CN111406119A

CN111406119A - 使用微滴式pcr系统的多重荧光测量

Info

Publication number: CN111406119A
Application number: CN201880056248.6A
Authority: CN
Inventors: 阿迪蒂亚·拉贾戈帕
Original assignee: Chromacode Inc
Current assignee: Chromacode Inc
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2018-06-27
Publication date: 2020-07-10
Also published as: EP4039829B1; US20190002963A1; EP3645749A1; WO2019006023A1; US20220127664A1; EP4379065A2; EP3645749B1; EP3645749A4; EP4039829A1

Abstract

本公开内容提供了用于在数字测定中检测单个光通道中的多个核酸靶标的方法和组合物。在一些情况下，可以在单个通道中检测三个或更多个核酸靶标。核酸靶标可以被分区、扩增、用于生成信号，其中每个信号对应于分区中核酸靶标的独特组合。

Description

使用微滴式PCR系统的多重荧光测量

交叉引用

本申请要求于2018年1月10日提交的美国临时专利申请号62/615,560和于2017年6月28日提交的美国临时专利申请号62/526,272的权益，所述申请通过引用整体并入本文。

背景技术

微滴式数字PCR(ddPCR)是用于检测和定量核酸靶标的有用方法。使用标记的寡核苷酸探针能够对乳液(即微滴)中存在的靶标进行特异性检测。然而，ddPCR在单个反应中可以测量的靶标数目有限。目前的多重ddPCR技术仅限于在单个反应中使用两个不同的颜色通道测量两个靶标。

发明内容

本文公开了通过使用单个光通道实现多个靶标的检测，用于增加可在单个数字测定(例如，数字PCR、ddPCR等)中测量的靶标数目的方法和组合物。在一些情况下，使用单个光通道检测三个、四个或更多个靶标。这是对现有数字多重化技术的关键改进。

在一些方面，本文提供了用于进行数字测定的方法，其包括：(a)将以下划分到多个分区中：(i)三个或更多个核酸靶标，和(ii)包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针的核酸探针集；(b)扩增所述分区中的所述三个或更多个核酸靶标；(c)由所述核酸探针集生成N个信号，所述N个信号中的每一个对应于在所述多个分区的分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在；以及(d)在单个光通道中检测所述N个信号；其中在(a)中，所述第一核酸探针的浓度为约X，所述第二核酸探针的浓度为至少约2X，并且所述第三核酸探针的浓度为至少约4X。在一些实施方案中，N为3或更大。在一些实施方案中，N为4或更大。在一些实施方案中，所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针。在一些实施方案中，在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8X。在一些实施方案中，所述N个信号中的每一个对应于荧光强度水平。在一些实施方案中，所述N个信号由所述核酸探针集生成。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含相同的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含不同的荧光团。在一些实施方案中，所述扩增包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述扩增包括线性扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括核酸延伸反应。

在一些方面，本文提供了用于进行数字测定的方法，其包括：(a)将以下划分到多个分区中：(i)三个或更多个核酸靶标，和(ii)包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针的核酸探针集；(b)扩增所述分区中的所述三个或更多个核酸靶标；(c)由所述核酸探针集生成N个信号，所述N个信号中的每一个对应于在所述多个分区的分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在；以及(d)在单个光通道中检测所述N个信号；其中在(a)中，所述第一核酸探针具有约Y的强度水平，所述第二核酸探针具有至少约2Y的强度水平，并且所述第三核酸探针具有至少约4Y的强度水平。在一些实施方案中，所述第一核酸探针包含具有约Y的强度水平的一个荧光团，所述第二核酸探针包含各自具有约Y的强度水平的至少两个荧光团，并且所述第三核酸探针包含各自具有约Y的强度水平的至少四个荧光团。在一些实施方案中，所述第一核酸探针包含具有约Y的强度水平的荧光团，所述第二核酸探针包含具有至少约2Y的强度水平的荧光团，并且所述第三核酸探针包含具有至少约4Y的强度水平的荧光团。在一些实施方案中，N为3或更大。在一些实施方案中，N为4或更大。在一些实施方案中，所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针。在一些实施方案中，所述第四核酸探针具有8X的强度水平。在一些实施方案中，所述第四核酸探针包含具有至少约8X的强度水平的荧光团。在一些实施方案中，所述N个信号中的每一个对应于荧光强度水平。在一些实施方案中，所述N个信号由所述核酸探针集生成。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含相同的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含不同的荧光团。在一些实施方案中，所述扩增包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述扩增包括线性扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括核酸延伸反应。

在一些方面，本文提供了用于进行数字测定的方法，其包括：(a)将三个或更多个核酸靶标划分到多个分区中；(b)扩增分区中的所述三个或更多个核酸靶标；(c)生成N个信号，所述N个信号中的每一个对应于在所述多个分区的分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在；以及(d)在单个光通道中检测所述信号。在一些实施方案中，N为3或更大。在一些实施方案中，N为4或更大。在一些实施方案中，所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。在一些实施方案中，所述N个信号中的每个信号对应于荧光强度水平。在一些实施方案中，(a)进一步包括将包含三个或更多个核酸探针的核酸探针集划分到多个分区中。在一些实施方案中，所述N个信号由所述核酸探针集生成。在一些实施方案中，所述核酸探针集各自包含一个或多个荧光团。在一些实施方案中，在(a)中提供的所述核酸探针集的浓度使得所述N个信号中的每一个对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每个核酸探针包含不同数目的荧光团，使得所述信号对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。在一些实施方案中，(a)中所述核酸探针集中的每个核酸探针以不同的浓度提供。在一些实施方案中，所述核酸探针集包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针。在一些实施方案中，在(a)中，所述第一核酸探针的浓度为约X，所述第二核酸探针的浓度为至少约2X，并且所述第三核酸探针的浓度为至少约4X。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8X。在一些实施方案中，在(a)中，所述第一核酸探针包含一个荧光团，所述第二核酸探针包含至少两个荧光团，并且所述第三核酸探针包含至少四个荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针包含至少六个荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含相同的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含不同的荧光团。在一些实施方案中，所述扩增包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述扩增包括线性扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括核酸延伸反应。

在一些方面，本文提供了进行数字测定的方法，其包括：(a)在多个微滴中扩增来自样品的至少三个核酸靶标，所述多个微滴包含核酸探针集，所述核酸探针集包含用能够在单个光通道中检测的荧光团标记的三个或更多个核酸探针，其中每个核酸探针与所述至少三个核酸靶标中的靶标互补；(b)如果存在所述至少三个核酸靶标中的一个或多个，则从所述多个微滴检测N个信号，其中所述N个信号中的每一个对应于在所述微滴中存在的所述至少三个核酸靶标中的一个或多个的独特组合；以及(c)从所述N个信号确定所述样品中所述至少三个核酸靶标中的每一个的存在或不存在。在一些实施方案中，N为3或更大。在一些实施方案中，N为4或更大。在一些实施方案中，所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。在一些实施方案中，所述N个信号中的每一个对应于荧光强度水平。在一些实施方案中，所述N个信号由所述核酸探针集生成。在一些实施方案中，(a)中提供的所述核酸探针集的浓度使得所述信号对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每个核酸探针包含不同数目的荧光团，使得所述信号对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。在一些实施方案中，所述核酸探针集包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针。在一些实施方案中，在(a)中，所述第一核酸探针的浓度为约X，所述第二核酸探针的浓度为至少约2X，并且所述第三核酸探针的浓度为至少约4X。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8X。在一些实施方案中，所述第一核酸探针包含具有约X的强度水平的荧光团，所述第二核酸探针包含具有至少约2X的强度水平的荧光团，并且所述第三核酸探针包含具有至少约4X的强度水平的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针包含具有至少约8X的强度水平的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集各自包含一个或多个荧光团。在一些实施方案中，所述荧光团是相同的荧光团。在一些实施方案中，所述荧光团是不同的荧光团。在一些实施方案中，所述扩增包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述扩增包括线性扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括核酸延伸反应。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及附图，将会获得对本发明特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1示出了来自本公开内容的多重数字测定的示例性信号读出的示意图，其中每个信号对应于靶标或其组合。

图2示出了来自本公开内容的多重数字测定的示例性信号读出的示意图，其中每个信号对应于单个靶标。

图3示出了实施例1中描述的实验的结果，证明了信号的生成，所述信号独特地对应于其信号在单个光通道中得以检测的核酸靶标的每个组合。

图4示出了实施例2中描述的实验的结果，说明了在各种核酸探针浓度下，在微滴式数字PCR反应中从核酸靶标生成的信号在单个光通道中的检测。

图5示出了实施例4中描述的实验的结果，说明了在单个数字PCR反应中在两个颜色通道之间的六个靶标的检测。

具体实施方式

聚合酶链反应(PCR)是用核酸聚合酶和引物在反应混合物中指数扩增特定靶标核酸的方法。引物是短的单链寡核苷酸，其与靶标序列的正链和负链的3’序列互补。反应混合物在重复的加热和冷却步骤中循环。加热循环使双链核酸靶标变性或分解成单链模板。在冷却循环中，引物与模板上的互补序列结合。在模板被引发后，核酸聚合酶产生了原始模板的拷贝。重复循环在每个循环中以指数方式将靶标扩增2倍，导致靶标序列在30个循环中增加约10亿倍(Saiki等人，1988)。

数字PCR是这样的过程，也就是将包含一个或多个靶标的样品分成多个分区(例如，孔、微滴等)，在每个分区中进行PCR反应，并记录由例如靶标特异性报告探针产生的荧光。这通常在数字PCR仪上进行，该PCR仪通过一个或多个激发/发射滤波器组测量光通道中来自每个分区的荧光。

通常，靶标特异性核酸探针是与扩增靶标的一条链互补的短寡核苷酸。所述探针缺少3’羟基，并且因此不可通过DNA聚合酶延伸。TaqMan(ThermoFisher Scientific)化学法是常见的用于多重实时PCR的报告探针方法(Holland等人，1991)。TaqMan寡核苷酸探针用荧光团和猝灭标签(即猝灭剂)共价修饰。在这种结构中，荧光团产生的荧光被猝灭，并且无法被实时PCR仪检测到。当感兴趣的靶标存在时，探针寡核苷酸碱基与扩增靶标配对。当结合时，其被Taq聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性消化，从而将荧光团与猝灭剂物理分离并释放信号以供实时PCR仪检测。

当前的方法对每个感兴趣的靶标使用独特探针，这限制了可以在单个数字测定中测量的靶标数目。需要方法来允许在单个光通道中检测多个(例如，三个或更多个)靶标，从而增加在单个数字PCR反应中可以测量的靶标数目。本文公开了用于在单个光通道中使用数字PCR检测三个或更多个核酸靶标的方法和组合物。

概述

本公开内容提供了用于在单个光通道中通过数字PCR检测多于一个核酸靶标的方法。在一些情况下，本公开内容的方法用于在单个光通道中通过数字PCR检测两个、三个、四个或更多个核酸靶标。

在一些情况下，单个光通道中多个核酸靶标的检测可以通过提供多个核酸探针来实现，每个探针对多个靶标中的一个具有特异性，其中所述探针用相同颜色的信号标签标记，但以不同的浓度提供，从而以独特的信号读出(例如，信号强度值)鉴别每个靶标。例如，为了在单个光通道中通过数字PCR检测三个核酸靶标，第一核酸探针可以以X的浓度提供，第二核酸探针可以以至少约2X的浓度提供，并且第三核酸探针可以以至少约4X的浓度提供，从而在数字PCR反应中生成信号，其中每个信号独特对应于分区中每个靶标或其组合的存在。

在一个实例中，样品可疑似包含三个核酸靶标中的一个或多个，对应于甲型流感病毒(InfA)、乙型流感病毒(InfB)和呼吸道合胞病毒B(RsvB)。提供了与三个靶标互补的独特核酸引物和探针，以供在数字PCR反应中扩增和检测靶标。每个引物组以约相同的浓度提供。每个核酸探针包含具有约相等发射波长的信号标签(例如，荧光团)，但以不同的浓度添加至样品，以使每个靶标能够独特鉴别。以最低浓度(例如，X)添加与InfA互补的探针，以中等浓度(例如，至少2X)添加与InfB互补的探针，并且以最高浓度添加与RsvB互补的探针(例如，至少4X)。在每微滴的每靶标仅存在一个寡核苷酸分子的假设下，使用标准数字PCR技术分离、扩增和检测靶标。使用不同浓度的寡核苷酸探针允许基于给定的信号强度检测每个靶标的存在或不存在。在这种情况下，最低强度的信号指示InfA的存在，中等强度的信号指示InfB的存在，最大强度的信号指示RsvB的存在。通过这种方法，所有三个靶标可以在单个反应中仅使用单个颜色通道进行鉴别。此外，通过使用每个探针的精确浓度，可以辨别与三个靶标的存在或不存在的任何组合相对应的信号。例如，在50x的信号强度指示存在InfA，100x的信号强度指示存在InfB，且200x的信号强度指示存在RsvB的情况下，一个、两个或三个靶标的任何组合将导致独特的信号强度(0x＝不存在靶标，50x＝仅InfA，100x＝仅InfB，150x＝InfA+InfB，200x＝仅RsvB，250x＝InfA+RsvB，300x＝InfB+RsvB，350x＝InfA+InfB+RsvB)。以这种方式，可以以存在或不存在的任何组合来明确分辨三个靶标的存在或不存在。

在一些情况下，使用单个光通道检测多于一个核酸靶标可以通过提供寡核苷酸探针来实现，每个寡核苷酸探对多个靶标中的一个具有特异性，其中每个探针都标记有发光信号标签的一个或多个拷贝，使得探针具有不同的强度水平，从而以独特信号读出(例如，信号强度值)鉴别每个靶标。例如，为了在单个光通道中通过数字PCR检测三个核酸靶标，可以提供具有X的强度水平的第一核酸探针，可以提供具有2X的强度水平的第二核酸探针，并且可以提供具有4X的强度水平的第三核酸探针，从而在数字PCR反应中生成信号，其中每个信号独特对应于分区中每个靶标或其组合的存在。

在一个实例中，样品可疑似包含三个靶标，即InfA、InfB和RsvB。提供了与三个靶标中的每一个互补的独特核酸引物和探针，以供在数字PCR反应中扩增和检测靶标。每个寡核苷酸探针包含具有不同强度水平的信号标签(例如，荧光团)，以独特地鉴别每个靶标。与InfA互补的探针包含强度水平为X的发光信号标签，与InfB互补的探针包含强度水平为至少约2X的发光信号标签，并且与RsvB互补的探针包含强度水平为至少约4X的发光信号标签。使用具有不同强度水平的信号标签允许基于给定的强度检测每个靶标的存在或不存在。在这种情况下，1x的信号强度指示InfA的存在，2x的信号强度指示InfB的存在，4x的信号强度指示RsvB的存在。类似地，3x的信号强度指示InfA+InfB的存在，5x的强度指示InfA+RsvB的存在，6x的强度指示InfB+RsvB的存在，7x的强度指示InfA、InfB和RsvB的存在。通过这种方法，任何组合的所有三个靶标的存在或不存在可以在单个反应中仅使用单个光通道鉴别。

除了使用在单个颜色通道内的不同强度来鉴别多个靶标外，还可以组合多个颜色通道以进一步增加单个反应中可检测靶标的数目。这可以通过提供对给定靶标具有特异性的探针来实现，所述探针包含处于不同浓度和/或具有不同强度水平的信号标签。

通过将单个颜色通道内的多于一个靶标的检测与多个颜色通道的使用相结合，可以显著增加在单个反应中可检测的靶标数目。一般而言，单个数字PCR反应中可检测的靶标数量可等于m*n，其中m是颜色通道内不同强度水平的数目，n是可用的颜色通道的数目。例如，在给定的颜色通道中可检测三个靶标的情况下，并且在使用两个颜色通道的情况下，在单个反应中可以鉴别九个独特的靶标。与现有的多重ddPCR技术相比，仅使用少量颜色通道测量许多靶标的能力是重大改进。

图1示出了信号读出的示意图，其可以与本公开内容的方法一起使用，以在单个数字PCR反应中检测大量核酸靶标，其中每个分区含有单个靶标或靶标的组合。如图所示，每种颜色内的每个强度水平可以代表独特的靶标或靶标组合。

图2示出了信号读出的示意图，其可以与本公开内容的方法一起使用，以在单个数字PCR反应中检测大量核酸靶标，其中每个分区包含至多一个核酸靶标。如图所示，每种颜色内的每个强度水平可以代表独特的靶标。

在一些情况下，通过滴定与靶标相关的特定比例的荧光基因探针，为每个靶标或其组合分配特定的荧光标记(颜色组合和颜色强度)。探针和引物浓度被选择为显著高于靶标浓度，以减轻统计样品分区差异(例如，试剂在分区间的泊松分布)。

在每个分区包含至多一个核酸靶标的情况下，每个分区可以单独测量，并且使用其荧光标记来鉴别该分区中存在的靶标。表1示出了用于示例数字测定的试剂浓度，该数字测定可用于实现针对多个靶标的以下信号输出：

·通道1中的1x信号水平和通道2中的0x信号水平鉴别靶标A

·通道1中的2x信号水平和通道2中的0x信号水平鉴别靶标B

·通道1中的0x信号水平和通道2中的1x信号水平鉴别靶标C

·通道1中的1x信号水平和通道2中的1x信号水平鉴别靶标D表1

	探针颜色1	探针颜色2	正向引物	反向引物
					靶标A	300nM	0nM	1200nM	1200nM
靶标B	600nM	0nM	1200nM	1200nM
					靶标C	0nM	300nM	1200nM	1200nM
靶标D	300nM	300nM	1200nM	1200nM

数字测定

在一些方面，本公开内容提供了用于执行数字测定的方法。用于执行数字测定的方法可以包含将多个核酸靶标和多个核酸探针划分到多个分区中。在一些情况下，可以将两个、三个、四个、五个或更多个核酸靶标与两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多核酸探针一起划分到多个分区中。分区后，核酸靶标可以在分区中通过例如聚合酶链反应(PCR)进行扩增。接下来，核酸探针可以生成N个信号。N个信号中的每个信号可以对应于分区中核酸靶标的独特组合的存在。在信号生成后，可以在单个光通道中检测N个信号。可以使用例如单个颜色通道中的荧光检测来检测信号。

用于执行数字测定的方法可包括在多个分区中扩增来自样品的核酸靶标，所述多个分区包含与该核酸靶标互补的核酸探针。每个核酸探针可以用荧光团标记。荧光团可以能够在单个光通道中被检测。例如，荧光团可以各自包含相似的发射波长光谱使得可以在单个光通道中对其进行检测。分区后，如果存在一个或多个核酸靶标，则可以从多个分区中检测到N个信号。N个信号中的每一个可以对应于分区中存在的一个或多个核酸靶标的独特组合。根据N个信号，可以确定样品中每个核酸靶标的存在或不存在。

在一些情况下，在所公开的方法中提供的每个核酸探针的浓度使得由核酸探针生成的每个信号独特地鉴别分区中核酸靶标的特定组合。例如，在提供三个核酸探针的情况下，可以以约X的浓度提供第一核酸探针，可以以至少约2X的浓度提供第二核酸探针，并且可以以至少约4X的浓度提供第三核酸探针，使得在分区中生成的信号对应于分区中核酸靶标的独特组合。在提供四个核酸探针的情况下，可以以约X的浓度提供第一核酸探针，可以以至少约2X的浓度提供第二核酸探针，可以以至少约4X的浓度提供第三核酸探针，并且可以以至少约8X的浓度提供第四核酸探针，使得在分区中生成的信号对应于分区中核酸靶标的独特组合。如本文其他各处所述，核酸探针浓度的各种组合可以用于所公开的方法。

在一些情况下，所公开的方法中提供的每个核酸探针的强度水平使得由核酸探针生成的信号独特地鉴别分区中核酸靶标的特定组合。例如，在提供三个核酸探针的情况下，第一核酸探针可以具有约Y的强度水平，第二核酸探针可以具有至少约2Y的强度水平，并且第三核酸探针可以具有至少约4Y的强度水平。在提供四个核酸探针的情况下，第一核酸探针可以具有约Y的强度水平，第二核酸探针可以具有至少约2Y的强度水平，并且第三核酸探针可以具有至少约4Y的强度水平，并且第四核酸探针可以具有至少约8Y的强度水平。每个核酸探针可以包含一个具有各种强度水平的荧光团，使得每个核酸探针具有不同的强度水平。备选地或附加地，每个核酸探针可以包含多个荧光团，每个荧光团具有约相同的强度水平，使得每个核酸探针具有不同的强度水平。

扩增

可以使用合适的扩增方法进行核酸靶标的扩增。扩增可以包括线性扩增。扩增可以包括聚合酶链反应。扩增可以包括核酸延伸反应。扩增可以在分区前或分区后进行。在一些情况下，核酸靶标的扩增在多个分区中进行。例如，可以将核酸靶标划分为多个微滴，并且在每个微滴内进行扩增，从而在微滴中存在至少一个核酸靶标的情况下生成信号。

可以修改扩增条件，使得在数字测定中生成的信号独特地鉴别靶标的每个组合。扩增条件可以包含热循环条件，其包括每个热循环的温度和时间长度。特定扩增条件的使用可用于修改每个信号的信号强度，从而使每个信号能够对应于分区中核酸靶标的独特组合。

信号

信号可以是荧光信号。信号可以对应于荧光强度水平。在本公开内容的方法中测量的每个信号可以具有不同的荧光强度值，从而对应于分区中核酸靶标的独特组合的存在。信号可以由一个或多个核酸探针生成。在数字测定中生成的信号的数目可以对应于被分区的核酸探针的数目、被分区的核酸靶标的数目，以及在一些情况下对应于分区条件。例如，在将三个核酸靶标和三个核酸探针分区以使得每个分区可包含一个、两个或所有三个核酸靶标的情况下，可以生成七个信号，其中每个信号对应于分区中三个核酸靶标的独特组合的存在。在本公开内容的数字测定中，N可以是在单个光通道中检测的信号的数目。N可以为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50或更大。N可以为至多50、40、30、24、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2。N可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40或50。如在本文其他各处将认识到的和在本文其他各处所述，可以在多个不同的光通道中生成信号组，其中每组信号在单个光通道中检测，从而显著增加在单个数字PCR反应中可以测量的核酸靶标的数目。在一些情况下，在单个反应中检测到两组信号。反应中检测到的每组信号可以包含相同数目的信号，或不同数目的信号。

分区

本公开内容的方法可以包含将核酸靶标、核酸探针并且在一些情况下将附加试剂划分到多个分区中。分区可以是微滴。分区可以是乳液。分区可以是孔。分区可以是微孔。可使用微流体装置进行分区。在一些情况下，使用微滴生成器进行分区。分区可包括将混合物(例如，包含核酸靶标和核酸探针的混合物)分到油包水微滴中。微滴可包含一个或多个核酸靶标。微滴可包含单个核酸靶标。微滴可包含两个或更多个核酸靶标。微滴可不包含核酸靶标。

核酸探针

在所公开的方法中，可以将任何数目的不同核酸探针与核酸靶标一起分区。在一些情况下，将3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50个或更多个不同的核酸探针划分到多个分区中。每个探针可以对样品中的给定核酸靶标具有特异性(例如，能够与之结合)。例如，可以提供三个核酸探针，其包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针，其中第一核酸探针对第一核酸靶标具有特异性，第二核酸探针对第二核酸靶标具有特异性，并且第三核酸探针对第三核酸靶标具有特异性。每个核酸探针可以包含具有约相等的发射波长的信号标签。在一些情况下，每个核酸探针包含相同的荧光团。在一些情况下，每个核酸探针包含不同的荧光团，其中每个荧光团能够在单个光通道中被检测。

多个核酸探针中的每个核酸探针可以以特定的浓度提供，使得从分区中的核酸探针生成的每个信号对应于靶标核酸的独特组合。在N个信号中的每个信号对应于靶标核酸的独特组合的情况下，该信号可以被描述为“非简并的”。在一个方面，第一核酸探针以约X的浓度提供。在第一核酸探针以约X的浓度提供的情况下，另外的核酸探针可以以大于X的特定浓度提供，从而能够生成非简并信号。

在一些情况下，第二核酸探针以至少约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X、约8X或更高的浓度提供。在一些情况下，第二核酸探针以至多约8X、约7X、约6X、约5X、约4X、约3X或约2X的浓度提供。在一些情况下，第二核酸探针以约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X或约8X的浓度提供。

在一些情况下，第三核酸探针以至少约4X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X、约11X、约12X或更高的浓度提供。在一些情况下，第三核酸探针以至多约12X、约11X、约10X、约9X、约8X、约7X、约6X、约5X或约4X的浓度提供。在一些情况下，第三核酸探针以约4X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X、约11X或约12X的浓度提供。

在一些情况下，第四核酸探针以至少约8X、约9X、约10X、约11X、约12X、约13X、约14X、约15X、约20X或更高的浓度提供。在一些情况下，第四核酸探针以至多约20X、约15X、约14X、约13X、约12X、约11X、约10X、约9X或约8X的浓度提供。在一些情况下，第四核酸探针以约8X、约9X、约10X、约11X、约12X、约13X、约14X、约15X或约20X的浓度提供。

每个核酸探针可以以与所有其他核酸探针不同的浓度提供。可以使用能够产生非简并信号(即，各自独特地鉴别分区中核酸靶标的特定组合的信号)的核酸探针浓度的任何组合。在一个实例中，第一核酸探针可以以约X的浓度提供，第二核酸探针可以以约3X的浓度提供，并且第三核酸探针可以以约8X的浓度提供，从而在多个分区中生成对应于核酸靶标独特组合的存在的非简并信号。

X可以是所公开的方法中提供的核酸探针的浓度。在一些情况下，X为至少50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM或更大。在一些情况下，X为至多500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM或50nM。X可以是能够被分区的核酸探针的任何浓度。

多个核酸探针中的每个核酸探针可以用发光信号标签的一个或多个拷贝标记，使得探针具有不同的强度水平，从而能够生成信号，该信号独特地鉴别分区中核酸靶标的每个组合。在一个方面，第一核酸探针具有约Y的强度水平。在第一核酸探针具有约Y的强度水平的情况下，另外的核酸探针可以具有大于Y的强度水平，从而能够生成非简并信号。第一核酸可包含具有约Y的强度水平的荧光团。

在一些情况下，第二核酸探针具有至少约2Y、约3Y、约4Y、约5Y、约6Y、约7Y、约8Y或更大的强度水平。在一些情况下，第二核酸探针具有至多约8Y、约7Y、约6Y、约5Y、约4Y、约3Y或约2Y的强度水平。在一些情况下，第二核酸探针具有约2Y、约3Y、约4Y、约5Y、约6Y、约7Y或约8Y的强度水平。第二核酸可包含具有至少约2Y的强度水平的单个发光信号标签(例如，荧光团)。备选地或附加地，第二核酸可以包含两个或更多个荧光团，每个荧光团具有约Y的强度水平。

在一些情况下，第三核酸探针具有至少约4Y、约5Y、约6Y、约7Y、约8Y、约9Y、约10Y、约11Y、约12Y或更大的强度水平。在一些情况下，第三核酸探针具有至多约12Y、约11Y、约10Y、约9Y、约8Y、约7Y、约6Y、约5Y或约4Y的强度水平。在一些情况下，第三核酸探针具有约4Y、约5Y、约6Y、约7Y、约8Y、约9Y、约10Y、约11Y或约12Y的强度水平。第三核酸可包含具有至少约4Y的强度水平的单个发光信号标签(例如，荧光团)。备选地或附加地，第三核酸可以包含四个或更多个荧光团，每个荧光团具有约Y的强度水平。

在一些情况下，第四核酸探针具有至少约8Y、约9Y、约10Y、约11Y、约12Y、约13Y、约14Y、约15Y、约20Y或更大的强度水平。在一些情况下，第四核酸探针具有至多约20Y、约15Y、约14Y、约13Y、约12Y、约11Y、约10Y、约9Y或约8Y的强度水平。在一些情况下，第四核酸探针具有约8Y、约9Y、约10Y、约11Y、约12Y、约13Y、约14Y、约15Y或约20Y的强度水平。第四核酸可包含具有至少约8Y的亮度的单个发光信号标签(例如，荧光团)。备选地或附加地，第四核酸可以包含八个或更多个荧光团，每个荧光团具有约Y的强度水平。

Y可以是由包含一个或多个信号标签(例如，荧光团)的核酸探针产生的信号强度水平。Y可以是能够在光通道中检测到的任何信号强度。

核酸探针可以是与给定核酸靶标的区域互补的核酸。核酸探针可以包含信号标签。信号标签可以包含生成信号的手段，例如荧光团。荧光团可以是例如FAM、TET、HEX、JOE、Cy3或Cy5。核酸探针可以进一步包含一个或多个猝灭剂。猝灭剂可以抑制荧光团的信号生成。猝灭剂可以是例如TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或Dabcy。

样品和靶标

本公开内容的核酸靶标可以源自任何来源，包括例如，病毒、细菌细胞和真核细胞。核酸靶标可以源自一个或多个细胞。细胞可以是肿瘤细胞。细胞可以是疑似包含病毒病原体的细胞。在一些情况下，核酸靶标源自无细胞样品(例如，血清、血浆)。核酸靶标可以是无细胞核酸。无细胞核酸可以是例如无细胞肿瘤DNA、无细胞胎儿DNA、无细胞RNA等。核酸靶标可包括脱氧核糖核酸(DNA)。DNA可以是任何种类的DNA，包括基因组DNA。核酸靶标可以是病毒DNA。核酸靶标可包括核糖核酸(RNA)。RNA可以是任何种类的RNA，包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA和微小RNA。RNA可以是病毒RNA。核酸靶标可包括其检测可用于诊断一种或多种疾病的基因。基因可以是其检测可用于鉴别受试者中病原体的存在或不存在的病毒基因或细菌基因。在一些情况下，本公开内容的方法可用于检测受试者中一种或多种感染剂(例如，病毒)的存在或不存在。在一些情况下，本公开内容的方法可用于检测来自受试者的无细胞核酸样品中胎儿核酸的相对量，从而诊断胎儿的一种或多种遗传异常。在一些情况下，本公开内容的方法可用于检测来自受试者的无细胞核酸样品中肿瘤DNA的存在或不存在，从而诊断受试者的癌症。

实施例

实施例1

将引物、核酸探针和聚合酶的混合物添加至样品，该样品含有等浓度的针对PanInfA、InfB和RsvB的合成DNA靶标，该浓度为每反应10,000拷贝。表2示出了每种引物、核酸探针和聚合酶的浓度。

表2

试剂	浓度
		Pan InfA正向引物	3.0μM
Pan InfA反向引物	3.0μM
		Pan InfA探针	200nM
InfB正向引物	3.0μM
		InfB反向引物	3.0μM
InfB探针	400nM
		RsvB正向引物	3.0μM
RsvB反向引物	3.0μM
		RsvB探针	1.6μM
Bio-Rad数字PCR聚合酶	2个单位

将24μL该总反应体积中分散至80μL数字微滴PCR油中，生成约15,000个微滴的群体。这些微滴使用Bio-Rad C1000热循环仪按照以下PCR方案进行热循环：95℃热启动10分钟；35个以下循环：在95℃下变性30秒，并在57℃下退火/延伸120秒。在PCR后，接着使用Bio-Rad QX200微滴读取器测量微滴。该实验的结果如图3所示。ddPCR反应混合物中所有三个靶标的存在生成了八个不同的微滴群体簇，从无靶标的簇(强度峰350AFU；“无靶标”)至具有所有靶标的簇(强度峰2800AFU；“InfA+InfB+RsvB”)，如图3所示。这些数据说明了所公开的方法在数字PCR仪的单个颜色通道中分辨多个靶标的能力。

实施例2

使用针对单个人鼻病毒(HRV)靶标的引物、探针和合成模板进行探针稀释系列。每个实验的反应物(引物、探针和模板)的浓度列于表3。按标记进行了七个实验(a-g)，每个实验使用不同浓度的HRV探针。

表3

将这些反应物添加至ddPCR聚合酶混合物。将21μL该总反应体积分散至80μL数字微滴PCR油中，生成约1000个微滴的群体。这些微滴使用Bio-Rad C1000热循环仪按照以下PCR方案进行热循环：95℃热启动10分钟；35个以下循环：在95℃下变性30秒，并在57℃下退火/延伸120秒。PCR后，接着使用Bio-Rad QX200微滴读取器测量微滴。这些实验的结果如图4所示，每个反应生成两个微滴群体簇：低强度的一个是不包含扩增的靶标的微滴，高强度的一个是包含具有扩增的靶标的微滴，如图4所示。在实验a中，由于未添加报告探针作为阴性对照，因此无法区分空微滴和靶标占据的微滴。对于所有其他实验，观察到空微滴和靶标占据的微滴的不同群体。随着HRV探针浓度的增加，靶标占据的微滴的信号强度也随之增加。这些数据强调了所公开的多重ddPCR方法较大的光学动态范围。

实施例3

用在FAM通道中发荧光的TaqMan探针标记RsvA、RsvB和HRV的靶标，而使用在VIC通道中发荧光的探针标记针对Pan InfA标志物以及H1和H3血清型的靶标。设计引物和探针混合物以生成对每个靶标的存在或不存在具有特异性的特征。对于每个实验，将8μL引物混合物添加至12μL的Bio-Rad数字PCR聚合酶主混液和6μL的样品体积，总反应体积为24μL。表4示出了每个反应使用的拷贝数。

表4

将该体积分散在80μL的微滴读取器油中，并在以下条件进行热循环：95℃热启动10分钟；35个以下循环：在95℃下变性30秒，并在57℃下退火/延伸120秒。然后使用Bio-RadQX200微滴读取器读取微滴。

这些实验的结果如图5所示。每个实验的左侧显示二维信号读出(标记为a-e)，右侧每个光通道对应的一维信号读出。鉴别反应中核酸靶标的独特组合的每个信号均用垂直线标记。这些数据证明，在单个ddPCR反应中跨两个颜色通道检测到六个靶标。

当提及可测量值诸如量、持续时间等时，术语“约”旨在涵盖指定值的±20％变化，或在一些情况下为±10％，或在一些情况下为±5％，或在一些情况下为±1％，或在一些情况下为±0.1％，因此这样的变化适于进行所公开的方法。此外，“约”可意指正负小于1％或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％或大于30％，这取决于情况并且是本领域技术人员已知或可知的。约还包括确切的量。因此，“约200nM”意指“约200nM”以及“200nM”。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。说明书中提供的具体示例不意在限制本发明。虽然本发明已经参考前述说明书进行了描述，但本文实施方案的描述和说明并不意味着以限制的意义来解释。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的依赖于各种条件和变量的具体描述、配置或相对比例。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，考虑到本发明还将覆盖任何这样的替代、修改、变化或等同项。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。

Claims

1.一种用于进行数字测定的方法，其包括：

(a)将以下划分到多个分区中：(i)三个或更多个核酸靶标，和(ii)包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针的核酸探针集；

(b)扩增所述分区中的所述三个或更多个核酸靶标；

(c)由所述核酸探针集生成N个信号，所述N个信号中的每一个对应于在所述多个分区的分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在；以及

(d)在单个光通道中检测所述N个信号；

其中在(a)中，所述第一核酸探针的浓度为约X，所述第二核酸探针的浓度为至少约2X，并且所述第三核酸探针的浓度为至少约4X。

2.根据权利要求1所述的方法，其中N为3或更大。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中N为4或更大。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8X。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述N个信号中的每一个对应于荧光强度水平。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述N个信号由所述核酸探针集生成。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述核酸探针集中的每一个包含相同的荧光团。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述核酸探针集中的每一个包含不同的荧光团。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述扩增包括聚合酶链反应。

12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述扩增包括线性扩增。

13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述扩增包括核酸延伸反应。

14.一种用于进行数字测定的方法，其包括：

(b)扩增所述分区中的所述三个或更多个核酸靶标；

(d)在单个光通道中检测所述N个信号；

其中在(a)中，所述第一核酸探针具有约Y的强度水平，所述第二核酸探针具有至少约2Y的强度水平，并且所述第三核酸探针具有至少约4Y的强度水平。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一核酸探针包含具有约Y的强度水平的一个荧光团，所述第二核酸探针包含各自具有约Y的强度水平的至少两个荧光团，并且所述第三核酸探针包含各自具有约Y的强度水平的至少四个荧光团。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一核酸探针包含具有约Y的强度水平的荧光团，所述第二核酸探针包含具有至少约2Y的强度水平的荧光团，并且所述第三核酸探针包含具有至少约4Y的强度水平的荧光团。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中N为3或更大。

18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中N为4或更大。

19.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。

20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第四核酸探针具有8X的强度水平。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第四核酸探针包含具有至少约8X的强度水平的荧光团。

23.根据权利要求14-22中任一项所述的方法，其中所述N个信号中的每一个对应于荧光强度水平。

24.根据权利要求14-23中任一项所述的方法，其中所述N个信号由所述核酸探针集生成。

25.根据权利要求14-24中任一项所述的方法，其中所述核酸探针集中的每一个包含相同的荧光团。

26.根据权利要求14-24中任一项所述的方法，其中所述核酸探针集中的每一个包含不同的荧光团。

27.根据权利要求14-26中任一项所述的方法，其中所述扩增包括聚合酶链反应。

28.根据权利要求14-26中任一项所述的方法，其中所述扩增包括线性扩增。

29.根据权利要求14-26中任一项所述的方法，其中所述扩增包括核酸延伸反应。

30.一种用于进行数字测定的方法，其包括：

(a)将三个或更多个核酸靶标划分到多个分区中；

(b)扩增所述分区中的所述三个或更多个核酸靶标；

(c)生成N个信号，所述N个信号中的每一个对应于在所述多个分区的分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在；以及

(d)在单个光通道中检测所述信号。

31.根据权利要求30所述的方法，其中N为3或更大。

32.根据权利要求30-31中任一项所述的方法，其中N为4或更大。

33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。

34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述N个信号中的每个信号对应于荧光强度水平。

35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中(a)进一步包括将包含三个或更多个核酸探针的核酸探针集划分到多个分区中。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述N个信号由所述核酸探针集生成。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述核酸探针集各自包含一个或多个荧光团。

38.根据权利要求37所述的方法，其中在(a)中提供的所述核酸探针集的浓度使得所述N个信号中的每一个对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述核酸探针集中的每个核酸探针包含不同数目的荧光团，使得所述信号对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。

40.根据权利要求35所述的方法，其中(a)中所述核酸探针集中的每个核酸探针以不同的浓度提供。

41.根据权利要求35所述的方法，其中所述核酸探针集包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针。

42.根据权利要求41所述的方法，其中在(a)中，所述第一核酸探针的浓度为约X，所述第二核酸探针的浓度为至少约2X，并且所述第三核酸探针的浓度为至少约4X。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8X。

44.根据权利要求41所述的方法，其中在(a)中，所述第一核酸探针包含一个荧光团，所述第二核酸探针包含至少两个荧光团，并且所述第三核酸探针包含至少四个荧光团。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针包含至少六个荧光团。

46.根据权利要求35所述的方法，其中所述核酸探针集中的每一个包含相同的荧光团。

47.根据权利要求35所述的方法，其中所述核酸探针集中的每一个包含不同的荧光团。

48.根据权利要求30-47中任一项所述的方法，其中所述扩增包括聚合酶链反应。

49.根据权利要求30-47中任一项所述的方法，其中所述扩增包括线性扩增。

50.根据权利要求30-47中任一项所述的方法，其中所述扩增包括核酸延伸反应。

51.一种进行数字测定的方法，其包括：

(a)在多个微滴中扩增来自样品的至少三个核酸靶标，所述多个微滴包含核酸探针集，所述核酸探针集包含用能够在单个光通道中检测的荧光团标记的三个或更多个核酸探针，其中每个核酸探针与所述至少三个核酸靶标中的靶标互补；

(b)如果存在所述至少三个核酸靶标中的一个或多个，则从所述多个微滴检测N个信号，其中所述N个信号中的每一个对应于在所述微滴中存在的所述至少三个核酸靶标中的一个或多个的独特组合；以及

(c)从所述N个信号确定所述样品中所述至少三个核酸靶标中的每一个的存在或不存在。

52.根据权利要求51所述的方法，其中N为3或更大。

53.根据权利要求51-52中任一项所述的方法，其中N为4或更大。

54.根据权利要求51-53中任一项所述的方法，其中所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。

55.根据权利要求51-54中任一项所述的方法，其中所述N个信号中的每一个对应于荧光强度水平。

56.根据权利要求51-55中任一项所述的方法，其中所述N个信号由所述核酸探针集生成。

57.根据权利要求56所述的方法，其中(a)中提供的所述核酸探针集的浓度使得所述信号对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。

58.根据权利要求51-57中任一项所述的方法，其中所述核酸探针集中的每个核酸探针包含不同数目的荧光团，使得所述信号对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。

59.根据权利要求51-58中任一项所述的方法，其中所述核酸探针集包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针。

60.根据权利要求59所述的方法，其中在(a)中，所述第一核酸探针的浓度为约X，所述第二核酸探针的浓度为至少约2X，并且所述第三核酸探针的浓度为至少约4X。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8X。

62.根据权利要求59所述的方法，其中所述第一核酸探针包含具有约X的强度水平的荧光团，所述第二核酸探针包含具有至少约2X的强度水平的荧光团，并且所述第三核酸探针包含具有至少约4X的强度水平的荧光团。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针包含具有至少约8X的强度水平的荧光团。

64.根据权利要求56所述的方法，其中所述核酸探针集各自包含一个或多个荧光团。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述荧光团是相同的荧光团。

66.根据权利要求64所述的方法，其中所述荧光团是不同的荧光团。

67.根据权利要求51-66中任一项所述的方法，其中所述扩增包括聚合酶链反应。

68.根据权利要求51-66中任一项所述的方法，其中所述扩增包括线性扩增。

69.根据权利要求51-66中任一项所述的方法，其中所述扩增包括核酸延伸反应。