CN112789355A - 用于大规模多重生化测定的配方及信号编码和解码方法 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了用于从样品中多重检测多个分析物的方法和组合物。分析物可以是核酸分析物。分析物的检测可以包括使一个或多个样品子集与杂交探针接触，从而产生能够检测多个分析物的存在或不存在的一个或多个累积信号测量值。
Description
交叉引用
本申请要求于2018年7月3日提交的美国临时专利申请号62/693,777和于2018年9月11日提交的美国专利申请号16/128,343的权益，这两个申请通过引用整体并入本文。
背景技术
非简并编码方案可用于在单个信号测量中检测多个分析物。然而，依赖于完全非简并编码方案的当前多重技术可能受限于诸如试剂浓度要求和信号检测能力的技术限制。
发明内容
本文公开了用于明确检测多个分析物的方法和组合物。在一些情况下，可以使用单个光学通道检测多个分析物，而无需完全非简并的编码方案。
在一些方面，本文提供了一种检测样品中以存在或不存在的任何组合形式的至少三个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)使所述样品的第一子集与第一多个杂交探针接触以产生第一累积信号测量值，所述第一累积信号测量值包括从所述第一多个杂交探针产生的一个或多个信号，其中所述第一累积信号测量值无法非简并地识别所述至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在；(b)使所述样品的一个或多个附加的子集与一个或多个附加的多个杂交探针接触以产生一个或多个附加的累积信号测量值，每个测量值包括从所述一个或多个附加的多个杂交探针产生的一个或多个附加的信号，其中所述一个或多个附加的累积信号测量值中的每个都无法非简并地识别所述至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在；以及(c)将所述第一累积信号测量值与所述一个或多个附加的累积信号测量值进行比较，其中所述比较独特地识别所述样品中多核苷酸分析物的任何组合，从而检测所述样品中以存在或不存在的任何组合形式的所述至少三个多核苷酸分析物的存在或不存在。在一些实施方案中，所述第一子集和所述一个或多个附加的子集分别处于相同的溶液体积中。在一些实施方案中，所述第一子集和所述一个或多个附加的子集分别处于不同的溶液体积中。在一些实施方案中，所述第一子集和所述一个或多个附加的子集分别被提供在多个分区中。在一些实施方案中，所述第一子集和所述一个或多个附加的子集分别被提供在多个孔中。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个中的独特杂交探的数量小于或等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针是寡核苷酸探针。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针各自包含荧光团。在一些实施方案中，产生所述第一累积信号测量值和所述一个或多个附加的累积信号测量值包括激发所述荧光团并检测从每个荧光团产生的信号。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个杂交探针包括能够在相同的光学通道中被检测到的荧光团。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个杂交探针包括相同的荧光团。在一些实施方案中，以不同的浓度提供所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个杂交探针。在一些实施方案中，所述至少三个多核苷酸分析物是至少七个多核苷酸分析物。在一些实施方案中，产生所述第一累积信号测量值和所述一个或多个附加的累积信号测量值包括聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述第一累积信号测量值和所述一个或多个附加的累积信号测量值包括信号强度。在一些实施方案中，所述第一累积信号测量值包括不确定性，并且其中所述一个或多个附加的累积信号测量值解决所述不确定性。在一些实施方案中，所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、显微镜检查、流式细胞术、所述多核苷酸分析物的物理分离、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个对应于所述至少三个多核苷酸分析物之一。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个与所述至少三个多核苷酸分析物之一具有互补性。在一些实施方案中，PCR是数字PCR。在一些实施方案中，PCR是定量PCR。
在一些方面，本文提供了一种检测样品中以存在或不存在的任何组合形式的至少三个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)提供第一样品溶液体积和第二样品溶液体积，每个包含或可能包含所述至少三个多核苷酸分析物；(b)使所述第一样品溶液体积与第一多个杂交探针接触，所述第一多个杂交探针各自对应于所述多核苷酸分析物之一，以产生第一累积信号测量值，所述第一累积信号测量值包括从所述第一多个杂交探针产生的一个或多个信号，其中所述第一累积信号测量值无法非简并地识别所述至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在；(c)使所述第二样品溶液体积与第二多个杂交探针接触，所述第二多个杂交探针各自对应于所述多核苷酸分析物之一，以产生第二累积信号测量值，所述第二累积信号测量包括从第二多个杂交探针产生的一个或多个信号，其中第二累积信号测量无法非简并地识别所述至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在；以及(d)将所述第一累积信号测量值与所述第二累积信号测量值进行比较，其中所述比较独特地识别所述样品中多核苷酸分析物的任何组合，从而检测样品中以存在或不存在的任何组合形式的至少三个多核苷酸分析物的存在或不存在。在一些实施方案中，所述第一样品溶液体积和第二样品溶液体积来源于所述样品。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第二多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第二多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针是寡核苷酸探针。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针各自包含荧光团。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的每个杂交探针包括能够在相同的光学通道中被检测到的荧光团。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的每个杂交探针包括相同的荧光团。在一些实施方案中，以不同的浓度提供所述第一多个杂交探针中的每个杂交探针。在一些实施方案中，产生所述第一累积信号测量值包括激发所述荧光团并且检测从每个荧光团产生的所述信号。在一些实施方案中，所述第二多个杂交探针是寡核苷酸探针。在一些实施方案中，所述第二多个杂交探针各自包含荧光团。在一些实施方案中，所述第二多个杂交探针中的每个杂交探针包括能够在相同的光学通道中被检测到的荧光团。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的每个杂交探针包括相同的荧光团。在一些实施方案中，以不同的浓度提供所述第二多个杂交探针中的每个杂交探针。在一些实施方案中，产生所述第二累积信号测量值包括激发所述荧光团并且检测从每个荧光团产生的所述信号。在一些实施方案中，所述至少三个多核苷酸分析物是至少五个多核苷酸分析物。在一些实施方案中，所述至少三个多核苷酸分析物是至少七个多核苷酸分析物。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针和所述第二多个杂交探针是相同的。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针和所述第二多个杂交探针是不同的。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针包括(i)与所述至少三个多核苷酸分析物中的第一多核苷酸分析物相对应的第一杂交探针，以及(ii)对应于所述至少三个多核苷酸分析物中的第二个多核苷酸分析物的第二杂交探针，并且其中所述第二多个杂交探针包括(1)对应于所述至少三个多核苷酸分析物中的所述第一多核苷酸分析物的第三杂交探针以及(2)对应于第三多核苷酸分析物的第四杂交探针。在一些实施方案中，以不同的浓度提供所述第三杂交探针和所述第一杂交探针。在一些实施方案中，所述第一累积信号测量值包括不确定性，并且其中所述第二累积信号测量值解决所述第一累积信号测量值的不确定性。在一些实施方案中，所述不确定性是不能明确识别所述至少三个多核苷酸分析物的多核苷酸分析物的单个组合的信号。在一些实施方案中，所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、显微镜检查、流式细胞术、所述多核苷酸分析物的物理分离、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。
在一些方面，本文提供了一种检测样品中以存在或不存在的任何组合形式的多个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)提供第一样品溶液体积和第二样品溶液体积，每个包含或可能包含所述多个多核苷酸分析物；(b)使所述第一样品溶液体积与第一多个杂交探针接触以产生第一累积信号测量值，所述第一累积信号测量值无法非简并地指示所述多个分析物的任何组合的存在或不存在；(c)使所述第二样品溶液体积与第二多个杂交探针接触以产生第二累积信号测量值，所述第二累积信号测量值无法非简并地指示所述多个分析物的任何组合的存在或不存在；以及(d)将所述第一累积信号测量值与所述第二累积信号测量值进行比较，从而非简并地指示以存在或不存在的任何组合形式的所述多个分析物的存在或不存在。在一些方面，本文提供了一种检测样品溶液体积中以存在或不存在的任何组合形式的多个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)使所述样品溶液体积与第一多个杂交探针接触以产生第一累积信号测量值，所述第一累积信号测量值无法非简并地指示所述多个分析物的任何组合的存在或不存在，其中所述第一多个杂交探针被附接到能够在第一信号通道中被检测的荧光团；(b)使所述样品溶液体积与第二多个杂交探针接触以产生第二累积信号测量值，所述第二累积信号测量值无法非简并地指示所述多个分析物的任何组合的存在或不存在，其中所述第二多个杂交探针被附接到能够在第二信号通道中被检测的荧光团；以及(c)将所述第一累积信号测量值与所述第二累积信号测量值进行比较，从而非简并地指示以存在或不存在的任何组合形式的所述多个分析物的存在或不存在。
在一些实施方案中，所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、显微镜检查、流式细胞术、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。在一些实施方案中，所述多个多核苷酸分析物包括至少三个多核苷酸分析物。在一些实施方案中，所述多个多核苷酸分析物包括至少七个多核苷酸分析物。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第二多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第二多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，在第一颜色通道中检测所述第一累积信号测量值，并且在第二颜色通道中检测所述第二累积信号测量值。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的一个或多个对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个。在一些实施方案中，所述第二多个杂交探针中的一个或多个对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的一个或多个对应于寡核苷酸的区域，所述寡核苷酸的区域对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个。在一些实施方案中，所述第二多个杂交探针中的一个或多个对应于寡核苷酸的区域，所述寡核苷酸的区域对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个。
在一些方面，本文提供了一种检测样品溶液体积中多个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：(a)提供包含或可能包含所述多个多核苷酸分析物的样品溶液体积；(b)如果所述样品溶液体积中存在所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个，则使所述样品溶液体积与多个杂交探针接触并激发所述杂交探针以产生累积信号测量值，其中所述累积信号测量值包括不确定性；(c)接收关于所述多核苷酸分析物的信息集；以及(d)将所述累积信号测量值与所述信息集进行比较，其中所述比较的结果解决了所述不确定性，从而检测到所述多个多核苷酸分析物的存在或不存在。在一些实施方案中，所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、显微镜检查、流式细胞术、所述多核苷酸分析物的物理分离、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。在一些实施方案中，所述多个多核苷酸分析物包括至少三个多核苷酸分析物。在一些实施方案中，所述多个多核苷酸分析物包括至少七个多核苷酸分析物。在一些实施方案中，所述多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。在一些实施方案中，每个杂交探针包含至少一个荧光团。在一些实施方案中，所述至少一个荧光团选自三个、四个、五个或六个荧光团。在一些实施方案中，所述信息集包括在(a)之前生成的附加累积信号测量值，其中将所述累积信号测量值与所述附加累积信号测量值进行比较解决所述不确定性。在一些实施方案中，所述信息集包括统计表，其中将来自所述统计表的数据与所述累积信号测量值进行比较解决所述不确定性。在一些实施方案中，所述信息集包括期望的临床结果。在一些实施方案中，所述期望的临床结果是对患者的治疗策略的鉴定。在一些实施方案中，所述患者疑似感染了细菌剂或病毒剂。
在一些方面，本文提供了一种测定，其包括：(a)第一反应，其无法非简并地检测多个分析物的任何组合的存在或不存在；以及(b)第二反应，其无法非简并地检测多个分析物的任何组合的存在或不存在；其中所述第一反应和第二反应的结果明确地检测了至少三个分析物的每个的存在或不存在，而不需要所述分析物的固定、质谱分析、显微镜检查、流式细胞术或熔解曲线分析。在一些实施方案中，所述第一反应和所述第二反应在相同的样品溶液体积中进行。在一些实施方案中，所述第一反应在第一样品溶液体积中进行并且所述第二反应在第二样品溶液体积中进行。在一些实施方案中，所述第一样品溶液体积和所述第二样品溶液体积各自包含或可能包含所述至少三个分析物。在一些实施方案中，所述至少三个分析物是多核苷酸分析物。在一些实施方案中，所述至少三个分析物是至少五个分析物。在一些实施方案中，所述至少三个分析物是至少七个分析物。在一些实施方案中，所述第一反应包括不确定性，并且其中所述第二反应解决所述不确定性。在一些实施方案中，所述不确定性是不能明确识别所述至少三个多核苷酸分析物的多核苷酸分析物的单个组合的信号。在一些实施方案中，所述第一反应和所述第二反应各自包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述第一反应包括从一个或多个信号产生第一累积信号测量值。在一些实施方案中，所述一个或多个信号是从一个或多个杂交探针产生的。在一些实施方案中，所述第二反应包括从一个或多个信号产生第二累积信号测量值。在一些实施方案中，所述一个或多个信号是从一个或多个杂交探针产生的。在一些实施方案中，所述第一反应包括产生在第一信号通道中检测到的一个或多个第一信号，并且其中所述第二反应包括产生在第二信号通道中检测到的一个或多个第二信号。
在一些方面，本文提供了一种用于检测多个多核苷酸分析物的组合物，所述组合物包含多个杂交探针，每个杂交探针对应于所述多个多核苷酸分析物之一，并包含至少一个荧光团，其中每个杂交探针在被激发时以及与其对应的多核苷酸分析物接触时产生累积强度信号，并且其中由来自所述多个杂交探针的所述累积强度信号产生的累积信号测量值形成Sidon序列。在一些实施方案中，所述至少一个荧光团选自三个、四个、五个或六个荧光团。在一些实施方案中，所述多个杂交探针包含至少七个独特的杂交探针。在一些实施方案中，所述组合物包含浓度为至少1X的第一杂交探针、浓度为至少4X的第二杂交探针、浓度为至少9X的第三杂交探针、浓度为至少15X的第四杂交探针、浓度为至少22X的第五杂交探针、浓度为至少32X的第六杂交探针和浓度为至少34X的第七杂交探针。
在一些方面，本文提供了一种非简并地检测以存在或不存在的任何组合形式的多个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，其包括：(a)提供包含或可能包含所述多个多核苷酸分析物中至少一个的样品溶液体积；(b)提供多个杂交探针，每个杂交探针包括至少一个荧光团，其中每个杂交探针产生累积强度信号，并且其中由来自所述多个杂交探针的所述累积强度信号产生的累积信号测量值形成Sidon序列；以及(c)使所述样品溶液体积与所述多个杂交探针接触以产生所述累积信号测量值，从而非简并地检测以存在或不存在的任何组合形式的所述多个分析物的存在或不存在。在一些实施方案中，所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、所述多核苷酸分析物的物理分离、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。在一些实施方案中，所述多个多核苷酸分析物是至少七个多核苷酸分析物。在一些实施方案中，所述多个杂交探针中的一个或多个与所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个结合。在一些实施方案中，所述多个杂交探针中的一个或多个与对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个的寡核苷酸的区域结合。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及附图，将会获得对本发明特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1A-1C示出了本公开内容的示例性测定的示意图，其包括两次测量，能够非简并地测量来自样品的三个分析物。图1A示出了包括简并的第一反应的示意图。图1B示出了能够解决第一反应的简并的第二反应的示意图。图1C示出了第一反应和第二反应的比较。
图2示出了针对单个测量、单个测量的复制和冗余测量，作为读出变异系数(CV)的函数的预期错误率的模拟。
图3示出了由实施例1中描述的反应产生的定量PCR(qPCR)曲线。
图4示出了二维图，其比较了来自图3所示的qPCR曲线的结果。
图5示出了对于用于测量来自样品的三个靶标分析物的测定，相对于样品中仅存在第三靶标或第一靶标和第二靶标而不是全部三个靶标的给定概率(P)值，非简并地测量所有三个分析物所需的每孔平均靶标的曲线图。
图6示出了使用完全非简并编码方案或Sidon序列编码方案来非简并测量给定数目的靶标需要的离散荧光水平的数目。
图7示出了由实施例2中描述的反应产生的qPCR曲线。
图8示出了基于图7中的qPCR曲线的给定靶标组合的每个重复的簇。
图9示出了实施例3中描述的qPCR反应的多维分析。
图10A和图10B示出了示例方案，该示例方案用于向临床医生提供做出明智的临床决定所需的信息，而不需要非简并地检测样品中的每种靶分析物。图10A示出了仅存在单个靶标(Inf A H1)的示例。图10B示出了存在两个靶标(Inf A H1和Inf A H3)的示例。
图11示出了实施例4中描述的实验结果。
图12示出了包含RSVA、RhV，或RSVA和RhV两者的样品的示例曲线。
具体实施方式
聚合酶链反应(PCR)是用核酸聚合酶和引物在反应混合物中指数扩增特定靶标核酸的方法。引物是短的单链寡核苷酸，其与靶标序列的正链和负链的3’序列互补。反应混合物在重复的加热和冷却步骤中循环。加热循环使双链核酸靶标变性或分解成单链模板。在冷却循环中，引物与模板上的互补序列结合。在模板被引发后，核酸聚合酶产生了原始模板的拷贝。重复循环在每个循环中以指数方式将靶标扩增2倍，导致靶标序列在30个循环中增加约10亿倍(Saiki等人，1988)。
数字PCR是这样的过程，也就是将包含一个或多个靶标的样品分成多个分区(例如，孔、微滴等)，在每个分区中进行PCR反应，并记录由例如靶标特异性报告探针产生的荧光。这通常在数字PCR仪上进行，该PCR仪通过一个或多个激发/发射滤波器组测量光学通道中来自每个分区的荧光。
通常，靶标特异性核酸探针是与扩增靶标的一条链互补的短寡核苷酸。所述探针缺少3’羟基，并且因此不可通过DNA聚合酶延伸。TaqMan(ThermoFisher Scientific)化学法是用于多重实时PCR的常见的报告探针方法(Holland等人，1991)。TaqMan寡核苷酸探针用荧光团和猝灭标签(即猝灭剂)共价修饰。在这种结构中，荧光团产生的荧光被猝灭，并且无法被实时PCR仪检测到。当感兴趣的靶标存在时，探针寡核苷酸碱基与扩增靶标配对。当结合时，其被Taq聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性消化，从而将荧光团与猝灭剂物理分离并释放信号以供实时PCR仪检测。
可通过将每个分析物编码为唯一的强度值来进行单个测量中的多个分析物的多重分析。例如，为了使用一次测量来检测样品中的多个多核苷酸分析物，可以以不同的浓度提供杂交探针，使得由探针生成的每个信号的强度(无论是单独地还是组合地)都是唯一的。表1示出了示例反应混合物，该混合物经配制可在单个荧光聚合酶链反应(PCR)测量中独特地检测三个核酸的任何组合。
表1
| 荧光探针 | 正向引物 | 反向引物 | |
| 靶标A | 300nM | 1200nM | 1200nM |
| 靶标B | 600nM | 1200nM | 1200nM |
| 靶标C | 1200nM | 1200nM | 1200nM |
在这种情况下，PCR反应结束时荧光测量值的最终输出强度是输入探针浓度的线性组合，以使所有探针在存在靶标的反应中耗尽，并且每种可能的靶标组合导致独特的最终荧光强度。在这种情况下，生成的信号强度可与样品中存在的靶标直接相关，如表2所示。
表2
使用这种完全非简并的方法进行多重分析可能需要足够的测定条件才能生成和测量每个信号强度水平。例如，可能需要提供探针浓度，以使其在每种可能的组合下产生足够不同的强度水平，并且信号检测方法必须能够检测每个唯一的强度水平。本文认识到需要用于明确检测来自样品的多个分析物的方法和组合物，该方法和组合物使这种检测所需的条件(例如，试剂浓度、测量能力等)最小化。
定义
如本文所用的，术语“互补性”或“互补的”可指核酸或核酸区域的性质，其中该核酸在给定的一组条件下能够结合、退火或以其他方式附接至另一核酸。与另一核酸的区域具有互补性的核酸区域可以包含与另一核酸上的核苷酸互补的核苷酸。互补性可以具有不同的程度。例如，核酸区域可以与另一核酸的区域具有约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约99％至约100％或约100％的互补性。互补性的程度可以描述在适当条件下能够与另一核酸附接的核酸的部分。互补性的程度可以描述包含与另一核酸上的核苷酸互补的核苷酸的核酸的量。具有互补性的核酸可以是双链核酸。具有互补性的核酸可以是单链核酸。与另一单链核酸互补的单链核酸在适当条件下能够与另一单链核酸的区域结合。一种互补核酸与另一种互补核酸结合的适当条件可以包括适当的缓冲液条件和适当的温度条件。适当的缓冲液条件可以包括适当的盐浓度，如钠盐、镁盐或钾盐的浓度。适当的温度条件可以包括适合于一种核酸与另一种核酸结合的退火温度。尽管与另一核酸具有互补性的核酸在适当的条件下可以与另一核酸结合，但是在不合适的条件下，例如在不合适的盐浓度或温度条件下，同一核酸可能无法结合。
如本文所用的，术语“同源的”或“同源性”可指核酸或核酸区域的性质，其中该核酸包含与另一核酸中包含的核苷酸相同的核苷酸。与另一核酸同源的核酸可以包含一个或多个与所述另一核酸上的核苷酸相同的核苷酸。同源性可以具有不同的程度，这取决于相同核苷酸的数目。与另一核酸的区域同源的核酸区域可以具有一定程度的同源性。例如，核酸区域可以与另一核酸的区域具有约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约99％至约100％或约100％的同源性。
概述
本公开内容提供了用于高度多重化的生化测定的方法和组合物，其可用于从样品中检测多个分析物。本公开内容的测定可用于非简并地从样品中检测三个或更多个分析物。相对于现有的多重测定，所公开的方法和组合物可需要较少数量的信号强度水平。
在一个实例中，可以通过qPCR在单个颜色通道中检测来自生物样品的三个或更多个核酸分析物。可以如表3所示提供荧光探针和合适的引物。
表3
| 荧光探针 | 正向引物 | 反向引物 | |
| 靶标A | 300nM | 1200nM | 1200nM |
| 靶标B | 600nM | 1200nM | 1200nM |
| 靶标C | 900nM | 1200nM | 1200nM |
在这种情况下，只需六种荧光强度水平即可测量分析物的任何组合，如表4所示。然而，该测量值包括3x荧光强度水平的简并性。在此示例中，3x强度水平的测量值将指示靶标A和靶标B两者的存在或靶标C的存在。如果没有附加的信息，则结果将不明确。
表4
如本文所述，可以获得关于靶标分析物的附加信息，并将其与测量的结果进行比较，从而解决不确定性。附加信息可以是例如，统计表、期望的临床结果或附加测量的结果。
测定
在一些方面，本公开内容提供了用于明确检测样品中多个分析物的存在或不存在的测定。所公开的测定可以检测以存在或不存在的任何组合形式的至少三个分析物的每个的存在或不存在，而无需使用以下中的一个或多个：分析物的固定、质谱分析、显微镜检查、流式细胞术或熔解曲线分析。分析物的检测可以通过使用两个或更多个反应来完成。例如，用于测量多个分析物的测定可以包括第一反应和第二反应。单独的第一反应和第二反应可能都无法非简并地检测分析物的任何组合的存在或不存在。第一和第二反应的结果可以一起明确地检测每个分析物的存在或不存在。
可以使用本公开内容的测定来检测任何数目的分析物。在一些情况下，测定可以明确地检测至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50个或更多个分析物。在一些情况下，测定可以明确地检测至多50、40、30、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个分析物。测定可以包括任何数目的反应，其中这些反应的结果一起确定多个分析物的存在或不存在的任何组合。测定可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个反应。单独的每个反应可能无法非简并地检测分析物的任何组合的存在或不存在。然而，每个反应的结果可以一起明确地检测每个分析物的存在或不存在。
反应可以在相同的样品溶液体积中进行。例如，第一反应可以在第一颜色通道中生成荧光信号，而第二反应可以在第二颜色通道中生成荧光信号，从而生成两个测量值以供比较。或者，可以在不同的样品溶液体积中进行反应。例如，第一反应可以在第一样品溶液体积中进行，并在给定的颜色通道中生成荧光信号，而第二反应可以在第二样品溶液体积中进行，并在相同的颜色通道或不同的颜色通道中生成荧光信号，从而生成两个测量值以供比较。
反应可以在单个分区(例如，孔)中进行。反应可以在多个分区(例如，多个微滴)中进行。反应可以包括聚合酶链反应(PCR)。反应可以包括例如定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)或微滴数字PCR(ddPCR)。在一些情况下，单个反应包括单个PCR反应(例如，qPCR、dPCR、ddPCR)。可以比较两个或更多个反应(例如，PCR反应)的结果，从而明确地检测多个分析物的任何组合的存在或不存在。
反应可以包括生成累积信号测量值。本公开内容的测定可以包括比较两个或更多个累积信号测量值，以明确地检测样品中分析物的任何组合。累积信号测量值可以包括从提供给样品溶液的一个或多个探针生成的一种或多种信号。累积信号测量值可以是信号强度水平，其对应于从多个杂交探针生成的信号的总和。例如，两个探针可以各自与分析物(例如，核酸分析物)结合，其中每个探针生成给定波长的1x强度的信号。这些信号的测量将生成与两个信号强度之和相对应的累积信号测量值，即2x信号强度。
反应可以包括不确定性。不确定性可以是无法明确地鉴别样品中分析物的单个组合的信号。例如，反应可生成2x强度水平的信号。基于反应的编码(例如，反应中存在的杂交探针的浓度)，2x强度水平可以对应于一种以上的分析物的组合，从而包括不确定性。可以通过进行一个或多个附加反应来解决不确定性，从而解决不确定性。例如，第二反应可生成3x信号强度水平，其中来自第一反应的2x信号强度水平和来自第二反应的3x信号强度水平两者的存在唯一地识别样品中分析物的给定组合。
测定可以包括根据解决不确定性所必需的信息，从反应选择中选择两个或更多个反应。例如，第一反应可以包括第一信号水平和第二信号水平的不确定性。对应于第一信号水平的结果可以确定解决不确定性所必需的第一附加反应，而对应于第二信号水平的结果可以确定解决不确定性所必需的第二附加反应。
分析物检测的方法
在一些方面，本公开内容提供了用于检测样品中多个分析物的存在或不存在的方法。分析物可以是多核苷酸分析物(例如，DNA、RNA等)。首先，可以使样品的子集与第一多个杂交探针接触。每个杂交探针可以对应于多核苷酸分析物(例如，可以结合至多核苷酸分析物的区域)。可以产生包括从第一多个杂交探针产生的一种或多种信号的第一累积信号测量值，该第一累积信号测量值可能无法非简并地识别至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在。接下来，可以使样品的一个或多个附加的子集与一个或多个附加的多个杂交探针接触。每个杂交探针可以对应于多核苷酸分析物(例如，可以结合至多核苷酸分析物的区域)。可以产生一个或多个附加的累积信号测量值，每个测量值包括从一个或多个附加的多个杂交探针产生的一个或多个附加的信号。一个或多个附加的累积信号测量值可能无法非简并地识别至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在。最后，可以将第一累积信号测量值与一个或多个附加累积信号测量值进行比较。比较可以唯一地识别样品中多核苷酸分析物的任何组合。
在一些方面，本公开内容提供了用于检测样品溶液体积中多个分析物的存在或不存在的方法。分析物可以是多核苷酸分析物(例如，DNA、RNA等)。首先，可以提供包括或可能包括多个分析物的样品溶液体积。样品溶液可以源自样品，例如来自受试者的样品。接下来，可以使样品溶液体积与多个杂交探针接触，如果样品溶液体积中存在多个分析物中的一个或多个，则可以激发该杂交探针以产生累积信号测量值。累积信号测量值可以包括不确定性。不确定性可以是对应于一种以上的分析物组合的信号强度水平。接下来，可以接收关于多核苷酸分析物的信息集。该信息集可以包括例如附加的累积信号测量值、统计表或期望的临床结果。最后，可以将累积信号测量值与信息集进行比较，其中比较的结果解决了不确定性，从而检测到分析物的存在或不存在。
在一些情况下，本公开内容的方法可能能够在不使用以下一项或多项的情况下检测多个分析物的存在或不存在：分析物的固定、质谱分析、显微镜检查、流式细胞术或熔解曲线分析。能够通过所公开的方法检测的以存在或不存在的任何组合形式的分析物的数量可以是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多。与样品溶液体积或样品子集接触的独特杂交探针的数量可以小于样品溶液体积中的多核苷酸分析物的数量。或者，与样品溶液体积或样品子集接触的独特杂交探针的数量可以等于样品溶液体积中的多核苷酸分析物的数量。
信息集可以包括统计表。统计表可以包括关于样品中存在给定分析物的可能性的信息。可以将统计表与累积信号测量值进行比较，从而解决不确定性。在一个实例中，从给定样品类型产生的累积信号测量值可以对应于单独存在靶标C或共同存在靶标A或B的情况。统计表可能包含有关靶标A和靶标B的信息，该信息表明在给定的样品类型中不会同时出现靶标A和靶标B。因此，在此实例中，将累积信号测量值与统计表进行比较可以明确地识别出仅存在靶标C。
信息集可以包括期望的临床结果。期望的临床结果可以是对患者的治疗策略的鉴定。测定的期望临床结果可以是针对患者的治疗策略的鉴定，其中患者怀疑被细菌剂或病毒剂感染。可以将累积信号测量值与临床结果进行比较，从而解决不确定性。例如，累积信号测量值可以对应于大量病毒基因中的任一种的存在和大量细菌基因中的任一种的不存在。可以将累积信号测量值与期望的临床结果进行比较，即确定临床医生是否应该用抗菌剂或抗病毒剂治疗患者。该比较的结果可以明确表明临床医生应使用抗病毒剂治疗患者。
信息集可以包括附加的累积信号测量值，其中附加的累积信号测量的结果能够解决不确定性。附加的累积信号测量值可以包括对应于多核苷酸分析物的独特组合的信号。备选地，附加的累积信号测量值可以包括对应于多核苷酸分析物的一个以上的组合的信号。将累积信号测量值与附加的累积信号测量进行比较可以解决不确定性。这可以独特地检测样品中多核苷酸分析物的给定组合。
测量编码
在一些情况下，可以通过使用一个或多个附加的测量结果来解决简并性。例如，第二测量值(例如，来自第二反应)可以能够解决简并性。可以使用与第一反应不同的编码方案来进行第二反应，以使得第一反应和第二反应的结果的比较非简并地识别分析物的任何组合。表5示出了两个反应的示例，每个反应均包含不同的编码方案。
表5
在这种情况下，反应1中编码了三个靶标，而反应2中仅编码了两个靶标。反应2的结果可用于解决反应1中“3x”信号强度水平的简并。通过比较两个反应的结果，这减少了非简并检测分析物任何组合所需的信号强度水平的数量。
图1A-1C示意性地示出了如何比较两个测量值(每个测量值分别不能独立地从样品中非简并地检测分析物的任何组合)以明确地识别分析物的任何组合。图1A示出了三个靶标分析物(A、B和C)的每个可能的组合的第一测量的结果。该测量包括在3x信号强度水平上的不确定性，其可以表示靶标C的存在或靶标A和B的组合的存在。图1B示出了第二测量的结果，该测量仅能够检测两种靶标分析物：A和B。图1C示出了两次测量的比较结果，它们可以共同独特地识别分析物的任何组合。
如本文所述，使用两个反应来非简并性地识别分析物的任何组合可产生稀疏代码空间，其可用于错误校正和估计。例如，表6示出了基于表5中的反应方案用于检测三个分析物的双反应测定的解码矩阵。根据来自孔1(反应1)和孔2(反应2)的信号强度识别每个分析物。例如，孔1和孔2中均为2x强度水平表明存在靶标B。
表6
| 孔1\孔2 | 0x | 1x | 2x | 3x | 4x | 5x | 6x |
| 0x | 无 | 无效 | 无效 | C | 无效 | 无效 | 无效 |
| 1x | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 |
| 2x | 无效 | 无效 | B | 无效 | 无效 | BC | 无效 |
| 3x | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 |
| 4x | 无效 | A | 无效 | 无效 | AC | 无效 | 无效 |
| 5x | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 | 无效 |
| 6x | 无效 | 无效 | 无效 | AB | 无效 | 无效 | ABC |
可以设计用于相同的两个反应的解码矩阵，以便在任何单个反应中均能抵抗1个单位的强度误差，如表7所示。在这种情况下，可以肯定地识别使用单个反应方案只能识别为错误的结果。例如，孔1中可能产生比预期靶标B较低或较高的强度水平(例如，由于PCR反应中的错误)，但当其与孔2中的预期2X强度水平结合时，仍可用于肯定地识别靶标B的存在。
表7
在一些情况下，单个反应可能包含两个测量值，在进行比较时，可以将它们用于明确检测分析物的任何组合。可以将样品子集(例如，在多个分区中或在单个样品溶液体积中提供)与第一多个杂交探针接触以产生第一累积信号测量值，所述第一累积信号测量值无法非简并地指示多个分析物的任何组合的存在或不存在。所述第一多个杂交探针可以被附接至荧光团，每个荧光团均能够在第一信号通道中被检测。第一多个杂交探针中的每个荧光团可以是相同的荧光团。第一多个杂交探针中的每个荧光团可以是不同的荧光团，其中所有荧光团都能够在同一信号通道中被检测。接下来，可以将样品子集(例如，在多个分区中或在单个样品溶液体积中提供)与第二多个杂交探针接触以产生第二累积信号测量值，所述第二累积信号测量值无法非简并地指示多个分析物的任何组合的存在或不存在。所述第二多个杂交探针可以被附接至荧光团，每个荧光团均能够在第二信号通道中被检测。第二多个杂交探针中的每个荧光团可以是相同的荧光团。第二多个杂交探针中的每个荧光团可以是不同的，其中所有荧光团都能够在同一信号通道中被检测。可以将第一累积信号测量值与第二累积信号测量值进行比较，从而非简并地指示多个分析物的任何组合的存在。在一些情况下，需要一个以上的附加累积信号测量值来解决第一累积信号测量值的不确定性。可能需要两个、三个、四个或更多个附加测量值，以使仅比较所有信号测量值非简并地指示多个分析物的任何组合的存在。
图5示出了使用七个离散强度水平(0x-6x)非简并地解析三个分析物所需的每个孔的平均靶标数目，其中P是仅第三个分析物(例如靶标C)或第一个分析物和第二个分析物(例如，靶标A和B)在给定样品中存在的概率。当P＝0时，可使用单个孔来解析所有三个靶标。当P＝1时，每个孔可解析1.5个靶标，因此可以使用两个孔解析所有三个靶标。对于P<0.5，仅使用七个离散强度水平就可以对靶标进行非简并测量而超出Shannon信息带宽限制。
第二反应可以与第一反应并行进行。第二反应可以在第一反应之后进行。在一些情况下，仅在第一反应包括简并性的情况下才进行第二反应。例如，来自第一样品的第一反应可以产生信号测量值，该信号测量值可明确地分配给分析物的给定组合，从而不需要第二反应。然而，来自第二样品的第一反应可能产生不能明确分配给分析物的给定组合的信号测量值(例如，可以代表多个可能的分析物组合)，从而需要使用第二测量值来解决不确定性。
表8示出了一种针对22个分析物的编码方案示例，其中一个分析物是常见的病毒基因，而其他21个分析物是个体中很少存在的病毒基因。
表8–反应1
| 强度(x) | 编码方案 | 所有代码 | 下一步 |
| 7 | AP|AQ|AR|AS|AT|AU|AV | 反射面板3 | |
| 6 | PQRSTUV | P|Q|R|S|T|U|V | 反射面板3 |
| 5 | AI|AJ|AK|AL|AM|AN|AO | 反射面板2 | |
| 4 | IJKLMNO | I|J|K|L|M|N|O | 反射面板2 |
| 3 | AB|AC|AD|AE|AF|AG|AH | 反射面板1 | |
| 2 | BCDEFGH | B|C|D|E|F|G|H | 反射面板1 |
| 1 | A | A | A存在 |
| 0 | 无靶标 |
根据第一反应的结果，可以选择附加的反应(“反射面板”)来解决任何简并。表9-11示出了可用于解决反应1的简并的三个附加反应。重要的是，仅需要一个附加反应即可完全解析21个稀有基因中任何一个的存在。
表9–反射面板1
表10–反射面板2
表11–反射面板3
Sidon序列
在一些方面，本公开内容的方法用于从样品中鉴定许多分析物，其中预期样品中存在不超过给定数目的分析物。例如，可以使用方法来检测对应于罕见突变或罕见疾病的多核苷酸分析物。在这些示例中，可采用更有效的编码方案。例如，如果预期在任何给定样品中最多仅存在两个靶标，则可使用Sidon编码序列。Sidon序列是自然数A＝{a0，a1，a2，...}的序列，其中集合中任何数值对ai+aj(i≠j)的和是唯一的。有效的Sidon序列(包括0)将导致靶标的任何成对组合对于0和单个靶标的任何组合都是唯一的，从而满足零、一个或两个靶标独特编码的要求。
表12示出了Sidon序列的实例。
表12
| 序列 | 备注 |
| 1，2，4，8 | Sidon序列，也是最佳的非简并编码 |
| 1，2，4，7 | Sidon序列，与一个三靶标组合冲突(1+2+4＝7) |
Golomb尺(Golomb ruler)是沿着稀疏标尺在整数位置处的一组数字，这样任意两对标志物之间的距离都是唯一的。所有Sidon序列均为Golomb尺，而所有Golomb尺均为Sidon序列。最佳的短Golomb尺已被制表，最多可制27个。最佳Golomb尺包含零，并保证在两个靶标之间无冲突。作为一个实例，考虑使用具有256个离散水平的8位传感器进行荧光测量。在最大密度的非简并编码中，通过将靶标编码为集合A＝{1，2，4，8，16，32，64，128}，可以唯一地解析8个靶标。使用基于Golomb尺的简并编码方案，可以将13个靶标唯一地编码为集合A＝{4，6，20，35，52，59，77，78，86，89，99，122，127}。此集合中的一个或两个靶标的每种组合都是唯一的，并且(122+127)的最大值为249，低于示例传感器中的256阈值。如表13所示，这种编码在更高水平的靶标多重化时更为有效。对于给定的应用，最佳Golomb尺可能是也可能不是最密集的编码。例如，对于四个靶标，可以使用[1，2，4，7]的编码。另外，图6示出了每个靶标所需的强度水平的数量的增长率现在是次指数的，从而允许显著提高编码密度。所公开的方法可以扩展为在两个、三个或更多个独立的测量通道上为多达三个、四个或更多个靶标定义空间，以确保在同一反应内或一个或多个附加的反应中正确调用应用的适当速率。
表13
在一些情况下，提供了包含多个杂交探针的组合物，每个探针对应于多个多核苷酸分析物之一。组合物可包含给定量的每个杂交探针，使得当每个杂交探针被激发并与其对应的多核苷酸分析物接触时，产生累积强度信号，其中从累积强度信号产生的累积信号测量值形成了Sidon序列。组合物可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或更多个杂交探针。组合物中的每个杂交探针可以处于不同的浓度。组合物中每个杂交探针的浓度可形成Sidon序列。例如，组合物可以包括七个杂交探针，其中第一杂交探针的浓度为1X，第二杂交探针的浓度为4X，第三杂交探针的浓度为9X，第四杂交探针的浓度为15X，第五杂交探针的浓度为22X，第六杂交探针的浓度为32X以及第七杂交探针的浓度为34X。
反应
本公开的方法可以包括一个或多个反应。反应可以包括使一个或多个分析物与一个或多个杂交探针接触。反应可包括核酸延伸。反应可包括核酸扩增。核酸扩增可包括例如，线性扩增、等温扩增或聚合酶链反应(PCR)。核酸扩增的各种方法可以用于本公开内容的反应中。在一些情况下，反应包括定量PCR(qPCR)。在一些情况下，反应包括数字PCR(例如，微滴数字PCR)。
反应可以生成一种或多种信号。反应可以生成包含多个信号之和的累积强度信号。信号可以是荧光信号。信号可以由杂交探针生成。例如，激发包含发光信号标签的杂交探针可以生成信号。信号可以由荧光团生成。荧光团可以在从杂交探针上释放时生成信号。反应可以包括荧光团的激发。反应可以包括信号检测。反应可以包括检测来自荧光团的发射。
反应可以包括使多核苷酸分析物与一个或多个杂交探针接触。反应可包括使样品溶液体积与多个杂交探针接触，每个探针对应于多个多核苷酸分析物之一，以产生包括从多个杂交探针产生的一种或多种信号的累积信号测量值。在一些情况下，来自单个反应的累积信号测量值无法非简并地识别多个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在。如本文所公开的，可以比较两个或更多个累积信号测量值，从而非简并地指示以存在或不存在的任何组合形式的多个分析物的存在或不存在。
本公开内容的方法可以包括任何数量的反应。方法可以包括至少1、2、3、4、5或更多个反应。在一些情况下，所公开的方法仅包括两个反应。在一些情况下，所公开的方法包括单个反应。
分区
本公开内容的方法可以包括将样品的子集(例如，包含多核苷酸分析物)、杂交探针并且在一些情况下将附加试剂划分到多个分区中。分区可以是微滴。分区可以是乳液。分区可以是孔。分区可以是微孔。可使用微流体装置进行分区。在一些情况下，使用微滴生成器进行分区。分区可包括将混合物(例如，包含多核苷酸分析物和核酸探针的混合物)分到油包水微滴中。微滴可包含一个或多个多核苷酸分析物。微滴可包含单个多核苷酸分析物。微滴可包含两个或更多个多核苷酸分析物。微滴可不包含多核苷酸分析物。多个微滴中的每个微滴可以生成信号。累积信号测量值可以包括由包含样品子集的多个微滴中的每个微滴生成的信号。
杂交探针
杂交探针可以是寡核苷酸探针。杂交探针可以是与给定核酸靶标或分析物的区域互补的核酸。在本公开内容的方法和测定中使用的每个杂交探针可包含至少一个荧光团。荧光团可以选自任何数目的荧光团。荧光团可以选自三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个荧光团。在单个反应中使用的一个或多个杂交探针可包含相同的荧光团。在一些情况下，在单个反应中使用的所有杂交探针均包含相同的荧光团。每个杂交探针在被激发并与其对应的分析物接触时可产生信号。信号可以是荧光信号。累积信号测量值可以包括从一个或多个杂交探针生成的一个或多个信号。
杂交探针可以包含信号标签。信号标签可以包含生成信号的手段，例如荧光团。荧光团可以是例如FAM、TET、HEX、JOE、Cy3或Cy5。杂交探针可以进一步包含一个或多个猝灭剂。猝灭剂可以抑制(即，猝灭)荧光团的信号生成。猝灭剂可以是，例如，TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或Dabcy。在一些情况下，杂交探针是水解探针。水解探针可以是例如
探针(Applied BiosystemsTM)。
杂交探针可以对应于多核苷酸分析物。例如，杂交探针可以与多核苷酸分析物具有互补性和/或同源性。杂交探针可以包含与多核苷酸分析物的区域互补或同源的区域。对应于多核苷酸分析物的杂交探针可能能够在合适的条件(例如，温度条件、缓冲液条件等)下与多核苷酸分析物结合。例如，杂交探针可能能够在适合于聚合酶链反应的条件下与多核苷酸分析物结合。杂交探针可以对应于与多核苷酸分析物相对应的寡核苷酸。例如，寡核苷酸可以是具有与多核苷酸分析物互补的区域和与杂交探针互补的区域的引物。
样品和分析物
本公开内容的分析物可以源自任何来源，包括例如，病毒、细菌细胞和真核细胞。分析物可以是多核苷酸(即，核酸)分析物。多核苷酸分析物可以源自一个或多个细胞。细胞可以是肿瘤细胞。细胞可以是疑似包含病毒病原体的细胞。在一些情况下，多核苷酸分析物源自无细胞样品(例如，血清、血浆)。多核苷酸分析物可以是无细胞核酸。无细胞核酸可以是例如无细胞肿瘤DNA、无细胞胎儿DNA、无细胞RNA等。多核苷酸分析物可包含脱氧核糖核酸(DNA)。DNA可以是任何种类的DNA，包括基因组DNA。多核苷酸分析物可以是病毒DNA。多核苷酸分析物可包括核糖核酸(RNA)。RNA可以是任何种类的RNA，包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA和微小RNA。RNA可以是病毒RNA。多核苷酸分析物可包含其检测可用于诊断一种或多种疾病的基因。基因可以是其检测可用于鉴定受试者中病原体的存在或不存在的病毒基因或细菌基因。在一些情况下，本公开内容的方法可用于检测受试者中一种或多种感染剂(例如，病毒)的存在或不存在。在一些情况下，本公开内容的方法可用于检测来自受试者的无细胞核酸样品中胎儿核酸的相对量，从而诊断胎儿的一种或多种遗传异常。在一些情况下，本公开内容的方法可用于检测来自受试者的无细胞核酸样品中肿瘤DNA的存在或不存在，从而诊断受试者的癌症。
试剂盒
本文还提供了用于检测样品是否存在多个分析物的试剂盒。试剂盒可包括一个或多个杂交探针。杂交探针可以被冻干。杂交探针可以以不同的浓度存在。杂交探针可包含信号标签，该信号标签可包含，例如，荧光团和一种或多种猝灭剂。试剂盒可以包括一个或多个寡核苷酸引物，例如，用于进行PCR。一个或多个所述寡核苷酸引物可以被冻干。在一些情况下，所有寡核苷酸引物都可以被冻干。试剂盒可包含一种或多种核酸酶。核酸酶可以是核酸聚合酶。核酸聚合酶可以是脱氧核糖核酸聚合酶。核酸酶可以是RNA酶。RNA酶可以是RNA酶III。RNA酶III可以是切酶。核酸酶可以是内切核酸酶。内切核酸酶可以是内切核酸酶I。内切核酸酶I可以是T7内切核酸酶I。试剂盒可以包含关于在本文所述的方法中使用任何前述物质的说明书。
实施例
实施例1
将引物、核酸杂交探针和聚合酶的混合物添加到包含一个或多个针对甲型流感病毒(FluA)、呼吸道合胞病毒A(RsvA)和/或呼吸道合胞病毒B(RsvB)的合成DNA靶标的样品中。对于每种独特的靶标组合，使用表14中所示的引物和探针浓度进行了两次qPCR反应。使用Luna通用探针一步酶反应混合物，通过Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统进行每个反应。循环条件由以下组成：在95℃下初始变性60秒，然后在95℃下进行30秒、然后在57℃下进行120秒的循环参数。如果存在靶标，则每个反应存在105个拷贝。
表14
图3示出了由反应1(测量1)和反应2(测量2)从靶标和无模板对照(NTC)的每种组合产生的qPCR曲线。收集一式三份的每个组合的数据。单独的测量1和测量2无法识别靶标的每种组合。图4示出了两次测量的比较结果，作为来自图3的每个qPCR曲线的最终强度的二维图。靶标的每个唯一组合都呈现在二维图中的不同位置，从而识别靶标的每个组合。一式三份的测量值在图上生成离散的簇，从而可以进行准确的误差校正。例如，所有三个靶标(FluA+RSVA+RSVB)的三次测量之一显示出低于测量1的预期强度值，但呈现出测量2的预期强度值。通过对两个反应的分析，可以将该数据点标识为“无呼叫”，可以将其很容易地从分析中弃去。相反，仅使用单个测量，就可以已将该数据点错误地标识为其他靶标组合。
实施例2
将引物、核酸杂交探针和聚合酶的混合物添加到包含一个或多个针对FluA、乙型流感病毒(FluB)、RsvA和/或RsvB的合成DNA靶标的样品中。将用FAM荧光团标记的引物和核酸探针按探针比例配制成混合物，以产生对应于Sidon序列{1，2，4，7}的信号。然后使用Taq聚合酶、引物/探针混合物以及每个单靶标和双靶标组合的105拷贝/反应，在AppliedBiosystems 7500快速实时PCR系统上生成PCR曲线。每个实验条件运行三次。循环条件由以下组成：在95℃下60秒的初始变性步骤，然后在95℃下进行30秒、然后在57℃下进行120秒的45个循环。
图7示出了由这些反应中的每个产生的qPCR曲线。靶标的每对组合都会产生离散的终点荧光信号强度。图8示出了针对给定靶标组合的每个重复的簇，基于荧光强度将其分成不同的箱。该数据显示使用该Sidon序列的正呼叫准确率(positive call accuracyrate)为93.1％。
实施例3
表15示出了使用12-靶标滚动码方案的示例性呼吸道病毒检测面板。产生了各自对表15中的一个靶标具有特异性的引物和杂交探针的配方，从而将产生与表15中的方案相对应的信号。为了测试该方案，使用该配方测试了一系列稀释的合成模板。
表15
对于零、一、两个或三个靶标的每种组合，此编码方法导致完全非简并的解空间，而四个或更多靶标的一些组合将无法解决不确定性。表16列举了不确定性状态的一些示例。
表16
因此，无法将存在四个靶标B、E、I、L的样品与具有四个靶标D、G、J、K的样品区分开。为了测试该方法，以此方法，如表17所示配制十二个呼吸道病毒靶标。在这种情况下，等效的不确定性状态将是带有腺病毒、副流感病毒3、副流感病毒1和RSVA的样品以及带有RSVB、FluA H1、偏肺病毒和FluA Pan标志物的样品，这取决于预期的样品群体被认为是极为罕见的。如表18所示，对该配方测试了一系列稀释的合成模板。
表17
表18
将引物/探针混合物与合成模板按表18所示的靶标组合进行组合，并在AppliedBiosystems Viia7系统上与可商购的Taq聚合酶一起运行在95℃下进行15秒，在60℃下进行2分钟，然后在95℃下进行初始变性60秒的70个循环。靶标呼叫(Target call)由多维荧光强度空间中的簇分配，其结果如图9所示。可以使用许多分类靶标的方法来构造任何这种简单的解码算法。
实施例4
构建了制剂，使得BioRad CX100系统上由于在微滴中存在任一个靶标而导致的荧光强度映射到该系统的荧光学通道1(FAM)上的相同位置。使用含有约20,000个拷贝的RSVA合成模板、约20,000个拷贝的鼻病毒(RhV)合成模板或同时包含这两种模板的孔进行了测试。该实验的结果如图11所示。生成的数据不能用于解决两个靶标之间的不确定性，然而如果为了做出临床决策不需要解决两个靶标之间的不确定性，则可以基于这些结果无视不确定性做出临床决策。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。说明书中提供的具体示例不意在限制本发明。虽然本发明已经参考前述说明书进行了描述，但本文实施方案的描述和说明并不意味着以限制的意义来解释。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到许多变化、改变和替代。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的依赖于各种条件和变量的具体描述、配置或相对比例。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，考虑到本发明还将覆盖任何这样的替代、修改、变化或等同项。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。
Claims (101)
1.一种检测样品中以存在或不存在的任何组合形式的至少三个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品的第一子集与第一多个杂交探针接触以产生第一累积信号测量值，所述第一累积信号测量值包括从所述第一多个杂交探针产生的一个或多个信号，其中所述第一累积信号测量值无法非简并地识别所述至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在；
(b)使所述样品的一个或多个附加的子集与一个或多个附加的多个杂交探针接触以产生一个或多个附加的累积信号测量值，每个测量值包括从所述一个或多个附加的多个杂交探针产生的一个或多个附加的信号，其中所述一个或多个附加的累积信号测量值中的每个都无法非简并地识别所述至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在；以及
(c)将所述第一累积信号测量值与所述一个或多个附加的累积信号测量值进行比较，其中所述比较独特地识别所述样品中多核苷酸分析物的任何组合，从而检测所述样品中以存在或不存在的任何组合形式的所述至少三个多核苷酸分析物的存在或不存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一子集和所述一个或多个附加的子集分别处于相同的溶液体积中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一子集和所述一个或多个附加的子集分别处于不同的溶液体积中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一子集和所述一个或多个附加的子集分别被提供在多个分区中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一子集和所述一个或多个附加的子集分别被提供在多个孔中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个中的独特杂交探的数量小于或等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针是寡核苷酸探针。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针各自包含荧光团。
10.根据权利要求9所述的方法，其中产生所述第一累积信号测量值和所述一个或多个附加的累积信号测量值包括激发所述荧光团并检测从每个荧光团产生的信号。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个杂交探针包括能够在相同的光学通道中被检测到的荧光团。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个杂交探针包括相同的荧光团。
13.根据权利要求1所述的方法，其中以不同的浓度提供所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个杂交探针。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少三个多核苷酸分析物是至少七个多核苷酸分析物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述第一累积信号测量值和所述一个或多个附加的累积信号测量值包括聚合酶链反应(PCR)。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一累积信号测量值和所述一个或多个附加的累积信号测量值包括信号强度。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一累积信号测量值包括不确定性，并且其中所述一个或多个附加的累积信号测量值解决所述不确定性。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、显微镜检查、流式细胞术、所述多核苷酸分析物的物理分离、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个对应于所述至少三个多核苷酸分析物之一。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个杂交探针和所述一个或多个附加的多个杂交探针中的每个与所述至少三个多核苷酸分析物之一具有互补性。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述PCR是数字PCR。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述PCR是定量PCR。
23.一种检测样品中以存在或不存在的任何组合形式的至少三个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)提供第一样品溶液体积和第二样品溶液体积，每个包含或可能包含所述至少三个多核苷酸分析物；
(b)使所述第一样品溶液体积与第一多个杂交探针接触，所述第一多个杂交探针各自对应于所述多核苷酸分析物之一，以产生第一累积信号测量值，所述第一累积信号测量值包括从所述第一多个杂交探针产生的一个或多个信号，其中所述第一累积信号测量值无法非简并地识别所述至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在；
(c)使所述第二样品溶液体积与第二多个杂交探针接触，所述第二多个杂交探针各自对应于所述多核苷酸分析物之一，以产生第二累积信号测量值，所述第二累积信号测量包括从第二多个杂交探针产生的一个或多个信号，其中第二累积信号测量无法非简并地识别所述至少三个多核苷酸分析物的任何组合的存在或不存在；以及
(d)将所述第一累积信号测量值与所述第二累积信号测量值进行比较，其中所述比较独特地识别所述样品中多核苷酸分析物的任何组合，从而检测样品中以存在或不存在的任何组合形式的至少三个多核苷酸分析物的存在或不存在。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一样品溶液体积和第二样品溶液体积来源于所述样品。
25.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
27.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第二多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于所述至少三个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
29.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一多个杂交探针是寡核苷酸探针。
30.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一多个杂交探针各自包含荧光团。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的每个杂交探针包括能够在相同的光学通道中被检测到的荧光团。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的每个杂交探针包括相同的荧光团。
33.根据权利要求14所述的方法，其中以不同的浓度提供所述第一多个杂交探针中的每个杂交探针。
34.根据权利要求30所述的方法，其中产生所述第一累积信号测量值包括激发所述荧光团并且检测从每个荧光团产生的所述信号。
35.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二多个杂交探针是寡核苷酸探针。
36.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二多个杂交探针各自包含荧光团。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二多个杂交探针中的每个杂交探针包括能够在相同的光学通道中被检测到的荧光团。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的每个杂交探针包括相同的荧光团。
39.根据权利要求14所述的方法，其中以不同的浓度提供所述第二多个杂交探针中的每个杂交探针。
40.根据权利要求36所述的方法，其中产生所述第二累积信号测量值包括激发所述荧光团并检测从每个荧光团产生的所述信号。
41.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少三个多核苷酸分析物是至少五个多核苷酸分析物。
42.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少三个多核苷酸分析物是至少七个多核苷酸分析物。
43.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一多个杂交探针和所述第二多个杂交探针是相同的。
44.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一多个杂交探针和所述第二多个杂交探针是不同的。
45.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一多个杂交探针包括(i)与所述至少三个多核苷酸分析物中的第一多核苷酸分析物相对应的第一杂交探针，以及(ii)对应于所述至少三个多核苷酸分析物中的第二个多核苷酸分析物的第二杂交探针，并且其中所述第二多个杂交探针包括(1)对应于所述至少三个多核苷酸分析物中的所述第一多核苷酸分析物的第三杂交探针以及(2)对应于第三多核苷酸分析物的第四杂交探针。
46.根据权利要求45所述的方法，其中以不同的浓度提供所述第三杂交探针和所述第一杂交探针。
47.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一累积信号测量值包括不确定性，并且其中所述第二累积信号测量值解决所述第一累积信号测量值的不确定性。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述不确定性是不能明确识别所述至少三个多核苷酸分析物的多核苷酸分析物的单个组合的信号。
49.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、显微镜检查、流式细胞术、所述多核苷酸分析物的物理分离、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。
50.一种检测样品中以存在或不存在的任何组合形式的多个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)提供第一样品溶液体积和第二样品溶液体积，每个包含或可能包含所述多个多核苷酸分析物；
(b)使所述第一样品溶液体积与第一多个杂交探针接触以产生第一累积信号测量值，所述第一累积信号测量值无法非简并地指示所述多个分析物的任何组合的存在或不存在；
(c)使所述第二样品溶液体积与第二多个杂交探针接触以产生第二累积信号测量值，所述第二累积信号测量值无法非简并地指示所述多个分析物的任何组合的存在或不存在；以及
(d)将所述第一累积信号测量值与所述第二累积信号测量值进行比较，从而非简并地指示以存在或不存在的任何组合形式的所述多个分析物的所述存在或不存在。
51.一种检测样品溶液体积中以存在或不存在的任何组合形式的多个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品溶液体积与第一多个杂交探针接触以产生第一累积信号测量值，所述第一累积信号测量值无法非简并地指示所述多个分析物的任何组合的存在或不存在，其中所述第一多个杂交探针被附接到能够在第一信号通道中被检测的荧光团；
(b)使所述样品溶液体积与第二多个杂交探针接触以产生第二累积信号测量值，所述第二累积信号测量值无法非简并地指示所述多个分析物的任何组合的存在或不存在，其中所述第二多个杂交探针被附接到能够在第二信号通道中被检测的荧光团；以及
(c)将所述第一累积信号测量值与所述第二累积信号测量值进行比较，从而非简并地指示以存在或不存在的任何组合形式的所述多个分析物的存在或不存在。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、显微镜检查、流式细胞术、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸分析物包括至少三个多核苷酸分析物。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸分析物包括至少七个多核苷酸分析物。
55.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
57.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，其中所述第二多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述第二多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
59.根据权利要求50-58中任一项所述的方法，其中在第一颜色通道中检测所述第一累积信号测量值，并且在第二颜色通道中检测所述第二累积信号测量值。
60.根据权利要求50-59中任一项所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的一个或多个对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个。
61.根据权利要求50-60中任一项所述的方法，其中所述第二多个杂交探针中的一个或多个对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个。
62.根据权利要求50-59中任一项所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的一个或多个对应于寡核苷酸的区域，所述寡核苷酸的区域对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个。
63.根据权利要求50-60中任一项所述的方法，其中所述第二多个杂交探针中的一个或多个对应于寡核苷酸的区域，所述寡核苷酸的区域对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个。
64.一种检测样品溶液体积中多个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(a)提供包含或可能包含所述多个多核苷酸分析物的样品溶液体积；
(b)如果所述样品溶液体积中存在所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个，则使所述样品溶液体积与多个杂交探针接触并激发所述杂交探针以产生累积信号测量值，其中所述累积信号测量值包括不确定性；
(c)接收关于所述多核苷酸分析物的信息集；以及
(d)将所述累积信号测量值与所述信息集进行比较，其中所述比较的结果解决了所述不确定性，从而检测到所述多个多核苷酸分析物的存在或不存在。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、显微镜检查、流式细胞术、所述多核苷酸分析物的物理分离、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中所述多个多核苷酸分析物包括至少三个多核苷酸分析物。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸分析物包括至少七个多核苷酸分析物。
68.根据权利要求64-67中任一项所述的方法，其中所述多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于或等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量等于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述第一多个杂交探针中的独特杂交探针的数量小于所述多个多核苷酸分析物中的独特多核苷酸分析物的数量。
71.根据权利要求64-70中任一项所述的方法，其中每个杂交探针包括至少一个荧光团。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述至少一个荧光团选自三个、四个、五个或六个荧光团。
73.根据权利要求64-72中任一项所述的方法，其中所述信息集包括在(a)之前生成的附加累积信号测量值，其中将所述累积信号测量值与所述附加累积信号测量值进行比较解决所述不确定性。
74.根据权利要求64-72中任一项所述的方法，其中所述信息集包括统计表，其中将来自所述统计表的数据与所述累积信号测量值进行比较解决所述不确定性。
75.根据权利要求64-72中任一项所述的方法，其中所述信息集包括期望的临床结果。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述期望的临床结果是对患者的治疗策略的鉴定。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述患者疑似感染了细菌剂或病毒剂。
78.一种测定，其包括：
(a)第一反应，其无法非简并地检测多个分析物的任何组合的存在或不存在；以及
(b)第二反应，其无法非简并地检测多个分析物的任何组合的存在或不存在；
其中所述第一反应和第二反应的结果明确地检测了至少三个分析物的每个的存在或不存在，而不需要所述分析物的固定、质谱分析、显微镜检查、流式细胞术或熔解曲线分析。
79.根据权利要求78所述的测定，其中所述第一反应和所述第二反应在相同的样品溶液体积中进行。
80.根据权利要求78所述的测定，其中所述第一反应在第一样品溶液体积中进行并且所述第二反应在第二样品溶液体积中进行。
81.根据权利要求80所述的测定，其中所述第一样品溶液体积和所述第二样品溶液体积各自包含或可能包含所述至少三个分析物。
82.根据权利要求78-81中任一项所述的测定，其中所述至少三个分析物是多核苷酸分析物。
83.根据权利要求78-82中任一项所述的测定，其中所述至少三个分析物是至少五个分析物。
84.根据权利要求78-83中任一项所述的测定，其中所述至少三个分析物是至少七个分析物。
85.根据权利要求78-84中任一项所述的测定，其中所述第一反应包括不确定性，并且其中所述第二反应解决所述不确定性。
86.根据权利要求85所述的测定，其中所述不确定性是不能明确识别所述至少三个多核苷酸分析物的多核苷酸分析物的单个组合的信号。
87.根据权利要求78-86中任一项所述的测定，其中所述第一反应和所述第二反应各自包括聚合酶链反应。
88.根据权利要求78-87中任一项所述的测定，其中所述第一反应包括从一个或多个信号产生第一累积信号测量值。
89.根据权利要求88所述的测定，其中所述一个或多个信号是从一个或多个杂交探针产生的。
90.根据权利要求78-89中任一项所述的测定，其中所述第二反应包括从一个或多个信号产生第二累积信号测量值。
91.根据权利要求90所述的测定，其中所述一种或多种信号是从一个或多个杂交探针产生的。
92.根据权利要求78-91中任一项所述的测定，其中所述第一反应包括产生在第一信号通道中检测到的一个或多个第一信号，并且其中所述第二反应包括产生在第二信号通道中检测到的一个或多个第二信号。
93.一种用于检测多个多核苷酸分析物的组合物，所述组合物包含多个杂交探针，每个杂交探针对应于所述多个多核苷酸分析物之一，并包含至少一个荧光团，其中每个杂交探针在被激发时以及与其对应的多核苷酸分析物接触时产生累积强度信号，并且其中由来自所述多个杂交探针的所述累积强度信号产生的累积信号测量值形成Sidon序列。
94.根据权利要求64所述的组合物，其中所述至少一个荧光团选自三个、四个、五个或六个荧光团。
95.根据权利要求64或65所述的组合物，其中所述多个杂交探针包含至少七个独特的杂交探针。
96.根据权利要求64-66中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含浓度为至少1X的第一杂交探针、浓度为至少4X的第二杂交探针、浓度为至少9X的第三杂交探针、浓度为至少15X的第四杂交探针、浓度为至少22X的第五杂交探针、浓度为至少32X的第六杂交探针和浓度为至少34X的第七杂交探针。
97.一种非简并地检测以存在或不存在的任何组合形式的多个多核苷酸分析物的存在或不存在的方法，其包括：
(a)提供包含或可能包含所述多个多核苷酸分析物中至少一个的样品溶液体积；
(b)提供多个杂交探针，每个杂交探针包括至少一个荧光团，其中每个杂交探针产生累积强度信号，并且其中由来自所述多个杂交探针的所述累积强度信号产生的累积信号测量值形成Sidon序列；以及
(c)使所述样品溶液体积与所述多个杂交探针接触以产生所述累积信号测量值，从而非简并地检测以存在或不存在的任何组合形式的所述多个分析物的存在或不存在。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述方法不需要所述多核苷酸分析物的固定、所述多核苷酸分析物的物理分离、质谱分析或熔解曲线分析的任何步骤。
99.根据权利要求97或98所述的方法，其中所述多个多核苷酸分析物是至少七个多核苷酸分析物。
100.根据权利要求97-99中任一项所述的方法，其中所述多个杂交探针中的一个或多个与所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个结合。
101.根据权利要求97-100中任一项所述的方法，其中所述多个杂交探针中的一个或多个与对应于所述多个多核苷酸分析物中的一个或多个的寡核苷酸的区域结合。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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