調整手段、湿度検出手段、及び恒温維持手段を有することを特徴とするＰＣＲ装置を提供するものである。
また、本発明は、前記攪拌手段が、ＳＡＷ発生器を用いる手段であることを特徴とするＰＣＲ装置を提供するものである。
また、本発明は、前記湿度調整手段が、乾燥手段及び／又は湿潤手段であることを特徴とするＰＣＲ装置を提供するものである。
また、本発明は、前記湿度調整手段が、ＰＣＲ反応溶液の容量を１５μＬ以下に保つ手段であることを特徴とするＰＣＲ装置を提供するものである。
また、本発明は、ＰＣＲに供されるヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ溶液、ＤＮＡポリメラーゼ用のバッファー、アルカリ変性液、及び中和液を有することを特徴とするＰＣＲ用キットを提供するものである。
また、本発明は、前記アルカリ変性液が、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸水素２ナトリウム溶液、炭酸２水素ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、及び水酸化アンモニウム溶液からなる群より選ばれる１以上の溶液であり、かつ、前記中和液が、塩酸、酢酸、及びクエン酸からなる群より選ばれる１以上の溶液であることを特徴とするＰＣＲ用キットを提供するものである。

本発明のＰＣＲ法を用いることにより、反応溶液量が５μＬ以下の微少容量であっても、簡便にｐＨ追従性を保つことができるため、反応効率よく、アルカリ変性式のＰＣＲ増幅を行うことが可能となる。また、等温条件下でＰＣＲを行うことができるため、温度制御と水分蒸発制御が簡便であることに加え、校正機能に優れたＤＮＡポリメラーゼを用いることができるため、より高精度にＰＣＲ増幅することが可能となる。
また、本発明のＰＣＲ装置やＰＣＲ用キットを用いることにより、反応溶液量が微少容量であっても、多くのＤＮＡサンプルを、簡便かつ効率よく、ＰＣＲ増幅することが可能となる。

本発明において、等温条件下とは、ＰＣＲ反応溶液を含有するＰＣＲ反応用容器が設置されている環境の温度が各工程において一定となるように制御されている条件下を意味し、ＰＣＲ反応溶液自体の温度が厳密に一定である必要はない。該環境とは、例えば、ＰＣＲ装置内の、該ＰＣＲ反応用容器が設置されている部位等をいう。該等温は、温度が一定である限り、特に限定されるものではなく、使用するＤＮＡポリメラーゼの至適温度等を考慮して、適宜設定することができる。校正機能に優れたＤＮＡポリメラーゼの至適温度は通常、あまり高温ではないため、１０〜４２℃であることが好ましい。

本発明における標的塩基配列とは、ＰＣＲにより増幅することを目的とする塩基配列を意味する。該標的塩基配列は、遺伝子上に存在する特定の領域の塩基配列であって、ＰＣＲが可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列等がある。

本発明における鋳型核酸とは、塩基配列中に標的塩基配列を含有しており、かつ、ＰＣＲにおいて鋳型として機能する核酸であれば、特に限定されるものではない。天然由来のものであってもよく、合成されたものであってもよい。また、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。

本発明のＰＣＲ法では、まず、工程（a）として、標的塩基配列を有する鋳型核酸と、該標的塩基配列をＰＣＲ増幅するために用いられるプライマーからなるプライマーセットと、ＰＣＲに供されるヌクレオチドを有するＰＣＲ反応溶液を調製する。本発明は、反応溶液量が微少容量であっても、高精度かつ簡便に標的塩基配列を増幅できるＰＣＲ法を提供することを目的とするため、工程（ａ）において調製されたＰＣＲ反応溶液の容量が５μＬ以下であることが好ましい。

該ＰＣＲ反応溶液の組成やｐＨ等、及び、は、鋳型核酸、各プライマー、及びヌクレオチドの濃度は、使用するＤＮＡポリメラーゼの至適反応条件等を考慮して、適宜設定することができる。該ヌクレオチドは、通常ＰＣＲにおいて用いられるヌクレオチドであれば、特に限定されるものではない。

次に、工程（ｂ）として、ＰＣＲ反応溶液に、アルカリ変性液を添加して攪拌することにより、鋳型核酸を一本鎖に解離させる。攪拌時間は、ＰＣＲ反応溶液の粘度や容量により、適宜設定することができる。確実に、鋳型核酸を一本鎖に解離させるために、該攪拌後、工程（ｃ）に移行する前に、一定時間放置することが好ましい。放置時間は、鋳型核酸の長さ等を考慮して、適宜設定することができる。

該アルカリ変性液は、中和作用によってアルカリ性が失われるアルカリ性溶液であれば、特に限定されるものではないが、ｐＨが１０以上であることが好ましい。該アルカリ変性液として、例えば、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸水素２ナトリウム溶液、炭酸２水素ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、及び水酸化アンモニウム溶液等がある。

次に、工程（ｃ）として、工程（ｂ）により得られたＰＣＲ反応溶液に、中和液を添加して攪拌することにより、一本鎖の鋳型核酸とプライマーがアニーリング可能なｐＨに調整する。攪拌時間は、ＰＣＲ反応溶液の粘度や容量により、適宜設定することができる。確実に、鋳型核酸とプライマーをアニーリングさせるために、該攪拌後、工程（ｄ）に移行する前に、一定時間放置することが好ましい。放置時間は、プライマーのＴｍ値等を考慮して、適宜設定することができる。

該中和液は、ＰＣＲ反応溶液のｐＨを６．５〜８．０の中性付近にすることができる溶液であれば、特に限定されるものではないが、ｐＨが３以下である高酸性溶液であることが好ましい。該中和液として、例えば、塩酸、酢酸、及びクエン酸等がある。

次に、工程（ｄ）として、工程（ｃ）により得られたＰＣＲ反応溶液に、ＤＮＡポリメラーゼ溶液を添加して攪拌することにより、前記標的塩基配列をＰＣＲ増幅する。攪拌時間は、ＰＣＲ反応溶液の粘度や容量により、適宜設定することができる。確実に、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ鎖を伸長させるために、該攪拌後、一定時間放置することが好ましい。放置時間は、ＤＮＡポリメラーゼの伸長活性や標的塩基配列の長さ等を考慮して、適宜設定することができる。

該ＤＮＡポリメラーゼは、伸長活性を有するＤＮＡポリメラーゼであれば、特に限定されるものではなく、通常生化学的若しくは分子生物学的実験において使用される酵素を用いることができる。該ＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、耐アルカリ性ＤＮＡポリメラーゼ、非耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びストランド置換型ＤＮＡポリメラーゼ等がある。ＰＣＲ増幅の精度が良いため、校正機能を有するＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。また、本発明のＰＣＲ法では、中和反応が繰り返されることにより、ＰＣＲ反応溶液中の塩濃度が高くなるおそれがあるため、耐塩性のＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ溶液には通常グリセロールが含有されており、該ＤＮＡポリメラーゼ溶液を複数回添加することにより、ＰＣＲ反応溶液中のグリセロール濃度が高くなるおそれがあるため、耐グリセロール性のＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。
その他、耐アルカリ性と耐塩性の双方を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、最初の工程（ｄ）において、１度だけ該ＤＮＡポリメラーゼ溶液を添加することにより、その後繰り返される工程（ｄ）において、該ＤＮＡポリメラーゼ溶液を添加しなくてもＰＣＲ増幅し得るため、操作の簡便性及び経済性の点から好ましい。

次に、工程（ｅ）として、前記工程（ｂ）〜（ｄ）を１回以上繰り返すことにより、標的塩基配列をＰＣＲ増幅することができる。前記工程（ｂ）〜（ｄ）の繰り返しの回数は、所望の標的塩基配列の量を考慮して、適宜設定することができる。

前記工程（ｂ）〜（ｄ）における攪拌操作は、ＳＡＷ処理、超音波処理、及びピペッティングからなる群より選ばれる１以上であることが好ましい。各工程において添加される各溶液をＰＣＲ反応溶液中に均一に拡散させることができるためである。該ピペッティングには、ピペットやピペットマン等を用いた操作に加え、分注機を用いて排出と吸引を繰り返す操作も含まれる。但し、ピペッティングにより攪拌する場合には、ピペッティングを行う度に、ピペットや先端のチップ等にＰＣＲ反応溶液が付着するため、コンタミネーションを避けるために使い捨てのチップ等を用いることが好ましい。

該攪拌は、ＳＡＷ処理や超音波処理であることが、さらに好ましい。ＰＣＲ反応溶液全体を攪拌するため、ＰＣＲ反応溶液が微少容量である場合であっても、簡便かつ効果的に攪拌することが可能であるためである。また、ＰＣＲ反応溶液に直接接する必要がないため、ＰＣＲ反応溶液を損失するおそれが少ないためである。特に、ＳＡＷ処理であることが好ましい。反応を阻害するおそれのある熱や、ＰＣＲ反応溶液の相互汚染を引き起こすおそれのあるミストを発生させることなく攪拌することができるためである。なお、ＳＡＷ処理とは、表面弾性波流動を利用して液体を能動的に混合或いは攪拌する処理である（ 例えば、特開２００５−２５４１１２号公報参照）。

前記工程（ｂ）〜（ｄ）において添加されるアルカリ変性液、中和液、及びＤＮＡポリメラーゼ溶液の容量が多い場合には、各工程を繰り返す度にＰＣＲ反応溶液の容量が増大するため、ＰＣＲの反応条件が変動し、好ましくない。また、微少容量のＰＣＲ反応用容器を用いる場合には、該ＰＣＲ反応用容器からＰＣＲ反応溶液が溢れるおそれがあり、好ましくない。水分の蒸発量とのバランスがとり易いため、各工程において添加される各溶液の容量が０．１〜１．０μＬであることが好ましい。
また、各工程における、ＰＣＲ反応溶液への各溶液の添加は、汎用されている８連又は１２連のマルチチャンネルピペットを用いて行ってもよく、市販の分注機を用いて行ってもよい。

本発明のＰＣＲ法においては、ＰＣＲ反応溶液の容量を適切に維持するために、湿度調整下において行うことが好ましい。該湿度調整のための手段は、特に限定されるものではなく、例えば、乾燥手段や湿潤手段を用いることによって行うことができる。該乾燥手段として、例えば、送風や除湿剤の添加等がある。該湿潤手段として、例えば、水の添加や水蒸気の充填等がある。ＰＣＲの反応条件の変動等を防止するために、該湿度調整により、ＰＣＲ反応溶液の容量を１５μＬ以下に保つことが好ましい。乾燥がひどい場合には、ＰＣＲ反応溶液の塩濃度が高くなりすぎる結果、ＰＣＲを阻害する可能性があるため、水の添加等により、ＰＣＲ反応溶液を希釈することが好ましい。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合には、温度が高いため、特に注意が必要である。

本発明において用いられるプライマーセットを構成するプライマーは、標的塩基配列をＰＣＲ増幅することができるように、標的塩基配列に応じて、常法により設計することができる。また、プライマーのＴｍ値と、使用するＤＮＡポリメラーゼの至適温度の兼ね合いの点から、本発明において用いられるプライマーセットは、鎖長が３〜６０塩基であるプライマーを有するプライマーセットであることが好ましい。

ＰＣＲ増幅した標的塩基配列を有する核酸の検出及び解析の点から、該プライマーセットは、標識されたプライマーを有するプライマーセットであることが好ましい。プライマーの標識に用いられる物質は、核酸の標識に用いることができ、かつ、本発明のＰＣＲ法を阻害しない物質であれば、特に限定されるものではない。該標識に用いられる物質として、例えば、フルオレセイン等の蛍光物質やジゴキシゲニン(ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ)等がある。該標識は、プライマーの５’末端にあってもよく、プライマーの塩基鎖の途中にあってもよい。

本発明のＰＣＲ法は、疎水性領域に囲まれた微小親水性領域を有する反応基板を用いて行ってもよい。該反応基板を用いることにより、ＰＣＲ反応溶液は表面張力により一定の形状に保たれるため、溢れる等により、反応基板上の他のＰＣＲ反応溶液と交じり合うおそれが低くなるためである。該反応基板の材質は、剛性を維持できるものであれば、特に限定されるものではなく、プラスチック、ガラス、金属等であってもよい。該反応基板は、例えば、ガラス基板に疎水性塗料等の疎水性固着物質を用いて、円形の線を描いたものでも良い。その他、ＰＣＲ反応用容器となり得る凹穴を反応基板上に設けたものであってもよい。

図１は、該反応基板の一態様を表したものである。図中の１は反応基板を、２は微小親水性領域を、３は疎水性領域をそれぞれ示している。反応基板１は微小親水性領域２を１以上有するものであればよいが、多種類のＰＣＲを同時に行うことができるため、該微小親水性領域２は複数あることが好ましい。該微小親水性領域２の形状は、特に限定されないが、面積は、ＰＣＲ反応溶液の容量に影響するため、所望の容量に適した面積にすることが好ましい。また、該微小親水性領域２は、グリッド状や千鳥格子状に配置することが好ましい。マルチチャンネルピペットや分注機の使用に適しているため、及び、視認性に優れているためである。

本発明のＰＣＲ装置は、本発明のＰＣＲ法に供されるＰＣＲ装置であって、反応基板設置部、液吐出手段、攪拌手段、湿度調整手段、湿度検出手段、及び恒温維持手段を有することを特徴とする。該攪拌手段はＳＡＷ発生器を用いる手段であることが好ましく、該湿度調整手段は乾燥手段や湿潤手段であることが好ましい。該恒温維持手段は市販されている恒温装置等を用いることができる。また、該湿度検出手段は、汎用されている湿度計等を用いることができる。

該液吐出手段は、０．１〜１．０μＬの液量を吐出することができる手段であれば、特に限定されるものではなく、市販の分注機等を用いることができる。液の吐出方法として、例えば、ＰＣＲ反応溶液に触れずにジェット状に噴出する方法や、チップ等を用いて、ＰＣＲ反応溶液に直接注入する方法等がある。チップ等を用いる場合には、ＰＣＲ反応溶液の相互混合を防止するために、使い捨てのチップ等を用いることが好ましい。

図２は、該ＰＣＲ装置の一態様を表したものである。図２−（ａ）が該一態様の平面図であり、図２−（ｂ）が側面図である。図中の４は湿度調整器を、５は反応基板の設置部位を、６は反応基板を、７は分注機を、８は分注ノズル群を、９はＳＡＷ発生装置を、１０は装置恒温保湿維持カバーをそれぞれ示している。装置内の温度を等温に保ち、かつ湿度を効果的に調製するために、該ＰＣＲ装置の全体を、装置恒温保湿維持カバーで覆うことが好ましい。また、反応基板６は、複数個設置されていてもよい。

本発明のＰＣＲ用キットは、ＰＣＲに供されるヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ溶液、ＤＮＡポリメラーゼ用のバッファー、アルカリ変性液、及び中和液を有することを特徴とするＰＣＲ用キットである。該アルカリ変性液は、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸水素２ナトリウム溶液、炭酸２水素ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、及び水酸化アンモニウム溶液からなる群より選ばれる１以上の溶液であることが好ましく、該中和液は、塩酸、酢酸、及びクエン酸からなる群より選ばれる１以上の溶液であることが好ましい。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

配列番号１の塩基配列を有するＳＤプライマーと、配列番号２の塩基配列を有するｒＥＤプライマーとからなるプライマーセットと、配列番号３の塩基配列を有する標的塩基配列からなる鋳型核酸を用いて、室温にてＰＣＲを行った。該鋳型核酸は、５’末端にＳＤプライマーの塩基配列を、３’末端にｒＥＤプライマーと相補的な塩基配列を、それぞれ有するように合成した、６９ｂｐの核酸である。ＰＣＲに供されるヌクレオチドとしてｄＮＴＰ ｍｉｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、アルカリ変性液として０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬社製）を、中和液として０．１Ｎ塩酸（ナカライテスク社製）を、ＤＮＡポリメラーゼ溶液としてＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＴａＫａＲａ社製）を、それぞれ用いた。ＰＣＲ反応溶液の調製には、１０×Ｂｕｆｆｅｒ（７０ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を用いた。また、疎水性領域に囲まれた微小親水性領域を有する反応基板としてアンプリグリッド（Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製）を、ＳＡＷ発生器としてプレートブースター（Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製）を、それぞれ用いた。

具体的には、まず、工程（ａ）として、０．５μＬの１０×Ｂｕｆｆｅｒに、鋳型核酸とｄＮＴＰ ｍｉｘが、最終濃度が０．２ｍＭとなるようにそれぞれ添加し、ＳＤプライマーとｒＥＤプライマーが、最終濃度が０．２ｍＭとなるようにそれぞれ添加し、最終的に５μＬとなるように、ＰＣＲ反応溶液を調製した。

次に、工程（ｂ）として、調製したＰＣＲ反応溶液に、０．７μＬの０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加し、プレートブースターを用いて、８２ＭＨｚで３５ｄＢｍのパワーで１５秒間ＳＡＷ処理をした後、工程（ｃ）として、該ＰＣＲ反応溶液に、０．５μＬの０．１Ｎ塩酸を添加し、８２ＭＨｚで３５ｄＢｍのパワーで１５秒間ＳＡＷ処理をした。さらに、工程（ｄ）として、該ＰＣＲ反応溶液に、０．１Ｕ／μＬのＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを０．５μＬ添加し、８２ＭＨｚで３５ｄＢｍのパワーで１５秒間ＳＡＷ処理をした。

次に、工程（ｂ）として、該ＰＣＲ反応溶液に、０．５μＬの０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加する以外は、全て前記と同様にして、工程（ｂ）〜（ｄ）を１６回繰り返すことにより、ＰＣＲ増幅を行った。

ＰＣＲ増幅後のＰＣＲ反応溶液をＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてバンドパターンを確認した。該バンドパターンを図３に示す。レーン１は塩基対長マーカーを、レーン２は０．１ｐｍｏｌの鋳型核酸を、レーン３は１ｐｍｏｌの鋳型核酸を、レーン４はＰＣＲ増幅前のＰＣＲ反応溶液を、レーン５は工程（ｂ）〜（ｄ）を１サイクルとした場合の１サイクル増幅後のＰＣＲ反応溶液を、レーン６は１５サイクル増幅後のＰＣＲ反応溶液を、それぞれ泳動したものである。矢印アが、６９ｂｐの標的塩基配列を有する核酸のバンドを示している。矢印イ及びウは、マーカーのバンドを示している。１サイクル増幅後のＰＣＲ反応溶液では、ＰＣＲ増幅された鋳型核酸はＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲでは検出できなかったが、１５サイクル増幅後のＰＣＲ反応溶液では、約０．２ｐｍｏｌのＰＣＲ増幅された鋳型核酸が検出された。

図３の結果から明らかであるように、本発明のＰＣＲ法を用いることにより、煩雑かつ困難な温度制御をすることなく、ＰＣＲ反応溶液が５μＬという微少容量であっても、簡便にＰＣＲ増幅を行うことができる。

本発明のＰＣＲ法、ＰＣＲ装置、又はＰＣＲ用キットを用いることにより、ＰＣＲ反応溶液量が微少容量である場合であっても、高精度かつ簡便にＰＣＲ増幅することができるため、被分析サンプルが微量である遺伝子解析等の分野で利用が可能である。特に、ＰＣＲ装置又はＰＣＲ用キットを用いることにより、多種類の微量サンプルを迅速かつ簡便にＰＣＲ増幅することができるため、ＳＮＰタイピングや遺伝子発現量の比較等の分野で利用が可能である。

本発明のＰＣＲ法及びＰＣＲ装置において用いられる、疎水性領域に囲まれた微小親水性領域を有する反応基板の一態様を示した概略図である。 本発明のＰＣＲ装置の一態様を示した概略図である。（ａ）が該一態様の平面図であり、（ｂ）が側面図である。該一態様では、液吐出手段として分注ノズル群８を有する分注機７を、攪拌手段としてＳＡＷ発生装置９を、恒温維持手段として装置恒温保湿維持カバー１０を、それぞれ用いている。 実施例１において、ＰＣＲ増幅後のＰＣＲ反応溶液をＢＩＯＡＮＡＬＹＺＥＲで確認したバンドパターンを示したものである。矢印アが標的塩基配列を有する核酸のバンドを、矢印イ及びウはマーカーのバンドを、それぞれ示している。レーン１は塩基対長マーカーを、レーン２は０．１ｐｍｏｌの鋳型核酸を、レーン３は１ｐｍｏｌの鋳型核酸を、レーン４はＰＣＲ増幅前のＰＣＲ反応溶液を、レーン５は工程（ｂ）〜（ｄ）を１サイクルとした場合の１サイクル増幅後のＰＣＲ反応溶液を、レーン６は１５サイクル増幅後のＰＣＲ反応溶液を、それぞれ泳動したものである。

符号の説明

１…反応基板、２…微小親水性領域、３…疎水性領域、４…湿度調整器、５…反応基板の設置部位、６…反応基板、７…分注機、８…分注ノズル群、９…ＳＡＷ発生装置、１０…装置恒温保湿維持カバー

Claims (18)

1. 各工程を等温条件下において行うＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法であって、
   （ａ） 標的塩基配列を有する鋳型核酸と、前記標的塩基配列をＰＣＲ増幅するために用いられるプライマーからなるプライマーセットと、ＰＣＲに供されるヌクレオチドを有するＰＣＲ反応溶液を調製する工程と、
   （ｂ） ＰＣＲ反応溶液に、アルカリ変性液を添加して攪拌することにより、鋳型核酸を一本鎖に解離させる変性工程と、
   （ｃ） 工程（ｂ）により得られたＰＣＲ反応溶液に、中和液を添加して攪拌することにより、一本鎖の鋳型核酸とプライマーがアニーリング可能なｐＨに調整する中和工程と、
   （ｄ） 工程（ｃ）により得られたＰＣＲ反応溶液に、ＤＮＡポリメラーゼ溶液を添加して攪拌することにより、前記標的塩基配列をＰＣＲ増幅する増幅工程と、
   （ｅ） 前記工程（ｂ）〜（ｄ）を１回以上繰り返す工程と、
   を有し、かつ、
   前記攪拌が、表面弾性波（Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｏｕｓｔｉｃ Ｗａｖｅ、ＳＡＷ）処理、超音波処理、及びピペッティングからなる群より選ばれる１以上であることを特徴とするＰＣＲ法。
2. 前記工程（ａ）において調製されたＰＣＲ反応溶液の容量が５μＬ以下であることを特徴とする請求項１記載のＰＣＲ法。
3. 前記アルカリ変性液、前記中和液、及び前記ＤＮＡポリメラーゼ溶液の容量が０．１〜１．０μＬであることを特徴とする請求項１又は２記載のＰＣＲ法。
4. 湿度調整下において行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のＰＣＲ法。
5. 前記湿度調整により、ＰＣＲ反応溶液の容量を１５μＬ以下に保つことを特徴とする請求項４記載のＰＣＲ法。
6. 前記湿度調整を、乾燥手段及び／又は湿潤手段を用いることによって行うことを特徴とする請求項４又は５記載のＰＣＲ法。
7. 前記アルカリ変性液のｐＨが１０以上であり、かつ、前記中和液のｐＨが３以下であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のＰＣＲ法。
8. 前記アルカリ変性液が、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸水素２ナトリウム溶液、炭酸２水素ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、及び水酸化アンモニウム溶液からなる群より選ばれる１以上の溶液であり、かつ、前記中和液が、塩酸、酢酸、及びクエン酸からなる群より選ばれる１以上の溶液であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のＰＣＲ法。
9. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、耐アルカリ性ＤＮＡポリメラーゼ、非耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びストランド置換型ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選ばれるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載のＰＣＲ法。
10. 前記等温が、１０〜４２℃であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載のＰＣＲ法。
11. 前記プライマーセットが、標識されたプライマーを有するプライマーセットであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載のＰＣＲ法。
12. 前記プライマーセットが、鎖長が３〜６０塩基であるプライマーを有するプライマーセットであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載のＰＣＲ法。
13. 請求項１〜１２のいずれか記載のＰＣＲ法に供されるＰＣＲ装置であって、反応基板設置部、液吐出手段、攪拌手段、湿度調整手段、湿度検出手段、及び恒温維持手段を有することを特徴とするＰＣＲ装置。
14. 前記攪拌手段が、ＳＡＷ発生器を用いる手段であることを特徴とする請求項１３記載のＰＣＲ装置。
15. 前記湿度調整手段が、乾燥手段及び／又は湿潤手段であることを特徴とする請求項１３又は１４記載のＰＣＲ装置。
16. 前記湿度調整手段が、ＰＣＲ反応溶液の容量を１５μＬ以下に保つ手段であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか記載のＰＣＲ装置。
17. ＰＣＲに供されるヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ溶液、ＤＮＡポリメラーゼ用のバッファー、アルカリ変性液、及び中和液を有することを特徴とするＰＣＲ用キット。
18. 前記アルカリ変性液が、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸水素２ナトリウム溶液、炭酸２水素ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、及び水酸化アンモニウム溶液からなる群より選ばれる１以上の溶液であり、かつ、前記中和液が、塩酸、酢酸、及びクエン酸からなる群より選ばれる１以上の溶液であることを特徴とする請求項１７記載のＰＣＲ用キット。

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