CN103649335A - 定量核酸酶保护测定（qnpa）和测序（qnps）的改进 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了对定量核酸酶保护测定（qNPA）和定量核酸酶保护测序（qNPS）方法的改进。所公开的方法使用包括5′末端和/或3′末端侧翼序列的核酸酶保护探针（NPP），其提供了通用杂交和/或扩增序列。所公开的方法可用于对靶核酸分子进行测序或检测，例如存在于固定的或不可溶样品中的那些。

Description

定量核酸酶保护测定(QNPA)和测序(QNPS)的改进

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年5月4日提交的美国临时申请No.61/482,486、2011年9月21日提交的美国临时申请No.61/537,492和2011年12月15日提交的美国临时申请No.61/576,143的优先权，所述临时申请全部以引用的方式纳入本文。

技术领域

本公开内容提供了改进的定量核酸酶保护测定（qNPA）和定量核酸酶保护测序（qNPS）方法。所述方法可用于核酸靶的鉴定、检测和/或测序。

背景技术

虽然已知检测和测序核酸分子的方法，但是仍然需要可允许同时分析多个样品或多个序列的方法。多路复用（multiplexing）核酸分子检测或测序反应的方法还没有达到最需要的性能或简单水平。

发明内容

本发明提供了可极大地改进现有的定量核酸酶保护测定（qNPA）和定量核酸酶保护测序（qNPS）方法并且代表对当前的核酸检测和测序方法的改进的方法。这些方法可用于核酸分子靶的鉴定、检测和/或测序。所述方法利用包括一个或多个侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）。所述NPPF包括与靶核酸分子的全部或一部分互补的序列，因而允许所述靶核酸分子和所述NPPF之间的特异性结合或杂交。例如，NPPF中与靶核酸分子中一个区域互补的区域以高特异性与所述靶核酸分子中的该区域结合或杂交（在一些实例中还可与双功能接头的一个区域结合）。NPPF还包括在所述NPPF的5′末端和/或3′末端的一个或多个侧翼序列。因此，所述一个或多个侧翼序列位于与靶核酸分子互补的序列的5′、3′或同时5′和3′。如果所述NPPF在5′末端和3′末端都包括侧翼序列，那么在一些实例中每个NPPF的序列均是不同的并且是不互补的。所述侧翼序列包括具有未在所述样品中的核酸分子中发现的序列（例如至少12个核苷酸的序列）的若干个连续的核苷酸，并且提供通用的杂交和/或扩增序列。这种通用的杂交和/或扩增序列，当其具有与扩增引物的至少一部分互补的序列时，可允许进行多路复用，因为相同的扩增引物可用于扩增特异性针对不同靶核酸分子的NPPF。其还为所有NPPF提供了通用杂交序列，所述通用杂交序列可用于将可检测标记添加到NPPF上或者用于捕获并浓缩NPPF。例如，如果相同的侧翼序列存在于特异性针对不同靶核酸分子的NPPF上，那么相同的引物可用于扩增任何具有相同侧翼序列的NPPF，即便所述NPPF靶向不同的核酸分子。例如，所述侧翼序列可用于捕获NPPF，例如捕获到表面上。所述侧翼序列可以含有可变的序列，例如特异性针对每种具体NPPF的序列，并且所述序列可被用于将所述NPPF捕获到表面或用于其他目的，例如鉴定所述NPPF。因此，在一些实例中，所述公开的方法可用于使用多种NPPF检测样品中若干种不同的靶核酸分子或对其测序，其中每种NPPF特异性结合至一种特定的靶核酸分子。在一个实例中，所述公开的方法被用于同时检测或测序多个样品中的至少一种靶核酸分子。

本公开内容提供了用于检测或确定样品中至少一种靶核酸分子的序列的方法。所述方法可以包括使所述样品（例如已经被加热以使样品中的核酸分子变性的样品）与至少一种NPPF在足以使得所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触。所述NPPF分子包括与所述靶核酸分子的全部或一部分互补的序列。这使得所述NPPF与所述靶核酸分子之间特异性结合或杂交。所述方法还包括使所述样品与一种或多种具有与侧翼序列的全部或一部分互补的序列的核酸分子（本文中这种分子被称为CFS）在足以使得所述侧翼序列与所述CFS特异性结合或杂交的条件下接触。多于一个的CFS可用于与整个侧翼序列杂交（例如，多个单独的CFS可与单个侧翼序列杂交，使得整个侧翼序列被覆盖）。这导致产生了已经结合（杂交）至所述靶核酸分子以及所述一个或多个CFS的NPPF分子，从而产生双链分子，所述双链分子可以包括至少四个连续的寡核苷酸序列，并且所有碱基都与互补的碱基杂交。

在使得所述靶核酸分子和所述一个或多个CFS结合至所述NPPF后，所述方法还可包括使所述样品与特异性针对单链（ss）核酸分子（或核酸分子的单链区域）的核酸酶在足以除去未与互补碱基杂交的核酸碱基的条件下接触。因此例如，未结合靶核酸分子或CFS的NPPF、以及未结合的靶核酸分子、样品中其他单链核酸分子和未结合的CFS会被降解。这产生了经消化的样品，其包括以与一个或多个CFS和靶核酸分子的双链加合物的形式存在的完整NPPF。在一些实例中，所述方法还包括提高所述样品中的pH和/或加热样品，想解离或除去结合至所述NPPF的靶核酸分子和CFS。

结合至所述靶核酸分子和CFS并因此可禁受所述核酸酶处理的NPPF，可被扩增和/或标记。可使用一种或多种扩增引物扩增所述经消化样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子。至少一种扩增引物包括与所述NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的区域。在一些实例中，所述NPPF包括在5′末端和3′末端的侧翼序列，并且使用两种扩增引物，其中一种扩增引物具有与所述5′末端侧翼序列互补的区域，另一种扩增引物具有与所述3′末端侧翼序列互补的区域。

或者，不使用可禁受所述核酸酶处理的NPPF，而可以直接使用与所述NPPF杂交的靶核酸链（例如DNA链），例如对其扩增、标记、检测、测序或其组合。例如，可使用一种或多种扩增引物扩增所述靶核酸链，从而产生可被检测和/或测序的靶扩增子。因此，虽然本文提到了NPPF扩增子，但应该理解可以用靶扩增子代替NPPF扩增子。

然后可对所产生的扩增子（或其部分，例如3′部分）测序或检测。在一个实例中，扩增子被连接到基质。例如，所述基质可以包括至少一种捕获探针，所述探针具有与所述NPPF扩增子上侧翼序列的全部或一部分互补的序列，从而允许捕获具有所述互补侧翼序列的NPPF扩增子。或者，所述基质可以包括至少一种与双功能接头连接的锚，其中所述双功能接头包括特异性结合所述锚的第一部分和特异性结合所述NPPF扩增子之一的一部分的第二部分。然后可对所捕获的NPPF扩增子进行测序或检测，从而确定样品中至少一种靶核酸分子的序列或对其进行检测。

在其他实例中，可检测或测序所述NPPF扩增子，而不用将其捕获到阵列上。例如可以将所述NPPF扩增子转移到测序平台。

可以用可检测标记来标记所述NPPF，例如在扩增过程中，或作为不经扩增的步骤。或者，侧翼区域之一或两者可用于将可检测标记杂交至所述NPPF。

根据下文参考附图进行的详细描述，本公开内容中上述的以及其他的目标和特征将变得更清楚。

附图说明

图1的示意图示出了示例性的具有侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF），100。NPPF100包括区域102，其具有特异性结合靶核酸序列和双功能（或编程）接头的序列。所述NPPF还包括5′侧翼序列104和3′侧翼序列106。

图2的示意图示出了使用所公开的方法用NPPF202检测或测序核酸分子的方法的初始步骤。虚线条表示特异性针对第一靶的NPPF（在一些实例中用生物素（B）标记所述NPPF），实心灰色条表示特异性针对第二靶的NPPF（在一些实例中用B标记所述NPPF），点线绿色条表示与所述NPPF的侧翼序列互补的核酸分子（CFS）204，实心黑色条表示靶核酸200（例如DNA或RNA）。可以在扩增过程中通过使用生物素（或地高辛）标记的引物添加生物素。或者，可以用另一标记（例如荧光团）标记所述引物，产生被标记的NPPF。（1）将样品（例如细胞或FFPE组织）与样品破碎缓冲液（例如以使得可以裂解所述样品中的细胞和组织）接触并与所述NPPF和CFS孵育。（2）用特异性针对单链核酸分子的核酸酶（例如S1核酸酶）经消化未结合的（例如单链的）核酸。（3）可例如通过加入碱并加热来灭活所述核酸酶并将所述NPPF从结合的靶分子和结合的CFS解离。（4）例如通过使用PCR以适合的引物208，扩增剩余的NPPF。在一些实例中，引物208包括可检测标记，以允许标记所产生的扩增子210。可对所产生的扩增子210进行检测（图3）或测序（图4）。

图3的示意图示出了如何在阵列212上捕获NPPF扩增子210（5），所述阵列212包括与锚214连接的双功能接头216或包括核酸捕获分子220。所述双功能接头216包括与NPPF扩增子210的一个区域互补（例如与已经杂交至所述靶核酸的序列互补）的区域，以及与所述锚的一部分互补的区域。所述核酸捕获分子220包括与NPPF扩增子210的一个区域（例如其侧翼序列或一部分）互补的区域。（6）在一个实例中，亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）被用于检测结合的NPPF以及（7）在加入底物后对所述阵列成像。所述阵列上信号的位置使得可鉴定由靶核酸分子产生的信号。

图4的示意图示出了可对NPPF扩增子210测序（5）。

图5A-B的示意图示出了在使用所公开的方法以NPPF402检测或测序核酸分子的方法的步骤中，当处理核酸分子时对所述核酸分子的详细说明。长的实心彩色条表示靶核酸分子400，末端有浅色和深色的条为特异性针对靶的NPPF402，不同颜色的末端404表示侧翼序列。靶的颜色与其对应的NPPF的颜色匹配。短的实心彩色条表示与所述NPPF的侧翼序列互补的核酸分子（CFS）406。

图6A-F的示意图示出了NPPF分子的示例性实施方案，包括仅在NPPF的一个末端具有侧翼序列的实施方案（A和B）或者在NPPF的两个末端都具有侧翼序列的实施方案（C-F）。

图7的棒状图示出了对于七种独特的NPPF，各自检测到的扩增子的数量。误差棒表示平均值的一个标准差。

图8的棒状图比较了所观察到的7种独特NPPF各自的比例与基于加入到初始PCR反应的NPPF量的预期比例。

图9的棒状图和表比较了在没有扩增（正常）或有扩增（极端灵敏度，ES）时检测到的NPPF探针。每个实验进行三次重复。在捕获和测量前将PCR扩增的反应稀释。

图10的表示出了用于测序细胞系裂解物的输入物质、NPPF类型和实验标签。每个实验进行两次重复或三次重复。

图11的棒状图示出了来自使用THP1细胞裂解物的三次重复测序实验的四十六种NPPF的测序计数。误差棒表示平均值的1个标准差。

图12A和12B是来自滴定测序的NPPF测序计数的线图。该实验在输入范围以及所述qNPS计数方法的检测范围和检测极限中看起来是线性输出的。使用四种浓度的THP1细胞裂解物作为输入物质。（A）示出了具有最低计数的八种NPPF，（B）示出了具有最高计数的四种NPPF。该实验进行三次重复；该图示出了来自仅一次平行实验的结果。

图13是测量miRNA的NPPF测序计数的线图。使用三种浓度的HepG2细胞裂解物作为输入物质。示出了五种代表性NPPF的计数。该实验进行三次重复；该图示出了来自仅一次平行实验的结果。

图14是使用一系列的PCR循环数和输入量扩增的NPPF的测序计数的棒状图。每个棒表示一个使用三个不同输入浓度之一和三个PCR循环数之一的qNPA实验。将所有的实验归一化使得读数的总数量被设置为是相等的，以帮助比较结果。

图15A和15B的棒状图表示在被分开的，（A）与阵列杂交或者（B）被测序并计数的三次重复反应中的NPPF。算出三次重复反应的平均值，误差棒表示平均值的一个标准差。

序列表

本文列出的核酸序列是使用如37C.F.R.1.822所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写表示。仅示出了每个核酸序列的一条链，但是应认为通过任何对所示链的引用而将其互补链包括在内。在所提供的序列中：

SEQ ID NO:1-16提供了可以用于所公开的方法的示例性的锚核酸序列。

SEQ ID NO:17和18分别提供了可以用于NPPF的示例性的5′和3′侧翼序列。

SEQ ID NO:19和20提供了示例性的PCR引物。

SEQ ID NO21-44提供了含有在核苷酸25-30处存在的条形码序列的示例性引物。

具体实施方式

I.综述

本公开内容提供了改进的检测或测序靶核酸分子的方法，所述方法允许进行多路复用。本公开内容的方法相对于当前可用的测序和检测方法提供了若干改进。例如，因为所述方法需要对靶核酸分子作的处理较少，所以可降低或消除由这种处理引入的偏倚（bias）。例如，在当前方法中，例如当所述靶为RNA时，方法通常使用多个步骤以从样品中分离或提取所述RNA，对其进行RT-PCR，连接所述RNA，或使用这些步骤的结合。在所公开的方法中，不需要这种步骤。因此，所述方法使得人们能够分析一系列本来不能进行检测测序的样品类型。另外，这导致来自所述样品的RNA的损失更少，提供更精确的结果。其还减少了酶偏倚。本公开内容的方法还提供了对目标核酸分子的靶向检测和测序。这极大地简化了数据分析。当前的全基因组测序方法遇到的挑战是所产生大量数据且需要复杂的生物信息学。虽然已经降低了测序费用，但是确定序列的能力超过了研究者储存、传输和分析数据的能力。因此，通常所产生数据多于在合理时间量内可以分析的数据量。因为本公开内容的方法是靶向的，所以它可以克服这些障碍。例如，所产生的数据量得到了简化，因为仅靶的一部分需要被检测或测序。不需要核苷酸的长读出序列（read），也不需要将序列片段与参考序列适当地比对。另外，所得结果可被简单地计数，而不需要进行复杂的生物信息学分析。

例如，所述方法可用于检测DNA或RNA，突变（例如基因融合、插入或缺失），串联重复，单核苷酸多态性（SNP）和DNA甲基化。所述方法使用探针，其在本文中被称为包含侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）。使用NPPF可使得可以进行多路复用，并保留被检测或测序的靶核酸分子的化学计量，因为所述探针上的侧翼序列允许存在用于扩增的通用引物结合位点并且允许加入测序衔接头和实验标签（在3′末端或5′末端，或者在两个末端，例如用以增强多路复用），而不破坏所述化学计量。因为所述侧翼位点可以是通用的，所以相同的引物可用于扩增针对任何靶序列的任何NPPF，从而允许多路复用并保留化学计量。在一个实例中，通过从所述NPPF的两个末端扩增，本公开内容的方法提供了比现有qNPA和qNPS方法更高的特异性。仅具有完整3′和5′侧翼序列的NPPF会被以指数方式扩增，而被核酸酶切割的NPPF不会被充分地扩增至足以被测序到或检测到。

另外，所述引物允许添加标签（例如添加实验标签以允许鉴定靶而不需要对整个NPPF本身测序，或者允许将来自不同患者的样品合并到单次运行中，所述实验标签在3′或5′末端或在两个末端以例如用以增强多路复用实验；以及添加测序衔接头使得可连接特定测序平台需要的序列并可形成用于某些测序平台的克隆）。使用NPPF还简化了被分析（例如被测序）的样品的复杂度，因为其将含有例如全基因的样品简化为所述NPPFs（或NPPF或靶扩增子）。与其他测序方法所需的数据分析相比，NPPF（或与所述NPPF杂交的靶）的测序简化了数据分析，将算法简化为简单地计数与加入到样品中的NPPF的匹配，而不是必须使序列与基因组匹配并使获自标准测序方法的多个序列/基因去卷积（deconvolute）。在一些实例中，与现有qNPA和qNPS方法相比，所公开的方法增强了获得的信号，例如增强至少10倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍或至少200倍，而不用在进行扩增前大量稀释NPPF产物。

在一个实例中，本公开内容提供了用于检测样品中至少一种靶核酸分子（例如至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100种靶核酸分子）或确定样品中至少一种靶核酸分子的序列的方法。在一些实例中，加热所述样品以使所述样品中的核酸分子变性，例如用以允许随后所述NPPF和所述样品中靶核酸分子之间的杂交。在一些实例中，所述样品为裂解的样品。在一些实例中，所述样品为固定的样品（例如石蜡包埋的福尔马林固定（FFPE）的样品、苏木精-伊红染色的组织或戊二醛固定的组织）。例如，所述靶核酸分子可以是被固定的、交联的或是不可溶的。

所述方法可以包括使所述样品与至少一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）在足以使所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触。在一些实例中，所公开的方法同时测序或检测多个样品中的至少一种靶核酸分子。在一些实例中，所公开的方法测序或检测样品中的两种或更多种靶核酸分子（例如同时）。在一个这样的实例中，使所述样品与多种NPPF接触，其中每种NPPF特异性结合至特定的靶核酸分子。例如，如果有10种靶核酸分子，那么可使所述样品与10种不同的NPPF接触，所述NPPF各自特异性针对所述10种靶之一。在一些实例中，将至少10种不同的NPPF与所述样品孵育。但是，应该理解在一些实例中，可以使用多于一种的（例如2、3、4、5、10、20或更多种）特异性针对单个靶核酸分子的NPPF，例如特异性针对所述靶的不同区域的NPPF群，或可以结合所述靶及其变体（例如具有突变或多态性的那些）的NPPF群。

所述NPPF分子包括5′末端和3′末端，以及两者之间与所述靶核酸分子的全部或一部分互补的序列。这使得所述NPPF与所述靶核酸分子特异性结合或杂交。例如，与所述靶核酸分子中一个区域互补的NPPF区域以高特异性结合或杂交至所述靶核酸分子中的该区域。所述NPPF可以与所述靶核酸序列的全部或一部分互补。所述NPPF分子还包括在所述NPPF的5′末端和/或3′末端的一个或多个侧翼序列。因此，所述一个或多个侧翼序列位于与靶核酸分子互补的序列的5′、3′或5′和3′。每个侧翼序列包括若干连续核苷酸，产生未在存在于样品中的核酸分子中发现的序列（例如具有至少12个连续核苷酸的序列）。如果所述NPPF在5′末端和3′末端都包括侧翼序列，那么在一些实例中各NPPF的序列是不同的并且相互不互补。

所述一个或多个侧翼序列提供与扩增引物的至少一部分互补的通用杂交/扩增序列。在一些实例中，所述侧翼序列可以包括（或允许添加）实验标签、测序衔接头或其组合。例如，所述实验标签可以是与捕获探针互补的序列，所述捕获探针能够捕获NPPF，例如捕获到表面上（例如在所述表面的特异性点上，或捕获到特异性的微珠上）。在一些实例中，所述实验标签可以是可鉴定NPPF的序列，例如特异性针对特定的患者或靶序列的标签，例如用以使得人们能够区分这些加标签的NPPF或对其分组。在一些实例中，所述测序衔接头是使得NPPF扩增子能够用于特定的测序平台的序列。

所述NPPF可以是任何核酸分子（例如DNA或RNA分子）并可以包括非天然碱基。在一些实例中，所述NPPF为至少35个核苷酸，例如40-80或50-150个核苷酸。NPPF中与所述靶核酸分子中一个区域互补的部分的长度可以是至少6个核苷酸，例如长度是至少10、至少25或至少60，例如至少6-60个核苷酸。所述NPPF的一个或多个侧翼序列的长度可以是至少6个核苷酸、至少12个核苷酸或至少25个核苷酸，例如12-50个核苷酸。在一些实例中，所述NPPF包括两个侧翼序列：一个在5′末端，另一个在3′末端。在一些实例中，在5′末端的侧翼序列与在3′末端的侧翼序列不同。另外，如果所述NPPF包括两个侧翼序列，那么理想的是这两个侧翼序列具有相似的解链温度（Tm），例如+/-5℃的Tm。

所述方法还包括使所述样品与具有同侧翼序列互补的序列的核酸分子（本文中这种分子被称为CFS）在足以使得所述侧翼序列特异性结合或杂交至所述CFS的条件下接触。本领域技术人员应该理解，不是使用单个CFS保护侧翼序列，而是可以使用多个CFS保护侧翼序列。这导致产生了已经结合至所述靶核酸分子以及所述CFS的NPPF分子，从而产生双链分子，所述双链分子包括至少三个连续的寡核苷酸序列并且所有碱基与互补碱基杂交，其中所述NPPF和CFS的碱基可以包括非天然碱基。所述CFS与其对应的侧翼序列杂交，从而保护所述侧翼序列在后续步骤中免于被核酸酶经消化。在一些实例中，每种CFS的长度恰好是其对应的侧翼序列的长度。在一些实例中，所述CFS与其对应的侧翼序列完全互补。但是本领域技术人员应该理解，保护5′末端侧翼序列的CFS的3′末端或保护3′末端侧翼序列的CFS的5′末端可以具有差异，例如在这些位置中每一个位置上的一个核苷酸。

在使得所述靶核酸分子以及一个或多个CFS结合至所述NPPF后，所述方法还可包括使所述样品与特异性针对单链（ss）核酸分子或核酸分子的单链区域的核酸酶（例如S1核酸酶）在足以除去未与互补碱基杂交的核酸碱基的条件下接触。因此例如，没有结合的靶核酸分子或CFS的NPPF、以及未结合的靶核酸分子、样品中的其他单链核酸分子和未结合的CFS均会被降解。这产生了经消化的样品，其包括以与CFS和靶核酸杂交的双链加合物形式存在的完整NPPF。在一些实例中，例如如果所述NPPF由DNA组成，那么所述核酸酶可以包括外切核酸酶、内切核酸酶或其组合。

在一些实例中，所述方法还包括提高所述样品的pH和/或加热所述样品，例如用以使所述核酸酶失活，以移除结合到所述NPPF的靶核酸分子和CFS，或包括这些的结合。在一些实例中，所述方法包括从所述NPPF释放靶核酸（例如DNA），然后进一步分析所释放的靶（例如检测或测序所述靶）。在一些实例中所述靶核酸为DNA，扩增所述DNA然后对其进行检测或测序。

结合至所述靶核酸分子和CFS并因此禁受住所述核酸酶处理的NPPF可被扩增，例如使用PCR扩增。可使用一种或多种扩增引物扩增所述经消化样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子。至少一种扩增引物包括与NPPF侧翼序列互补的区域。在一些实例中，所述NPPF在5′末端和3′末端包括侧翼序列，并且使用两种扩增引物，其中一种扩增引物具有与所述5′末端侧翼序列互补的区域，另一种扩增引物具有与所述3′末端侧翼序列互补的区域。所述扩增引物的一种或两种可以包括允许在扩增过程中将实验标签或测序衔接头连接到所述NPPF扩增子的序列，并且一种或两种引物可以被标记以使得能够标记所述NPPF扩增子。在一些实例中，添加实验标签和测序衔接头，例如在所述NPPF扩增子的两端。例如，使用这种引物可以产生从所述NPPF扩增子的5′末端或3′末端或者从3′末端和5′末端两个末端延伸的实验标签或序列标签，以尽可能地增加多路复用的程度。所述实验标签可以包括独特的核酸序列，所述独特的核酸序列使得能够鉴定样品、受试者或靶核酸序列。在一些实例中，所述扩增引物含有使得能够将所述NPPF扩增子捕获到基质上（例如通过与所述基质上的探针杂交，所述探针具有与所述NPPF扩增子上的捕获序列互补的序列）的实验标签。所述测序衔接头可以包括核酸序列，所述核酸序列使得能够将所产生的NPPF捕获到测序平台上。例如，所述扩增引物可以包括这样的序列，即所述序列使得能够连接聚腺苷酸（poly-A）或聚胸苷酸（poly T）序列标签，所述聚腺苷酸或聚胸苷酸序列标签一旦被捕获到测序芯片上可以帮助扩增。在一些实例中，使用所述扩增引物标记所述NPPF扩增子。在其他实例中，使用一个或两个侧翼区域以使可检测标记与所述NPPF杂交，例如以经标记的探针（例如不进行扩增）。

然后可对所产生的NPPF（或靶）扩增子（或其部分，例如3′部分）进行测序或检测，从而确定所述样品中至少一种靶核酸分子的序列或检测所述样品中至少一种靶核酸分子。

在一个实例中，对所述NPPF扩增子（或其部分）进行测序。可以使用任何方法测序所述NPPF扩增子，并且本公开内容不限于特定的测序方法。在一些实例中，所使用的测序方法为

测序、测序、链终止测序、染料终止测序或焦磷酸测序。在一些实例中，使用单分子测序。在其中对所述NPPF扩增子进行测序的一些实例中，所述方法还包括将所获得的NPPF序列与参考序列数据库比较；并确定每种鉴定的NPPF序列的数量。

在一些实例中，检测所述NPPF扩增子。在这样的实例中，所述方法可以包括使所述NPPF扩增子与表面（例如具有多个空间上不连续的区域的表面）接触。在一个实例中，所述NPPF扩增子被所述表面上的一种或多种核酸捕获分子捕获，其中所述表面上核酸捕获分子的序列与所述NPPF扩增子的侧翼序列的至少一部分互补。这种互补性允许所述NPPF扩增子与所述表面上的捕获分子杂交和结合。可将这种捕获分子直接缀合到所述表面。将所述NPPF扩增子与所述表面在足以使得所述NPPF扩增子特异性结合到所述表面上的捕获分子的条件下孵育或接触。在一些实例中，将所述NPPF扩增子与表面群接触，其中所述表面群包括表面亚群（例如微珠群），并且其中每个表面亚群包含至少一种与所述NPPF扩增子上侧翼序列的至少一部分互补的核酸捕获分子。因此，这使得能够捕获所有NPPF，所述NPPF具有与所述表面上的捕获分子互补的序列，而不用管所述NPPF靶向的序列。然后可以检测结合的NPPF扩增子。在一些实例中，该步骤用于（例如从含有引物的混合物中）纯化或浓缩NPPF扩增子，随后可将所述NPPF扩增子从所述表面释放，例如通过逆转杂交（例如通过提高温度以熔脱所捕获的NPPF或通过改变pH和温度），并分析NPPF扩增子。

在另一个实例中，通过使用锚和双功能接头将所述NPPF扩增子捕获到表面上。所述表面可以包括多个区域，每个区域包括至少一种与双功能接头连接的锚。所述双功能接头包括特异性结合到所述锚的第一部分以及特异性结合或杂交到所述NPPF扩增子之一的至少一部分的第二部分。将所述NPPF扩增子与所述表面在足以使得所述NPPF扩增子特异性结合到所述双功能接头的第二部分的条件下孵育或接触。在一些实例中，将所述NPPF扩增子与表面群接触，其中所述表面群包括表面亚群（例如微珠群），其中每个表面亚群包含至少一种与双功能接头连接的锚。然后可以检测结合的NPPF扩增子。

另外，所述NPPF扩增子可以包括可检测标记，从而允许对其进行检测。在一些实例中，在扩增过程中引入这种标记。在具体实例中，所述可检测标记为半抗原、荧光分子、酶或放射性同位素。例如，存在于NPPF扩增子上的生物素可以通过以下方式来检测：使所述NPPF扩增子与缀合有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素（avidin）或链霉亲和素（streptavidin）接触。

II.术语

除非另有说明，根据惯常用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可以见于Benjamin Lewin,Genes VII，由Oxford UniversityPress出版，2000(ISBN019879276X)；Kendrew et al.(eds.),TheEncyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Publishers出版，1994(ISBN0632021829)；Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由Wiley,John&Sons,Inc.出版，1995(ISBN0471186341)；和George P.Rédei,EncyclopedicDictionary of Genetics,Genomics,and Proteomics,2nd Edition,2003(ISBN:0-471-26821-6)。

提供对术语和方法的如下解释以更好地描述本公开内容并指导本领域普通技术人员实施本公开内容。除非上下文另有明确说明，单数形式的“一”、“一个”以及“所述”是指一个或多于一个。例如术语“包含一个细胞”包括单个或多个细胞，其应被理解为等同于短语“包含至少一个细胞”。除非上下文另有明确说明，术语“或”是指所述的可选要素中的单个要素或者两个或更多个要素的组合。本文使用的“包含”意即“包括”。因此“包含A或B”意即“包括A、B或A和B”，但没有排除另外的要素。

为了便于评阅本公开内容的多个实施方案，提供了如下对具体术语的解释：

3'末端：核酸分子的末端，其末端残基的3'没有结合核苷酸。

5'末端：核酸序列的末端，其末端残基的5'位置结合核苷酸。

扩增核酸分子：为了增加核酸分子例如NPPF或其部分的拷贝数量。所产生的产物称为扩增产物或扩增子。体外扩增的实例为聚合酶链式反应（PCR），其中将样品（例如含有NPPF的样品）与一对寡核苷酸引物在使得所述引物与所述样品中的核酸分子杂交的条件下接触。所述引物在适合条件下延伸，从模板解离，然后重新退火，延伸以及解离以扩大所述核酸分子的拷贝数量。

（核酸的）结合或稳定结合：如果足够数量的第一核酸分子（例如NPPF）与另外的核酸分子（例如靶核酸分子）形成碱基对或杂交，那么所述第一核酸分子与所述另外的核酸分子结合或稳定结合，例如NPPF与其互补靶核酸序列的结合。

结合可以通过物理或功能性质来检测。核酸分子之间的结合可以通过本领域技术人员已知的任何方法来检测，包括功能（例如表达和/或活性的降低）和物理结合测定。

互补的：核酸之间形成碱基对的能力。寡核苷酸和其类似物通过互补碱基之间的氢键杂交，所述氢键结合包括Watson-Crick氢键、Hoogsteen氢键或反向Hoogsteen氢键。通常，核酸分子包含含氮碱基，所述含氮碱基为嘧啶（胞嘧啶（C）、尿嘧啶（U）和胸腺嘧啶（T））或嘌呤（腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G））。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地，A与T或U氢键合，G与C键合。“互补的”是指发生在不同核酸或同一核酸的两个不同区域之间的碱基配对。

术语“特异性杂交的”和“特异性互补的”是这样的术语，即指足够的互补性程度以使得探针（例如NPPF）或其类似物与核酸靶（例如DNA或RNA靶）之间发生稳定且特异性的结合。所述探针或类似物不需要与其靶序列100%互补才能发生特异性杂交。当在需要特异性结合的条件下例如在本文公开的方法中，存在足够的互补性程度以避免探针或类似物与非靶序列非特异性结合时，所述探针或类似物是可特异性杂交的。

足以…的条件：任何容许所需要的活性，例如允许两个核酸分子（例如NPPF和靶核酸、NPPF和CFS或NPPF和双功能接头）特异性结合或杂交，或允许核酸酶除去（或消化）未结合的核酸的环境。

接触：置于直接的物理连接中；包括固体和液体形式。例如在体外在溶液中核酸探针（例如NPPF）和生物样品可以发生接触。

检测：为了确定因子（例如信号、具体核苷酸、氨基酸、核酸分子和/或生物体）是否存在。在一些实例中，这还可包括定量。例如，使用所公开的方法使得能够检测样品中的靶核酸分子。

可检测标记：直接或间接缀合到另外的分子（例如核酸分子，例如NPPF或扩增引物/探针）以帮助检测该分子的化合物或组合物。标记的具体、非限制性实例包括荧光和产生荧光的部分、生色部分、半抗原、亲和标签和放射性同位素。所述标记可以是可直接检测的（例如可光学检测的）或是可间接检测的（例如通过与一种或多种另外的可检测的分子相互作用）。在本文公开的探针的上下文中的示例性标记在下文中描述。用于标记核酸的方法以及选择用于多种目的的标记的指导记载于，例如Sambrook and Russell,in Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)和Ausubel et al.,in Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associatesand Wiley-Intersciences(1987，包括更新)。

杂交：互补的单链DNA、RNA或DNA/RNA杂交以形成双链分子（还称为杂交复合物）的能力。核酸杂交技术可以用于在核酸探针和其被设计靶向的基因之间形成杂交复合物。

术语“特异性杂交的”和“特异性互补的”是指足够的互补性程度，使得在第一核酸分子（或其类似物）与第二核酸分子（例如核酸靶，例如DNA或RNA靶）之间发生稳定且特异性结合。所述第一和第二核酸分子不需要100%互补才能发生特异性杂交。本文中特异性杂交还称为“特异性结合”。

导致特定严格性程度的杂交条件将依赖于杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度（例如Na⁺浓度）将决定杂交的严格性。关于为获得特定的严格性程度而使用的杂交条件的计算记载于Sambrook et al.,(1989)Molecular Cloning,second edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY(第9和11章)。

核酸酶：切割磷酸二酯键的酶。内切核酸酶是切割核苷酸链中内部磷酸二酯键的酶（与之相反，外切核酸酶切割核苷酸链末端的磷酸二酯键）。内切核酸酶包括限制性内切核酸酶或其他位点特异性的内切核酸酶（其在序列特异性位点切割DNA）、DNA酶I、Bal31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、核糖核酸酶A、核糖核酸酶T1、RNA酶I、RNA酶PhyM、RNA酶U2、RNA酶CLB、微球菌核酸酶以及无嘌呤/无嘧啶内切核酸酶。外切核酸酶包括外切核酸酶III和外切核酸酶VII。在具体实例中，核酸酶是特异性针对单链核酸，例如S1核酸酶、绿豆核酸酶、核糖核酸酶A或核糖核酸酶T1。

核酸：单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，包括以与天然存在的核苷酸类似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的类似物。术语“核苷酸”包括但不限于单体，所述单体包括连接糖（例如核糖、脱氧核糖或其合成的类似物）的碱基（例如嘧啶、嘌呤或其合成的类似物）或者如在肽核酸（PNA）中连接氨基酸的碱基。核苷酸是多核苷酸中的一个单体。核苷酸序列是指多核苷酸中的碱基序列。

靶核酸（例如靶DNA或RNA）是意欲确定其检测、量或序列（例如以定量或定性方式）的核酸分子。在一个实例中，所述靶为核酸分子（例如目的DNA或RNA）的限定区域或特定部分。在其中所述靶核酸序列为靶DNA或靶RNA的实例中，这样的靶可以通过其特定序列或功能定义；通过其基因或蛋白质名称定义；或者通过任何其他可唯一地将其从其他核酸中识别出来的方式来定义。

在一些实例中，靶核酸序列（例如DNA或RNA）的改变与疾病或病症“相关”。也就是说，对所述靶核酸序列的检测可用于推断与疾病或病症有关的样品的状态。例如，所述靶核酸序列可以以两种（或更多种）可区分的形式存在，使得第一形式与没有疾病或病症相关，第二（或不同的）形式与存在疾病或病症相关。所述两种不同形式可以是可定性区分的，例如通过核苷酸多态性或突变，并且/或者所述两种不同形式可以是可定量区分的，例如通过样品中存在的靶核酸序列的拷贝数量。

核苷酸：核酸分子的基本单位。核苷酸包括连接到戊糖单糖的含氮碱基以及通过酯键连接到所述糖部分的一个、两个或三个磷酸基团。

DNA的主要核苷酸为脱氧腺苷5'-三磷酸（dATP或A）、脱氧鸟苷5'-三磷酸（dGTP或G）、脱氧胞苷5'-三磷酸（dCTP或C）和脱氧胸苷5'-三磷酸（dTTP或T）。RNA的主要核苷酸为腺苷5'-三磷酸（ATP或A）、鸟苷5'-三磷酸（GTP或G）、胞苷5'-三磷酸（CTP或C）和尿苷5'-三磷酸（UTP或U）。

核苷酸包括含有修饰的碱基、修饰的糖部分和修饰的磷酸酯骨架的那些核苷酸，例如如Nazarenko等人的美国专利No.5,866,336（其以引用的方式纳入本文）中所述。包括含有其他修饰的核苷酸，例如在锁核酸中发现的核苷酸。因此，本文公开的NPPF、引物、CFS、双功能接头和锚可以包括天然和非天然碱基。

可用于在核苷酸结构上任意位置修饰核苷酸的修饰的碱基部分的实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、乙酰胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷（β-D-galactosylqueosine）、肌苷、N～6-异戊烯基腺嘌呤（N～6-sopentenyladenine）、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷（β-D-mannosylqueosine）、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、Q核苷（queosine）、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-S-羟乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

可用于在核苷酸结构上任意位置修饰核苷酸的修饰的糖部分的实例包括但不限于：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木糖和己糖，或所述磷酸酯骨架的修饰的组分，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯（phosphoramidate）、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯或甲缩醛（formacetal）或其类似物。

引物.短的核酸分子，例如长度为9个核苷酸或更多个核苷酸的DNA寡核苷酸，其在一些实例中被用于起始更长核酸序列的合成。更长的引物的长度可以是约10、12、15、20、25、30或50个核苷酸或更多个核苷酸。引物可以通过核酸杂交被退火结合至互补的核酸链以在所述引物和所述互补链之间形成杂交体（hybrid），然后所述引物通过聚合酶沿着所述互补链延伸。引物对可以用于扩增核酸序列，例如通过PCR或其他核酸扩增方法。

在一个实例中，引物包含标记，其可被称为探针。

探针：能够与靶核酸分子（例如靶DNA或RNA）杂交并且在杂交到所述靶时能够被直接或间接检测的核酸分子。因此，探针使得能够检测并在一些实例中定量靶核酸分子例如DNA或RNA。在一些实例中，探针包括可检测标记。

核酸酶保护探针（NPP）：具有与靶DNA或RNA互补且能够与所述靶DNA或RNA杂交的序列的核酸分子。所述NPP保护互补的靶DNA或RNA核酸分子免于被核酸酶（例如特异性针对单链核酸的核酸酶）切割。包含侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）是在5′末端、3′末端或5′末端和3′末端进一步包括一个或多个侧翼序列的NPP，其中所述侧翼序列包括未在存在于所述样品中的核酸分子中发现的连续核苷酸序列，并且其可以提供可用作扩增引物连接位点的通用扩增序列位点。在一个实例中，所述侧翼序列被用于将所述NPPF捕获到基质上，其中所述基质上的核酸捕获序列和所述侧翼序列的至少一部分是彼此互补的，从而使得能够将所述NPPF捕获到所述基质上。

样品：从受试者（例如人或其他哺乳动物受试者）获得的含有DNA（例如基因组DNA或cDNA）、RNA（包括mRNA或miRNA）、蛋白质或其组合的生物样本。实例包括但不限于细胞、细胞裂解物、染色体制品、外周血或其级分、尿、唾液、组织活体检查（例如肿瘤活体检查或淋巴结活体检查）、手术样本、骨髓、羊膜穿刺样品、细针抽出物、循环肿瘤细胞和尸检材料。在一个实例中，样品包括RNA或DNA。在具体实例中，样品被直接使用（例如新鲜的或冷冻的），或可以在使用前例如通过固定（例如使用福尔马林）和/或包埋到石蜡中（例如FFPE组织样品）进行处理。

序列同一性/相似性：两个或更多个核酸序列或者两个或更多个氨基酸序列之间的同一性/相似性被表示为所述序列之间的同一性或相似性。序列同一性可以以同一性百分数的方式测量；所述百分数越高，序列就越相同。

比对用于比较的序列的方法是本领域中熟知的。多种程序和比对算法记载于：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins&Sharp,Comput.Appl.Biosci.5:151-3,1989；Corpet et al.,Nucl.Acids Res.16:10881-90,1988；Huang et al.Comput.Appl.Biosci.8,155-65,1992和Pearson et al.,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994。Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990，提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项。

NCBI基本局部比对搜索工具（BLAST）（Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990）可从若干来源获得，包括美国国家生物信息中心（National Center for Biological Information，NCBI，National Libraryof Medicine,Building38A,Room8N805,Bethesda,MD20894）和因特网，其用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。Blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。另外的信息可在NCBI网站找到。

比对后，匹配的数量是通过计数在两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量来确定。序列同一性百分数是通过将匹配的数量除以所鉴定序列中示出的序列的长度，或者除以联接的长度（articulatedlength）（例如来自所鉴定序列中所示序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基），然后将所得到的值乘以100来确定。

两个核酸分子密切相关的一个指示是所述两个分子在严格条件下互相杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同环境参数下不同。本文公开的核酸探针不限于所示出的确切序列，因为本领域技术人员会理解，可以改变序列而不实质上影响探针发挥所需作用的能力。例如，本文提供了与所公开的探针具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，例如100%序列同一性的序列（例如SEQID NO:1-16）。本领域技术人员会理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导；可使用的探针可能在这些范围之外。

测序：是为了确定无支链的生物聚合物的一级结构（或一级序列）。测序产生了被称为序列的用符号表示的线性描绘，其简明地概述被测序分子（例如多核苷酸）的多数原子水平结构。当所述分子为多核苷酸例如RNA或DNA时，测序可用于获得所述分子在核苷酸水平上的信息，然后其可用于解密所述分子本身和/或其编码的多肽的多种二次信息。DNA测序是确定给定DNA分子的核苷酸顺序的过程，RNA测序是确定给定RNA分子的核苷酸顺序的过程。在一些实例中，核酸分子的测序是例如通过确定含侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）的至少一部分序列而间接完成的，所述核酸酶保护探针结合所述靶核酸分子。

同时：同时或基本上同时发生和/或在同一样品或在同一反应中发生（例如同时的）。在一些实例中，所述事件在另一事件的1微秒至120秒内（例如在0.5-120秒内，在1-60秒内，或在1-30秒内，或在1-10秒内）发生。

受试者：任何多细胞脊椎生物，例如人和非人哺乳动物（例如兽医的受试者）。在一个实例中，已知或怀疑受试者具有肿瘤或感染。

表面（或基质）：不可溶的或可以通过随后的反应使其不可溶的任何固体支持物或材料。众多不同的固体支持物是本领域技术人员已知的，包括但不限于硝酸纤维素、反应盘的孔壁、多孔板、试管、聚苯乙烯微珠、磁珠、膜和微粒（例如胶乳颗粒）。该术语涵盖任何适合的多孔材料，所述材料具有足够孔隙度以允许检测器试剂接触并具有适合的表面亲和力以固定捕获试剂（例如寡核苷酸）。例如，硝酸纤维素的多孔结构对很多种试剂（例如捕获试剂）而言具有极佳的吸收和吸附性质。尼龙拥有类似特性，也是适合的。可以使用微孔结构，以及在水合状态下具有凝胶结构的材料。

可用的固体支持物的另外实例包括天然聚合的碳水化合物及其合成修饰的、交联的或取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联藻酸、取代和交联的瓜尔胶、纤维素酯，特别是与硝酸和羧酸的纤维素酯、混合纤维素酯以及纤维素醚；含氮的天然聚合物，例如蛋白质及衍生物，包括交联的或修饰的明胶；天然的烃聚合物，例如乳胶和橡胶；可用适合的多孔结构制备的合成聚合物，例如烯类聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯乙酸酯及其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，例如聚酯、聚酰胺，以及其他聚合物例如聚氨基甲酸酯类或聚环氧化物；多孔无机材料例如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙，碱金属和碱土金属、铝和镁的硅酸盐；以及铝或硅氧化物或水合物，例如粘土、矾土、滑石、高岭土、沸石、硅胶或玻璃（这些材料可与上述聚合物材料一起用作过滤器）；以及上述各类的混合物或共聚物，例如通过在已有的天然聚合物上起始合成聚合物的聚合而获得的接枝共聚物。

为了各种目的，本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，以引用的方式全文纳入本文。只要适用的法规和/或法律允许，所有与本文提到的GenBank登录号相关的序列，以引用的方式全文纳入本文，如同其在2011年12月15日提供的一样。如有冲突，以本发明书——包括术语解释——为准。

虽然下文描述了适合的方法和材料，但是与本文描述的方法和材料类似或等价的那些方法和材料可用于实施或测试所公开的技术。所述材料、方法和实施例仅是示例性的并且不意欲是限制性的。

III.检测或测序核酸分子的方法

本文公开了检测和/或测序样品中存在的核酸分子的方法。在一些实例中，在同一样品或同一测定中（例如在测定板或阵列的同一孔中）检测至少两种不同的核酸分子。在一些实例中，在至少两个不同样品或测定中（例如在来自不同患者的样品中）检测到相同核酸分子或分子。

所公开的方法提供了对定量核酸酶保护测定（qNPA）的改进，所述定量核酸酶保护测定例如在国际专利公开WO99/032663；WO00/037683；WO00/037684；WO00/079008；WO03/002750；和WO08/121927；和美国专利No.6,232,066、6,238,869；6,458,533；和7,659,063中描述的那些，所有参考文献以引用的方式全文纳入本文。还参见Martel et al.,Assay and Drug Development Technologies.2002,1(1-1):61-71;Martel et al.,Progress in Biomedical Optics and Imaging,2002,3:35-43;Martel et al.,Gene Cloning and Expression Technologies,Q.Lu and M.Weiner,Eds.,Eaton Publishing,Natick(2002);SeligmannPharmacoGenomics,2003,3:36-43;Martel et al.,“Array Formats”in“Microarray Technologies and Applications,”U.R.Muller and D.Nicolau,Eds,Springer-Verlag,Heidelberg(2005);Sawada et al.,Toxicology in Vitro,20:1506-1513,2006;Bakir,et al.,Bioorg.&Med.Chem Lett,17:3473-3479,2007;Kris et al.,Plant Physiol.144:1256-1266,2007;Roberts et al.,Laboratory Investigation,87:979-997,2007;Rimszaet al.,Blood,2008Oct15,112(8):3425-3433;Pechhold et al.,NatureBiotechnology,27:1038-1042,2009。例如，与现有的qNPA方法相比，所公开的qNPA方法具有增强的灵敏度，例如可检测信号增加至少10倍、至少25倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍、至少170倍或至少200倍。也就是说，需要至多1/10，或甚至1/200的样品；或相反地，可以使用所公开的方法检测低于当前可用方法灵敏度的1/10，或者甚至最低至1/20的稀少基因。因此，在可从患者回收仅仅10、50或100个细胞情况下，可以测试诸如提供极少量FFPE的细针抽出物或循环肿瘤细胞的样品类型，并且可使用所公开的方法检测稀有基因。

另外，所公开的方法提供了对例如记载于美国专利公开No.US-2011-0104693的定量核酸酶保护测序（qNPS）方法的改进。qNPS测序方法是使用qNPA将样品中存在的靶核酸分子（即使所述靶核酸分子是交联的时候）转化为稳定的单链核酸靶（核酸酶保护探针，NPP），所述单链核酸靶可通过以下方式从溶液中回收而无需捕获或分离：使用所述核酸酶保护步骤以及（如果必要的话）用碱处理以使所述核酸酶保护探针从保护性靶分子解离，并且在RNA的情况中，水解所述RNA靶。然后通过测序确定核酸酶水解后留下的NPP的量，所述测序可以包括对所述探针本身测序。本文所公开的改进方法使用NPP的变体——一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）。使用NPPF允许进行多路复用，并且保留所检测或测序的靶核酸分子的化学计量，因为所述探针上的侧翼序列容许用于扩增的通用引物结合位点。因为所述引物结合位点是通用的，所以相同的引物可用于扩增针对任何靶序列的任何NPPF，从而允许多路复用并保留化学计量。在一个实例中，从所述NPPF两个末端的侧翼序列进行扩增，提供了意想不到且比现有qNPA和qNPS方法更高的特异性。具有完整3′和5′侧翼序列的NPPF会以指数方式被扩增；被核酸酶切割的NPPF不会被充足地扩增至足以被测序到或检测到。与此相反，使用现有qNPA方法处理的NPP可以在参与所述阵列上的捕获的序列末端被部分切割，或者在参与所述阵列上的检测的序列末端被部分切割，或者在两端被部分切割（这是由于弱的或不正确的杂交到不正确的靶核酸上），并仍然被捕获和检测，导致针对正确靶核酸的特异性降低。使用所公开的NPPF探针不会发生这种情况。所公开的方法保留了原始的核酸分子计量，使得所检测或测序的核酸分子保留了与测试样品中所述核酸分子的相同相对量，例如变化不多于20%、不多于15%、不多于10%、不多于9%、不多于8%、不多于7%、不多于6%、不多于5%、不多于4%、不多于3%、不多于2%、不多于1%、不多于0.5%或不多于0.1%，例如0.001%-5%、0.01%-5%、0.1%-5%或0.1%-1%。

所公开的方法还允许多路复用实验，例如在同一测定中的多个反应（例如在同一反应孔中来自不同患者的多个样品），以及在测序仪的同一运行/通道中分析的多个反应。

特别地，与现有qNPA和qNPS方法相比，所公开的方法使用修饰的核酸保护探针（NPP），其在所述NPP的一个末端或两个末端包括侧翼序列。这些具有5′末端和/或3′末端侧翼序列的经修饰的NPP在本文中称为具有侧翼序列的核酸保护探针（NPPF）。充当通用引物位点用于杂交和/或扩增（以及可用于其他目的，包括NPPF的捕获或加标签）的一个或两个侧翼序列的存在，保留了所述样品中原始的核酸化学计量，因为所述侧翼序列是所述NPPF的一部分。另外，这消除了进行连接以将引物位点、标签等添加到所述NPPF的需要，添加引物位点、标签等可引入使样品中核酸化学计量产生偏离的人为假象，并提供另外的变异性来源。消除对连接的需要既消除了潜在的使化学计量产生偏离的人为假象又可避免重复性降低。

图1的示意图示出了示例性的NPPF。具有至少一个侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）100包括区域102，区域102包括特异性与靶核酸序列结合的序列（还可与双功能接头特异性结合）。所述靶核酸序列可以是DNA（例如基因组DNA或cDNA）或RNA（例如mRNA、miRNA、tRNA、siRNA），或者是DNA和RNA。所述NPPF包括一个或多个侧翼序列104和106。图1示出了具有5′侧翼序列104和3′侧翼序列106的NPPF100。但是，在一些实例中NPPF可以仅具有一个侧翼序列。

图2的示意图示出了使用所公开的方法用所述NPPF检测或测序核酸分子的示例性方法的初始步骤。如步骤1中所示，使已经用样品破碎缓冲液处理（例如裂解的或以其他方式处理以使得可接触核酸）的样品（例如已知或怀疑含有靶核酸的样品，200）与多种具有一个或多个侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）202接触或孵育，所述多种核酸酶保护探针202包括至少一种与第一靶核酸（例如靶DNA或RNA）特异性结合的NPPF。所述反应还可包括与第二靶核酸特异性结合的其他NPPF，等等。例如，所述方法可以使用一种或多种不同的NPPF，所述NPPF被设计为特异性针对各独特靶核酸分子。因此，测量100个基因需要使用至少100种不同的NPPF，每个基因有至少一种特异性的NPPF（例如每个基因有若干不同的NPPF）。因此，例如，所述方法可以使用至少2种不同的NPPF，使用至少3、至少4、至少5、至少10、至少25、至少50、至少75、至少100或甚至至少200种不同的NPPF（例如2-500、2-100、5-10、2-10或2-20种不同的NPPF）。但是，应该理解在一些实例中，所述多种NPPF可以包括特异性针对同一种靶核酸分子的多于一种（例如2、3、4、5、10、20、50或更多种）NPPF。图2中的虚线条表示特异性针对第一靶的NPPF，实心灰色条表示特异性针对第二靶的NPPF。在一些实例中，所述NPPF包括可检测标记，例如生物素（B），但是本领域技术人员应该理解可以在其他步骤例如在扩增过程中添加标记。因此，图2中示出的生物素是任选的，可以使用其他标记。所述反应还包括与所述侧翼序列互补的核酸分子（CFS）204，所述核酸分子是特异性针对NPPF202的侧翼序列。图2示出的点线绿色条204为特异性针对NPP的一个或多个侧翼序列的CFS。本领域技术人员应该理解所述CFS的序列将会根据所存在的侧翼序列而变化。另外，可以使用多于一个的CFS以确保侧翼区域得到保护（例如可以使用至少两个结合到单个侧翼序列的不同区域的CFS）。所述CFS可以包括天然或非天然碱基。虽然图2示出了在其两个末端有侧翼序列的NPPF；但是本领域技术人员应该理解可以使用单独一个侧翼序列。将所述样品、NPPF和CFS在足以使NPPF特异性结合到其各自的靶核酸分子且足以使CFS结合到其在所述NPPF侧翼序列上的互补序列的条件下孵育。在一些实例中，所加入的CFS204相对于NPPF202是过量的，例如至少是NPPF的5倍的CFS（摩尔过量），例如所述NPPF的至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少40倍、至少50倍或至少100倍的CFS。在一些实例中，所加入的NPPF202相对于所述样品中总核酸分子是过量的，例如至少为所述样品中总核酸分子的50倍的NPPF（摩尔过量），例如所述样品中总核酸分子的至少75倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍或至少1000倍的NPPF。为了方便实验，可以包括类似浓度的每种NPPF以制备混合物，使得对于所测量的丰度最高的核酸靶而言存在至少为该核酸靶的50倍的NPPF，例如至少100倍过量。所使用的所有NPPF的实际超出量和总量仅受限于所述核酸酶（例如S1核酸酶）破坏所有未杂交到靶核酸靶的NPPF的能力。在一些实例中所述反应被加热，例如在50℃孵育过夜。

如图2中步骤2所示，在使得发生所述结合/杂交反应后，使所述样品与特异性针对单链（ss）核酸分子的核酸酶在足以除去（或消化）单链核酸分子（例如未结合的核酸分子，例如未结合的NPPF、CFS和靶核酸分子或这些分子中保持为单链的部分）的条件下接触。如图2所示，将所述样品与特异性针对单链核酸分子的核酸酶一起孵育，导致了对任意单链核酸分子的降解，留下完整的双链核酸分子，包括其上已经结合CFS和靶核酸分子的NPPF。例如，将所述反应用S1核酸酶在50℃下孵育1.5小时（虽然水解可以在其他温度发生并且可以持续进行其他的时间长度，但是所需要的时间和温度会部分地为核酸酶的量的函数，并且依赖于需要被水解的核酸的量以及被保护的双链区域的Tm）。

在该反应后，所述样品可以任选地被处理以另外除去或分离未杂交的物质和/或灭活或除去残留的酶（例如通过加热、酚提取、沉淀、柱过滤等）。例如，如步骤3所示可以提高所述反应的pH以灭活所述核酸酶，以及加热所述反应以破坏所述核酸酶。另外，加热所述反应还会使所述靶核酸（例如靶DNA或靶RNA）和CFS与所述NPPF上的互补区域解离。这留下了先前结合所述靶核酸分子和CFS的完整的NPPF，其中所述完整的NPPF与已经杂交到所述靶的NPPF的量成正比。在一些实例中，所述杂交的靶核酸和CFS可以例如通过核酸酶或通过化学处理来降解。或者，可以处理所述样品以便留下所述靶核酸分子的（单链）杂交部分，或由所述靶核酸分子和CPS与所述NPPF杂交形成的双链体，供进一步分析（例如测序与所述NPPF杂交的靶）。在一个实例中，将pH提高至约pH8，并将所述反应在95℃下孵育10分钟，使得所述靶核酸和CFS解离（如果所述靶核酸为RNA，则水解所述靶核酸）。

如图2中步骤4所示，在步骤2或步骤3之后，扩增所述NPPF，例如使用PCR。图2以箭头示出了PCR引物或探针208。所述PCR引物或探针可以包括标记，例如生物素，从而导致产生标记的扩增子。PCR引物/探针208的至少一部分是特异性针对NPPF202的侧翼序列。然后可检测所产生的扩增子210，例如通过结合到阵列上（见图3），或者对其测序（见图4）。在一些实例中，所述引物208的浓度相对于CPS204是过量的，例如过量达至少10,000倍、至少50,000倍、至少100,000倍、至少150,000倍、至少200,000倍或至少400,000倍。在一些实例中，所述反应中引物208的浓度为至少200nM（例如至少400nM、至少500nM或至少1000nM），所述反应中CPS204的浓度低于1pM、低于0.5pM或低于0.1pM。

如图3中步骤5所示，可使扩增子210（其为扩增的NPPF）与包括多个空间上不连续区域的表面212接触。示出了两种不同方式。在一种实例中（上），所述表面包括至少一种与双功能接头216连接的锚214。在一些实例中将扩增子210加入到2×缓冲液，然后与表面212接触。双功能接头216包括特异性结合到所述锚的第一部分和特异性结合到多种NPPF扩增子210之一的第二部分。将扩增子210与表面212在足以使得多种NPPF扩增子210各自特异性结合到双功能接头216的第二部分的条件下一起孵育。如图1所示，NPPF102中特异性结合到双功能接头的区域在序列上与所述双功能接头互补（也与所述靶核酸序列互补）。使用NPPF扩增子210中包括的可检测标记检测结合到双功能接头216的第二部分的NPPF扩增子210，从而检测所述样品中的靶核酸。

在其他实例中（下），所述表面包括至少一种核酸捕获分子220，其可通过共价键直接连接到所述表面。在一些实例中将扩增子210加入到2×缓冲液，然后与表面212接触。核酸捕获分子220包括与多种NPPF扩增子210之一的至少一部分（例如所述NPPF侧翼序列区域的至少一部分，或例如在扩增过程中添加到所述侧翼序列的区域）互补的序列。将扩增子210与表面212在足以使得多种NPPF扩增子210各自特异性结合到核酸捕获分子220的条件下一起孵育。

使用NPPF扩增子210中包括的可检测标记来检测结合到核酸捕获分子220的NPPF扩增子210，从而检测所述样品中的靶核酸。例如，可将所述NPPF扩增子与所述表面在50℃下孵育过夜以使得所述NPPF扩增子结合到核酸捕获分子220。在一个实例中，用生物素标记所述NPPF扩增子。如图3的步骤6所示，可以使用亲和素-HRP218检测所述生物素（例如与所述亲和素-HRP在37℃下孵育1小时）。如图3的步骤7所示，除去过量的未结合的亲和素-HRP218，加入适合的底物，对所述表面成像以检测结合的NPPF。虽然生物素作为一个实例示出，但是本领域技术人员应理解，可以使用其他检测方法，例如通过检测所述NPPF扩增子上的荧光团或抗体。

在一些实例中，如果NPPF扩增子210没有被标记（例如在图2步骤4的扩增过程中没有加入标记），那么NPPF扩增子210可以包括与被标记探针的序列互补的区域（例如所述侧翼序列或其部分）（其中所述区域与双功能接头216不互补）。然后可将这种互补探针杂交到NPPF扩增子210，然后将它们连接至基质，如图3的步骤5所示。

在一些实例中，使所述NPPF扩增子与多个表面接触（例如微珠或其他颗粒的群）。在一个实例中，每个表面（例如混合微珠群中的每个微珠或微珠亚群）包括至少一种与双功能接头连接的锚，所述双功能接头包括与所述锚特异性结合的第一部分和第二部分，所述第二部分在足以使得所述多种NPPF扩增子各自特异性结合到所述双功能接头的第二部分的条件下特异性结合到所述多种NPPF扩增子之一。可以使用与所述NPPF扩增子连接的可检测标记来检测结合到所述双功能接头的第二部分的NPPF扩增子，从而检测所述样品中的靶核酸分子。在另一个实例中，每个表面（例如混合微珠群中的每个微珠或微珠亚群）包括至少一种核酸捕获分子，所述核酸捕获分子具有这样的序列，即所述序列在足以使得所述多种NPPF扩增子各自特异性结合到所述核酸捕获分子的条件下，与所述NPPF扩增子的至少一部分（例如侧翼序列或其一部分）互补。可以使用与所述NPPF扩增子连接的可检测标记检测结合到所述核酸捕获分子的NPPF扩增子，从而检测所述样品中的靶核酸分子。

如图4中步骤5所示，可对扩增子210（其为扩增的NPPF）测序。例如，所扩增的NPPF的一个或两个侧翼序列可以包括（或其上已经添加）序列衔接头，或者与所述侧翼序列互补且杂交的引物可以包括序列衔接头序列，其与测序芯片上的捕获序列互补并使得能够使用特定测序平台测序所述NPPF。在一些实例中，对多种NPPF平行测序，例如同时测序。因此该方法可用于测序多种NPPF序列。

图5A和5B的示意图提供了对所述方法的进一步的概括，以及所述核酸分子的更多细节。如图5A的左图所示，将样品（例如已经用样品破碎缓冲液处理的样品）中的靶核酸400与多种具有一个或多个侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）402（其中每种NPPF是特定性针对特定靶核酸400）以及与所述侧翼序列互补的核酸分子（CFS）406（其是特异性针对所述NPPF末端上的侧翼序列404）接触或孵育。示出了三种不同的靶核酸400：靶1的一个拷贝（绿色）靶2的两个拷贝（红色）和靶3的三个拷贝（蓝色）。该实例示出了加入等量的每种NPPF402。虽然图5A示出了在NPP的两个末端具有侧翼序列的NPPF；但是本领域技术人员应该理解可以使用单个侧翼序列。图5A的中图示出了在使靶核酸400、NPPF402和CFS406之间发生结合/杂交反应之后的反应产物。靶核酸400杂交到所述NPPF的中间区域，CFS406杂交到3′和5′侧翼序列404。图5A的右图示出了在将所述样品与特异性针对单链（ss）核酸分子的核酸酶在足以除去（或消化）单链核酸分子的条件下接触之后的反应产物。如图所示，所述靶核酸中未与NPPF408杂交的区域被消化掉，NPPF中没有结合到靶核酸或CFS的单链区域（例如410）也是如此。这留下了完整的双链核酸分子，包括其上已经结合CFS和靶核酸分子的NPPF（例如412）以及NPPF中仅杂交到靶（未杂交到CFS），或仅杂交到CFS（未杂交到靶）的区域（例如414）。

图5B的左图示出了分离所述双链核酸分子（例如使用加热和提高pH）之后的反应产物。然后可扩增所获得的幸存的NPPF，其与在核酸酶步骤中保护它们的靶核酸分子成正比。图5B的中图示出了将它们扩增之后的反应产物。图5B的右图示出了扩增后，可检测或测序所获得的NPPF扩增子（例如见图2-4）。

在一些实施方案中，所述方法可以包括将来自受试者的样品（例如包括核酸例如DNA或RNA的样品）与多种NPPF接触，所述多种NPPF包括至少一种特异性结合至第一靶（例如第一RNA）的NPPF和任选的至少一种特异性结合至第二靶（例如第二RNA）的NPPF。在一些实例中，所述多种NPPF包括多于一种（例如2、3、4、5或更多种）特异性针对单独一种靶核酸分子的NPPF。例如，所述多种NPPF可以包括至少一种NPPF（例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、500、1000、2000、3000或更多种），其中每种NPPF特异性结合单独一种靶核酸分子。在另外的或额外的实例中，所述多种NPPF包括至少两种不同的NPPF群（例如2、3、4、5、10、20或50种不同的NPPF序列），其中每种NPPF群（或序列）特异性结合到不同的靶核酸分子。

在一些实例中，若干种NPPF杂交到同一靶核酸的不同部分，并且与每种靶核酸的不同部分杂交的NPPF的数量可以相同或不同。例如，相对于以更高水平表达的核酸靶，低表达的核酸靶可以具有更多的与其杂交的NPPF，例如四种NPPF与低表达的核酸靶杂交，一种NPPF与高表达的核酸靶杂交。在一些实例中，一些特异性针对某些靶核酸的NPPF可以没有侧翼序列（例如NPP），因此不可被扩增或被标记或连接有合适的衔接头，因此NPPF的这部分不会被检测到或测序到。使用这样的混合物，具有侧翼序列的NPPF与没有侧翼序列的NPP的比例可以为约1：5、或约1：10、或约1：100、或约1：1,000时，可“减弱”所测量的信号或所测序到的NPPF的数量，使得如果有10,000个拷贝的靶核酸并且使用1比5的比例，则在扩增后测序到的NPPF的数量仅为每种NPPF都含有侧翼序列时应该会测序到的数量的1/5。

在一些实例中，所述多种NPPF包括至少2、至少5、至少10、至少20、至少100或至少1000（例如2-5000、2-3000、10-1000、50-500、25-300、50-300、10-100或50-100）种独特的NPPF序列。所述多种NPP可以包括特异性针对一种或多种靶核酸分子的NPPF的任意组合。将所述多种NPPF和所述CFS一起，与所述样品在足以使得所述NPPF特异性杂交到其各自的靶核酸和其各自的CFS的条件下孵育。在一些实例中，所加入的CFS相对于所述NPPF是过量的，例如相对于NPPF至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍摩尔过量的CFS。在一些实例中，所加入的NPPF相对于所述样品中的核酸分子是过量的，例如相对于所述样品中的核酸分子至少10倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少250倍、至少1,000倍、至少10,000倍或至少100,000倍摩尔过量或更多的NPPF。应该理解，如果针对高丰度核酸靶的NPPF过量1,000倍，并且每种不同的NPPF的相同浓度是相同的，那么针对低丰度基因的NPPF的过量可以是更多倍，例如对于丰度是高丰度核酸靶1/1000的基因来说可以是大于1000倍。

然后可将所述杂交的样品与特异性针对单链核酸的核酸酶（例如S1核酸酶）接触。然后可扩增所获得的幸存的NPPF，其与在核酸酶步骤中保护它们的靶核酸分子成正比。例如，可以使用包括与所述NPPF侧翼序列互补的序列的扩增引物。然后所获得的NPPF扩增子可以通过本领域中已知方法检测，例如通过使其结合至阵列或其他基质，或者对其测序。当一种或多种靶核酸分子各自的NPPF被检测到或测序到时，所述一种或多种靶核酸分子被鉴定为存在于样品中。

A.示例性的杂交条件

本文公开了足以使得多种NPPF特异性杂交到一种或多种靶核酸分子（例如来自受试者的样品中的DNA和RNA），以及特异性杂交到与所述一个或多个侧翼序列互补的CFS的条件。例如，使核酸（例如NPPF）能够在选择的严格性条件下杂交到另一核酸（例如靶DNA或RNA或CFS）同时使与其他物质或分子的非特异性杂交最少的特征（例如长度、碱基组成和互补程度）可以根据本公开内容确定。所述NPPF的特征在以下第IV部分更详细地论述。通常，NPPF的一个区域会具有与其对应靶核酸分子充分互补的核酸序列（例如图1，102）以使得其能够在选择的严格杂交条件下杂交，并具有与其对应CFS充分互补的区域（例如图1，104、106）以使得其能够在选择的严格杂交条件下杂交。示例性的杂交条件包括在约37℃或更高温度（例如约37℃、42℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或更高）下杂交。可以改变的杂交反应参数有盐浓度、缓冲液、pH、温度、孵育时间、变性剂（例如甲酰胺）的量和类型。例如，可以将核酸（例如多种NPPF）在缓冲液（例如含有NaCl、KCl、H₂PO₄、EDTA、0.05%Triton X-100或其组合的缓冲液）例如裂解缓冲液中以约10pM至约10nM（例如约30pM至5nM、约100pM至约1nM）的浓度加入到样品中。

在一个实例中，以至少10pM，例如至少20pM、至少30pM、至少50pM、至少100pM、至少150pM、至少200pM、至少500pM、至少1nM或至少10nM的终浓度将每种NPPF加入到样品中。在一个实例中，以约30pM的终浓度将每种NPPF加入到样品中。在另一个实例中，以约167pM的终浓度将每种NPPF加入到样品中。在另外的实例中，以约1nM的终浓度将每种NPPF加入到样品中。在一个实例中，以约至少6倍于探针的量，例如至少10倍或至少20倍于探针的量（例如6-20倍于探针的量）的终浓度将每种CFS加入到样品中。在一个实例中，加入的每种CFS为至少1nM、至少5nM、至少10nM、至少50nM、至少100nM或至少200nm，例如1-100、5-100或5-50nM。例如如果有6种探针，每种为166pM，那么可以以5-50nM加入每种CFS。

将所述样品中的核酸变性，使其成为单链并能够用于杂交（例如在约95℃-约105℃下，持续约5-15分钟）。通过使用不同的变性溶液，该变性温度可以改变，只要温度和缓冲液组成的组合导致形成单链靶DNA或RNA或单链靶DNA和RNA。然后所述样品中的核酸和CFS在约4℃-约70℃（例如约37℃-约65℃、约42℃-约60℃或约50℃-约60℃）的温度下与所述多种NPPF杂交，持续约10分钟至约72小时（例如至少约1小时-48小时、约6小时-24小时、约12小时-18小时或过夜）。当然，所述杂交条件会根据所用的具体NPPF和CFS而变化，但是其被设置为确保NPPF与所述靶分子和CFS杂交。在一些实例中，将所述多种NPPF和CFS与所述样品在至少约37℃、至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约70℃的温度下孵育。在一个实例中，将所述多种NPPF和CFS与所述样品在约37℃、约42℃或约50℃下孵育。

在一些实施方案中，所述方法不包括核酸纯化（例如在使所述样品与所述NPPF接触之前不进行核酸纯化，并且/或者在使所述样品与所述NPPF接触之后不进行核酸纯化）。在一些实例中，除了细胞裂解以外不需要对所述样品进行预处理。在一些实例中，细胞裂解以及使所述样品与所述多种NPPF和CFS接触是依次发生的。在其他实例中，细胞裂解以及使所述样品与所述多种NPPF和CFS接触是同时发生的，在一些非限制性实例中没有任何干预步骤。

当随后对所述NPPF进行PCR（例如通用扩增或例如用于实时PCR的NPPF特异性扩增）时，用于裂解、NPPF与其靶核酸杂交、核酸酶消化和碱水解的缓冲液和试剂可以与用于扩增的聚合酶相容。

B.用核酸酶处理

在所述NPPF杂交到所述样品中的靶核酸以及杂交到CFS后，对所述样品进行核酸酶保护步骤。已经杂交到靶核酸分子和（当使用时）CFS（一个或两个CFS，取决于在所述NPPF上有5′和3′的侧翼序列或者仅有一个侧翼序列，或者当不需要侧翼序列用于进行扩增或测量时则没有CFS）的NPPF没有被所述核酸酶水解，并且随后可被扩增，然后被检测或测序（或两者都进行）。

用一种或多种核酸酶处理会破坏所有的单链核酸分子（包括样品中未杂交到NPPF（从而不受NPPF保护）的RNA和DNA、未杂交到靶核酸的NPPF以及未杂交到NPPF的CFS（当使用时）），但是不会破坏双链核酸分子例如已经与CFS和所述样品中存在的靶核酸分子杂交的NPPF。例如，如果所述样品包括细胞提取物或裂解物，那么不想要的核酸（例如非靶的基因组DNA、tRNA、rRNA、mRNA、miRNA以及一种或多种靶核酸分子中未杂交到互补NPPF序列的部分（例如悬突））可以在该步骤中被充分破坏，在mRNA或DNA核酸靶的情况中，所述一种或多种靶核酸分子的未杂交到互补NPPF序列的部分将会占所述核酸靶序列的大部分。这保留了靶核酸/CFS/NPPF双链体的化学计量。如果所述靶分子被交联到由固定产生的组织上，那么所述NPPF杂交到所述交联的靶分子而不需要逆转交联，或者以其他方式将所述靶核酸从其交联的组织上释放。

可以选择条件使得导致未配对碱基的单个核苷酸差异不被切割，或可以使用仅切割未配对的碱基直到所述杂交的核酸酶保护探针的末端的核酸酶，例如外切核酸酶。还可以选择这样的条件，即其在单个未配对碱基的位点处水解所述NPPF序列，并且类似地在该位置水解所述靶核酸。

核酸酶的实例包括内切核酸酶、外切核酸酶和其组合。取决于所述杂交复合物的性质以及所述样品中存在的核酸剩余部分和非靶核酸序列的性质，可以使用多种核酸酶中的任一种，包括DNA酶、胰RNA酶、绿豆核酸酶、S1核酸酶、RNA酶A、核糖核酸酶T1、外切核酸酶III、外切核酸酶VII、RNA酶CLB、RNA酶PhyM、RNA酶U2等。本领域技术人员可以选择适合的核酸酶。在具体的实例中，所述核酸酶是特异性针对单链（ss）核酸的，例如S1核酸酶。除了水解过量的NPPF并将靶核酸的化学计量赋予所述NPPF之外，使用特异性针对单链核酸的核酸酶的一个优势是，在单链（“粘性的”）分子可能导致不需要的背景或交叉反应性的后续反应步骤中除去这些分子。但是，本领域技术人员应该理解，如果要对所述靶核酸测序，那么这是不必要的，因为仅具有适合的测序衔接头的NPPF会杂交到测序芯片上，此时所述样品中的单链分子可被洗掉。S1核酸酶可市购自例如Promega,Madison,WI(cat.no.M5761);Life Technologies/Invitrogen,Carlsbad,CA(cat.no.18001-016);Fermentas,Glen Burnie,MD(cat.no.EN0321)以及其他制造商。这些酶的反应条件是本领域熟知的并可以凭经验优化。

在一些实例中，将在缓冲液（例如含有乙酸钠NaCl、KCl、ZnSO₄、KATHON或其组合的缓冲液）中稀释的S1核酸酶加入到杂交的探针/样品混合物并在约37℃至约60℃（例如约50℃）下孵育10-120分钟（例如10-30分钟、30-60分钟、60-90分钟或120分钟）以消化所述样品中未杂交的核酸和未杂交的NPPF。

可以任选地处理所述样品以另外除去未杂交的物质和/或灭活或除去残留的酶（例如通过加热、酚提取、沉淀、柱过滤、加入蛋白酶k、加入核酸酶抑制剂、螯合所述核酸酶发挥活性所需的二价阳离子，或其组合）。在一些实例中，任选地处理所述样品以使所述靶核酸和一个或多个CFS从其互补的NPPF上解离（例如使用碱水解和加热）。在一些实例中，在杂交和核酸酶处理后，杂交到所述NPPF的靶RNA分子可以被降解，例如通过在碱中解离具有NPPF的双链体，然后通过核酸酶或通过化学/物理处理（如在高温下进行碱水解）破坏所述RNA，留下与杂交到靶核酸的NPPF成正比的NPPF。或者，可以处理所述样品以留下所述靶核酸的（单链）杂交部分，或留下由杂交的靶核酸和所述探针形成的双链体供进一步分析。

在一些实例中在与核酸酶孵育之后，加入碱（NaOH或KOH）以使pH提高至约9-12并加热所述样品（例如加热至95℃持续10分钟）。这使所述靶分子/CFS/NPPF二聚体解离，留下单链状态的NPPF，并且在RNA的情况中水解所述RNA靶分子。该步骤还可以中和或灭活所述核酸酶，例如通过使pH升高到约6以上。

在一些实例中处理所述样品以将pH调节至约7-约8，例如通过加入酸（例如HCl）。在一些实例中，在Tris缓冲液中使pH升高至约7-约8。升高pH可以防止DNA脱嘌呤，还可防止许多单链特异性的核酸酶（例如S1）充分发挥功能。

在一些实例中，在扩增前，纯化或分离所述样品以除去不需要的核酸或其他分子，例如通过凝胶纯化或其他分离方法。

C.扩增

可以例如使用常规方法例如PCR或其他形式的酶扩增或基于连接的扩增方法扩增所获得的NPPF分子（或已从所述NPPF分离所获得的靶核酸分子），所述NPPF分子与被测试样品中存在的靶核酸分子的量成正比的。

可以使用的体外扩增方法的实例包括但不限于定量实时PCR、链置换扩增（见USPN5,744,311）；无转录等温扩增（见USPN6,033,881）；修复链反应扩增（见WO90/01069）；连接酶链反应扩增（见EP-A-320308）；缺口填充连接酶链反应扩增（见USPN5,427,930）；偶连的连接酶检测和PCR（见USPN6,027,889）；以及NASBA^TM RNA无转录扩增（见USPN6,025,134）。在一个实例中，使用基于连接的扩增方法，其中引物是NPPF特异性的并且对接（butt-up）在一起使得它们可以连接在一起，解链（melt off），然后新的引物连接在一起，进行一系列的循环。连接可以是酶促的或非酶促的。如果所述NPPF侧翼序列用于杂交所述引物，那么扩增可以是通用的。

定量实时PCR是另一种体外扩增核酸分子的形式，可通过AppliedBiosystems（TaqMan PCR）进行。5′核酸酶测定提供了用于仅检测特定扩增产物的实时方法。在扩增过程中，所述探针与其靶序列退火产生了底物，当Taq DNA聚合酶从上游引物延伸到所述探针的区域时，该酶的5′核酸酶活性将切割所述底物。这种对聚合反应的依赖确保了对所述探针的切割仅在所述靶序列被扩增时发生。荧光探针的使用使得可以省去用于分析探针降解的PCR后处理。所述探针为连接有报告荧光染料和猝灭剂染料的寡核苷酸。当所述探针完整时，所述猝灭剂的接近大大减少了由所述报告染料通过

共振能量转移（FRET）发射的穿过空间的荧光。对于实时PCR，可以将所述NPPF的样品分到单独的孔或反应位置中，将不同的NPPF特异性的引物组加入到每个孔或反应位置。使用各自具有不同标记的探针使得能够进行多路复用的实时PCR，以在单个孔或反应位置内测量多种不同的NPPF。

在扩增所述NPPF过程中，可以例如在3′或5′末端或在两个末端将实验标签和/或测序衔接头作为例如所述引物和延伸构建体的一部分纳入。例如，包括与NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分的扩增引物，可以包括与需要的实验标签和/或测序衔接头互补的第二部分。本领域技术人员应该理解实验标签和/或测序衔接头的不同组合可被加入到所述NPPF的任一末端。在一个实例中，使用第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述NPPF，所述第一扩增引物包括与所述3′-NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分和与需要的测序衔接头互补的第二部分（或包含需要的测序衔接头的第二部分），所述第二扩增引物包括与所述5′-NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分和与需要的实验标签互补的第二部分（或包含需要的实验标签的第二部分）。在另一个实例中，使用第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述NPPF，所述第一扩增引物包括与所述3′-NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分和与需要的测序衔接头和需要的实验标签互补的第二部分（或包含需要的测序衔接头和需要的实验标签的第二部分），所述第二扩增引物包括与所述5′-NPPF侧翼序列的全部或一部分互补的第一部分和与需要的实验标签互补的第二部分（或包含需要的实验标签的第二部分）。

应该理解NPPF特异性引物可以用于添加测序衔接头、实验标签（包括使得能够通过基质捕获NPPF的标签）和NPPF标签。可将所述NPPF的样品分开到含有一种或多种不同的NPPF特异性引物的单独孔或位置中，扩增，然后单独测序或合并测序（或检测）。

还可使用扩增来将可检测标记引入到所产生的NPPF扩增子中（例如，如果所述NPPF原来是未标记的或如果需要另外的标记），或引入其他允许检测或猝灭的分子。例如，所述扩增引物可以包括在扩增过程中被纳入到所述NPPF中的可检测标记、半抗原或猝灭剂。这样的标记、半抗原或猝灭剂可被引入到所述NPPF扩增子的任一末端（或两个末端）或两个末端之间的任何位置。

在一些实例中，所获得的NPPF扩增子在检测或测序前被提纯。例如，可以在检测或测序前使用本领域中熟知的方法（例如凝胶纯化、生物素/亲和素捕获和释放、毛细管电泳）将扩增反应混合物提纯。在一个实例中，将所述NPPF扩增子生物素化（或使其包括另外的半抗原）并捕获到亲和素或抗-半抗原包被的微珠或表面上，洗涤，然后释放用于检测或测序。类似地，可将所述NPPF扩增子捕获到互补的寡核苷酸（例如结合到表面上的寡核苷酸）上，洗涤，然后释放用于检测或测序。所述扩增子的捕获不需要是特别特异性的，因为所公开的方法除去了大多数的基因组或转录组序列，留下已经杂交到靶核酸分子上的NPPF。如果需要，可以使用其他方法提纯扩增产物。

在扩增的最后步骤之后所扩增的产物还可以通过使用水解单链寡核苷酸的核酸酶（例如外切核酸酶I）的方法来提纯，同时其仍然为双链，所述核酸酶接着可以在继续下一步骤（例如杂交到表面）之前被灭活。

D.NPPF扩增子的检测

在一些实例中，通过任何适合的方式（例如基于所述NPPF扩增子上存在的可检测标记）来检测所获得的扩增子。在一个具体的非限制性实例中，所述NPPF扩增子包括生物素标记。在该实例中，可以通过以下方式来检测所述扩增子：将所述NPPF扩增子（例如在含有所述NPPF扩增子的支持物，例如阵列或微珠上）与亲和素-HRP、链霉亲和素-HRP或含有另外的适合酶（例如碱性磷酸酶）的缀合物一起孵育，然后使所述支持物与生色底物、化学发光底物或产生荧光的底物接触。在一个非限制性实例中，所述底物为TMA-3（Lumigen,Southfield,MI）。另外的化学发光底物是可以市购的，例如

(KPL,Gaithersburg,MD)、

(Pierce,Rockford,IL)和ECL^TM(Amersham/GEHealthcare,Piscataway,NJ)。例如使用微阵列成像器（例如OMIX、OMIX HD、CAPELLA或SUPERCAPELLA成像器，HTG MolecularDiagnostics,Tucson,Arizona）扫描仪或目视例如在侧流装置中，检测由所述底物产生的信号。可以使用基于铕的发光，以及电致发光或光散射或电（例如电导率或电阻）。在另一个实例中，所述NPPF包括荧光标记，例如Cy-3或Cy-5。可以使用标准的微阵列成像器（例如Typhoon^TM成像器（GE Life Sciences,Piscataway,NJ）、

微阵列扫描仪（Molecular Devices,Sunnyvale,CA）、

扫描仪（Affymetrix,Santa Clara,CA））、流式细胞术方法或荧光显微术方法来检测所述NPPF扩增子。本领域技术人员可以选择用于这些或其他可检测标记的适合的检测方法和试剂。

E.使用捕获分子检测NPPF

在一些实施方案中，在杂交、核酸酶处理和扩增之后，使含有NPPF扩增子的样品与包括多个空间上不连续区域的表面（其各自包括捕获分子）接触，或与多个各自包括捕获分子的表面接触。例如，所述表面可以是微珠群，其中所述微珠的亚群各自包括至少一种捕获分子。例如，第一亚群可以包括至少一种捕获分子，而第二亚群可以包括至少一种序列与所述第一亚群不同的捕获分子，等等。在一些实例中，所述捕获分子包括至少一种与双功能接头（也称为“编程接头”）连接的锚。或者，所述捕获分子包括核酸捕获探针，所述核酸捕获探针具有与NPPF扩增子的至少一部分互补的序列，例如与NPPF扩增子的侧翼区域的全部或一部分互补的序列。

在其中所述捕获分子包括至少一种与双功能接头连接的锚的实例中，所述锚和双功能接头是通过杂交、退火、共价键或其他结合而连接。所述双功能接头包括特异性结合到所述锚（例如与其互补）的第一部分和特异性结合到所述多种NPPF扩增子之一（例如与其互补，例如与图1示出的NPPF100的区域102的全部或一部分互补）的第二部分。

在一些实施方案中，所公开的方法包括在表面上（例如在阵列上）的锚，其与双功能接头连接，所述双功能接头被用于在所述扩增步骤后捕获所述NPPF扩增子。在一些实例中，锚是长度为约8-150个（例如约8-100、15-100、20-80、25-75或25-50，例如约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150个核苷酸）核苷酸的寡核苷酸。在一个非限制性实例中，所述锚长度为约25个核苷酸。在一些实例中，所述锚包括特异性结合到所述双功能接头第一部分的第一部分和充当所述表面和所述锚的第一部分之间的间隔物的第二部分。在一些实例中，所述锚的第二部分的长度为约6-60个碳原子或核苷酸（例如约6、12、24、30、36、42、48、54或60个碳原子或核苷酸）。在其他实例中，所述锚的第二部分的长度为约5-100个碳原子或核苷酸（例如约10-50、15-40、20-30或约25个碳原子或核苷酸）。

用于所公开的方法的锚的碱基组成是这样的，即使得所述锚和双功能接头的配对的热力学稳定性高。在一些实例中，所述锚的碱基组成百分数为约30-40%G、30-40%C、10-20%A和10-20%T。在一些实例中，所述锚中的最近邻频率使G-G或C-C的最近邻最少以减少由G-四联体形成介导的副反应。在其他实例中，可以将非天然碱基或肽核酸纳入到所述锚或双功能接头中以改变其性质。

设计和合成所公开的方法中使用的锚的方法记载于例如PCT公开No.WO98/24098中，其以引用的方式纳入本文。在一些实例中，需要一组彼此基本不相似的锚。获得一组不相似锚的示例性算法如下：

1)定义所述组的大小。在一些实施方案中，16、24、36、48、49、64、81、96和100组成可用的大小。

2)定义所述锚组的总序列结构。上述的长度和碱基组成被用于定义这些参数。通常，G碱基和C碱基的数量与A碱基和T碱基的数量保持相等。这种相等使最终组的结构多样性最优。因此，这些组将通过方程G_nC_nA_mT_m来描述。

3)对于由m和n定义的组结构，使用随机数生成器产生一组随机的序列异构体。

4)选择所述随机序列组的一个成员用作所述组的要素#1。

5)定义组成员中容许的最大相似度。以局部配对碱基比较的方式定义相似度。例如，当比对两个相同长度n的寡聚物链使得5′和3′末端对齐时，没有错配是指在所有位置1-n上所述两条链中的碱基都相同的情况。完全错配是指在所有位置1-n上所述两条链中的碱基都不相同的情况。例如，可用的最大相似度可以是在一组16,16mer捕获探针内有10个或更多个错配。

6)选择所述随机序列组的第二成员并确定其与要素#1的相似度。如果要素#2与要素#1的相似度低于最大容许相似度，其会保留在所述组中。如果要素#2的相似度大于最大容许相似度，将其丢弃并选择新序列用于比较。重复这个过程直到确定第二要素。

7)以顺序方式，选择所述随机序列组的其他成员，所述其他成员相对于所有之前选择的要素满足所述不相似度限制。

可用于所公开的方法的一组16个锚的一个非限制性实例在表1示出。

表1.示例性的锚序列

锚序列(5′-＞3′)	SEQ ID NO：
		TGATTCAGACCGGCCG	1
CCCGGGGCGTCTTAAC	2
		GGACGCCATATGCGCT	3
TGAGGGCTCCGCCATA	4
		AACCCGTGACGTGTGC	5
AGCATCGCCGGTCCTG	6
		CCTGCAAGGCTGACGT	7
CAGTTGTCGACCCCGG	8
		CGGCGCGTCCAATTCG	9
ATCGATCTGAGGGCCC	10
		GTACATGCGGCCTGCA	11
TAGCCGCTCGCTAGAG	12
		CCTAGTGATGACCGGC	13
GTCTGAGGGCAACCTC	14

锚序列(5′-＞3′)	SEQ ID NO：
		CTAGCTGGCTACGCAG	15
GCCATCCGCTTGGAGC	16

在其他实例中，其中所述捕获分子包括至少一种核酸捕获探针，其具有与NPPF扩增子的至少一部分互补的序列，例如与NPPF扩增子的侧翼区域的全部或一部分互补的序列。例如，所述核酸捕获探针可以包括与所述NPPF扩增子互补的区域，并可以包括不与其互补的区域（例如使得能够将所述探针连接到表面上的区域）。所述核酸捕获探针可以直接连接到表面。例如，所述核酸捕获探针可以包括胺，用于共价连接到表面上。在一些实例中，核酸捕获探针是长度为至少8个核苷酸的寡核苷酸，例如长度为至少10、至少15、至少20、至少30、至少50或至少100个核苷酸（例如，约8-100、15-100、20-80、25-75或25-50，例如约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150个核苷酸）。本领域技术人员会理解，所述核酸捕获探针中与所述NPPF扩增子的一个区域互补的区域不需要是100%互补的，只要在所述核酸捕获探针和适合的NPPF扩增子之间可以发生杂交即可。在一些实例中，所述核酸捕获探针中与所述NPPF扩增子一个区域互补的区域的长度为至少8个核苷酸，例如长度为至少8、至少10、至少15、至少20、至少30、至少50或至少100个核苷酸（例如长度为约8-100、15-100、20-80、25-75或25-50，例如约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或150个核苷酸）。

在一些实例中，使含有NPPF扩增子的样品变性，然后将其与所述阵列的表面接触（例如通过加热至95℃并持续5分钟，并迅速将样品在冰上冷却）。在一些实例中，调节所述含有NPPF的样品，然后与使其所述表面接触（例如调节盐或甲酰胺的浓度）。将所述含有NPPF扩增子的样品与所述表面（例如阵列或微珠）一起孵育，持续时间足以使所述NPPF扩增子特异性结合（例如杂交）到所述捕获分子。在一些实例中，将所述样品与所述表面在约37℃至约65℃（例如约45℃至约60℃或约50℃至约60℃，例如50℃）下孵育至少1小时（例如1-8小时、1-36小时、12-24小时或16-24小时或过夜）以使得所述NPPF扩增子杂交到所述捕获分子（“NPPF捕获”）。例如，如果使用微流体或巨流体（macrofluidic）装置、侧流装置或通过减少扩散以及使用主动流或进行混合，则所述捕获时间可以缩短。

可以用于所公开的方法的一些表面（或基质）可以容易地从商业供应商获得。在一些实施方案中，所述表面为96-、384-或1536-孔微量滴定板，例如由Corning Costar销售的改良的板。在其他实施方案中，基质包括一种或多种微珠（例如可以由大小或颜色区分的微珠群，例如通过流式细胞术区分的微珠群）。或者，含孔的表面（其还包含凹陷或“凹窝”）可以通过如下方式制备：对物质（例如铝或钢）进行微加工来制备模具，然后将塑料或类似材料微注射到所述模具中以形成构造物（structure）。或者，可以组装由玻璃、塑料、陶瓷等组成的构造物。隔离膜（seperator）可以是例如材料（例如硅酮）的片，其上遍布隔开的洞，使得当将三个所述片连接在一起时每个洞形成测试孔的壁。细分器（subdivider）可以是例如材料（例如硅酮）的薄片，其被塑造成滤网或细网状物的形式。所述表面上隔开不同反应的分隔物（divider）还可以是溶液不会附着其上的有涂层的表面，或纳米结构，或简单地是单独的滴，或毛细管或微流体通道或位置。在一些实例中，所述基质是材料（例如玻璃或塑料）的平片，例如为用于生化测定的典型微板的下部的形状。所述基质的上表面可以是平的，或可以被制备成具有凹陷，所述凹陷与所述细分器形状结合以在每个样品孔中提供充分的细分或孔。可以通过标准操作（例如用于组装硅片的操作）来将所述三个片连接在一起。

适用于所述表面的材料包括但不限于：玻璃、二氧化硅、金、银、凝胶或聚合物、硝酸纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚乙烯吡咯烷、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚氟乙丙烯、聚乙烯乙烯醇、聚甲基戊烯、聚氯三氟乙烯、聚砜类（polysulfornes）、羟基化双轴取向聚丙烯、胺化双轴取向聚丙烯、硫醇化双轴取向聚丙烯、乙烯丙烯酸、乙烯甲基丙烯酸（thylenemethacrylic acid）以及其共聚物的混合物（见美国专利No.5,985,567），或由包括碳的纳米材料组成。

通常，可用于形成所述表面的材料的适合特性包括：能够进行表面激活使得一经激活，所述支持物的表面即能够在其上共价地连接生物分子例如寡核苷酸（例如锚）；能够进行生物分子的“原位”合成；是化学惰性的，使得所述支持物上未被寡核苷酸或蛋白质占据的区域不允许非特异性结合，或者当非特异性结合发生时，这种物质可以被容易地从所述表面除去而不会除去所述寡核苷酸或蛋白质。所述表面可以是可渗透的、可部分渗透的或不可渗透的。

根据本公开内容可以使用多种用于排列所述锚的阵列形式。一种合适的形式包括二维的不连续单元样式（例如在64×64阵列中4096个方块）。如本领域技术人员所理解的，包括但不限于槽（矩形）和圆形阵列的其他阵列形式同样适合使用（见美国专利No.5,981,185）。在一些实例中，所述阵列为多孔板。

寡核苷酸锚、双功能接头和其他捕获分子（以及NPPF、CFS和PCR探针/引物）可以通过常规技术（例如用商品化的寡核苷酸合成仪和/或通过将已经这样合成的亚片段连接在一起）来合成。太长而不能通过这种方法可靠地合成的核酸可以使用常规的操作通过扩增操作来产生。

在一个实施方案中，具有与NPPF扩增子中至少一部分互补的序列的预先形成的核酸锚（例如寡核苷酸锚）或核酸捕获探针（例如寡核苷酸探针），是可以通过多种常规技术中的任一种来被设置在测试区域表面上或表面内，所述多种常规技术包括光蚀刻印刷或丝网印刷化学连接、喷墨技术沉积、毛细管、滤网或流体通道芯片、采用电极阵列的电化学成模、与针或刺接触，或变性然后烘烤或UV照射到滤器上（见例如Rava et al.(1996).美国专利No.5,545,531；Fodor et al.(1996).美国专利No.5,510,270；Zanzucchi et al.(1997).美国专利No.5,643,738；Brennan(1995).美国专利No.5,474,796；PCT WO92/10092；PCT WO90/15070）。可将寡核苷酸锚或探针置于测试区域的表面顶部，或者例如在聚丙烯酰胺凝胶垫的情况中可以以这样的方式将寡核苷酸锚或探针嵌入到所述表面中，即使得一些所述锚或探针从所述凝胶结构伸出到所述凝胶内的水性部分和凝胶表面中并能够与接头或NPPF相互作用。对于可渗透的表面和可部分渗透的表面也是如此，例如其中第一部分（例如所述表面中与含有双功能接头或NPPF的溶液接触的区域）可渗透而第二部分（例如进入所述表面一段距离的部分）不渗透的表面。在一个实施方案中，将预先形成的寡核苷酸锚或探针在5′末端用游离氨基衍生化；将其以凭经验常规确定的浓度（例如约1μM）溶于缓冲液中，例如50mM pH8.5的磷酸盐缓冲液和1mM EDTA；并用Pixus纳米喷射分散器（Cartesian Technologies）以约10.4纳升的液滴加到测试孔中的特定位置，所述测试孔的上表面为新的、干的DNA结合板（CorningCostar）。取决于寡核苷酸连接和蒸发的相对速率，在制备过程中可能需要控制所述孔中的湿度。在另一个实施方案中，可以使用常规方法，例如对生长中的寡核苷酸链的光激活脱保护（例如结合使用位点定向的“掩蔽物”）或通过使用纳米喷射分散器模式化分散灭活化合物的纳升小滴，而在测试区域的表面上直接合成寡核苷酸锚或探针。例如，可以使所有生长中的寡核苷酸脱保护以接受单个核苷酸，然后在整个所述表面加入核苷酸。在另一个实施方案中，使用常规方法将寡核苷酸锚或探针经所述寡核苷酸的3′末端连接到所述表面上。

F.使用替代的方法检测NPP

在一些实施方案中，在杂交、核酸酶处理和扩增之后，使用另外的方法例如高通量平台检测所述NPPF扩增子。在一些实例中，使用凝胶电泳、色谱、质谱、测序、常规微阵列分析检测NPPF扩增子，在所述PCR扩增步骤或杂交捕获过程中检测NPPF扩增子。在一些实施方案中，所述NPPF扩增子不包括可检测标记并且使用间接的检测方法。本领域技术人员知晓这样的方法，包括但不限于本文描述的那些方法。

在一个实例中，使用基于微珠的测定例如微珠阵列检测NPPF扩增子。基于微珠的测定的一个实例使用

微珠（Luminex,Austin,TX），例如QBEAD测定。在一些实例中，通过杂交至与微珠连接的寡核苷酸（例如在约50℃下约1小时），在

微珠或其他微珠上捕获所述NPP。所述NPPF扩增子中包括的可检测标记可以例如通过流式细胞术（例如使用Luminex200、Flexmap3D或其他适合的仪器）检测。

在另一个实例中，使用标准的微阵列检测NPPF扩增子。这种阵列的一个实例是Nimblegen微阵列（Nimblegen,Madison,WI）。在一些实例中，所述NPPF扩增子与包括寡核苷酸的阵列杂交，所述寡核苷酸特异性结合所述NPPF扩增子。在所述NPPF扩增子中包括的可检测标记可以被检测。

在一些实例中，用“条形码”测定检测NPPF扩增子。这种测定的一个实例是

分析系统（Nanostring Technologies,Seattle,WA）。在一些实例中，所述NPPF扩增子与包括一种或多种颜色编码标签（“条形码”）的探针杂交。对颜色编码的标签的检测使得可以鉴别所述NPPF扩增子。见例如WO07/0761282;WO07/076129;WO07/139766。

F.扩增子的测序

在一些实例中，对所获得的NPPF扩增子进行测序，例如通过对完整NPPF扩增子或其部分（例如足以鉴定所述靶核酸分子的量）进行测序。本公开内容不限于具体的测序方法。在一些实例中，在单个反应中对多种不同的NPPF扩增子测序。在一个实例中，可对所述NPPF扩增子的实验标签测序，所述实验标签可以被设计为对应于特定的靶序列。因此，如果所述NPPF扩增子的3′末端在末端的2-25个核苷酸（例如末端的2-5或2-7个核苷酸，例如末端的2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸）具有序列，所述序列表示针对所测量的各个靶的独特序列，那么这就是需要被测序为鉴定所述靶的所述NPPF扩增子的所有序列，并且通过计数所测序到的这种实验标签的数量可以确定所述样品中各靶的量。

在一个实例中，使用链终止方法对所获得的NPPF扩增子例如由DNA组成的扩增子进行测序。此技术利用DNA合成反应的序列特异性终止，所述DNA合成反应使用修饰的核苷酸底物。在链终止物测序中，通过使用与所述NPPF扩增子的一部分互补的寡核苷酸引物在所述NPPF扩增子的特定位点处起始延伸。使用聚合酶例如RNA或DNA聚合酶延伸所述寡核苷酸引物。与所述引物和聚合酶一起包括在内的是四种脱氧核苷酸碱基（或核糖核苷酸）以及低浓度的链终止核苷酸（常见为双脱氧核苷酸）。通过所述聚合酶有限地引入所述链终止核苷酸产生仅在使用该特定核苷酸的位置处终止的一系列相关核酸片段。然后，例如在平板聚丙烯酰胺凝胶上，或者在充满粘性聚合物的窄玻璃管（毛细管）内，通过电泳按大小分离所述片段。

替代的方法是染料终止物测序。使用该方法使得能够在单个反应中完全测序，而不是使所述链终止方法所需要的四个反应。这通过以在不同的波长下发出荧光的不同荧光染料标记每种双脱氧核苷酸链终止物的每一种来实现。

在另一个实例中使用焦磷酸测序，例如由Biotage（用于低通量测序）和454Life Sciences（用于高通量测序）商业化的方法。在基于阵列的方法（例如454Life Sciences）中，单链核酸（例如DNA）退火至微珠并通过EmPCR扩增。然后，将这些结合核酸的微珠连同在ATP的存在下产生光的酶一起置于光纤芯片上的孔中。当将游离核苷酸从此芯片上洗下时，因为核苷酸与其互补碱基对结合时产生ATP所以产生了光。加入一种（或多种）核苷酸导致产生光信号的反应，所述光信号是例如用CCD照相机记录。信号强度与纳入单核苷酸流中的核苷酸（例如同聚物连续片段（stretch））的数量成比例。

在另一个实例中，使用

（例如HiSeq）或Ion Helicos、

（Applied Vioasystems）或任意数量的其他商品化测序系统对所述NPPF扩增子进行测序。测序衔接头（例如所述NPPF扩增子上存在的poly-A或poly-T尾，例如使用PCR引入）被用于捕获。用

或

进行的测序通常涉及文库制备，所述文库制备是通过将DNA随机片段化，继而体外连接常用衔接头序列而实现。对于所公开的方法，可省略将待测序核酸随机片段化的步骤，并且可将衔接头序列与所述NPPF扩增子体外连接，例如所述NPPF扩增子上存在的实验标签，但是这些还可以通过使用所述侧翼区域和PCR纳入，免去对连接的需要。一旦被通过测序衔接头捕获到所述测序芯片/微珠上，进行桥式扩增以形成每个探针的克隆用于测序。在这些方法中，所述NPPF扩增子最终在空间上聚集到平面基质上的单一位置（

原位克隆，桥式PCR），或聚集到微米级微珠的表面（乳液PCR），所述微珠可被回收并排成阵列（乳液PCR）。所述测序方法包括酶驱动生物化学和基于成像的数据采集的交替循环。这些平台依赖于借助合成的测序，即被引发的模板（primed template）的连续延伸。连续重复进行酶辨识和成像，用于为每个阵列特征建立连续的测序读取结果。通过在每个循环（例如，通过聚合酶引入荧光标记的核苷酸的循环）的全阵列成像采集数据。每个循环（例如通过聚合酶引入荧光标记的核苷酸的循环）。在流动槽（flow cell）上形成的克隆上可以使用多于一种测序引物，使得能够进行双末端测序，或者对所述扩增子的一个或多个其他部分（例如条形码或索引标签或实验标签）进行测序。

对于

扩增后，在测序芯片/微珠扩增子上，测序引物与所述NPPF杂交。测序是通过焦磷酸测序进行。将携带扩增子的微珠与嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus,Bst）聚合酶和单链结合蛋白一起预孵育，然后沉积具有皮升级孔的微型制造阵列中，每孔一个微珠，使得此生物化学与基于阵列的测序相容。还加入了更小的微珠，其携带同样为焦磷酸测序所需的固定化的酶（ATP硫酸化酶和萤光素酶）。在测序过程中，半-有序阵列的一侧充当流动槽用于引入和除去测序试剂。另一侧连接光纤束用于基于CCD的信号检测。在每个循环中，引入单一种类的未标记的核苷酸。对于其中这种引入导致了纳入的序列，焦磷酸借助ATP硫酸化酶和萤光素酶被释放，在特定的阵列坐标产生由CCD检测的突发光。经过多轮循环，检测到的纳入事件的模式揭示了各个微珠代表的模板序列。

对于使用桥式PCR的方法（例如

），放大的测序特征是通过桥式PCR产生。正向和反向PCR引物均通过柔性接头连接于固体基质，使得在扩增过程中从任何单个模板分子产生的所有扩增子保持固定并聚集到阵列上的单个物理位置。在一些实例中，桥式PCR使用延伸（使用Bst聚合酶）与变性（例如用甲酰胺）的交替循环。所产生的“簇(cluster)”均由约1000个克隆扩增子构成。可将几百万个簇扩增至单流动槽上八个独立“泳道”中每一个内的可辨别位置（使得可在同一次设备运行中平行地对8个独立实验测序）。簇产生后，所述扩增子是线性化的，并且测序引物与目的区域侧翼的通用衔接头序列杂交。序列辨识（sequence interrogation）的每个循环是由使用经修饰的DNA聚合酶和四种核苷酸的混合物进行的单碱基延伸构成。这些核苷酸是“可逆的终止物”，因为在3'羟基位置处可化学切割的部分只容许在每个循环中发生单碱基纳入，并且同样可化学切割的四种荧光标记之一对应于每种核苷酸的种类。在四个通道中进行单碱基延伸并采集图像后，化学切割两基团用于下一循环。目前常规的读出序列长度最长达36bp。

在一个实例中，使用

或

单分子测序方法。

应该理解可以设计所述NPPF用于通过任何方法在任何目前或以后开发的测序仪上进行的测序。所述NPPF自身不会限制所使用的测序方法和所使用的酶。其他测序方法正在或将要开发，本领域技术人员可理解所产生的NPPF扩增子（或与所述NPPF杂交的DNA）将适用于这些系统上进行的测序。

G.对照

在一些实施方案中，所述方法包括使用一种或多种阳性和/或阴性对照，所述对照处在与实际的实验NPPF相同的反应条件下。加标签的使用使得能够将实际上不同样品用作对照，但被处理用于在与测试样品相同的测序泳道中测序并运行。当测量靶RNA时，可测量DNA作为细胞数的对照。

在一些实例中，“阳性对照”包括内部的归一化对照，其针对变量例如每种样品裂解的细胞数、DNA或RNA的回收率或杂交效率，例如一种或多种NPPF、CFS、对应的接头等，其是特异性针对一种或多种基础水平或组成型持家基因，例如结构基因（例如肌动蛋白、微管蛋白或其他基因）或DNA结合蛋白（例如转录调节因子或其他蛋白）。在一些实例中，阳性对照包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、肽基脯氨酰（peptidylproylyl）异构酶A（PPIA）、大核糖体蛋白（RPLP0）、核糖体蛋白L19（RPL19）或下文论述的其他持家基因。其他阳性对照可被掺入到样品中以独立于样品作为测定过程的对照。

在其他实例中，阳性对照包括特异性针对已知存在于所述样品中的DNA或RNA（例如很可能存在于待测试的物种中的核酸序列，例如持家基因）的NPPF。例如，可在与多种测试NPPF杂交之前或杂交的过程中，将所述对应的阳性对照NPPF加入到所述样品中。或者，在核酸酶处理后将所述阳性对照NPPF加入到所述样品中。

在一些实例中，阳性对照包括已知存在于所述样品中的核酸分子（例如很可能存在于待测试的物种中的核酸序列，例如持家基因）。可在与多种NPPF杂交之前或杂交过程中将所述对应的阳性对照核酸分子（例如体外转录的核酸或从不相关样品中分离的核酸）加入到所述样品中。

在一些实例中，“阴性对照”包括已知其互补物（complement）在所述样品中并不存在的一种或多种NPPF、CFS、对应的接头等，例如作为杂交特异性的对照，例如来自非待测试物种的核酸序列，例如当分析人核酸时来自植物的核酸序列（例如拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP2-样乙烯-响应转录因子（ANT）），或在自然界中未发现的核酸序列。

在一些实施方案中，相对于至少一种持家核酸分子的信号对每种NPPF扩增子的信号进行归一化，例如用于解释样品之间细胞结构的差异。示例性的持家基因包括GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、SDHA（琥珀酸脱氢酶）、HPRT1（次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1）、HBS1L（HBS1-样蛋白）、β-肌动蛋白（ACTB）、β-2微球蛋白（B2m）和AHSP（α血红蛋白稳定蛋白）中的一种或多种。本领域技术人员可以选择另外的持家基因用于对所公开的方法中的信号进行归一化，所述另外的持家基因包括但不限于核糖体蛋白S13（RPS13）、核糖体蛋白S20（RPS20）、核糖体蛋白L27（RPL27）、核糖体蛋白L37（RPL37）、核糖体蛋白38（RPL38）、鸟氨酸脱羧酶抗酶1（OAZ1）、聚合酶（RNA）II（DNA指向的）多肽A（220kDa，POLR2A）、yes相关蛋白1（YAP1）、酯酶D（ESD）、蛋白酶体（蛋白酶体（prosome）、巨蛋白因子（macropain）、26S亚基、ATP酶、1，PSMC1）、真核生物翻译起始因子3亚基A（EIF3A）或18S rRNA（见例如de Jonge et al.,PLoS One2:e898,2007;Saviozzi et al.,BMC Cancer6:200,2006;Kouadjo et al.,BMC Genomics8:127,2007；各自以引用的方式纳入本文）。所述归一化的值可以直接在样品或测定之间比较（例如在单个测定中的两个不同样品之间，或在两个单独测定中测试的相同样品之间）。

IV.具有侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）

所公开的方法使得能够（例如同时地）检测和/或测序一种或多种靶核酸分子。基于所述靶核酸，可以使用本文提出的标准结合本领域技术人员的知识设计在所公开的方法中使用的NPPF。在一些实例中，所公开的方法包括产生一种或多种适合的NPPF用于检测特定的靶核酸分子。所述NPPF在多种（已知或凭经验确定的）条件下特异性结合（或能够特异性结合）靶核酸或其部分，只要这种靶存在于所述样品中。

所述NPPF包括与靶核酸分子互补的区域，使得对于每种特定的靶核酸序列，在所述反应中存在至少一种特异性针对所述靶核酸序列的NPPF。例如，如果存在2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的待检测或测序的靶核酸序列，所述方法将对应地使用至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的NPPF（其中每种NPPF对应于一种特定的靶）。因此在一些实例中，所述方法使用至少两种NPPF，其中每种NPPF是特异性针对不同的靶核酸分子。但是，应该理解，针对特定的靶核酸分子（例如单个靶核酸序列的许多不同区域）可以产生若干种不同的NPPF。在一个实例中，NPPF包括与仅在转录组序列的单个基因中发现的序列互补的区域。NPPF被设计特异性针对靶核酸分子并且被设计为具有相似的Tm（如果要用于同一反应）。

因此，可将单个样品与一种或多种NPPF接触。一组NPPF是两种或更多种NPPF的集合，所述NPPF各自特异性针对不同的靶和/或同一靶的不同部分。一组NPPF可以包括至少、最高达或确切地为2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、50、100、500、1000、2000、3000、5000或10,000种不同的NPPF。在一些实例中，将样品与足量的NPPF接触，所述NPPF对该NPPF的靶来说是过量的，例如100倍、500倍、1000倍、10,000倍、100,000倍或10⁶倍过量。在一些实例中，如果使用一组NPPF，那么该组中的每种NPPF均以相对于所述样品中其各自的靶（或靶的一部分）来说过量的量提供。过量的NPPF可以帮助对结合特定靶的NPPF的量进行定量。一些方法实施方案涉及同时与相同的NPPF或相同的NPPF组接触的多个样品（例如至少、最高达或确切地为10、25、50、75、100、500、1000、2000、3000、5000或10,000个不同的样品）。

图1示出了示例性的NPPF100，其具有包括与所述靶核酸序列特异性结合或杂交的序列的区域102，以及在所述NPPF的5′和3′末端的侧翼序列104、106，其中所述侧翼序列与其互补序列（本文称为CFS）结合或杂交。所述NPPF（以及与所述NPPF结合的CFS）可以由天然的核苷酸（例如核糖核苷酸（RNA），或脱氧核糖核苷酸（DNA））或非天然的核苷酸（例如锁核酸（LNA，见例如美国专利No.6,794,499）、肽核酸（PNA））等组成。所述NPPF可以是单链的或双链的。在一些实例中，所述NPPF包括一种或多种合成碱基或替代碱基（例如肌苷）。在NPPF中可以在一个或多个位置（例如1、2、3、4、5或更多个位置）使用修饰的核苷酸、非天然的核苷酸、合成的或替代核苷酸。在一些实例中，与长度和组成相同但不包括修饰的核酸的NPPF的T_m相比，在所述NPPF中使用一种或多种修饰的或非天然的核苷酸，可以增加所述NPPF的T_m。本领域技术人员可以设计这种修饰的核苷酸的探针以获得具有所需T_m的探针。在一个实例中，NPPF由DNA或RNA（例如单链（ssDNA）或分支DNA（bDNA））组成。在一个实例中，NPPF为适体。

凭经验确定用于特定靶或样品（例如固定或交联的样品）的NPPF的适当大小的方法是常规的。在具体实施方案中，NPPF长度可以最高达500个核苷酸，例如长度最高达400、最高达250、最高达100或最高达75个核苷酸，包括例如20-500、20-250、25-200、25-100、25-75或25-50个核苷酸的长度。在一个非限制性实例中，NPPF长度为至少35个核苷酸，例如长度为至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少150或至少200个核苷酸，例如长度为50-200、50-100或75-200或36、72或100个核苷酸。取决于所需要的功能，具体的NPPF实施方案可以更长或更短。在一些实例中，所述NPPF具有合适的大小（例如足够小）以渗透固定的和/或交联的样品。固定的或交联的样品在固定或交联的程度上可以不同；因此，普通技术人员可以确定对特定样品情况或类型来说合适的NPPF大小，例如通过使用具有已知的固定靶浓度的样品进行一系列实验并相对于靶信号强度比较NPPF大小。随着NPPF长度增加，在这种实验中，在某一点靶信号强度应该开始下降。在一些实例中，将所述样品（因此，靶的至少一部分）被固定或交联，并且所述NPPF小的足以使得信号强度保持较高并且基本上不因NPPF的大小而变化。

与靶核酸序列特异性结合的序列102在序列上与待检测或测序的靶核酸序列互补。本领域技术人员应该理解，序列102不需要与整个靶核酸互补（例如，如果所述靶是有100,000个核苷酸的基因，那么序列102可以是其部分，例如与特定靶核酸分子互补的至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100或更多个连续核苷酸）。探针的特异性随着长度而增加。因此例如，与仅具有15个核苷酸的相应序列相比，与所述靶核酸序列特异性结合且包括25个连续核苷酸的序列102将以更高的特异性退火到靶序列。因此，本文公开的NPPF可以具有与靶核酸序列特异性结合的序列102，所述序列102包括与特定靶核酸分子互补的至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100或更多个连续核苷酸（例如与靶DNA或靶RNA互补的约6-50、10-40、10-60、15-30、18-23、19-22或20-25个连续核苷酸）。与靶核酸序列特异性结合的序列102（其可以是用于实践本公开内容的方法的NPPF的一部分）的具体长度包括与靶核酸分子互补的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续核苷酸。在一些其中靶核酸分子为miRNA（或siRNA）的实例中，与所述靶核酸序列特异性结合的序列102的长度可以更短，例如长度为20-30个核苷酸（例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸）以匹配所述miRNA（或siRNA）长度。但是，本领域技术人员应该理解与靶特异性结合的序列102不需要与所述靶核酸分子100%互补。取决于所述反应条件和对应的所用核酸酶的选择性，可能需要多于一个错配（例如至少两个邻近错配）以发生核酸酶消化。在一些实例中，所述NPPF在一个或多个位置（例如1、2、3、4、5或更多个位置）处是简并的，例如与所述靶特异性结合的序列104中特定位置处多个核苷酸（例如2、3或4个核苷酸）的混合物。

序列102还与编程或双功能接头特异性结合（其中所述双功能接头的一个区域与序列102互补）。在一些实施方案中，在杂交和核酸酶处理后，将所述样品与表面（例如包括多个空间上不连续的区域的表面）接触，所述表面至少包括捕获分子，例如与编程接头连接的锚或包括与所述NPPF扩增子的一部分（例如侧翼序列或其部分）互补的序列的核酸捕获探针。如图3所示，双功能接头216包括与锚214特异性结合（例如与其互补）的第一部分和与NPPF扩增子210的一个区域特异性结合（例如与其互补）的第二部分。在一些实例中，所述NPPF扩增子具有与所述双功能接头互补的至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续核苷酸。

侧翼序列104、106的序列可以提供与扩增引物的至少一部分互补的通用扩增位点。因此所述侧翼序列使得能够进行多路复用，因为可使用相同的扩增引物扩增特异性针对不同靶核酸分子的NPPF。所述侧翼序列与在靶基因组中发现的序列不相似。例如，如果所述靶核酸为人序列，那么所述侧翼序列的序列与在所述靶基因组中发现的序列不相似。这有助于减少可能存在于所述靶基因组中的非靶序列与所述NPPF的结合。分析序列与基因组的相似性的方法是本领域中熟知的。

侧翼序列104、106还可用于允许捕获NPPF扩增子，例如捕获到基质上。例如，含有侧翼序列（其包括与表面上存在（例如直接缀合到表面）的核酸捕获探针互补的序列）的NPPF，可以与所述核酸捕获探针杂交，使得能够将所述NPPF扩增子捕获或结合到所述表面。因此，在一些实例中，所述侧翼序列包括（或允许添加，例如在扩增过程中）实验标签，例如允许捕获所述NPPF扩增子的实验标签。应该理解可以使用其他的实验标签，例如用于唯一地鉴定NPPF或NPPF群的那些，并且应该理解这些实验标签可以是所述NPPF的一部分，或可以在以后添加，例如通过使用与所述侧翼序列互补的引物，所述引物还包括与所述待添加到所得扩增子上的标签互补的序列。所述侧翼序列还使得能够标记所述NPPF，例如在所述NPPF的扩增过程中，或通过使用与所述侧翼序列互补的经标记的探针并使所述探针与所述NPPF结合。在一些实例中，所述侧翼序列包括（或允许添加，例如在扩增过程中）测序衔接头，例如一些测序平台所需要的poly-A或poly-T序列。

应该理解NPPF可以包括一个或两个侧翼序列（例如一个在5′末端，一个在3′末端，或5′末端和3′末端），并且所述侧翼序列可以是相同或不同的。如图6A和B所示，所述NPPF可以包括单独一个侧翼序列。图6A和6B示出了在5′末端的侧翼序列，但是应该理解其还可以在3′末端。图6A示出了其中所述反应中的所有NPPF均具有相同的侧翼序列F1的实例。使用F1特异性引物（例如标记的引物）进行的扩增可用于将相同的5′或3′标签（例如测序衔接头或实验标签）添加到各NPPF上。例如，可以将相同的测序衔接头添加到所有的NPPF上，使得能够在相同的测序平台中对所述NPPF进行测序。图6B示出了其中所述反应中的每种NPPF（或每种NPPF亚群）具有不同的侧翼序列，F1-F3，的实例。例如，F1、F2和F3可以分别与表面上的捕获核酸探针1、2和3互补。这消除了对双功能接头的需求（例如见图3的下图）。在另一个实例中，使用T1-F1、T2-F2和T3-F3特异性引物进行的扩增可用于将不同的实验标签添加到每种不同的NPPF（或NPPF群）上。

如图6C-6F所示，在一些实例中，所述NPPF可以包括两个侧翼序列，一个在所述NPPF的5′末端，另一个在3′末端。图6C示出了其中所述反应中的所有NPPF均在两个末端具有相同的侧翼序列F1的实例。图6D示出的实例中，所有5′末端侧翼序列是相同的（例如F1），所有3′末端侧翼序列是相同的（例如F（a）），但是所述5′末端和3′末端侧翼序列不同。在这样的实例中，这使得能够在所述NPPF的一个末端包括例如相同的实验标签，在所述NPPF的另一侧包括例如相同的测序衔接头。因为不会有引物杂交偏差，所以应该以相同的保真度向每种NPPF加标签。图6E示出的实例中，在一个末端的所有侧翼序列是相同的（例如在5′末端的F1），而在另一末端的所有侧翼序列彼此不同（例如F（a）、F（b）和F（c））。在这样的实例中，这使得能够使用单独一种捕获探针捕获所有的NPPF（例如使用至少一部分序列与F1互补的捕获探针）。在另一末端的侧翼序列，F（a）、F（b）和F（c）可用于例如区别性地标记每种NPPF（例如使用不同的实验标签）。或者，F（a）、F（b）和F（c）可以分别与捕获探针1、2和3互补，并且F1可用于以相同方式标记所有的NPPF。图6F示出的实例中，所有的侧翼序列是不同的，不论其位置如何（例如F（a）、F（b）、F（c）、F1、F2和F3）。在该实例中，每个侧翼序列均可用于不同的实验标签或用于不同实验标签和不同测序衔接头的组合。

因此，NPPF序列可以由1-2-3表示，其中1和3是序列2（其与靶核酸互补）两侧的侧翼序列。这些区域中各自可在所述方法中的某一时刻与其互补序列杂交。例如，A可以与NPPF的侧翼序列1互补（例如A可以是与序列1互补的CFS），B可以与NPPF的序列2互补（例如与序列2互补的靶序列），C可以与NPPF的侧翼序列3互补（例如C可以是与序列3互补的CFS）。这出现在靶核酸分子和CFS与其对应的NPPF杂交的过程中。例如：

1-2-3

A-B-C

在一些实例中，使用所述侧翼序列添加分别由D和E表示的实验标签（例如使实验或患者能彼此区分开的那些）和测序衔接头，例如在扩增过程中（使得所述扩增引物与侧翼序列互补并且包括与待添加至所得NPPF扩增子上的标签或衔接头互补的序列）。例如，使用这样的引物扩增NPPF会产生如下的序列：E-1-2-3-D或D-1-2-3-E。

下表还示出了五种示例性的5′-标签（例如实验标签或测序衔接头）、5′-侧翼序列、靶特异性序列、3′-侧翼序列和3′标签的组合。5′-标签和3′-标签在扩增过程中添加。5′-侧翼序列和3′-侧翼序列是初始NPPF的一部分（因此是所述侧翼序列自身的一部分）。

在具体实例中，每个侧翼序列不会与任何其他的NPPF序列（例如序列102或其他侧翼序列）特异性结合或与样品中任何组分特异性结合。在一些实例中，如果有两个侧翼序列，那么侧翼序列104、106各自的序列是不同的。理想的是，如果有两个不同的侧翼序列（例如在同一NPPF上两个不同的侧翼序列和/或在一组NPPF中与其他NPPF的侧翼序列），侧翼序列104、106各自具有相似的解链温度（T_m），例如彼此的T_m差为+/-约10℃或+/-5℃，例如+/-4℃、3℃、2℃或1℃。

在具体实例中，侧翼序列104、106长度为至少12个核苷酸，例如长度为至少15、至少20、至少25、至少30、至少40或至少50个核苷酸，例如12-50或12-30个核苷酸，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中所述连续核苷酸未在待测试样品中存在的核酸分子中发现。侧翼序列是通过杂交具有与所述侧翼序列互补的序列的分子（CFS）受到保护而免于被核酸酶降解。

影响NPPF-靶和NPPF-CFS杂交特异性的因素包括NPPF和CFS的长度、解链温度、自身互补性以及重复或非唯一序列的存在。参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001;Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(andSupplements to2000);Ausubel et al.,Short Protocols in MolecularBiology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,4th ed.,Wiley&Sons,1999。导致特定程度的杂交（严格性）的条件将根据杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度（例如Na⁺浓度）将决定杂交的严格性。在一些实例中，所公开的方法中使用的NPPF的T_m为至少约37℃、至少约42℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃、至少约65℃、至少约70℃、至少约75℃、至少约80℃，例如约42℃-80℃（例如，约37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80℃）。在一个非限制性实例中，所公开的方法中使用的NPPF的T_m为约42℃。计算探针T_m的方法是本领域技术人员已知的（参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001,Chapter10）。在一些实例中，选择用于特定反应的NPPF使其各自具有相同或相似的T_m，以帮助同时检测或测序样品中多种靶核酸分子，例如彼此的T_m差为+/-约10℃，例如彼此的T_m差为+/-10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃或1℃。

A.侧翼序列

所述NPP的一个或两个侧翼序列（例如图1的104或106）包括提供通用扩增位点的序列。这种序列与扩增引物的至少一部分互补。这使得所述引物能够与所述NPPF杂交，并扩增所述NPPF。因为在特异性针对不同靶核酸分子的NPPF之间侧翼序列可以相同，这使得能够用相同的引物扩增任意数量的不同NPPF。例如，NPPF可以包括5'-侧翼序列和3'-侧翼序列，其中所述5′和3′侧翼序列彼此不同，但是对于针对不同靶的多种NPPF来说是相同的。因此包括与所述5'-侧翼序列互补的序列的扩增引物和包括与所述3'-侧翼序列互补的序列的扩增引物，都可以被用于在单个反应中扩增多种NPPF，即使所述NPPF是特异性针对不同靶序列的。

在一些实例中，所述侧翼序列不包括实验标签序列和/或测序衔接头序列。在一些实例中，所述侧翼序列包括实验标签序列和/或测序衔接头序列或由其组成。在其他实例中，用于扩增所述NPPF的引物包括实验标签序列和/或测序衔接头序列，因此使得能够在所述NPPF的扩增过程中将所述实验标签和/或测序衔接头纳入到所述NPPF扩增子中。

在一个实例中，设计侧翼序列使得所述序列自身形成环。因此，侧翼序列的一个区域与该侧翼序列的第二区域互补，使得所述第一和第二区域互相杂交，形成环或发夹。这会消除对CFS的需求，因为所述第二区域会在所述核酸酶步骤中保护所述第一区域。

B.结合侧翼序列的引物

与侧翼序列特异性结合或杂交的扩增引物可用于起始扩增，例如PCR扩增。另外，所述扩增引物可用于将核酸标签（例如实验标签或测序衔接头）和/或可检测标记引入到NPPF。例如，所述扩增引物除了具有与所述侧翼序列互补的区域外，还可以包括具有核酸序列的第二区域，所述第二区域的核酸序列导致将实验标签、测序衔接头、可检测标记或其组合添加到所得NPPF扩增子上。实验标签或测序衔接头可引入到NPPF的5′和/或3′末端。在一些实例中，将两个或多个实验标签和/或测序衔接头添加到NPPF扩增子的一个末端或两个末端，例如使用具有可导致添加两个或多个实验标签和/或测序衔接头的核酸序列的单个引物。可以使用实验标签，例如用于使样品或序列彼此区分，或用于允许通过基质捕获NPPF扩增子。序列标签使得能够通过特定测序平台捕获所得NPPF扩增子。

可在NPPF的任意位点引入可检测标记，包括5′和/或3′末端。在一个实例中，通过杂交与NPPF扩增子互补的标记的探针而将所述标记引入到所述NPPF扩增子。在一个实例中，通过在扩增NPPF的过程中使用标记的引物而将标记引入到所述NPPF扩增子，从而产生标记的NPPF扩增子。可检测标记使得能够检测所述NPPF扩增子。

在一些实例中，这种引物长度为至少12个核苷酸，例如至少15、至少20、至少30、至少40或至少50个核苷酸（例如25个核苷酸）。在一些实例中，所述引物包括纳入到所述NPPF扩增子中的可检测标记（这种引物可称为探针），例如生物素。

C.添加实验标签

实验标签可以在产生NPPF时就为其的一部分（例如是侧翼序列的一部分）。在另一个实例中，在以后例如在扩增NPPF的过程中添加实验标签，产生含有实验标签的NPPF扩增子。所述NPPF上通用侧翼序列的存在使得能够使用通用引物，所述通用引物可以将其他序列例如在扩增过程中引入到所述NPPF上。

实验标签（例如使样品能彼此区分的实验标签）可用于鉴定与NPPF连接的特定靶序列，或使得能够通过基质捕获NPPF扩增子（其中所述实验标签与所述基质上的捕获探针互补，使得两者之间能杂交）。在一个实例中，所述实验标签为所述NPPF或NPPF扩增子的5′末端和/或3′末端的前三、五、十、二十或三十个核苷酸。

在一个实例中，实验标签被用于使样品彼此区分。例如，这种序列可以作为条形码起作用，使得能够将所检测的特定序列与特定的样品、患者或实验（例如特定反应孔、天或反应条件组）相关联。例如这使得被检测或测序的特定NPPF能够与特定的患者或样品或实验相关联。使用这种标签提供了一种降低成本/样品并增加样品通量的方式，因为可将多种NPPF扩增子加标签，然后合并（例如来自不同实验或患者）在例如单次测序运行或检测阵列中。这使得能够将不同的实验样品或患者样品合并到同一仪器通道内的单次运行中。例如，这种标签允许在单个通道内的单次运行中测序100或1000个不同的实验。例如，每个通道中混合集中100个样品，可以在8-通道测序仪的单次运行中测试8000个样品。另外，如果所述方法包括对所完成的扩增反应进行凝胶纯化的步骤（或其他不需要实际分离的纯化或提纯方法），那么每次检测或测序运行仅需要进行一次凝胶纯化（或提纯或纯化反应或过程）。然后可以例如通过所述实验标签对所测序到的NPPF扩增子进行分类。

在一个实例中，所述实验标签被用于鉴定与所述NPPF连接的特定靶序列。在这种情况下，使用实验标签来对应特定的靶序列可以减少所需要的测序时间或量，因为对NPPF的末端而不是整个NPPF测序就是足够的。例如，如果这种实验标签存在于所述NPPF扩增子的3′末端，那么不必对整个所述NPPF扩增子序列本身进行测序以鉴定与所述NPPF杂交的靶序列。而是，仅需要对含所述实验标签的所述NPPF扩增子的3′末端进行测序。这可以显著地减少测序时间和资源，因为需要测序的物质较少。

在一个实例中，所述实验标签被用于使得能够从样品中捕获NPPF，以浓缩NPPF或NPPF扩增子。例如，所述实验标签可以具有与基质表面上捕获探针的至少一部分序列互补的序列，从而允许所述NPPF与所述捕获探针杂交。例如，在扩增后，含有实验标签的NPPF扩增子（例如含有相同实验标签的NPPF扩增子群）可以通过以下方式与其他物质分离：将所述样品与含有多种捕获探针的基质（例如磁珠）一起孵育，所述捕获探针具有与所述实验标签互补的序列。在捕获所述NPPF扩增子后，可对其进行检测或测序，或可以将其从所述基质释放用于进一步分析。在一个实例中，所述基质为磁珠，并将含有NPPF扩增子的PCR物反应与所述微珠孵育。然后将所述微珠保持在磁场中，同时除去所述样品溶液（含有不需要的核酸分子和其他物质）。所捕获的NPPF可以通过逆转杂交（例如通过加入碱并加热）而被洗脱为较小的体积。应该理解类似的方法可以用于其他NPPF和其他基质（例如通过使用固体基质和流过装置），导致所捕获的NPPF被洗脱为较小的体积。如果在扩增过程中添加半抗原，那么其可用于捕获。这种方法的一个优势是，可以从较大样品例如1ml血浆中分离所述NPPF或NPPF扩增子并将其洗脱为用于测定的较小体积，例如20μl。

实验标签还可用于扩增，例如巢式扩增或两阶段扩增。

在具体实例中，实验标签长度为至少3个核苷酸，例如长度为至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40或至少50个核苷酸，例如3-50、3-20、12-50或12-30个核苷酸，例如长度为3、5、10、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

D.添加测序衔接头

测序衔接头可以在产生NPPF时就为其的一部分（例如是所述侧翼序列的一部分）。在另一个实例中，在以后例如在扩增NPPF的过程中添加测序衔接头，产生含有测序衔接头的NPPF扩增子。所述NPPF上通用侧翼序列的存在使得能够使用通用引物，所述通用引物可以将其他序列例如在扩增过程中引入到所述NPPF上。

测序衔接头可用于将特定测序平台需要的序列添加到NPPF扩增子上。例如，一些测序平台（例如454和Illumina平台）需要待测序的核酸分子在其5′末端和/或3′末端包括特定的序列，例如用于捕获待测序的分子。例如，适合的测序衔接头被所述测序芯片或微珠上的互补序列所识别，并且通过所述测序衔接头的存在捕获所述NPPF。

在一个实例中，将poly-A（或poly-T），例如长度为至少10个核苷酸的poly-A或poly-T在PCR扩增过程中添加到所述NPPF。在一个具体实例中，将poly-A（或poly-T）添加到所述NPPF的3′末端。在一些实例中，使用末端脱氧核苷酸转移酶（Tdt）将这种添加的序列在其3′末端进行多聚腺苷酸化。

在具体实例中，添加的测序标签的长度为至少12个核苷酸（nt），例如长度为至少15、至少20、至少25、至少30、至少40或至少50个nt，例如12-50或12-30个nt，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个nt。

E.可检测标记

在一些实例中，所公开的NPPF、PCR引物或其两者包括一个或多个可检测标记。可检测标记是本领域中熟知的。可检测标记是可用于产生可检测信号的分子或物质，所述可检测信号指示了样品中NPPF或NPPF扩增子（例如结合或杂交的探针）的存在或浓度。因此，标记的NPPF提供了对样品中靶核酸序列（例如靶DNA或靶RNA）的存在或浓度的指示物。本公开内容不受限于使用具体的标记，即使提供了实例。

在一些实例中，所述标记在所述NPPF的合成过程中被纳入到所述NPPF中。在一些实例中，所述标记在扩增过程中被纳入到所述NPPF中，例如使用标记的引物（从而产生标记的NPPF扩增子）。在其他实例中，通过使用与所述NPPF（例如NPPF扩增子）的一部分例如所述NPPF的侧翼区域互补从而与其杂交的标记探针来标记所述NPPF。

在一些实例中，用于所公开方法的多种NPPF中所包括的每一种NPPF都用相同的可检测标记标记。在其他实例中，将至少一种NPPF用与所述多种NPPF中至少一种其他NPPF不同的可检测标记标记。例如，包括在所述多种NPPF中的至少一种NPPF可以用荧光团（例如Cy-3^TM）标记，而包括在所述多种NPP中的至少一种NPPF可用不同的荧光团（例如Cy-5^TM）标记。在一些实例中，所述多种NPPF可以包括至少2、3、4、5、6或更多种不同的可检测标记。类似地，在本文提供的方法中使用的扩增引物可以用相同或不同的可检测标记标记。

与一种或多种核酸分子（例如NPPF或扩增引物）连接的标记可直接或间接检测。标记可以通过任何已知或有待发现的机制检测，包括光子的吸收、发射和/或散射，所述光子包括射频、微波频率、红外频率、可见光频率和紫外线频率光子。可检测标记包括有色的、荧光的、电致发光的、发磷光的和发光的分子和物质、将一种物质转化为另一种物质以提供可检测差异（例如通过将无色物质转化为有色物质或反之亦然，或通过产生沉淀或增加样品浊度）的催化剂（例如酶）、半抗原以及顺磁性和磁性分子或物质。另外的可检测标记包括Raman（光散射）标记（例如

biotags,Oxonica,Bucks,UK）。其他示例性可检测标记包括地高辛、使用能量传递和能量猝灭对（例如FRET）、IR和吸光度/比色标记。

在非限制性实例中，用共价连接半抗原分子（例如硝基-芳香族化合物例如二硝基苯基（DNP）、生物素、荧光素、地高辛配基等）的dNTP标记NPPF或引物。将半抗原和其他标记缀合到dNTP（例如用以帮助纳入标记的探针）的方法是本领域中熟知的。例如，操作参见例如美国专利No.5,258,507、4,772,691、5,328,824和4,711,955。可以在dNTP上任何位置例如磷酸（例如α、β或γ磷酸）或糖上将标记直接或间接连接到所述dNTP。在一些实例中，标记的核酸分子的检测可以通过使所述半抗原-标记的NPP与第一抗半抗原的抗体接触来完成。在一个实例中，所述第一抗半抗原的抗体（例如小鼠半抗原的抗体）是用酶直接标记。在另一个实例中，缀合至酶的第二抗体（例如山羊抗小鼠IgG的抗体）被用于信号放大。在其他实例中，所述半抗原为生物素并通过以下方式来检测：使所述半抗原-标记的NPPF与缀合至酶例如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的亲和素或链霉亲和素接触。

可检测标记的其他实例包括荧光分子（或荧光染料）。许多荧光染料是本领域技术人员已知的，并可以选自例如Life Technologies（从前的Invitrogen）（例如见The Handbook—A Guide to Fluorescent Probesand Labeling Technologies）。可连接（例如化学缀合）到核酸分子（例如NPPF）的具体荧光团的实例记载在Nazarenko et al.的美国专利No.5,866,366中，例如4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸芪-2,2’二磺酸、吖啶及其衍生物例如吖啶和吖啶异硫氰酸酯、5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸酯(Lucifer Yellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、亮黄（Brilliant Yellow）、香豆素及其衍生物例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素（AMC，香豆素120）、7-氨基-4-三氟甲基香豆素（香豆素151）；焰红染料（cyanosine）；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；5’,5”-二溴邻苯三酚-磺酞（溴邻苯三酚红）；7-二乙氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二乙撑三胺五乙酸盐；4,4’-二异硫氰酸二氢-芪-2,2’-二磺酸；4,4’-二异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯（DNS，丹酰氯）；4-(4’-二甲氨基苯偶氮基)苯甲酸（DABCYL）；4-二甲氨基苯基偶氮基苯基-4’-异硫氰酸酯（DABITC）；曙红及其衍生物例如曙红和曙红异硫氰酸酯；赤藓红及其衍生物例如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；乙啡啶；荧光素及其衍生物如5-羧基荧光素（FAM）、5-(4,6-二氯三嗪-2-基）氨基荧光素（DTAF）、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素（JOE）、荧光素、异硫氰酸荧光素（FITC）和QFITC（XRITC）；2′,7′-二氟荧光素（OREGON）；荧光胺；IR144；IR1446；异硫氰酸酯孔雀绿；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘及其衍生物如芘、芘丁酸酯及琥珀酰亚胺基-1-芘丁酸酯；活性红4（Reactive Red4，Cibacron Brilliant Red3B-A）；罗丹明及其衍生物如6-羧基-X-罗丹明（ROX）、6-羧基罗丹明（R6G）、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明（Rhod）、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、罗丹明绿（rhodamine green）、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物（德克萨斯红）；N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA）；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物。

其他适合的荧光团包括在约617nm下发射的硫醇反应性铕螯合物（Heyduk and Heyduk,Analyt.Biochem.248:216-27,1997;J.Biol.Chem.274:3315-22,1999），以及GFP、Lissamine^TM、二乙氨基香豆素、氯三嗪基荧光素、萘并荧光素、4,7-二氯罗丹明和夹氧杂蒽（xanthene）（例如记载于Lee et al.的美国专利No.5,800,996）及其衍生物。还可以使用本领域技术人员已知的其他荧光团，例如可从Life Technologies(Invitrogen;Molecular Probes(Eugene,OR))获得的那些，包括ALEXA

系列染料（例如记载于美国专利No.5,696,157,6,130,101和6,716,979）、BODIPY系列染料（二吡咯并亚甲基硼二氟化物染料，例如记载于美国专利No.4,774,339、5,187,288、5,248,782、5,274,113、5,338,854、5,451,663和5,433,896）、Cascade Blue（记载于美国专利No.5,132,432中的磺化芘的胺反应性衍生物）和Marina Blue（美国专利No.5,830,912）。

除了上述荧光染料外，荧光标记可以是荧光纳米颗粒，例如半导体纳米晶体，例如QUANTUM DOT^TM（例如从Life Technologies(QuantumDot Corp,Invitrogen Nanocrystal Technologies,Eugene,OR)获得；还参见美国专利No.6,815,064；6,682,596和6,649,138）。半导体纳米晶体是具有尺寸依赖性的光和/或电特性的微观颗粒。当用一次能源照射半导体纳米晶体时，二次能量发射以与半导体纳米晶体中使用的半导体材料的带隙对应的频率发生。这种发射可以作为具有特定波长的有色光或荧光被检测到。具有不同光谱特征的半导体纳米晶体记载于例如美国专利No.6,602,671。可以通过记载于例如Bruchez et al.,Science281:2013-2016,1998；Chan et al.,Science281:2016-2018,1998和美国专利No.6,274,323的技术将半导体纳米晶体与多种生物分子（包括dNTP和/或核酸）或底物偶联。

各种组成的半导体纳米晶体的形成公开于例如美国专利No.6,927,069；6,914,256；6,855,202；6,709,929；6,689,338；6,500,622；6,306,736；6,225,198；6,207,392；6,114,038；6,048,616；5,990,479；5,690,807；5,571,018；5,505,928；5,262,357和美国专利公开No.2003/0165951以及PCT公开No.99/26299（1999年5月27日公开）中。可产生不同的半导体纳米晶体群，其可基于其不同的光谱特征而被识别。例如，可以生成如下的半导体纳米晶体，其基于其组成、大小或大小和组成而发射不同颜色的光。例如，基于大小在不同波长（565nm、655nm、705nm或800nm发射波长）下发射光的量子点（其适合作为本文中所公开的探针中的荧光标记物）可获自Life Technologies(Carlsbad,CA)。

其他标记包括例如放射性同位素（例如³H）、金属螯合物例如放射性或顺磁性金属离子例如Gd³⁺的DOTA和DPTA螯合物，和脂质体。

可以与核酸分子（例如NPPF或扩增引物）一起使用的可检测标记还包括酶，例如HRP、AP、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-内酰胺酶。当所述可检测标记包括酶时，可以与酶结合使用色原、荧光化合物或发光化合物以产生可检测信号（多种这样的化合物可购自例如Life Technologies,Carlsbad,CA）。生色化合物的具体实例包括二氨基联苯胺（DAB）、4-硝基苯基磷酸盐（pNPP）、坚固红、坚固蓝、溴氯吲哚基磷酸（BCIP）、四唑硝基蓝（NBT）、BCIP/NBT、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺（TMB）、2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐]（ABTS）、邻联茴香胺、4-氯萘酚（4-CN）、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）、邻苯二胺（OPD）、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β–吡喃半乳糖苷（X-Gal）、甲基伞形基（methylumbelliferyl）-β-D-吡喃半乳糖苷（MU-Gal）、对硝基苯基--α-D-吡喃半乳糖苷（PNP）、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β–D-葡糖苷酸（X-Gluc）、3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）、品红、碘硝基四唑（INT）、四唑蓝和四唑紫。

或者，酶可以用于金相检测方案。金相检测方法包括将酶例如碱性磷酸酶，与水溶性的金属离子和所述酶的无氧化还原活性的底物结合使用。所述底物被所述酶转化为氧化还原活性剂，并且所述氧化还原活性剂还原金属离子，使其形成可检测的沉淀物（参见例如美国专利申请公开No.2005/0100976、PCT公开No.2005/003777和美国专利申请公开No.2004/0265922）。金相检测方法还包括使用氧化还原酶（例如辣根过氧化物酶）以及水溶性金属离子、氧化剂和还原剂，再次形成可检测的沉淀物（参见例如美国专利No.6,670,113）。

在一些实施方案中，所述可检测标记被连接或纳入到所述NPPF或引物的5′末端或3′末端（例如所述NPPF或引物为末端标记的探针）。在其他实例中，所述可检测标记被纳入到所述NPPF或引物中的内部位置，例如从所述NPPF或引物的5′末端起1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个碱基，或者从所述NPPF或引物的3′末端起1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个碱基。

在一个实例中，所述NPPF的侧翼区域之一含有受体或发射体（emitter）（例如受体荧光团），而与所述侧翼区域互补的所述扩增引物则相反（例如含有供体荧光团）。因此，所述引物-NPPF双链体发射可检测信号，但是单链引物或单链NPPF不发射。信号的出现是样品中NPPF的量的量度，并可在不从所扩增的加合物中分离经标记的过量引物的情况下被测量。FRET受体-供体对的实例是本领域中已知的，可以包括，作为供体荧光团与JOE、TAMRA和ROX一起使用的FAM，3-(ε-羧基-戊基)-3'-乙基-5,5'-二甲基氧杂羰花青（CYA）可以作为罗丹明衍生物（例如R6G、TAMRA和ROX）的供体荧光团，所述罗丹明衍生物可以作为受体荧光团。Grant et al.(Biosens Bioelectron.16:231-7,2001)提供了可以用于本文公开的方法中的FRET对的具体实例。

V.样品

样品是包含一个或多个靶的任何集合，例如生物样品或生物样本。所述样品可以使用本领域普通技术人员熟知的方法收集或获得。用于所公开的方法的样品可以包括任何含有核酸（例如基因组DNA、cDNA、病毒DNA或RNA、rRNA、tRNA、mRNA、miRNA、寡核苷酸、核酸片段、修饰的核酸、合成核酸等）的样本。在一个实例中，所述样品包括不稳定的RNA。在一些实例中，所述待检测或测序的核酸分子在所述样品中是交联的（例如交联的DNA、mRNA、miRNA或vRNA）或在所述样品中是可溶的。在一些实例中，所述样品为固定的样品，例如包括导致靶分子交联的试剂的样品。在一些实例中，在检测或测序所述样品中的靶核酸分子之前，不对所述靶核酸进行提取、溶解或两者。

在一些实例中，所公开的方法包括获得所述样品，然后分析所述样品。在一些实例中，所公开的方法包括选择具有肿瘤的受试者，然后在一些实例中基于所述受试者的肿瘤进一步选择要检测的一种或多种靶DNA或RNA，例如用于为所述受试者确定诊断或预后，或用于选择一种或多种治疗。在一些实例中，首先将待分析样品中的核酸分子从所述样品中进行分离、提取、浓缩或其组合。

在一些实例中，将所述样品中的RNA反转录，然后执行本文提供的方法。但是，所公开的方法不需要反转录，因为通过杂交和核酸酶活性可将所述靶RNA序列有效地转化为互补的探针序列。有时需要测序RNA分子而非测序编码所述RNA的基因序列，因为RNA分子不一定与其DNA模板是共线的（co-linear）。并且一些生物是RNA，例如RNA病毒。

在一些实例中，裂解所述样品。所述裂解缓冲液被设计为用于灭活酶并防止RNA降解，但是在有限稀释到杂交稀释缓冲液中后，其容许核酸酶发挥活性并促进严格特异性的杂交。可以加入稀释缓冲液以中和所述裂解缓冲液和其他缓冲液的抑制活性，例如对其他酶（例如聚合酶）的抑制活性。或者，可将所述裂解缓冲液和其他缓冲液的组成改变为例如聚合酶可以耐受的组成。

在一些实例中，所述方法包括同时分析多个样品。例如，所述方法可以同时分析至少两个不同的样品（例如来自不同患者的样品）。在一个实例中，所述方法可以同时检测或测序至少两个不同样品（例如至少5、至少10、至少100、至少500、至少1000或至少10,000个不同样品）中的至少两个不同的靶核酸分子（例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同的靶）。

示例性的样品包括但不限于，细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制备物、细胞涂片、体液（例如血液及其级分，例如血清和血浆、唾液、痰、尿、脊髓液、胃液、汗、精液等）、细胞涂片、口颊细胞、组织提取物、细胞或器官、组织活组织检查（例如肿瘤活组织检查）、细针抽出物、打孔活组织检查、循环肿瘤细胞、新鲜组织、冷冻组织、固定的组织、固定的且蜡-（例如石蜡-）包埋的组织、骨髓和/或组织切片（例如低温组织切片和/或石蜡包埋组织切片）。所述生物样品还可以是实验室研究样品例如细胞培养物样品或上清。

从受试者获得样品的方法是本领域中已知的。例如，获得组织或细胞样品的方法是常规的。可以从正常细胞或组织，或从赘生性（neoplastic）细胞或组织获得示例性的样品。肿瘤形成是一种生物病症，其中一个或多个细胞已经发生了特有的间变，伴随分化丧失、生长速率增加、侵入周围组织，并且所述细胞可能能够转移。在具体实例中，生物样品包括肿瘤样品例如含有赘生性细胞的样品。

示例性的赘生性细胞或组织可以包括在实体瘤中或从实体瘤中分离，所述实体瘤包括肺癌（例如非小细胞肺癌，例如肺鳞状细胞癌）、乳癌（例如小叶癌和导管癌）、肾上腺皮质癌、成釉细胞瘤、壶腹癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、胆管瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、神经胶质瘤、颗粒细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、水泡样胎块（hydatiform mole）、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口癌、骨软骨瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、毛母质瘤、前列腺癌、肾细胞癌、唾液腺肿瘤、软组织肿瘤、Spitz痣、鳞状细胞癌、畸胎癌和甲状腺癌。示例性的赘生性细胞还可包括在血液癌症中或从血液癌症中分离，所述血液癌症包括白血病，所述白血病包括急性白血病（例如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞性白血病以及红白血病）、慢性白血病（例如慢性髓细胞性（粒细胞性）白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病）、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤（无痛和高级别形式）、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征和脊髓发育不良。

例如，可以通过手术切除全部或部分肿瘤，通过收集肿瘤的细针抽出物以及通过本领域中已知的其他方法来获得来自所述肿瘤的含细胞物质的样品。在一些实例中，将组织或细胞样品施加到基质上并进行分析以确定一个或多个靶DNA或RNA的存在。用于所公开的方法中的固体支持物仅需要带有所述生物样品，并任选地使得能够方便地检测所述样品中的组分（例如蛋白质和/或核酸序列）。示例性的支持物包括显微镜载玻片（例如玻璃显微镜载玻片或塑料显微镜载玻片）、盖玻片（例如玻璃盖玻片或塑料盖玻片）、组织培养皿、多孔板、膜（例如硝酸纤维素或聚偏氟乙烯（PVDF））或BIACORE^TM芯片。

所公开的方法是灵敏的且特异性的，能够检测甚至含有有限数量细胞的样品中的靶核酸分子。包括少量细胞例如少于250,000个细胞（例如少于100,000、少于50,000、少于10,000、少于1,000、少于500、少于200、少于100个细胞或少于10个细胞）的样品，包括但不限于FFPE样品、细针抽出物（例如来自肺、前列腺、淋巴、乳房或肝的那些）、打孔活组织检查、针头活组织检查、小群的（例如FACS）分选细胞或循环肿瘤细胞、肺抽出物、少量的激光捕获或巨解剖（macrodissected）的细胞或循环肿瘤细胞、外来体和其他亚细胞颗粒，或体液（例如血浆、血清、脊髓液、唾液和乳房抽出物）。例如，可以在少至1000个细胞（例如包括1000个或更多细胞的样品，例如1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、50,000或更多个细胞）中检测靶DNA或靶RNA。在一些实例中，可以在约1000至100,000个细胞（例如约1000-50,000、1000-15,000、1000-10,000、1000-5000、3000-50,000、6000-30,000或10,000-50,000个细胞）中检测靶DNA或靶RNA的表达。在一些实例中，可以在约100至250,000个细胞（例如约100-100,000、100-50,000、100-10,000、100-5000、100-500、100-200或100-150个细胞）中检测靶DNA或靶RNA的表达。在其他实例中，可以在约1至1000个细胞（例如约1-500个细胞、约1-250个细胞、约1-100个细胞、约1-50个细胞、约1-25个细胞或约1个细胞）中检测靶DNA或靶RNA的表达。

可以以多种本领域普通技术人员已知的方式处理样品，然后（或与所述处理同时）使所述样品与靶特异性的试剂（例如NPPF）接触。一种相对简单的处理是将所述样品悬浮在缓冲液例如裂解缓冲液中，这将所述样品的所有组分保留在单个溶液中。许多用于检测靶的传统方法需要更复杂的样品处理（例如包括多个步骤和/或多种类型的专用仪器）以使所述靶能够与一种或多种靶特异性试剂接触。例如，某些检测方法需要从所述样品中部分或完全分离（例如提取）靶（例如DNA或mRNA）。当将靶（例如DNA或RNA）从样品中其他非靶生物组分中纯化出来时，其已被分离或提取。纯化是指将所述靶与样品中还存在的一种或多种无关组分分离。例如，在用成对的靶特异性引物对mRNA进行基于PCR的检测之前，常常将总mRNA或可溶性mRNA（包括所述靶mRNA）与所述样品中的细胞蛋白质和其他核酸分离。与未经纯化或未经提取的样品相比，从混合样本或样品中分离、提取或纯化的组分通常被富集达到至少50%、至少60%、至少75%、至少90%或至少98%或甚至至少99%。

从样品分离生物组分是耗时的并且存在因例如降解和/或用于分离的处理效率低或不完全而损失正在分离的组分的风险。此外，众所周知，一些样品例如固定的组织、靶（例如DNA或RNA，例如mRNA或miRNA）难以被高保真地分离（例如与新鲜或冷冻的组织相比），因为，据认为所述靶的至少一部分与所述固定样品中的其他组分交联，从而不能被容易地分离或溶解并且其可能在分离可溶和不可溶级分时损失。因此，在一些实例中，检测靶核酸的方法不需要或不包括，在使所述样品与一种或多种NPPF接触之前从样品中纯化、提取或分离靶，和/或所述方法仅包括在使所述样品与靶特异性试剂接触之前将所述样品悬浮于可保留所述样品全部组分的溶液例如裂解缓冲液中。

在一些实例中，将所述样品中的细胞在水性溶液中裂解或透化（permeabilized）（例如使用裂解缓冲液）。所述水性溶液或裂解缓冲液包括洗涤剂（例如十二烷基硫酸钠）和一种或多种离液剂（例如甲酰胺、盐酸胍、异硫氰酸胍或脲）。所述溶液还可含有缓冲液（例如SSC）。在一些实例中，所述裂解缓冲液包括约15%-25%甲酰胺（v/v）、约0.01%-0.1%SDS和约0.5-6×SSC（例如约3×SSC）。所述缓冲液可任选地包括tRNA（例如约0.001至约2.0mg/ml）或核糖核酸酶；DNA酶；蛋白酶K；可降解蛋白质、基质、碳水化合物、脂质或一种寡核苷酸或其组合的酶（例如胶原酶或脂肪酶）。所述裂解缓冲液还可包括pH指示剂，例如酚红。在具体实例中，所述裂解缓冲液包括20%甲酰胺、3×SSC（79.5%）、0.05%SDS、1μg/ml tRNA和1mg/ml酚红。将细胞在所述水性溶液（任选地用油覆盖以防止蒸发或吸收石蜡）中在足够的温度（例如约22℃至约110℃，例如约80℃至约105℃、约37℃至约105℃或约90℃至约100℃）下孵育足够的时间（例如约1分钟至约60分钟，例如约5分钟至约20分钟或约10分钟）以裂解或透化所述细胞。在一些实例中，裂解在约95℃下进行。在一些实例中，所述裂解步骤包括将所述样品在约95℃下孵育约5-15分钟以使所述样品中的RNA变性，但不使基因组DNA变性。在其他实例中，所述裂解步骤包括将所述样品在约105℃下孵育约5-15分钟以使所述样品中的RNA和基因组DNA变性。在一个实例中，所述裂解缓冲液中包括蛋白酶K。

在一些实例中，不经进一步纯化直接使用粗细胞裂解物。可以在存在或不存在一种或多种所公开的NPPF的情况下裂解所述细胞。如果在没有探针的情况下裂解所述细胞，那么可以随后将一种或多种探针加入到所述粗裂解物中。在其他实例中，从所述细胞裂解物分离核酸（例如DNA和/或RNA），然后使所述裂解物与一种或多种NPPF接触。

在其他实例中，组织样品是通过将所述组织在介质中固定并包埋来制备或者包括在固体支持物（例如玻璃载玻片）上制备为单层的细胞悬浮液（例如通过将细胞涂抹或离心到固体支持物上）。在另外的实例中，新鲜的冷冻（例如未固定的）组织或组织切片可以用于本文公开的方法中。在具体实例中，FFPE组织切片被用于所公开的方法中。

在一些实例中，使用包埋介质。包埋介质是组织和/或细胞被包埋在其中以帮助保存它们留待以后分析的惰性物质。包埋还使得组织样品能够被切成薄的切片。包埋介质包括石蜡、火棉胶、OCT^TM化合物、琼脂、塑料或丙烯酸酯。许多包埋介质是疏水性的；因此，可能需要除去所述惰性物质，然后再进行分析，所述分析主要利用亲水试剂。本文使用的术语去石蜡化或脱蜡在广义上是指部分或完全除去生物样品中任何类型的包埋介质。例如，石蜡包埋的组织切片是通过穿过有机溶剂例如甲苯、二甲苯、苎烯或其他适合溶剂而被脱蜡。在其他实例中，直接使用石蜡包埋的组织切片（例如不经脱蜡步骤）。

可以通过任何适合的方法（包括灌注或通过浸没在固定剂中）来固定组织。固定剂可分类为交联剂（例如醛，例如甲醛、低聚甲醛和戊二醛以及非醛交联剂）、氧化剂（例如金属离子和复合物，例如四氧化锇和铬酸）、蛋白变性剂（例如乙酸、甲醇和乙醇）、机制未知的固定剂（例如氯化汞、丙酮和苦味酸）、组合试剂（例如卡诺伊（Carnoy’s）固定剂、甲氧基乙酰苯胺（methacarn）、布安液（Bouin’s fluid）、B5固定剂、罗斯曼液（Rossman’s fluid）和让德尔氏液（Gendre’s fluid））、微波和混杂的固定剂（例如排除体积固定（excluded volume fixation）和蒸汽固定）。在所述固定剂中还可包括添加剂，例如缓冲液、洗涤剂、鞣酸、苯酚、金属盐（例如氯化锌、硫酸锌和锂盐）和镧。

在制备组织或细胞样品时最常用的固定剂是甲醛，形式通常为福尔马林溶液（在缓冲溶液中的4%甲醛，称为10%缓冲福尔马林）。在一个实例中，所述固定剂为10%中性缓冲福尔马林，因此在一些实例中样品是福尔马林固定的。

在一些实例中，所述样品为环境样品（例如土壤、空气或水样品，或从表面（例如通过拭抹）获得的样品）或食物样品（例如含有蔬菜、水果、乳制品或肉的样品），例如用以检测可能存在的病原体。

VI.靶核酸

靶核酸分子是能够检测的核酸分子，或目的核酸分子，或可以用所公开的方法检测的核酸分子。靶包括单链、双链或其他多链核酸分子（例如DNA（例如基因组DNA、线粒体DNA或合成DNA）、RNA（例如mRNA、miRNA、tRNA、siRNA、长的非编码（nc）RNA、生物学上存在的反义RNA、与Piwi相互作用的RNA（piRNA）或小核仁RNA（snoRNA））），不论其是来自真核生物、原核生物、病毒、真菌、细菌或其他生物。基因组DNA靶可以包括基因组的一个或几个部分，例如编码区（例如基因或外显子）、非编码区（具有已知或未知的生物功能，例如增强子、启动子、调节区、端粒或“无义”DNA）。在一些实施方案中，靶可以含有可以天然存在或以其他方式诱导（例如化学或辐射诱导的突变）的突变（例如生殖细胞或体细胞突变）或者是所述突变的结果。这种突变可以包括（或归因于）基因组重排（例如易位、插入、缺失或倒位）、单核苷酸改变和/或基因组扩增。在一些实施方案中，靶可以含有一个或多个修饰或合成的单体单元（例如肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）、甲基化核酸、翻译后修饰的氨基酸、交联的核酸或交联的氨基酸）。

如上下文所述，靶核酸分子中NPPF可以特异性结合的部分也可以称为“靶”，但更具体地可以称为靶部分、互补区域（CR）、靶位点、经保护的靶区域或经保护的位点或类似短语。NPPF特异性结合其互补区域形成复合物，该复合物可以与所述整个靶和/或样品保持为整体，或者与所述整个靶和/或样品是分离的（或者是分离的或变得与其分离）。在一些实施方案中，将NPPF/CR复合物从所述整个靶和/或样品分离（或变为解离的），例如通过核酸酶例如S1核酸酶的作用。

使用所公开的方法可以分析所有类型的靶核酸分子。在一个实例中，所述靶为核糖核酸（RNA）分子，例如信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）、微RNA（miRNA）、siRNA、反义RNA或病毒RNA（vRNA）。在另一个实例中，所述靶为脱氧核糖核酸（DNA）分子，例如基因组DNA（gDNA）、线粒体DNA（mtDNA）、叶绿体DNA（cpDNA）、病毒DNA（vDNA）、cDNA或转染的DNA。在一个具体的实例中，所述靶为反义核苷酸。在一些实例中，可以使用所公开的方法分析细胞或组织的整个转录组序列。在一个实例中，所述靶核酸分子为罕见的核酸分子，例如仅在所述样品中出现少于约100,000次、少于约10,000次、少于约5,000次、少于约100次、少于约10次，或仅出现一次，例如在所述样品中仅出现1-10,000、1-5,000、1-100或1-10次的核酸分子。

可以在同一样品或测定中，或者甚至在多个样品或测定中，例如同时地检测或测序多个靶。类似地，可以在多个样品中例如同时地检测或测序单个靶。在一个实例中，所述靶核酸分子为miRNA和mRNA。因此，在这样的实例中，所述方法会包括使用至少一种特异性针对所述miRNA的NPPF和至少一种特异性针对所述mRNA的NPPF。在一个实例中，所述靶核酸分子为两个不同的DNA分子。因此，在这样的实例中，所述方法会包括使用至少一种特异性针对第一靶DNA的NPPF和至少一种特异性针对第二靶DNA的NPPF。在一个实例中，所述靶核酸分子为两个不同的RNA分子。因此，在这样的实例中，所述方法会包括使用至少一种特异性针对第一靶RNA的NPPF和至少一种特异性针对第二靶RNA的NPPF。

在一些实例中，所公开的方法允许检测或测序DNA或RNA单核苷酸多态性（SNP）或变体（sNPV）、剪接点、甲基化DNA、基因融合或其他突变、蛋白质结合的DNA或RNA，还有cDNA以及表达水平（例如DNA或RNA表达，例如cDNA表达、mRNA表达、miRNA表达、rRNA表达、siRNA表达或tRNA表达）。可通过所公开的方法定量和鉴定任何这样的核酸分子，即设计出与其杂交的核酸酶保护探针，甚至不需要对所述靶核酸分子自身进行测序，甚至在一些实例中所述靶核酸分子可以被破坏。

在一个实例中，DNA甲基化是通过使用如下的NPPF来检测，所述NPPF在已发生或未发生甲基化的位点处包括碱基错配，使得一旦处理所述靶样品，甲基化碱基就被转化为不同的碱基，所述不同的碱基与所述NPPF中的碱基互补。

本领域技术人员应该理解所述靶可以包括天然或非天然碱基或其组合。

在具体非限制性实例中，选择与赘生物（例如癌）相关的靶核酸（例如靶DNA或靶RNA）。已经在赘生性细胞（尤其在癌细胞例如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳癌、结肠癌、神经系统癌等）中鉴定了多种染色体异常（包括易位和其他重排、再重复（reduplication）或缺失）或突变。

在一些实例中，靶核酸分子包括GAPDH（例如GenBank登录号NM_002046）、PPIA（例如GenBank登录号NM_021130）、RPLP0（例如GenBank登录号NM_001002或NM_053275）、RPL19（例如GenBank登录号NM_000981）、ZEB1（例如GenBank登录号NM_030751）、Zeb2（例如GenBank登录号NM_001171653或NM_014795）、CDH1（例如GenBank登录号NM_004360）、CDH2（例如GenBank登录号NM_007664）、VIM（例如GenBank登录号NM_003380）、ACTA2（例如GenBank登录号NM_001141945或NM_001613）、CTNNB1（例如GenBank登录号NM_001904、NM_001098209或NM_001098210）、KRT8（例如GenBank登录号NM_002273）、SNAI1（例如GenBank登录号NM_005985）、SNAI2（例如GenBank登录号NM_003068）、TWIST1（例如GenBank登录号NM_000474）、CD44（例如GenBank登录号NM_000610、NM_001001389、NM_00100390、NM_001202555、NM_001001391、NM_001202556、NM_001001392、NM_001202557）、CD24（例如GenBank登录号NM_013230）、FN1（例如GenBank登录号NM_212474、NM_212476、NM_212478、NM_002026、NM_212482、NM_054034）、IL6（例如GenBank登录号NM_000600）、MYC（例如GenBank登录号NM_002467）、VEGFA（例如GenBank登录号NM_001025366、NM_001171623、NM_003376、NM_001171624、NM_001204384、NM_001204385、NM_001025367、NM_001171625、NM_001025368、NM_001171626、NM_001033756、NM_001171627、NM_001025370、NM_001171628、NM_001171622、NM_001171630）、HIF1A（例如GenBank登录号NM_001530、NM_181054）、EPAS1（例如GenBank登录号NM_001430）、ESR2（例如GenBank登录号NM_001040276、NM_001040275、NM_001214902、NM_001437、NM_001214903）、PRKCE（例如GenBank登录号NM_005400）、EZH2（例如GenBank登录号NM_001203248、NM_152998、NM_001203247、NM_004456、NM_001203249）、DAB2IP（例如GenBank登录号NM_032552、NM_138709）、B2M（例如GenBank登录号NM_004048）和SDHA（例如GenBank登录号NM_004168）。

在一些实例中，靶miRNA包括hsa-miR-205（MIR205、例如GenBank登录号NR_029622）、hsa-miR-324（MIR324、例如GenBank登录号NR_029896）、hsa-miR-301a（MIR301A、例如GenBank登录号NR_029842）、hsa-miR-106b（MIR106B、例如GenBank登录号NR_029831）、hsa-miR-877（MIR877、例如GenBank登录号NR_030615）、hsa-miR-339（MIR339、例如GenBank登录号NR_029898）、hsa-miR-10b（MIR10B、例如GenBank登录号NR_029609）、hsa-miR-185（MIR185、例如GenBank登录号NR_029706）、hsa-miR-27b（MIR27B、例如GenBank登录号NR_029665）、hsa-miR-492（MIR492、例如GenBank登录号NR_030171）、hsa-miR-146a（MIR146A、例如GenBank登录号NR_029701）、hsa-miR-200a（MIR200A、例如GenBank登录号NR_029834）、hsa-miR-30c（例如GenBank登录号NR_029833、NR_029598）、hsa-miR-29c（MIR29C、例如GenBank登录号NR_029832）、hsa-miR-191（MIR191、例如GenBank登录号NR_029690）或hsa-miR-655（MIR655、例如GenBank登录号NR_030391）。

在一个实例中，所述靶为病原体核酸例如病毒RNA或DNA。示例性的病原体包括但不限于病毒、细菌、真菌和原生动物。在一个实例中，所述靶为病毒RNA。病毒包括正链RNA病毒和负链RNA病毒。示例性的正链RNA病毒包括但不限于：微小核糖核酸病毒（例如口蹄疫病毒科（Aphthoviridae）[例如口蹄疫病毒（FMDV）]）、心病毒科（Cardioviridae）；肠病毒科（Enteroviridae）（例如柯萨奇病毒、艾可病毒、肠道病毒和脊髓灰质炎病毒）；鼻病毒科（Rhinoviridae）（鼻病毒））；肝病毒科（Hepataviridae）（甲型肝炎病毒）；披膜病毒（Togaviruses）（其实例包括风疹；甲病毒属（例如西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒和委内瑞拉马脑炎病毒））；虫媒病毒（其实例包括登革热病毒、西尼罗河病毒和日本脑炎病毒）；以及冠状病毒（其实例包括SARS冠状病毒，例如Urbani株）。示例性的负链RNA病毒包括但不限于：正黏液病毒（例如流感病毒）、弹状病毒（例如狂犬病病毒）和副黏液病毒（其实例包括麻疹病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒）。在一个实例中，所述靶为来自DNA病毒的病毒DNA，所述DNA病毒例如疱疹病毒（例如水痘-带状疱疹病毒，例如Oka株；巨细胞病毒；和单纯疱疹病毒（HSV）1型和2型）、腺病毒（例如腺病毒1型和腺病毒41型）、痘病毒（例如牛痘病毒）和细小病毒（例如细小病毒B19）。在另一个实例中，所述靶为逆转录病毒核酸，例如来自1型人免疫缺陷病毒（HIV-1），例如C亚型、HIV-2；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒（FIV）；猫白血病病毒（FeLV）；猿猴免疫缺陷病毒（SIV）；和鸟类肉瘤病毒的核酸。在一个实例中，所述靶核酸为细菌核酸。在一个实例中，所述细菌核酸来自革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌（Escherichiacoli）（K-12和O157:H7）、痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）。在另一个实例中，所述细菌核酸来自革兰氏阳性细菌，例如炭疽杆菌（Bacillus anthracis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎球菌、淋病双球菌和链球菌性脑膜炎。在一个实例中，所述靶核酸为来自原生动物、线虫或真菌的核酸。示例性的原生动物包括但不限于疟原虫属（Plasmodium）、利什曼原虫属（Leishmania）、棘阿米巴属（Acanthamoeba）、贾第虫属（Giardia）、内阿米巴属（Entamoeba）、隐孢子虫属（Cryptosporidium）、等孢子球虫属（Isospora）、肠袋虫属（Balantidium）、毛滴虫属（Trichomonas）、锥虫属（Trypanosoma）、纳氏虫属（Naegleria）和弓形虫属（Toxoplasma）。示例性的真菌包括但不限于粗球孢子菌（Coccidiodes immitis）和皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis）。

本领域技术人员可以鉴定可以用本文公开方法检测的其他靶DNA或RNA和/或其他的靶miRNA。

VII.测定输出

在一些实施方案中，所公开的方法包括确定样品中一种或多种靶核酸分子的存在或量。在其他或另外的实施方案中，所公开的方法包括确定样品中一种或多种靶核酸分子的序列，所述方法可以包括对所检测的序列定量。所述方法的结果可以在提供关于测试结果的信息的可感知输出中提供给用户（例如科学家、临床医师或其他健康护理工作者、实验室人员或患者）。在一些实例中，所述输出可以是纸件输出（例如手写或打印输出）、在屏幕上显示、图形输出（例如图、表或其他图表）或音频输出。在一个实例中，所述输出为包括指示所述样品中检测到（或未检测到）的靶核酸分子的存在或量（例如归一化的量）的定性或定量指示剂的表格或图。在其他实例中，所述输出为存在于基质上的信号的布局图或图像（例如阵列的荧光的数字图像）。在其他实例、实施方案中，所述输出为样品中一种或多种靶核酸分子的序列，例如指出所述靶分子中具体突变的存在的报告。

在一些实例中，所述输出为数值，例如样品中靶核酸分子的量。在其他实例中，所述输出为图示，例如在标准曲线上指示所述样品中靶核酸分子的值（例如量或相对量）的图。在其他实例中，所述输出为图示，例如指示所述样品中靶核酸分子的序列的图（例如其可以指示哪里存在突变）。在一些实例中，所述输出被传送给用户，例如通过实物、音频或电子方式（例如通过邮件、电话、传真传输、电子邮件或传送至电子病历）提供输出。

所述输出可以提供定量信息（例如特定靶核酸分子的量或特定靶核酸分子相对于对照样品或值的量）或可以提供定性信息（例如确定特定靶核酸分子是否存在）。在其他实例中，所述输出可以提供关于所述样品中靶核酸分子相对量的定性信息，例如鉴定相对于对照的增加或减少或相对于对照没有变化。

如本文所述，所述NPPF扩增子可以包括一个或多个实验标签，所述一个或多个实验标签可用于例如鉴定特定的患者、样品、实验或靶序列。使用这种标签使得能够“分类”或甚至计数所检测或测序的NPPF扩增子，从而使得能够在单个反应中分析多个不同的样品（例如来自不同的患者）、多个不同的靶（例如至少两个不同的核酸靶）或其组合。在一个实例中，Illumina和Bowtie软件可以用于这种分析。

在一个实例中，所述NPPF包括的实验标签对每个不同的靶核酸分子来说都是独特的。使用这样的标签使得能够仅测序或检测该标签，而不用对整个NPPF测序，以鉴定对应于特定核酸靶的NPPF。另外，如果要分析多个核酸靶，对每个靶使用独特的实验标签简化了分析，因为可以分类每个检测到或测序到的实验标签，如果需要还可以计数。这使得能够定量所述样品中的靶核酸，因为所述NPPF扩增子与所述样品中的靶是成化学计量比例的。例如如果对样品中的多种靶核酸进行检测或测序，那么所述方法使得能够通过简单地检测或测序，然后分类所述实验标签，而产生示出所检测或测序的每个靶序列和拷贝数的表格或图。

在另一个实例中，所述NPPF包括的实验标签对每个不同样品都是独特的（例如对每个患者样品来说独特的标签）。使用这种标签使得能够将具体检测到的NPPF扩增子与具体的样品相关联。因此如果在同一反应（例如同一孔或同一测序反应）中分析了多个样品，那么对每个样品使用独特的实验标签简化了分析，因为每个检测到或测序到的NPPF均可以与具体样品相关联。例如，如果检测或测序样品中的靶核酸，那么所述方法能够产生示出每个样品的分析结果的表格或图。

本领域技术人员应该理解每个NPPF扩增子可以包括多个实验标签（例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个实验标签），例如代表所述靶序列的标签和代表所述样品的另外的标签。一旦检测到或测序到每个标签，就可以使用适合的软件来以任何所需格式分类所述数据，例如图或表格。例如，这使得能够同时分析多个样品中的多个靶序列。

在一些实例中，将所检测到或测序到的NPPF扩增子与每个靶核酸序列的已知序列的参考数据库相比较。在一些实例中，这种比较使得能够检测突变，例如SNP。在一些实例中，这种比较使得能够将参考NPPF的丰度与已知含有SNP的区域中NPPF探针的丰度做比较。

本公开内容可通过如下的非限制性实施例进一步解释。

实施例1

多个NPPF的同时测序

该实施例描述了用于产生NPPF并对其测序的方法。

产生了七个不同的NPPF。每个NPPF包括特异性针对特定靶核酸分子且长度为25个核苷酸、中值Tm为62℃的区域以及在两个末端的侧翼序列。虽然5′和3′侧翼序列不同，但是所述七个不同NPPF各自的5′侧翼序列相同，3′侧翼序列相同。5'-侧翼序列是Tm为61℃的25个核苷酸，3'-侧翼序列是Tm为63℃的25个核苷酸。

将所述七个不同NPPF以已知比例（1:1.5:2:4:5）合并并如下进行PCR扩增。将所述NPPF与PCR引物孵育。一个引物包括与所述5'-侧翼序列互补的序列，第二引物包括与所述3'-侧翼序列互补的序列。所述第二引物还包括能够将六个核苷酸的实验标签纳入到所得扩增子中的序列，使得使用该引物扩增的每个NPPF均具有相同的六个核苷酸的实验标签。进行了几次这样的反应，每次用不同的标签。所述第一引物长度为49个碱基。这些碱基中的二十个与所述5'-侧翼序列是相同的。这20个碱基的Tm为54℃，整个引物的总Tm为70℃。与所述3'-侧翼序列互补的第二引物总共有57个核苷酸，Tm为约70℃。所述第二引物的前19个核苷酸与所述3′-侧翼序列完全互补并且Tm为54℃。

进行八个单独的PCR反应，使得可以确定差异（variance）。将所得扩增子使用凝胶纯化或标准的基于柱的纯化（Qiagen QIAQuick离心柱）提纯。然后使用Illumina平台对含有NPPF和实验标签的扩增子进行测序。将每个测序到的扩增子基于所述实验标签序列进行分类——每个标签代表所述七个NPPF的一个复制池。在每个实验标签组内，计数为所述七个标签各自鉴定的扩增子的数量。

对1.28亿个扩增子进行了测序，并且其中1.10亿（87%）产生了完全测序的实验标签。使用Bowtie将所述扩增子与预期序列进行比较，产生了约80%完全匹配的序列。对于Illumina系统来说，基于其公开的误差和质量规格，这是良好的完全匹配序列百分比。图5示出了对于所述七个独特NPPF中每一个所检测到的扩增子的数量，其数量对应于PCR前合并的NPPF的原始比例。在八次单独实验中测量所述探针，在各自具有在扩增过程中添加的不同实验标签。将这些全部合并到所述测序仪的单个通道中并测序。误差棒表示所述八次实验的重复性（1SD）。

图6是图5示出的数据的重绘图，示出了每个探针的八次独立实验结果，平均结果（没有误差棒，与具有误差棒的图5中描述的平均结果相同）和预期结果（基于添加到所述样品中的NPPF的量）。对于所述七个NPPF中每一个观察到的比例均与那些预期的匹配（基于添加到所述PCR反应的NPPF的原始量）。

实施例2

多个NPPF的同时检测

该实施例描述了用于使用阵列产生并检测NPPF的方法，以及对达到的扩增程度的定量。

产生了三个不同的NPPF（一个含有与人BAX基因互补的序列，一个含有EML4-ALK融合基因互补序列，一个含有EML4互补序列）。因此，每个NPPF均包括特异性针对特定靶核酸分子的区域以及在两个末端的侧翼序列。每个NPPF的5′末端具有生物素标记。所述NPPF为25个核苷酸，具有63℃-65℃的Tm。虽然所述5′和3′侧翼序列不同，但是所述七个NPPF各自的5′侧翼序列相同，3′侧翼序列相同。所述5'-侧翼序列是Tm为61℃的25个核苷酸，3'-侧翼序列是Tm为63℃的25个核苷酸。

在一个实验中，在qNPA之后，将未扩增的NPPF与阵列杂交。所述阵列包括与双功能接头结合的锚探针。所述双功能接头的一半与所述锚互补，另一半与所述NPPF的基因特异性部分互补。因此所述接头在所述锚和所述NPPF之间形成桥。将所述三个不同NPPF以已知比例合并，并与含有目的靶序列的合成RNA以及与所述NPPF上侧翼区域互补的CFS杂交。在S1介导的对未杂交的RNA、NPPF和CFS的消化之后，将所述反应物分份。将一部分与所述阵列在使得所述NPPF能够与其适合的双功能接头结合的条件下一起孵育。通过所述NPPF上的生物素标记使用荧光链霉亲和素-藻红蛋白检测所述NPPF与所述阵列的结合。

在另一个实验中，对所合并的反应物的另一部分进行PCR扩增，然后与阵列杂交，并且在与所述阵列杂交之前将所述产物按1:10或1:100稀释。为了进行PCR扩增，将含NPPF的反应物与PCR引物一起孵育。一个引物包括与所述5'-侧翼序列相同的序列（并包括生物素标记），第二引物包括与所述3'-侧翼序列互补的序列。与所述5'-侧翼序列互补的第一引物为22个核苷酸并且具有59℃的Tm，与所述3'-侧翼序列互补的第二引物为22个核苷酸并具有56℃的Tm。使用具有相同侧翼序列（但是靶特异性区域不同）的NPPF的优势是，所述侧翼序列容许使用通用PCR引物，使得仅需要单个5′引物序列和单个3′引物序列来扩增多个不同的NPPF序列。将所述NPPF扩增子按1:10或1:100稀释，然后与所述阵列杂交并如上所述进行检测。

如图7所示，在杂交捕获之前使用PCR扩增，使灵敏度增加至少150倍（考虑了PCR步骤之后对所述扩增子的稀释）。

实施例3

为测量mRNA或miRNA而设计的多个NPPF的同时测序

该实施例描述了用于产生并测序NPPF的方法。

产生了两组NPPF。在第一组中，产生了四十六个不同的NPPF。每个NPPF包括特异性针对特定靶核酸分子的长度为25个核苷酸、中值Tm为56℃的区域以及在两个末端的侧翼序列。对于第二组，产生了十三个不同的NPPF。每个NPPF包括特异性针对特定miRNA靶核酸分子的长度为18-25个核苷酸、中值Tm为51℃的区域以及在两个末端的侧翼序列。

对于所有的NPPF，不管靶如何，虽然5′和3′-侧翼序列不同，但是对于不同NPPF它们各自的5′侧翼序列相同，3′侧翼序列相同。所述5'-侧翼序列（5′-AGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC3′;SEQ ID NO:17）是Tm为61℃的25个核苷酸，3'-侧翼序列（5′GATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAA3′;SEQ ID NO:18）是Tm为63℃的25个核苷酸。

使用这些NPPF作为探针，对来自两个细胞系的不同浓度的裂解物进行qNPA。图10示出了所述qNPA反应、用作输入物质的样品和在测序前添加的实验标签。对于每个细胞浓度，反应进行三次重复。一些实验标签不能被所述测序仪软件识别，因此用这些实验标签标记的反应在该分析中不予考虑。将所述不同的NPPF合并，并与细胞裂解物的RNA杂交以及与所述NPPF上侧翼区域互补的CFS杂交。对于组1的四十六个NPPF，杂交在50℃下进行，而对于组2的十三个NPPF，杂交在37℃下进行。这种温度差异考虑了所述miRNA NPPF的长度较短及其相应较低的Tm。

在S1介导的对未杂交RNA、NPPF和CFS的消化之后，通过添加1M pH9.0的Tris中和所述反应，并通过加热至95℃持续20分钟来灭活S1核酸酶。然后将每个所得的含有代表所述样品中原始转录物的NPPF的反应物，与PCR引物一起孵育。一个引物包括与所述5'-侧翼序列互补的序列，第二引物包括与所述3'-侧翼序列互补的序列。所述第二引物还包括使得能够将六个核苷酸的实验标签纳入到所得扩增子中的序列，使得每个使用该引物扩增的NPPF具有相同的六个核苷酸的实验标签。

所述第一引物（5′-AATGATACGGCGACCACCGACAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC3′;SEQ ID NO:19）长度为49个碱基。这些碱基中的二十个与所述5'-侧翼序列是相同的。这20个碱基的Tm为54℃，整个引物的总Tm为70℃。与所述3'-侧翼序列互补的第二引物（5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATnnnnnnGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTT3′;SEQ ID NO:20）总共有57个核苷酸，Tm为约70℃。所述第二引物的前19个核苷酸与所述3′-侧翼序列完全互补并且Tm为54℃。上述用“nnnnnn”标记的六个碱基是以下表2中24个序列之一。所得序列在右栏示出，其SEQ ID NO:在括号内示出。

表2:引物和条形码的序列

三次重复反应均在单独PCR反应中扩增，并具有单独的实验标签，使得可以确定差异（见图10）。将所得扩增子使用凝胶纯化或标准的基于柱的纯化（Qiagen QIAQuick离心柱）提纯。然后使用Illumina平台对含有所述NPPF和实验标签的扩增子进行测序。所述实验标签可以位于若干位置，在该实施例中，其位于所述扩增子的3′末端，紧接着与索引读取测序引物互补的区域的下游。因此Illumina测序以两个步骤完成，最初读取所述序列，然后再使用第二测序引物读取所述实验标签。以这种方式使用两种测序引物是在Illumina平台上多路复用检测样品的一种标准方法。

首先基于所述实验标签（条形码）对测序的每个扩增子进行分类，然后在每个实验标签组内，计数对于每个不同标签鉴定的扩增子的数量。将所述扩增子使用Bowtie与预期序列进行比较。

图11示出了使用所述46个mRNA NPPF在THP1细胞上进行三次重复qNPA反应的结果。在重复之间观察到极好的重复性并且CV是低的。该图呈现了对于四十六个独特NPPF中每一种所检测到的扩增子的数量，其对应于PCR前合并的NPPF的原始比例。误差棒表示平均值的1个标准差。在三次单独实验中测量所述探针，其各自具有在扩增过程中添加的不同的实验标签。将这些全部合并到所述测序仪的单个通道中并测序。误差棒表示所述三次实验的重复性（1SD）。

图12A和12B示出了从在四点THP1细胞滴定上运行的反应获得的46个mRNA NPPF中12个的曲线图计数。所示出的数据表示最低（A）和最高（B）丰度NPPF，并证明了使用测序可获得大范围的检测。其还证明了对于高丰度和低丰度探针的qNPS反应的线性（表示所述样品中对应RNA的高表达和低表达）。

图13对来自在三点HepG2细胞滴定（5000个细胞-50000个细胞）上运行的反应的十三个miRNA NPPF中五个的结果作了曲线图。选择这五个是因为它们具有相似水平并可以在同一曲线图上清楚地看到。该曲线图证明了使用所公开的方法可以检测细胞裂解物中的miRNA，并且相对于所测试的样品大小显示了良好的线性。

实施例4

使用测序并在阵列上捕获NPPF来检测设计用于测量mRNA的多个NPPF

该实施例描述了用于产生NPPF并对其测序的方法。

产生了九个不同的NPPF。每个NPPF包括特异性针对特定靶核酸分子的长度为25个核苷酸、中值Tm为57℃的区域以及在两个末端的侧翼序列。虽然所述5′和3′侧翼序列不同，但是不同NPPF各自的5′侧翼序列相同，3′侧翼序列相同。所述5'-侧翼序列（5′-AGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’;SEQ ID NO:17）是Tm为61℃的25个核苷酸，3'-侧翼序列（5′GATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAA-3′;SEQ ID NO:18）是Tm为63℃的25个核苷酸。每个NPPF的5'-侧翼序列包括生物素标记。

对样品进行qNPA，所述样品包含合成RNA在qNPA裂解缓冲液中（体外转录的RNA）的稀释液。对于每个样品浓度，反应进行三次重复。所述不同NPPF均以166pM的浓度合并，并与上述的样品以及与所述NPPF上侧翼区域互补的CFS杂交。在所述反应中包括10倍摩尔比例的CFS（每个CFS为1.6nM）。杂交在50℃下进行至少16小时，总反应体积30μl。在杂交后，将20μl S1反应缓冲液添加到所述反应中。该缓冲液包含:100mM NaOAc pH5.0、250mM KCl、22.5nMZnSO4和25U的S1核酸酶。使所述S1反应在50℃下进行90分钟。在S1介导的对未杂交RNA、NPPF和CFS的消化之后，通过添加1.5μl1M的pH9.0的Tris中和所述反应，并通过加热至95℃持续20分钟来灭活S1核酸酶。每个所得反应物均含有代表所述样品中原始转录物的NPPF。此时将所述反应物分为两部分。

在qNPA之后，将所述未扩增的NPPF的一部分与阵列杂交。所述阵列包括与双功能接头结合的锚探针。所述双功能接头的一半与所述锚互补，另一半与所述NPPF的基因特异性部分互补。因此所述接头在所述锚和所述NPPF之间形成桥。向来自上述反应的NPPF中补加盐替换缓冲液以将所述反应物调节为用于阵列杂交的条件（盐替换缓冲液为：3.225M NaCl；67.5mM EDTA pH8.0；3×SSC；500mM HEPES pH7.5），并与所述阵列在50℃下一起孵育16小时。通过所述NPPF上的生物素标记使用荧光链霉亲和素-藻红蛋白检测所述NPPF与所述阵列的结合。

将所述反应物的另一部分准备用于测序。首先将所述反应物与PCR引物孵育。一个引物包括与所述5'-侧翼序列互补的序列，第二引物包括与所述3'-侧翼序列互补的序列。所述第二引物还包括使得能够将六个核苷酸的实验标签纳入到所得扩增子中的序列，使得每个使用该引物扩增的NPPF均具有相同的六个核苷酸的实验标签。

所述第一引物长度为49个碱基。这些碱基中的二十个与所述5'-侧翼序列是相同的。这20个碱基的Tm为54℃，整个引物的总Tm为70℃。与所述3'-侧翼序列互补的第二引物总共有57个核苷酸，Tm为约70℃。所述第二引物的前19个核苷酸与所述3′-侧翼区域完全互补并且Tm为54℃。

三次重复反应各自在单独的PCR反应中用不同的标签扩增，使得可以确定差异。将所得扩增子使用凝胶纯化或标准的基于柱的纯化（Qiagen QIAQuick离心柱）提纯。然后如实施例3中所述，使用Illumina平台对含有所述NPPF和实验标签的扩增子进行测序，使用第二索引读取技术对所述实验标签进行测序。

还建立了PCR反应以确定循环数对测序结果的影响。简言之，三次重复反应各自在三个单独的PCR反应中扩增，每个反应使用不同的标签，使得可以确定差异。这样的三个PCR反应进行10、12或15个循环的PCR，将所得扩增子使用凝胶纯化或标准的基于柱的纯化（Qiagen QIAQuick离心柱）提纯。然后如实施例3中所述，使用Illumina平台对含有所述NPPF和实验标签的扩增子进行测序，使用第二索引读取技术对所述实验标签进行测序。

首先基于所述实验标签（条形码）对所测序的每个扩增子进行分类，然后在每个实验标签组内，计数对于各个不同标签所鉴定的扩增子的数量。使用Bowtie将所述扩增子与所述预期序列进行比较。

图14示出了低PCR循环数（10、12和15）不会过度地影响测序结果。所述棒状图示出了在测序后每个NPPF产生的计数。指出了循环数和原始样品中输入物质的量。所得数据被归一化以能够比较不同的循环和输入水平。虽然，清楚的是，这些循环中的任一个都可以用于所公开的方法，但是在15个PCR循环后所述样品中物质的增加，使得随后更容易对测序库提纯。大于15个循环产生比所需要的扩增子尺寸更大和更小的虚假产物。因此在一些实例中，所公开的方法使用10-15个PCR循环，例如10、11、12、13、14或15个循环。

图15A和15B示出了分开后来自相同的三次重复qNPA反应的结果。NPPF是通过与阵列的杂交来检测（图15A）或是通过计数所测序的NPPF（图15B）来检测。示出的棒是所述三次重复的平均值，误差棒表示所述平均值的一个标准差。

考虑到所公开的本发明的原理可以应用到许多可能的实施方案中，应该认识到所示出的实施方案仅是本公开内容的示例，不应被视为是对本公开内容的范围的限制。相反地，本发明的范围是由以下权利要求确定。因此，本发明人要求保护在这些权利要求范围和精神内的所有发明。

Claims (36)

1.一种确定样品中至少一种靶核酸分子的序列的方法，包括：

使所述样品与至少一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）在足以使所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触，

其中所述NPPF包含：

5′末端和3′末端，

与所述靶核酸分子的一个区域互补的序列，使得所述NPPF和所述靶核酸分子之间能够特异性结合，

位于与所述靶核酸分子互补的序列的5′、3′或5′和3′的侧翼序列，其中所述侧翼序列包含未在所述样品中的核酸分子中发现的至少12个连续核苷酸，所述至少12个连续核苷酸提供了通用扩增序列，并且其中所述侧翼序列与扩增引物的至少一部分互补；

使所述样品与包含同所述侧翼序列互补的序列的核酸分子（CFS）在足以使所述侧翼序列特异性结合至所述CFS的条件下接触；

使所述样品与特异性针对单链核酸分子的核酸酶在足以除去未结合的核酸分子的条件下接触，从而产生包含与所述靶核酸分子和CFS杂交的NPPF的经消化的样品；

用所述扩增引物扩增所述经消化的样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子，其中至少一个扩增引物包含与所述NPPF的侧翼序列互补的区域；和

对所述NPPF扩增子的至少一部分进行测序，从而确定所述样品中至少一种靶核酸分子的序列。

2.一种检测样品中至少一种靶核酸分子的方法，包括：

使所述样品与至少一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针（NPPF）在足以使所述NPPF特异性结合至所述靶核酸分子的条件下接触，

其中所述NPPF包含：

5′末端和3′末端，

与所述靶核酸分子的一个区域互补的序列，使得所述NPPF和所述靶核酸分子之间能够特异性结合，

位于与所述靶核酸分子互补的序列的5′、3′或5′和3′的侧翼序列，其中所述侧翼序列包含未在所述样品中的核酸分子中发现的至少12个连续核苷酸，所述至少12个连续核苷酸提供了通用扩增序列，并且其中所述侧翼序列与扩增引物的至少一部分互补；

使所述样品与包含同所述侧翼序列互补的序列的核酸分子（CFS）在足以使所述侧翼序列特异性结合至所述CFS的条件下接触；

使所述样品与特异性针对单链核酸分子的核酸酶在足以除去未结合的核酸分子的条件下接触，从而产生包含与所述靶核酸分子和CFS杂交的NPPF的经消化的样品；

用扩增引物扩增所述经消化的样品中的NPPF，从而产生NPPF扩增子，其中至少一个扩增引物包含与所述NPPF的侧翼序列互补的区域；和

检测所述NPPF扩增子，从而检测所述样品中至少一种靶核酸分子。

3.权利要求1或2的方法，其中所述NPPF包含DNA分子。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述NPPF包含35-150个核苷酸。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中与所述靶核酸分子的一个区域互补的序列长度为10-60个核苷酸。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述侧翼序列长度为12-50个核苷酸。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述NPPF在5′末端和3′末端包含侧翼序列，其中所述5′末端的侧翼序列与3′末端的侧翼序列不同。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述至少一个扩增引物还包含一个序列，所述序列允许在所述扩增步骤中将实验标签或测序衔接头连接到NPPF扩增子。

9.权利要求1-7任一项的方法，其中所述侧翼序列还包含实验标签、测序衔接头或其两者。

10.权利要求8或9的方法，其中所述实验标签包含使得能够鉴定样品、受试者、处理或靶核酸序列的核酸序列。

11.权利要求8-10任一项的方法，其中所述测序衔接头包含允许捕获到测序平台上的核酸序列。

12.权利要求8-11任一项的方法，其中所述实验标签或测序标签存在于所述NPPF扩增子的5′末端或3′末端。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中一种或多种靶核酸分子是被固定、被交联或是不可溶的。

14.权利要求1-13任一项的方法，其中所述样品是被固定。

15.权利要求1-14任一项的方法，其中所述NPPF为DNA，并且所述核酸酶包括外切核酸酶、内切核酸酶或其组合。

16.权利要求1-15任一项的方法，其中所述特异性针对单链核酸分子的核酸酶包括S1核酸酶。

17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述方法同时测序或检测多个样品中的至少一种靶核酸分子。

18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述方法测序或检测至少两种靶核酸分子，并且其中所述样品与至少两种不同的NPPF接触，每种NPPF均特异性针对不同的靶核酸分子。

19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述方法是对多个样品进行，并且在所述多个样品中的每一个中检测至少两种靶核酸分子。

20.权利要求1-19任一项的方法，其中至少一种NPPF是特异性针对miRNA靶核酸分子，并且至少一种NPPF是特异性针对mRNA靶核酸分子。

21.权利要求1-20任一项的方法，还包括裂解所述样品。

22.权利要求1或3-21任一项的方法，其中测序包括Solexa测序、454测序、链终止测序、染料终止测序或焦磷酸测序。

23.权利要求1或3-22任一项的方法，其中测序包括单分子测序。

24.权利要求1或3-23任一项的方法，还包括：

将所获得的NPPF序列与参考序列数据库比较；和

确定每个鉴定的NPPF序列的数量。

25.权利要求2-21任一项的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与包含多个空间上不连续区域的表面接触，每个区域包含至少一种与双功能接头连接的锚，其中所述双功能接头包含与所述锚特异性结合的第一部分和与所述NPPF扩增子之一的至少一部分特异性结合的第二部分，所述接触是在足以使所述NPPF扩增子特异性结合至所述双功能接头的第二部分的条件下进行。

26.权利要求2-21任一项的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与包含多个空间上不连续区域的表面接触，每个区域包含至少一种具有与所述NPPF扩增子之一的至少一部分互补的区域的核酸锚，所述接触是在足以使所述NPPF扩增子特异性结合至所述核酸锚的条件下进行。

27.权利要求2-21任一项的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与表面群接触，其中所述表面群包含表面的亚群，其中每个表面亚群包含至少一种与双功能接头连接的锚，所述双功能接头包含与所述NPPF扩增子之一的至少一部分特异性结合的第一部分，所述接触是在足以使所述NPPF扩增子特异性结合至所述双功能接头的第二部分的条件下进行。

28.权利要求2-21任一项的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与表面群接触，其中所述表面群包含表面的亚群，其中每个表面亚群包含至少一种具有与所述NPPF扩增子之一的至少一部分互补的区域的核酸锚，所述接触是在足以使所述NPPF扩增子特异性结合至所述核酸锚的条件下进行。

29.权利要求27或28的方法，其中所述表面群包含微珠群。

30.权利要求2-21或25或27任一项的方法，其中所述双功能接头的第二部分是与同所述靶核酸分子的区域互补的NPPF区域互补，从而使所述NPPF扩增子与所述双功能接头之间能够特异性结合。

31.权利要求2-30任一项的方法，其中所述NPPF扩增子包含可检测标记。

32.权利要求31的方法，其中所述可检测标记包括半抗原、荧光分子、酶或放射性同位素。

33.权利要求31的方法，其中所述可检测标记包括生物素。

34.权利要求33的方法，其中检测所述NPPF扩增子包括使所述NPPF扩增子与缀合有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素或链酶亲和素接触。

35.权利要求1-34任一项的方法，其中所述至少一种NPPF包括至少10种NPPF。

36.权利要求1-35任一项的方法，其中所述样品为福尔马林固定的。

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