KR20010095747A

KR20010095747A - 돌연변이 신규 확인방법

Info

Publication number: KR20010095747A
Application number: KR1020000019071A
Authority: KR
Inventors: 박준수
Original assignee: 송광헌
Priority date: 2000-04-11
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2001-11-07

Abstract

본 발명은 유전자에서 특정 돌연변이를 확인하는 신규한 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 돌연변이 유무를 검사할 유전자 주형(template)에 상응하고 3' 말단의 염기가 각각 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T)을 가지며, 이들 프라이머(primer)의 길이를 달리하여 Taq효소를 이용하여 DNA합성후 얻은 단일가닥 DNA(single strand DNA)의 길이 차이를 확인함으로써, 그 부분만의 염기서열을 확인하고, 돌연변이 유무를 알아내는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 종래의 방법에 비해 간단하고 정확하게 돌연변이 유무와 종류를 확인할 수 있는 장점이 있다.

Description

돌연변이 신규 확인방법{New method for identifying mutant DNA}

본 발명은 유전자에서 특정 돌연변이를 확인하는 신규한 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 돌연변이 유무를 검사할 유전자 주형(template)에 상응하고 3' 말단의 염기가 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T)을 가지며, 길이가 서로 다른 프라이머(primer)를 Taq 효소를 이용하여 DNA 합성시켜 얻은 중합 산물의 길이 차이를 확인하므로써 돌연변이 유무를 확인하는 방법에 관한 것이다.

유전자에서 돌연변이를 찾아내는 것은 매우 중요한 일이다. 상업적으로는 유전자의 돌연변이가 질병으로 이어질 경우, 사람에게서 돌연변이를 찾아내서 의학적인 진단을 하는 데 사용할 수 있으며, 이는 암의 진단에서 특히 유용하게 사용될 수 있다. 그러나 유전자에서 돌연변이를 찾아내는 것은 매우 시간이 많이 들고, 비용이 많이 드는 일이다. 따라서 돌연변이를 적은 비용에 빠르게 검사할 수 있는 방법의 개발이 필요하고, 이에 부응해서 상당수의 돌연변이 검사방법이 개발되었다.

유전자에서 돌연변이를 찾아내는 방식에는 두종류가 있다. 첫째로 돌연변이가 일어나는 위치가 어디인지 모르는 상황에서 돌연변이를 찾아내는 방법으로, SSCP(single strand conformation polymorphism)와 DNA 시퀀싱(sequencing)이 대표적인 방법이다. 두번째로 특정부위의 돌연변이만을 찾아내는 방법으로, DNA칩(chip)이나 PASA(PCR amplificaton of specifc allele)와 같은 방법을 들 수 있다. 두번째의 방법은 질병과 관련된 돌연변이가 이미 알려져 있는 유전자의 검사에 유용한데, SSCP나 DNA 시퀀싱에 비해서 매우 빠르고 비용이 적게드는 방법이다. 그러나, DNA칩과 같은 방법은 한번에 많은 양의 돌연변이를 검사할 수는 있지만, 단일 가닥(single strand) DNA간의 하이브리드(hybrid)를 그 원리로 하고 있기 때문에, 정확도가 높지 않아서 아직 임상에서 쓰기는 어려운 실정이고, PASA는 검사해야 할 돌연변이수가 많은 유전자에는 적용하기 어려운 단점이 있다.

따라서, 여러 돌연변이 위치가 있는 유전자에서 돌연변이를 정확하게 검사하는 방법의 개발이 필요한 실정이다.

따라서, 본 발명은 종래 기술의 이러한 문제점을 일거에 해결할 수 있는 새로운 개념의 돌연변이 확인 방법을 제시하고자 하는 것이다. 즉, 본 발명에서는 돌연변이를 확인하는 방법에 있어서, 특정 위치의 돌연변이 여부를 정확하게 확인하고 돌연변이수가 많은 유전자도 확인할 수 있는 새로운 개념의 돌연변이 확인방법(이하에서는 이를 "NMD(kNown Mutations Detection)법"이라 한다)를 사용하고 있다.

본 발명의 NMD법이란, 유전자에서 특정 돌연변이를 확인하는 방법으로서, 더욱 구체적으로는 돌연변이 유무를 검사할 유전자 주형(template)에 상응하고 3' 말단의 염기가 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T)을 가지며, 길이가 서로 다른 프라이머(primer)를 Taq 효소를 이용하여 DNA 합성시켜 얻은 중합 산물의 길이 차이를 확인하므로써 돌연변이 유무를 확인하고 염기서열을 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 NMD법을 가능하게 하는 것은, PCR에 이용되는 Taq 효소에 3'→5' 절단효소(exonuclease) 기능이 없는 것에 기인한다. Taq 효소는 하기 그림에서 보는 바와 같이, DNA 주형에 붙은 프라이머의 3' 말단에서부터 DNA를 합성하게 되는데, 3' 말단이 주형과 상보적으로 결합하고 있는 경우에는 계속적으로 DNA 합성이 이루어지지만, 3' 말단이 상보적인 결합을 이루지 않는 경우에는 DNA 합성이 멈추게 된다.

일반적으로 생체내의 DNA 중합효소는 상기와 같이 3' 말단이 상호적인 결합을 이루지 않는 경우에 그 끝을 잘라버린 후 새로이 중합을 시작하지만, Taq 효소에는 이러한 기능이 결핍되어 있으므로, 3' 말단의 상보적 결합 유무에 따라서 DNA 합성 유무가 결정되게 된다. Taq 효소의 이러한 특성은 PASA법에 쓰이고 있다.

본 발명의 NMD법도 Taq 효소의 이러한 특성을 이용하고 있다. 구체적으로는, 검사하려고 하는 유전자의 염기서열 중 일반적으로 돌연변이 가능성이 있다고 인식되고 있는 특정 위치의 염기나 또는 그러한 인식이 되어 있지 않다 하더라도 새로이 돌연변이의 유무를 확인하려고 하는 특정위치의 염기(하기 그림에서는 "G" 염기를 말함)를 가진 DNA 주형과 5' 말단 쪽으로는 상보적인 결합을 하지만 상기 특정위치의 염기(하기 그림에서는 주형의 3' 말단에서 "G"인 위치의 염기에 상응하는 위치의 염기를 말함)가 각각 서로 다르고(하기 그림에서는 "A", "T", "G", "C" 염기를 말함) 각각의 길이가 서로 다른 프라이머(하기 그림에서는 3' 말단이 "A" 염기인 프라이머가 가장 길고 3' 말단이 "C" 염기인 프라이머가 가장 짧음)를 Taq 효소에 의해 DNA 중합을 하게 되면, 정상적인 DNA 주형의 경우 특정 위치의 염기가 "G"이므로 3' 말단의 염기가 "C"이고 전체적인 길이가 가장 짧은 프라이머가 계속적으로 중합을 하게 되며, 돌연변이의 경우(정상적인 DNA 주형의 "G"가 "T"로 바뀐 돌연변이 DNA 주형의 경우)에는 3' 말단이 "A"이고 전체적인 길이가 가장 긴 프라이머가 계속적으로 중합을 하게 된다.

결국, 최종적으로 얻어진 중합산물들의 길이를 비교함으로써 특정 위치의 염기가 돌연변이 되었는지 여부와 함께 그러한 돌연변이의 종류를 정확하게 판단할 수 있다.

그러한 구체적인 예를 그림을 통해 설명하면 하기와 같다.

우선, 염기서열이 알려져 있는 DNA 주형 중 돌연변이 유무를 확인하고자 하는 위치의 염기를 특정한다. 상기에서는 이를 대문자 "G"로 표시한 염기의 돌연변이 유무를 확인하고자 한다.

다음 단계로, 5' 말단 방향으로 상보적인 결합을 할 수 있고 상기 "G"에 상응하는 위치에서 염기가 서로 다르며, 5' 말단의 길이가 다른 4개의 프라이머를 제작한다. 상기에서는 273-2C, 273-2G, 273-2T, 273-2A 프라이머를 제조한다.

주형은 PCR법 등을 사용하여 일정한 길이의 DNA를 다량으로 증폭한 것을 사용한다.

상기 주형과 4 종류의 프라이머를 포함하는 조건에 Taq 효소를 첨가하여 DNA중합을 실행하여 얻어진 중합산물을 시퀀싱 겔(sequencing gel)에서 명확하게 돌연변이의 유무를 확인한다.

시퀀싱 겔을 통해 얻어진 분석 결과는 하기와 같은 내용으로 확인된다. 즉, 정상 DNA 주형의 경우에는 3' 말단이 C이고 길이가 가장 짧은 273-2C 프라이머가 DNA 중합된 산물이 다량 검출되고, 돌연변이 DNA 주형의 경우에는 3' 말단이 A이고 길이가 가장 긴 273-2A 프라이머가 DNA 중합된 산물이 다량 검출된다.

DNA 중합산물의 검출방법은 어떠한 프라이머가 중합에 참여했는지를 확인할 수 있다면 방법에 별도의 제한이 없다.

경우에 따라서는, 돌연변이가 일어날 가능성이 있는 2 이상의 염기의 위치별로 상기와 같은 방법으로 각각 4종류의 프라이머를 제작하여 한꺼번에 중합반응시키고 시퀀싱 겔 등에서 한꺼번에 분석을 할 경우, 유전자내에 존재하는 2 이상의 돌연변이를 한번의 중합반응 및 검출 방법에 의해 다수 위치의 돌연변이 여부와 돌연변이의 종류를 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에 의해 실행한 중합 산물의 시퀀싱 겔 분석법의 결과를 예시하면 다음 그림과 같이 나타날 수 있다.

즉, 각각의 돌연변이별로 프라이머를 제작하여 중합반응을 시킨 후, 반응액을 모아서 시퀀싱 겔과 같은 긴 겔에 런닝(running)할 경우, 돌연변이 위치 별로 돌연변이 유무를 판단할 수0 있으며, 돌연변이시 정상 샘플과 비교해서 밴드 전이(band shift)가 나타난 것을 통해, 그 돌연변이 유무를 확인할 수 있게 된다.

본 발명의 NMD는 여러가지 장점을 가지고 있는 데, 이들을 기존의 돌연변이 검사법과 비교해 보면 다음과 같다.

우선 간단하다는 것을 들 수 있는데, DNA칩과 같이 복잡한 칩 제조장치나 판독기(reader) 등이 필요없이 일반 실험실에서 사용하는 도구들만으로 NMD를 바로 실행할 수 있다. 또한, PASA와 같은 경우 하나의 돌연변이 지점(mutation hot spot)이 있을 경우 4개의 PCR 튜브에서 각각 PCR법을 실행해 4개의 레인에서 런닝(running)을 해야만 그 위치의 돌연변이가 무엇으로 바뀌었는지 확인할 수 있는 반면에, NMD법은 4종류의 프라이머를 하나의 튜브에 넣고 반응을 시키고, 또 여러 돌연변이 지점의 검사를 하나의 시퀀싱 겔 등에서 확인할 수 있다. 실제적으로 계산해서, 20개의 돌연변이 지점을 PASA법으로 검사해서 서열를 확인하는 경우 PASA법은 80(20×4)개의 PCR 반응을 시켜서 80개 레인에서 결과를 확인해야 하는 반면에, 본 발명의 NMD법은 20개의 반응으로 하나의 레인에서 비교군과 분석을 통해서 돌연변이 유무를 확인할 수 있게 된다.

다음은 정확성을 들 수 있는데, DNA칩은 하이브리드를 기반으로 하므로 정확성이 떨어지고, PASA법은 오염이 일어날 경우 잘못된 검출 신호(false positive signal)가 나타나게 되는데, 이는 PCR법을 기반으로 하기 때문에 작은 오염조차도 증폭되어 나타나게 되므로 결과를 확인하는 데 문제가 될 수 있다. 그러나, 본 발명의 NMD법은 결과를 확인하는 데 있어서 단일 가닥 프라이머 연장(single strand primer extension)을 기본으로 하기 때문에, 오염된 부분이 증폭되는 일은 발생하지 않게 된다. 따라서 PASA법보다 좀더 명확하게 구분하게 된다.

다음으로 새로운 돌연변이가 발견되어 이를 검사에 넣을 경우, DNA칩은 새로운 칩을 처음부터 다시 만들어야 하는 단점이 있으나, 본 발명의 NMD법의 경우 PCR프라이머를 새로 추가해서 반응을 시킴으로써 바로 검사에 추가할 수 있는 장점이 있다.

결론적으로, NMD를 이용해서 유전자 돌연변이검사를 할 경우, 기존의 방법보다, 적은 비용을 들이고, 좀더 쉬운 방법으로 여러 부분의 돌연변이 위치를 정확하게 검사할 수 있게 된다.

Claims

돌연변이 유무를 검사할 유전자 주형(template)에 상응하고 돌연변이 가능성이 높은 3' 말단의 염기만이 각각 다르며 전체 유전자 길이가 다른 적어도 둘 이상의 유전자 프라이머(primer)를 상기 유전자 주형에 대해 Taq 효소를 이용하여 DNA중합하여 얻어진 중합 산물에서 프라이머의 길이를 확인하므로써 특정 위치의 돌연변이 유무를 확인하는 돌연변이 확인방법.
제 1항에 있어서, 상기 프라이머의 3' 말단의 염기가 각각 A, T, G 및 C인 돌연변이 확인방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 돌연변이 위치가 2 이상인 주형에 상응하는 2이상의 프라이머를 사용하는 돌연변이 확인방법.