TWI641834B

TWI641834B - 藉由大量平行ｒｎａ定序之母體血漿轉錄體分析

Info

Publication number: TWI641834B
Application number: TW103107127A
Authority: TW
Inventors: 盧煜明; 趙慧君; 陳君賜; 江培勇; 徐寶賢
Original assignee: 香港中文大學
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2018-11-21
Also published as: CA2897684C; MX2021015876A; EP2961851A1; JP6525894B2; CN109136364A; TW202246521A; CA3117788A1; KR102241051B1; CA2897684A1; SG10201609080WA; IL281429A; EP2961851B1; IL239939B; EP3587588B1; CN105143466B; JP2021164469A; JP2019162121A; SG11201506516TA; EA202190075A2; HK1253097A1

Abstract

本發明提供利用來自女性妊娠個體之樣品診斷妊娠相關病症、測定對偶基因比率、測定循環轉錄本之母體或胎兒貢獻及/或鑑別母體或胎兒標記之方法。本發明亦提供一種基因於診斷女性妊娠個體中之妊娠相關病症之用途。

Description

藉由大量平行RNA定序之母體血漿轉錄體分析

相關申請案之交叉參考

本申請案主張標題為「MATERNAL PLASMA TRANSCRIPTOME ANALYSIS BY MASSIVELY PARALLEL RNA SEQUENCING」並於2013年2月28日申請之美國臨時專利申請案第61/770,985號之優先權，該案係出於所有目的以引用方式併入本文中。

已報導在母體血漿中具有妊娠特異性的細胞外RNA分子¹。其等已藉由簡單利用來自母體之周邊血液樣本為胎兒評估及妊娠監測提供非侵入性檢測工具。迄今為止，已利用母體血漿RNA開發出許多具前景的產前診斷應用^2-8。研究者一直在積極尋找其他RNA標記，以拓展在胚胎異常及妊娠病理之不同領域中之應用。

理論上，最直接的RNA標記鑑別法係直接分析母體血漿中之細胞外RNA分子之概況。然而，該方法並不容易，因為習知高通量篩選技術(諸如微陣列分析及基因表現系列分析(SAGE))檢測母體血漿中之通常低濃度之部分降解的細胞外RNA之能力有限⁹。取而代之地，大多數已報導的RNA標記篩選策略藉由比較胎盤與母體血細胞之表現圖譜而間接進行¹⁰。藉由高靈敏度而低通量的技術(諸如實時逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR))，僅進一步研究母體血漿樣品中在胎盤中之表現比在母體血細胞中高得多的轉錄本。迄今為止，藉由該間接方法所鑑別的血漿RNA標記相對有限。此係可能因為基於組織的採集策略尚未完全考慮到所有影響母體血漿中之胎盤RNA濃度之生物因素。此外，藉由該方法無法鑑別出非胎盤組織響應妊娠而表現並釋放之轉錄本。因此，非常希望有一種容許直接分析母體血漿轉錄體概況之高通量靈敏方法。

類似地，直接型血漿RNA概況分析可用於其中存在來自兩個個體之RNA分子之混合物之其他情境((諸如)器官移植)中。移植接受者之循環中含有來自提供者及接受者之核酸分子。提供者或接受者所提供之RNA分子之相對概況之變化可在移植器官或接受者中表現為病理(諸如移植排斥)。

本發明提供利用女性妊娠個體之樣品診斷妊娠相關病症、測定對偶基因比率、測定循環轉錄本之母體或胎兒貢獻及/或鑑別母體或胎兒標記之方法、系統及裝置。在一些實施例中，該樣品係含有母源性及胎源性RNA分子之混合物之血漿。

該等RNA分子經分析(例如，定序)以得到複數個讀段(read)，並(例如，藉由序列比對)識別此等讀段在參考序列中之位置。識別出在母親或胎兒中之任一者中為第一對偶基因同型接合及在母親及胎兒中之另一者中為第一對偶基因及第二對偶基因異型接合之資訊基因座。然後篩選出該等資訊基因座，並進一步分析位於(例如，對齊)該等經篩選的資訊基因座上之讀段。在一些實施例中，計算出對應於第一對偶基因及第二對偶基因之讀段之比率，並與截止值相比較，以診斷妊娠相關病症。在一些實施例中，利用位於經篩選的母體資訊基因座上之讀段確定該樣品中源自胎兒的一部分RNA。在一些實施例中，針對個別經篩選的資訊基因座，計算對應於第一對偶基因及第二對偶基因之讀段之比率，並將該比率與截止值相比較，以指定該基因座為母體或胎兒標記。

本發明方法並不限於產前診斷，且可應用於含有源自兩個個體之RNA分子之混合物之任何生物樣品。例如，可使用得自器官移植接受者之血漿樣品。移植器官中所表現之轉錄本反映提供者的基因型，且以可檢測濃度出現在接受者血液中。藉由讀取此等轉錄本，可鑑別出提供者及接受者所表現之基因內之資訊基因座，且可測定來自各個體之對偶基因之相對表現水平。單獨由提供者或接受者所貢獻之對偶基因之反常表現水平可用於診斷移植相關病症。

可用於本發明方法中之生物樣品包括血液、血漿、血清、尿液、唾液及組織樣品。例如，已在妊娠婦女之尿液中檢測到胎兒核酸。已顯示，腎臟移植接受者之尿液中含有來自移植器官之細胞外游離核酸及細胞。已在許多情形下觀察到微嵌合現象(Microchimerism)。微嵌合現象係指體內存在來自另一個體之細胞或核酸來源，包括特定個體之器官及組織。已在甲狀腺、肝臟、脾臟、皮膚、骨髓及其他組織的活體組織檢查中觀察到微嵌合現象。由於先前懷過孕或輸過血便可出現微嵌合現象。

本發明亦提供一種基因於診斷女性妊娠個體中之妊娠相關病症之用途。將該基因之表現水平與由一或多個各懷有健康胎兒之其他女性個體所測得的對照值作比較。本文所述妊娠相關病症包括子癇前症、宮內生長受限、侵入性胎盤形成及早產。其他妊娠相關病症可為置胎兒於胎兒死亡風險之病症，諸如新生兒溶血性疾病、胎盤功能不全、胎兒水腫、胎兒畸形。還有其他妊娠相關疾病可為引起孕期併發症之病症，諸如HELLP症候群、系統性紅斑狼瘡及母體之其他免疫性疾病。

3000‧‧‧電腦系統

3071‧‧‧I/O控制器

3072‧‧‧系統記憶體

3073‧‧‧中央處理器

3074‧‧‧印表機

3075‧‧‧系統匯流排

3076‧‧‧監視器

3077‧‧‧串列埠

3078‧‧‧鍵盤

3079‧‧‧存儲設備

3081‧‧‧外部界面

3082‧‧‧顯示適配器

圖1顯示對偶基因比率B/A與該等各自基因於胎盤及母體血細胞中之相對表現水平間之正相關關係。

圖2顯示總基因表現水平與基因於胎盤及母體血細胞中之相對表現水平間之關係。

圖3為診斷妊娠相關病症之方法之流程圖。

圖4及5顯示RNA-seq讀段比對結果之概述。

圖6顯示來自測定兩個個體之血漿RNA之序列之數據。圖6A顯示來自M9356P(經Ribo-Zero Gold預處理)及M9415P(未經Ribo-Zero Gold預處理)之RNA-seq文庫之經定序讀段之GC%分佈。圖6B顯示M9356P與M9415P之基因表現圖譜間之相關性。

圖7顯示針對相對組織表現水平(胎盤/血細胞)所繪製的母體血漿中之RNA-SNP對偶基因比率及不同RNA轉錄本之總血漿濃度之圖。

圖8顯示針對相對組織表現水平(血細胞/胎盤)所繪製的RNA-SNP對偶基因比率及含有資訊SNP之不同基因之總血漿濃度之圖。

圖9顯示胎兒特異性SNP對偶基因之RNA-SNP對偶基因比率及含有此等對偶基因之RNA轉錄本在母體血漿中之表現水平。

圖10顯示母體特異性SNP對偶基因之RNA-SNP對偶基因比率及含有此等對偶基因之RNA轉錄本在母體血漿中之表現水平。

圖11顯示子癇前症及對照個體中之母體特異性SNP對偶基因之數據。圖11A顯示病例5641(末三個月遲發型子癇前症)及病例7171(對照)之包含母體特異性SNP對偶基因之資訊SNP之RNA-SNP對偶基因比率。圖11B顯示病例5641之包含母體特異性SNP對偶基因之資訊SNP之RNA-SNP對偶基因比率及血漿濃度相對於病例7171(對照)之彼等之倍數差異。

圖12顯示子癇前症及對照個體中之母體特異性SNP對偶基因之數據。圖12A顯示病例5641(末三個月遲發型子癇前症)及病例9356(對照)之包含母體特異性SNP對偶基因之資訊SNP之RNA-SNP對偶基因比率。圖12B顯示病例5641之包含母體特異性SNP對偶基因之資訊SNP之RNA-SNP對偶基因比率及血漿濃度相對於病例9356之彼等之倍數差異。

圖13以表格形式顯示圖11中之數據。

圖14以表格形式顯示圖12中之數據。

圖15為測定來自懷有胎兒的女性個體之樣品中源於胎兒的一部分RNA之方法之流程圖。

圖16顯示母體血漿轉錄體之資訊SNP分析之結果。

圖17顯示妊娠晚期之母體血漿樣品中在未進行對偶基因特異性表現篩選時之胎兒及母體的相對貢獻。

圖18顯示母體血漿轉錄體之胎兒及母體貢獻。圖18A顯示妊娠早期及晚期母體血漿中之胎源性及母源性轉錄本之比例。圖18B顯示分娩前後之對偶基因計數及胎兒-對偶基因比率。

圖19比較子癇前症及對照妊娠病例在一個RNA-SNP上之胎兒及母體的貢獻分數。

圖20係指定基因組基因座為母體或胎兒標記之方法之流程圖。

圖21為妊娠相關基因之清單。

圖22顯示在分娩後的個體中比在分娩前具有更低表現水平的妊娠相關基因。

圖23顯示血漿樣品之層次聚類，其使用131種妊娠相關基因。

圖24顯示131種妊娠相關基因在胎盤、母體血細胞及母體血漿中之表現水平。圖24A為兩個妊娠晚期病例之胎盤及母體血細胞及分娩前後的母體血漿之基因表現(log₂(轉錄本濃度))之熱圖。該等131種妊娠相關基因優先表現於胎盤中。圖24B顯示，131種基因在胎盤及血漿中之表現水平呈正相關(P<0.05，斯皮爾曼(Spearman)相關)。

圖25比較利用基於血漿及基於組織方法所鑑別的基因的血漿中 RNA之胎兒及母體貢獻。

圖26列出母體血漿中藉由RNA-Seq鑑別出的98種子癇前症-相關RNA。該圖顯示在收集自無併發症妊娠婦女及已出現子癇前症的婦女之血漿中之表現水平。

圖27顯示病例9415之PAPPA RNA中之單核苷酸多態性(SNP)位點上之RNA-定序讀段計數。對偶基因-A係共有對偶基因，且對偶基因-G係胎兒特異性對偶基因。

圖28顯示病例9415之H19 RNA中之單核苷酸多態性(SNP)位點上之RNA-定序讀段計數。

圖29顯示藉由甲基化敏感限制酶消化檢測母體H19甲基化狀態。

圖30顯示可與本發明實施例之系統及方法一起使用之實例電腦系統3000之方塊圖。

I.序論

十多年前已報導在母體血漿中存在細胞外游離胎兒RNA¹¹。在該發現以後，已開展許多研究來檢測母體血漿中之源於胎兒及胎盤的循環RNA^1,10,12。有趣的是，發現胎盤特異性轉錄本在血漿中之表現水平與彼等在胎盤組織中的表現水平呈正相關¹⁰，由此強調血漿RNA分析作為非侵入性工具以監測胎盤或胎兒健康及發育之臨床效用。事實上，母體循環RNA之檢測具有以下臨床應用：診斷妊娠或胎盤相關病症(諸如子癇前症^2,13-15、宮內生長遲滯⁴及早產⁸)及非侵入性檢測胎兒染色體異常^5,7,16。此等進展強調RNA生物標記於分子評估產前病症之潛在效用。

儘管血漿RNA分析在產前檢查中之前景樂觀，但迄今為止，母體血漿中之經充分驗證的妊娠或胎盤相關轉錄本數量仍然有限。就此而言，已利用逆轉錄酶(RT)-PCR檢查血漿中之RNA生物標記^{1,4,8,10,12,13}，逆轉錄酶(RT)-PCR係一種每次分析通常將靶向相對少量RNA物質之靈敏方法。值得注意的是，此等研究主要集中在與母體血細胞相比時在胎盤中之表現水平相對較高的基因上，並假定妊娠相關基因主要源自胎盤。該等途徑已鑑別出在胎盤中高度表現之妊娠相關RNA標靶，但可能遺漏了其他重要標靶。此外，假如血漿RNA之濃度低且完整性差^9,15，則習知高通量方法(諸如基因表現系列分析及微陣列分析)將無法穩健地用於直接檢查血漿轉錄體。

藉由使用大量平行定序(MPS)進行RNA分析(亦即RNA-定序(RNA-seq))可潛在地解決血漿RNA分析之上述技術侷限^17,18。由於具有增強靈敏度及寬動態範圍，RNA-seq已被用於檢查許多人類組織(包括胎盤)中之基因表現¹⁹。MPS之優越性已藉由其在直接分析健康個體²⁰及妊娠婦女^21,22中血漿miRNA之概況之可行性而被進一步證實。然而，血漿轉錄體之全譜系仍不明瞭，此可能係因為長RNA物質在血漿中之穩定性低於短miRNA所致²³。

在本研究中，吾人已顯示，可在母體血漿中檢測胎源性及母源性轉錄本，且可利用RNA-seq，藉由檢查胎兒及母體特異性單核苷酸多態性(SNP)估算其相對貢獻。此外，可在母體血漿中監測胎盤之對偶基因特異性表現模式。吾人亦已證實，可藉由直接檢查分娩前後的母體血漿鑑別妊娠相關轉錄本。

II.利用SNP對偶基因比率診斷妊娠相關病症之方法

基因表現圖譜分析可用於檢測個體之疾病狀態。本發明實施例包括通過分析來自兩個不同個體之RNA分子之混合物來分析個體之表現圖譜之方法。該等方法利用於一個個體所特有之對偶基因與兩個個體間所共有的對偶基因之相對豐度。基於共有對偶基因與個體特異性對偶基因之相對豐度，可測定兩個個體之基因表現圖譜。本發明方法之一可行應用係藉由分析含有來自胎兒及妊娠婦女之RNA之母體血漿樣品中之RNA來分析胎兒的基因表現圖譜。另一應用係分析自移植接受者之血漿樣品(其含有來自提供者及接受者之RNA)中之源於提供者的RNA之基因表現圖譜。

在含有來自兩個個體之RNA之混合物中，無法基於分析該混合物中不同RNA轉錄本之總量測定各個體之表現圖譜，因為難以測定各個體對總RNA之相對貢獻。不同RNA轉錄本之相對豐度可用於監測個體之健康或檢測疾病狀態。

在該方法中，可首先藉由直接分析個體之基因型或藉由家族分析測定兩個個體之基因型。例如，若雙親之基因型為AA及TT，則胎兒之基因型將為AT。

以下假設性實例說明該方法之原理。就各受關注的基因而言，編碼區內存在SNP，因此可在不同基因之RNA轉錄本中觀察到多態性。假定胎兒及妊娠婦女之基因型分別為AB及AA。因而，B對偶基因對胎兒而言具有特異性，且A對偶基因將為胎兒及母親所共有。不同基因在胎盤及母體血細胞中之相對表現水平係如表1中所示。

在該實例中，吾人假定，胎盤及母體血細胞將為母體血漿貢獻各自RNA轉錄本之2%，貢獻比例相對相等。換言之，若某一基因之胎盤表現水平為10000，則其將為母體血漿共貢獻200個RNA轉錄本。如圖1中所示，對偶基因比率B/A與各自基因在胎盤及母體血細胞中之相對表現水平呈現良好的正相關關係。相對地，總基因表現水平受到母體血細胞之表現之波動之影響，且因此與胎盤之表現之相關性欠佳(圖2)。

利用對偶基因比率分析之另一優勢在於針對母體血細胞之表現水平來標準化特定基因在胎盤中之表現水平。由於不同基因及不同樣品間之表現水平可存在巨大差異，故該標準化將使得不同基因間之比較更為穩健，且避免與參考基因(例如，管家基因)作比較之必要性。換言之，在習知基因表現分析中，某一基因在樣品中之表現水平係參照管家基因而測量，或作為相對於該樣品之總RNA之量而測量。為確定異常基因表現，通常地，將會拿測試樣品之相對值與對照樣品作比較。

此處，吾人提出一種新型方法，藉此，吾人使用由胎兒貢獻並針對相同基因之母體貢獻標準化之相對量作為測定基因表現圖譜之手段。在會改變基因於胎盤或母體器官中之表現之病理狀態(例如子癇前症、早產、母體疾病(諸如系統性紅斑狼瘡))下，該基因之胎兒對母體比在與沒有該等病理狀態之妊娠期相比時將發生變化。該方法可使用母體血漿中之RNA轉錄本中胎兒特異性SNP對偶基因相對於共用對偶基因來實踐。

該方法亦可使用母體血漿中之RNA轉錄本中母體特異性SNP對偶基因相對於共用對偶基因來實踐。當一或多個RNA基因轉錄本之該等對偶基因比率中之一或多者在與非病理狀態下預期之比率相比時發生變化時可確定為病理狀態。一個基因座或多個基因座間之該等對偶基因比率之模式可用於確定病理狀態。非病理狀態可藉由正常妊娠期之對偶基因比率、當妊娠期不再受病理狀態影響時測試之前或之後所得樣品中之對偶基因比率或來自先前得自正常妊娠期之現有數據(亦即先前導出的參考範圍)之對偶基因比率表示。

可利用本發明方法診斷之妊娠相關病症包括任何以基因在母體及胎兒組織中之反常相對表現水平為特徵之病症。此等病症包括(但不限於)子癇前症、宮內生長受限、侵入性胎盤形成、早產、新生兒溶血性疾病、胎盤功能不全、胎兒水腫、胎兒畸形、HELLP症候群、系統性紅斑狼瘡及母體之其他免疫性疾病。該等方法可區分樣品中由母體及胎兒所貢獻之RNA分子，該樣品含有該等分子之混合物。因此，即使一個個體之貢獻並未變化或反向變化，該等方法亦可確定另一個體(亦即，母親或胎兒)對某一特定基因座上或某一特定基因之混合物之貢獻之變化。當測量基因之總體表現水平而不考慮組織或個體來源時，無法輕易檢測該等變化。如本文所述之妊娠相關病症在胎兒中並不以染色體異常為特徵，例如非整倍性。

本發明方法亦可在沒有先前關於胎盤之基因型分型資訊下進行。例如，妊娠婦女之基因型可藉由直接分析其血細胞之基因型而測出。然後，可分析血漿樣品之RNA轉錄本，分析方法係例如但不限於大量平行定序。可確定顯示兩種不同對偶基因之RNA轉錄本。在該組轉錄本中，若母親係同型接合，其將暗示胎兒係胎兒特異性對偶基因及母體對偶基因之異型接合。在該情形下，可在沒有先前關於胎兒(或胎盤)之基因型資訊下進行RNA對偶基因比率分析。此外，其中母體為異型接合而胎兒為同型接合之情形可藉由偏離1：1之比率而確定。該等技術之進一步細節係描述在美國專利案8,467,976中。

A.診斷方法

圖3中顯示根據一些實施例之診斷妊娠相關病症之方法300。該方法使用來自懷有胎兒之女性個體之樣品。該樣品可係母體血漿且含有源自母體及胎兒的RNA分子之混合物。該樣品可視需要得自處於妊娠期任何階段之女性個體。例如，具有單胎妊娠之頭-、中-及末三個月妊娠婦女可充當個體。頭-及中三個月妊娠婦女可歸為「妊娠早期病例」，且末三個月妊娠婦女可歸為「妊娠晚期病例」。在一些實施例中，樣品亦可在分娩胎兒後、或自分娩前後的同一個體收集，且來自非妊娠女性之樣品可充當對照。樣品可在分娩後的任何時間獲得(例如，24小時)。

樣品可得自周邊血液。母體血液樣品可視需要(例如)藉由離心加以處理，以自血漿分離出血細胞。可向血液樣品或其一部分添加穩定劑，且該樣品可在使用前保存。在一些實施例中，亦獲得胎兒組織樣品，例如絨毛膜絨毛、羊水或胎盤組織。如下文所述，胎兒組織可用於測定胎兒基因型。胎兒組織可在分娩之前或之後獲得。

獲得樣品後，便可自母體血細胞及血漿以及任何胎兒組織(諸如胎盤樣品)提取RNA或DNA。胎盤及血細胞RNA樣品可在準備定序文庫前經(諸如)Ribo-Zero Gold套組(Epicentre)預處理，以移除核糖體RNA(rRNA)。

在該方法之步驟301中，獲取複數個讀段。該等讀段係由分析得自樣品之RNA分子而獲得。在各種實施例中，該等讀段可藉由定序、數位PCR、RT-PCR及質譜法獲得。雖然該論述聚焦於定序，但該描述之態樣亦適用於其他用於獲得該等讀段之技術。例如，數位PCR(包括微流體及液滴式PCR)可利用針對各對偶基因之探針(包括引物)提供不同對偶基因之知識。該等探針可攜帶標記，以使其等區別於彼此，例如藉由呈現不同顏色。在相同實驗或不同實驗(例如，在獨立載玻片或芯片上)中，具有不同標記之探針可定向不同基因座。檢測到標記反映出進行擴增的RNA或cDNA分子之存在及/或數量，且對應於該等RNA或cDNA分子之讀段，其中該等讀段提供有關位於對應該等探針之基因座上之RNA或cDNA分子之序列資訊。關於「序列讀段」之描述同樣適用於經由任何適宜技術(包括非定序技術)所得讀段。

可視需要利用任何可用技術進行定序。核酸定序技術及方法之實例包括大量平行定序、次代定序、全基因組定序、外顯子組定序、進行或不進行目標富集之定序、合成定序(例如，擴增定序、選殖擴增定序、橋式擴增定序、可逆終止子定序)、接合定序、雜交定序(例如，微陣列定序)、單分子定序、實時定序、奈米孔定序、焦磷酸定序、半導體定序、質譜分析定序、霰彈槍定序及桑格(Sanger)定序。在一些實施例中，利用大量平行技術對自樣品中的RNA製備之cDNA文庫進行定序。可視需要(例如)利用mRNA-Seq樣品製備套組(Illumina)，按照製造商說明書(或略作修改)合成cDNA文庫。在一些實施例中，針對血漿cDNA之末端修復步驟使用經5-倍稀釋的Klenow DNA聚合酶。可使用QIAquick PCR純化套組及QIAquick MinElute套組(Qiagen)分別純化經末端修復及經腺苷酸化的產物。在一些實施例中，將經10倍稀釋的雙末端接頭用於血漿cDNA樣品，或利用AMPure XP珠粒(Agencourt)對經接頭接合的產物進行兩輪純化。cDNA文庫可在HiSeq 2000儀器(Illumina)上經定序得到呈雙末端格式的75bp或利用其他格式或儀器測出。

在步驟302中，識別該等讀段在參考序列中之位置。就基於PCR的技術而言，可藉由(例如)對探針或引物上之檢測標記之顏色與對該探針或引物具有特異性的序列進行匹配確定位置。就定序技術而言，可藉由比對序列讀段與參考序列來確定位置。序列比對可藉由電腦系統進行。可使用任何生物資訊管道進行原始數據預處理(諸如移除高度重複讀段及低品質讀段)、數據比對及/或數據標準化。母體血細胞、胎盤組織及母體血漿中之RNA轉錄本濃度可計算為片段數/千鹼基/百萬外顯子讀段(FPKM)。為測定對偶基因比率，可進行數據預處理及比對，但無需進行數據標準化。可使用任何參考序列(例如，hg19參考人類基因組)及任何算法進行比對。

在進行步驟301及302之一實例中，移除重複讀段及rRNA讀段後，就各非妊娠女性血漿樣品而言獲得平均3百萬個可分析讀段；就各妊娠婦女血漿樣品而言獲得平均12百萬個可分析讀段。就組織RNA-seq而言，對胎盤及血細胞分別獲得平均173百萬及41百萬個可分析讀段/樣品。將RNA-seq比對統計結果匯總於圖4及5中。亦檢查所有樣品中之經定序讀段之GC含量(圖6A及表2)。

在步驟303中，鑑別出一或多個資訊基因座。該步驟可測定或推斷出女性個體及胎兒在基因組內基因座處之基因型，並比較此等基因型。若某一基因座在第一實體中為相應第一對偶基因的同型接合(例如，AA)，而在第二實體中為相應第一對偶基因及相應第二對偶基因的異型接合(例如，AB)，則認為其具資訊。第一實體可係女性妊娠個體或胎兒，且第二實體係女性妊娠個體及胎兒中之另一者。換言之，就各資訊基因座而言，一個個體(母親或胎兒)係同型接合，且另一個體係異型接合。

資訊基因座可根據哪個個體係異型接合及某一對偶基因之唯一貢獻者作進一步分類。若胎兒係同型接合且女性妊娠個體係異型接合，則認為某一基因座係母體資訊基因座或相當於母體特異性基因座。若女性妊娠個體係同型接合且胎兒係異型接合，則認為某一基因座係胎兒資訊基因座或相當於胎兒特異性基因座。在步驟303中，所鑑別的資訊基因座全部係母體特異性或胎兒特異性，因為相同個體充當全部此等基因座之第二實體。

資訊基因座可代表單核苷酸多態性或「SNP」，其中第一對偶基因與第二對偶基因之單核苷酸之身份不同。資訊基因座亦可代表短插入或缺失，其中某一對偶基因與其他對偶基因相比時插入或缺失一或多個核苷酸。

在一些實施例中，女性妊娠個體在一或多個資訊基因座處或各資訊基因座處之基因型係藉由測定獲自母體組織之基因組DNA之序列而確定。母體組織可係母體血細胞任何其他類型的組織。在一些實施例中，胎兒在一或多個資訊基因座處或各資訊基因座處之基因型係藉由測定獲自胎兒組織(諸如胎盤、絨毛膜絨毛、羊水)之基因組DNA之序列而確定。若以較不具侵入性方法較佳，則胎兒DNA亦可得自母體血液樣品，以進行定序。用於獲得定序用RNA分子之相同樣品可係此胎兒DNA之來源，或可使用不同樣品。應瞭解，可在不直接分析胎兒基因型之情形下鑑別出胎兒資訊基因座。例如，若確定女性妊娠個體在某一基因座處之第一對偶基因係同型接合，且RNA定序表明在母體及胎兒RNA之混合物中存在第二對偶基因，則可認為胎兒在該基因座處係異型接合。

在一些實施例中，利用大量平行方法分析母體及胎兒兩者之基因型，以鑑別出資訊基因座。可對富外顯子組母體血細胞及胎盤基因組DNA樣品進行定序。可分別利用QIAamp DNA套組及QIAamp血液套組(二者均來自Qiagen)，按照製造商說明書自胎盤組織及母體血細胞提取基因組DNA。外顯子組富集及定序文庫製法可利用TruSeq外顯子組富集套組(Illumina)按照製造商之方法來進行。該等文庫可在 HiSeq 2000儀器(Illumina)上經定序得到呈PE格式之75bp。

在步驟304中，篩選出一或多個資訊基因座。如本文所使用，「篩選」意指從彼等步驟303中所鑑別出的資訊基因座中選出某些資訊基因座，以供進一步分析。「經篩選的」資訊基因座係如此選出的基因座。可基於一或多個標準進行選擇。一種此類標準係資訊基因座位於基因組中或參考序列上的位置。在一些實施例中，僅進一步分析位於參考序列之外顯子或表現區內之基因座。

另一篩選標準係所有彼等步驟301中所獲取並在步驟302中對齊參考序列的序列讀段中對齊基因座且含有各對偶基因之序列讀段之數量。在一些實施例中，經篩選的資訊基因座必須關聯至少第一預定數量的含有第一對偶基因之序列讀段及/或第二預定數量的含有第二對偶基因之序列讀段。該等預定數量可係1、2或更多，且可對應於所需讀取品質或定序深度。經過篩選，可鑑別一或多個經篩選的資訊基因座。

在一些實施例中，僅考慮篩選代表SNP之資訊基因座。在該方法之一實例中，檢查NCBI dbSNP Build 135數據庫中約一百萬個全部位於外顯子中之SNP，並利用母體及胎兒基因型從該等百萬個SNP中鑑別出資訊SNP。為了說明資訊SNP，指定「A」為共有對偶基因，並指定「B」為母體或胎兒特異性對偶基因。資訊SNP包括彼等在給定基因座上具有母體特異性SNP對偶基因之SNP(亦即在胎兒中為「AA」，且在母親中為「AB」)及彼等在給定基因座上具有胎兒特異性SNP對偶基因之SNP(亦即在母親中為「AA」，且在胎兒中為「AB」)。該等基因型係利用內部(in-house)生物資訊管道命名。為進行篩選，只有其中「A」對偶基因及「B」對偶基因均分別顯示至少一個讀段計數之資訊SNP才會用於分析。

在步驟305及306中，計算對齊各經篩選的資訊基因座之序列讀段之數量並依據其等所含對偶基因進行分選。就各經篩選的資訊基因座而言，確定兩個數量：第一數量，其係對齊該基因座且含有相應第一對偶基因(亦即，共有對偶基因)之序列讀段之數量；及第二數量，其係對齊該基因座且含有相應第二對偶基因(亦即，母體或胎兒特異性對偶基因)之序列讀段之數量。可視需要計算出第一數量及第二數量。各基因座之第一數量加上第二數量得到對齊該基因座之序列讀段之總數量。某一特定經篩選的資訊基因座之第一數量與第二數量之比率可稱為「對偶基因比率」。

在步驟307及308中，合計該等經篩選的資訊基因座之第一對偶基因及第二對偶基因之數量。在步驟307中，計算出第一數量之第一總和。該第一總和代表含有該等經篩選的資訊基因座之相應第一對偶基因(亦即，共有對偶基因)之序列讀段之總數量。在步驟308中，計算出第二數量之第二總和。該第二總和代表含有經篩選的資訊基因座之相應第二對偶基因(亦即，母體或胎兒特異性對偶基因)之序列讀段之總數量。可視情況利用步驟304中所鑑別的所有經篩選的資訊基因座或其子集計算該等總和。在一些實施例中，計算該等總和之加權值。例如，對某一染色體之基因座之總數之貢獻可藉由用彼等基因座之第一數量及第二數量乘以標量而放大或縮小。

在步驟309中，計算出第一總和與第二總和之比率。該比率代表針對經篩選的資訊基因座所累積的對應第一對偶基因及第二對偶基因之序列讀段之相對數量。在一些實施例中，該比率係簡單地根據第一總和除以第二總和來計算。此計算得到對應共有對偶基因之序列讀段之數量做為對應母體或胎兒特異性對偶基因之序列讀段之倍數。或者，該比率可根據第二總和除以第一總和與第二總和之總和來計算。此處，該比率提供對應母體或胎兒特異性對偶基因之序列讀段之數量做為所有序列讀段之分數。熟悉技藝人士將知曉計算該比率的其他方法。計算該比率之第一總和及第二總和可代表存在於樣品中之源自對應經篩選的資訊基因座之共有及特異性對偶基因之RNA(亦即，轉錄本)之量。

在步驟310中，將步驟309中所計算的比率與截止值進行比較，以判定胎兒、母親或妊娠期是否患有妊娠相關病症。在各種實施例中，截止值可自一或多個得自未患妊娠相關病症之女性妊娠個體(亦即，對照個體)之樣品測出及/或自一或多個得自患有妊娠相關病症之女性妊娠個體之樣品測出。在一些實施例中，該截止值係藉由對來自對照個體之樣品實施上述相同方法，並檢查相同或重疊組的經篩選的資訊基因座而測出。截止值可設置在介於妊娠期未患病症之預期值與妊娠期患有病症之預期值間之數值。該截止值可基於正常值之統計學差異。

在一些實施例中，針對女性妊娠個體所計算的比率(如步驟309中)使用某一組基因中之經篩選的資訊基因座，並利用一些或全部相同的基因中之經篩選的資訊基因座計算對照個體之比率(亦即截止值)。若針對女性妊娠個體所計算的比率係基於母體特異性對偶基因，則針對對照個體所計算的截止值亦可基於母體特異性對偶基因。類似地，該比率及截止值均可基於胎兒特異性對偶基因。

可視需要進行該比率與截止值之比較。例如，若該比率超過該截止值或低於該截止值任一數量或一定程度，則可診斷為某一病症。該比較可涉及到計算差值，或計算女性妊娠個體之比率與截止值間之另一比率。在一些實施例中，該比較涉及到針對某些基因評估共有及非共有對偶基因之相對表現水平在女性妊娠個體與對照個體間是否有顯著差異。

若需要，該方法亦可用於估算樣品中源於母體或胎兒之RNA部分。該估算係藉由用步驟309中所計算的比率乘以某一標量而進行。該標量代表異型接合個體中經篩選的資訊基因座相對於第二對偶基因之表現之總表現水平。

以下實例說明該標量之應用。若該方法中所計入的第二對偶基因具有胎兒特異性，則在步驟309中所計算的比率可提供對應胎兒特異性對偶基因之序列讀段之數量做為所有對應經篩選的資訊基因座之序列讀段之分數。在含有共有對偶基因之序列讀段中，一些係由母親貢獻，且一些係由胎兒貢獻。若已知或可估算胎兒中之胎兒特異性對偶基因與共有對偶基因之相對表現水平，則該比率可經縮放以獲得對所有對應經篩選的資訊基因座之序列讀段之胎兒貢獻分數之估算值。

在一些實施例中，胎兒及共有對偶基因係對稱地表現在多數基因座上，且假定標量係約二。在其他實施例中，該標量偏離二，並將不對稱基因表現考慮在內²⁴。對序列讀段之母體貢獻分數則係一減去胎兒貢獻分數。當位於經篩選的資訊基因座之第二對偶基因具有母體特異性時，可進行類似計算。

B.實例：1.對偶基因比率與血漿濃度之相關性

分析母體血漿樣品(孕齡37 2/7)之表現圖譜，並與妊娠婦女之相應胎盤及母體血細胞進行比較。利用Illumina HiSeq 2000儀器，對此等各樣品之RNA進行大量平行定序。利用外顯子組定序，藉由大量平行定序分析胎盤及母體血細胞之基因型。吾人檢查了NCBI dbSNP Build 135數據庫中約一百萬個位於外顯子中之SNP，並分選出其中母體為同型接合(基因型AA)，且胎兒為異型接合(基因型AB)的資訊SNP。因此，A對偶基因係母親及胎兒所共有的對偶基因，且B對偶基因具有胎兒特異性。

針對相對組織表現水平(胎盤/血細胞)，繪製母體血漿中之RNA-SNP對偶基因比率及不同RNA轉錄本之總血漿濃度之圖(圖7)。吾人可觀察到，血漿中之RNA-SNP對偶基因比率與相對組織表現水平具有良好相關性(Spearman R=0.9731679，P=1.126e-09)。然而，總血漿濃度與組織表現並無相關性(Spearman R=-0.7285714，P=0.002927)。

除分析胎兒表現以外，該方法亦可用於分析母體表現之概況分析。在該情形下，可使用母體為異型接合(基因型AB)且胎兒為同型接合(基因型AA)之資訊SNP。RNA-SNP對偶基因比率可根據母體特異性對偶基因計數除以共有對偶基因之計數來計算。在圖8中，針對相對組織表現水平(血細胞/胎盤)，繪製RNA-SNP對偶基因比率與含有資訊SNP之不同基因之總血漿濃度之圖。吾人可觀察到，組織表現水平與母體血漿中之RNA-SNP對偶基因比率呈良好正相關(Spearman R=0.9386，P<2.2e-16)，但不與總血漿轉錄本濃度呈良好正相關(Spearman R=0.0574，P=0.7431)。

將RNA轉錄本、其RNA-SNP對偶基因比率及其血漿濃度製成圖9及圖10中之表格。

2.比較子癇前症及對照妊娠病例之母體血漿RNA-SNP對偶基因比率

就兩個女性妊娠個體之病例而言，獲得平均117,901,334個原始片段(表3A)。比較末三個月遲發型子癇前症(PET)病例(5641)及其孕齡-相匹配的對照病例(7171)之帶有母體特異性SNP對偶基因之循環轉錄本之子集之RNA-SNP對偶基因比率。如圖11A中所示，此等轉錄本之RNA-SNP對偶基因比率在PET及對照病例中呈現出不同的型態。重要的是，RNA-SNP對偶基因比率型態不同於如圖11B中所示的血漿轉錄本濃度型態。此說明，母體血漿RNA-SNP對偶基因比率分析可用作另一種更好地區分PET病例與正常妊娠病例之度量標準。隨著資訊SNP之數量增加，資訊轉錄本之數量可進一步增加，其係由PET病例 (5641)及另一正常妊娠對照病例(9356)之比較例證(圖12A及12B)。將圖11及圖12中所示RNA-SNP對偶基因比率及RNA轉錄本之血漿濃度分別製成圖13及圖14中之表格。

III.測定胎兒及母體RNA貢獻之方法

A.方法

圖15中顯示方法1500，該方法係用於測定懷有胎兒的女性個體之樣品中源於胎兒的RNA部分。該樣品可如上文針對方法300所述般獲取及製備。

在步驟1501中，獲取複數個序列讀段。在步驟1502中，使該等序列讀段對齊參考序列。此等步驟可如上文針對步驟301及302所述般進行。

在步驟1503中，鑑別出一或多個母體資訊基因座。各母體資訊基因座在胎兒中為相應第一對偶基因的同型接合，且在女性妊娠個體中為相應第一對偶基因及相應第二對偶基因的異型接合。因此，第一對偶基因係母親及胎兒所共有，且第二對偶基因具有母體特異性。該等母體資訊基因座可如上文針對步驟303所述般鑑別。

在步驟1504中，如步驟304中一般篩選出母體資訊基因座，並鑑別出一或多個經篩選的母體資訊基因座。然後，在步驟1505-1511中，在個別經篩選的母體資訊基因座水平上操作序列讀段。在步驟1505及1506中，測定各經篩選的母體資訊基因座之第一數量及第二數量。在步驟1505中，第一數量係測定為對齊該基因座且含有相應第一對偶基因之序列讀段之數量。在步驟1506中，第二數量係測定為對齊該基因座且含有相應第二對偶基因之序列讀段之數量。步驟1505及1506可類似於上文所論述的步驟305及306一般進行。

在步驟1507中，計算各母體資訊基因座之第一數量及第二數量之總和。該總和可等於對齊該基因座之序列讀段之總數量。在步驟1508中，藉由第二數量除以該總和計算出母體比率。該母體比率提供所有對齊該特定基因座且含有第二(母體特異性)對偶基因之序列讀段之分數。

在步驟1509中，測定標量。該標量代表女性妊娠個體中經篩選的母體資訊基因座相對於相應第二對偶基因之表現之總表現水平。在一些實施例中，在已知或假定兩個對偶基因在女性妊娠個體中之表現為對稱的情況中，該標量係約二。在其他實施例中，該標量可偏離二，並將不對稱基因表現考慮在內。由於多數基因座係對稱地表現，故對稱假設係有效。

在步驟1510中，將母體比率乘以該標量以獲得母體貢獻。母體貢獻代表在經篩選的母體資訊基因座上由母體所貢獻之序列讀段之分數(或，引申開來，該樣品中RNA之分數)。一減去母體貢獻便得到胎兒貢獻，或由胎兒所貢獻之序列讀段之分數。在步驟1511中，計算經篩選的母體資訊基因座之胎兒貢獻。

在步驟1512中，測定該樣品中源於胎兒的RNA之部分。該部分係經篩選的母體資訊基因座之胎兒貢獻之平均值。在一些實施例中，(例如)藉由針對經篩選的母體資訊基因座所計算出之總和計算該平均值之加權值。藉由計算加權平均值，步驟1512中所測定之部分可反映出不同基因座或基因在該樣品中之相對表現水平。

可針對一個經篩選的母體資訊基因座、許多此等基因座或所有此等基因座(獲得其定序數據)計算該樣品中源於胎兒的RNA之部分。應瞭解，該部分反映了在獲取該樣品時特定女性妊娠個體中之循環轉錄體。若樣品係在妊娠期間的不同時間自個體獲得，則方法1500中所鑑別的該組經篩選的母體資訊基因座可隨著樣品不同而不同，此等基因座上測得的源於胎兒的RNA之部分亦會隨著樣品不同而不同。樣品中源於胎兒的RNA之部分亦可隨著個體不同而不同，即使在控制妊娠階段或其他因素時亦然，且可在患有妊娠相關病症之個體與健康個體間存在差異。因此，可拿該部分與截止值作比較，以診斷此病症。

在一些實施例中，該截止值係藉由利用來自一或多個健康個體之樣品實施方法1500而測得。在一些實施例中，若該部分超過該截止值或低於該截止值任一數量或一定程度，則可進行診斷。該比較可涉及到計算差異或計算女性妊娠個體中胎源性RNA部分與截止值之比率。在一些實施例中，該比較涉及到評估女性妊娠個體中胎源性RNA部分與在類似妊娠期間見於健康妊娠婦女之胎源性RNA部分是否存在顯著差異。

該樣品中源於胎兒的RNA部分亦可藉由檢查胎兒資訊基因座而測出。在各胎兒資訊基因座處，該部分可藉由首先計算胎兒比率而評估，胎兒比率係用含有第二(胎兒特異性)對偶基因之序列讀段之數量除以序列讀段之總數量。胎兒貢獻則係用該胎兒比率乘以代表兩個對偶基因在胎兒中之相對表現水平之標量。因此，方法1500之一變體可如下進行：藉由鑑別出胎兒資訊基因座，篩選此等基因座，計算各經篩選的基因座之胎兒貢獻，及求取經篩選基因座之胎兒貢獻之平均值。若需要，藉由方法1500所測定之胎源性RNA部分可藉由求取針對經篩選的母體資訊基因座所計算出的胎兒貢獻與針對經篩選的胎兒資訊基因座所計算出的胎兒貢獻之平均值而擴大。此處所計算的平均值可經加權，以反映序列讀段在不同基因座上之數量變化，進而給予母體或胎兒特異性基因座更大權重，或視需要進行其他處理。

B.實例

1.鑑別並估算母體血漿中胎源性及母源性轉錄本

首先基於基因分型數據鑑別資訊基因(定義為具有至少一個資訊SNP之基因)。在兩個妊娠早期病例中，分別可獲得總數量為6,714及6,753個的資訊基因來檢查胎兒及母體貢獻之相對比例(圖16及17)。在兩個妊娠晚期病例中，分別可獲得總數量為7,788及7,761個的資訊基因來檢查胎兒及母體貢獻之相對比例。為測量母體血漿中胎兒貢獻之相對比例，吾人在母體血漿樣品中分選出其中胎兒特異性對偶基因為至少一個RNA-seq讀段所覆蓋之RNA轉錄本。此等胎源性轉錄本之相對比例在妊娠早期及晚期期間分別為3.70%及11.28%。利用類似方法，循環中母體貢獻之相對比例(利用母體特異性SNP對偶基因檢查)在妊娠早期及晚期期間預計分別為76.90%及78.32%(圖18A)。

2.比較PET及對照妊娠病例之RNA-SNP的胎兒及母體貢獻分數

吾人已檢查GNAS轉錄本(在PET病例(5641)及其孕齡-相匹配的對照病例(7171)中均檢測到)的胎兒及母體貢獻分數。在GNAS轉錄本中，在病例5641中，在基因座rs7121上存在包含胎兒特異性SNP對偶基因之資訊SNP位點；在病例7171中，在相同的SNP位點上，存在母體特異性SNP對偶基因。在病例5641中，算得此SNP位點的胎兒及母體貢獻分數分別為0.09及0.91。另一方面，在病例7171中，相同SNP 位點的胎兒及母體貢獻分數分別為0.08及0.92(圖19)。與對照病例7171相比，此轉錄本中之胎兒貢獻分數增加12.5%，且母體貢獻分數下降1.09%。有趣的是，與7171相比，在病例5641中，檢測到此轉錄本之FPKM增加21%。

IV.指定基因組基因座為母體或胎兒標記之方法

A.方法

圖20中顯示指定基因組基因座為母體或胎兒標記之方法2000。該方法涉及分析來自懷有胎兒的女性個體之樣品。該樣品可係母體血漿，且含有母源性及胎源性RNA分子之混合物。該樣品可如上文針對方法300所述般獲得及製備。

在步驟2001中，獲取複數個序列讀段。在步驟2002中，使該等序列讀段對齊參考序列。此等步驟可如上文針對步驟301及302所述般進行。

在步驟2003中，鑑別出一或多個資訊基因座。各基因座在第一實體中為相應第一對偶基因的同型接合，且在第二實體中為該相應第一對偶基因及相應第二對偶基因的異型接合。該第一實體係女性妊娠個體或胎兒，且該第二實體係女性妊娠個體及胎兒中之另一者。該等資訊基因座可如上文針對步驟303所述般鑑別。

在步驟2004中，如同步驟304，篩選出該等資訊基因座，並鑑別出一或多個經篩選的資訊基因座。在一些實施例中，僅考慮篩選代表SNP之資訊基因座。在該方法之一實例中，經篩選的資訊基因座包括資訊SNP，其中在母體血漿中有至少一個序列讀段對應「A」對偶基因，且有一個序列讀段對應「B」對偶基因。

然後，在步驟2005-2008中，在個別經篩選的資訊基因座水平上操作序列讀段。在步驟2005及2006中，測定各經篩選的資訊基因座之第一數量及第二數量。在步驟2005中，第一數量係測定為對齊該基因座且含有相應第一對偶基因之序列讀段之數量。在步驟2006中，第二數量係測定為對齊該基因座且含有相應第二對偶基因之序列讀段之數量。步驟2005及2006可類似於上文所論述的步驟305及306般進行。

在步驟2007中，計算各資訊基因座之第一數量及第二數量之比率。該比率代表含有第一對偶基因及第二對偶基因之序列讀段(及，引申開來，樣品中之轉錄本)之相對豐度。在一些實施例中，該比率係簡單地根據第一數量除以第二數量來計算。此計算得到對應共有對偶基因之序列讀段之數量做為對應母體或胎兒特異性對偶基因之序列讀段之倍數。該比率或其倒數可視為對偶基因比率，且就SNP基因座而言，可視為RNA-SNP對偶基因比率。

在一些實施例中，就包含母體特異性SNP對偶基因之資訊SNP而言，各SNP之RNA-SNP對偶基因比率可根據母體特異性對偶基因：共有對偶基因來計算。另一方面，就包含胎兒特異性SNP對偶基因之資訊SNP而言，RNA-SNP對偶基因比率可根據胎兒特異性對偶基因：共有對偶基因來計算。不同於基因表現分析(其中數據標準化係必要)，RNA-SNP對偶基因比率分析不需要數據標準化，且引入較少偏差。就含有多於一個資訊SNP之轉錄本而言，可計算各資訊SNP位點之RNA-SNP對偶基因比率，並計算出每個轉錄本之平均RNA-SNP對偶基因比率。

在步驟2007中，該比率或可如下計算，用第二數量除以第一數量與第二數量之總和。此處，該比率提供對應母體或胎兒特異性對偶基因之序列讀段之數量做為該基因座上所有序列讀段之分數。就「A」及「B」對偶基因而言，該比率可表示如下：B-對偶基因比率=B-對偶基因計數/(A-對偶基因計數+B-對偶基因計數)

理論上，就單獨由胎兒或母親貢獻之血漿轉錄本而言，假設沒有對偶基因特異性表現，B-對偶基因比率應為0.5。熟悉技藝人士將知曉計算該比率之其他方法。

在步驟2008中，當該比率超過截止值時，則指定經篩選的資訊基因座為標記。在一些實施例中，該截止值係約0.2至約0.5。在一些實施例中，該截止值係0.4。在該方法之一實例中，就具有高胎兒或母體貢獻之RNA轉錄本而言，將B-對偶基因比率的截止值界定為0.4。該截止值將RNA-seq讀段之泊松(Poisson)分佈及隨機取樣考慮在內。在一些實施例中，當該比率超過該截止值時，則認為「B」對偶基因之貢獻很高。

特定資訊基因座上之高對偶基因比率可指示：(i)第二或「B」對偶基因在異型接合個體中之表現高於「A」對偶基因(亦即，該對偶基因係不對稱表現)，(ii)母體血漿中所有對齊該基因座之RNA之較大份額係由異型接合個體貢獻，或(i)及(ii)二者。若與該資訊基因座有關的基因呈現病理學過度表現，則高對偶基因比率亦可指示妊娠相關病症。因此，該方法之一些實施例亦包括基於經篩選的資訊基因座是否指定為第二實體(亦即，異型接合個體)之標記來診斷妊娠相關病症。在作出此診斷時，用於與對偶基因比率比較之截止值可基於得自健康妊娠個體之血漿樣品中之轉錄本濃度。

在一些實施例中，方法2000亦可用於估算樣品中位於特定經篩選的資訊基因座上且源於母體或胎兒之RNA部分。該估算係藉由用在步驟2007中所計算的比率乘以某一標量而進行。該標量代表異型接合個體中該基因座相對於第二對偶基因之表現之總表現水平。

舉例而言，若該方法中所計入的第二(「B」)對偶基因具有胎兒特異性，則如上文計算之B-對偶基因比率代表對應該對偶基因之序列讀段之數量做為所有對應經篩選的資訊基因座之序列讀段之分數。在含有共有(「A」)對偶基因之序列讀段中，一些係由母親貢獻，且一些係由胎兒貢獻。若已知或可估算胎兒中之胎兒特異性與共有對偶基因之相對表現水平，則該B-對偶基因比率可經縮放以獲得所有對應該基因座之序列讀段之胎兒貢獻分數之估算值。若「A」及「B」對偶基因在胎兒中係平等表現，則該標量係約二。在該基因座上，序列讀段之母體貢獻分數則係一減去胎兒貢獻分數。當該經篩選的資訊基因座上之「B」對偶基因具有母體特異性時可進行類似計算。

B.實例：高胎兒及母體貢獻

利用如上所述0.4之B-對偶基因截止值，發現在妊娠早期(亦即頭三個月及中三個月)期間，有0.91%之循環轉錄本顯示高胎兒貢獻。該百分比在妊娠晚期(亦即末三個月)期間增加至2.52%。另一方面，在妊娠早期及晚期期間，分別有42.58%及50.98%顯示高母親貢獻(圖16、17及18A)。

V.基因於診斷妊娠相關病症之用途

A.妊娠相關基因

亦提供一種鑑別妊娠相關基因之方法。該方法包括獲取複數個第一序列讀段及複數個第二序列讀段。該等第一序列讀段係由測定自妊娠婦女之血漿樣品獲得之RNA分子之序列所產生。該等第二序列讀段係由測定自非妊娠婦女之血漿樣品獲得之RNA分子之序列所產生。使該等第一序列讀段及該等第二序列讀段與參考序列進行比對，並指定一組候選基因。

根據該方法，然後使用序列讀段來測定各候選基因在來自妊娠婦女及非妊娠婦女之樣品中之表現水平。具體言之，就各候選基因而言，使用第一序列讀段測定對應候選基因之轉錄本之第一數量；及使用第二序列讀段測定對應候選基因之轉錄本之第二數量。轉錄本之第一數量及轉錄本之第二數量可經標準化。然後計算候選基因之轉錄本比率，其中該轉錄本比率包括轉錄本之第一數量除以轉錄本之第二數量。然後將該轉錄本比率與截止值比較。若該轉錄本比率超過該截止值，則將該候選基因確定為妊娠相關基因。

在該方法之一些實施例中，轉錄本之第一數量之標準化相當於按照第一序列讀段之總數量縮放轉錄本之第一數量。類似地，轉錄本之第二數量之標準化相當於按照第二序列讀段之總數量縮放轉錄本之第二數量。在其他實施例中，各候選基因之轉錄本之第一數量之標準化相當於按照所有候選基因之第一轉錄本之總數量縮放該候選基因之轉錄本之第一數量。各候選基因之轉錄本之第二數量之標準化相當於按照所有候選基因之第二轉錄本之總數量縮放該候選基因之轉錄本之第二數量。

若在其他所有條件均相同的情形下，與非妊娠婦女相比，基因在妊娠婦女中之表現水平更高，則該方法一般鑑定該等基因為妊娠相關。妊娠及非妊娠婦女可係相同個體，亦即，得自個體分娩前後的樣品可分別作為第一序列讀段及第二序列讀段之來源。

吾人已顯示，帶有胎兒特異性對偶基因之循環RNA轉錄本之子集在分娩後完全從母體血漿中消失(圖18B)。此等轉錄本在母體血漿中被認為具有胎兒特異性。另一方面，分娩後亦無法檢測到一部分母體特異性對偶基因。因此，吾人探究了在妊娠期間顯示向上調節之基因(稱為妊娠相關基因)，方法係藉由直接比較其等在分娩前後的母體血漿中之呈現。吾人將妊娠相關基因定義為彼等在末三個月妊娠婦女之分娩前血漿中檢測得到，且其產後血漿濃度在兩種情形下均下降2倍之基因。藉由利用生物資訊學算法進行數據標準化及差異基因表現分析，吾人編制了131種妊娠相關基因的一覽表(圖21)。據先前報導，在此等基因中，有15個基因在母體血漿中具有妊娠特異性^{1,2,4,5,9,10,12}。利用一步法實時RT-PCR，吾人另外已驗證，最新鑑別的五個轉錄本與妊娠有關，其等大量存在於分娩前的母體血漿中，亦即STAT1、GBP1 及HSD17B1大量存在於10種來自末三個月妊娠婦女之額外血漿樣品中，及KRT18及GADD45G大量存在於10種來自另一組末三個月妊娠婦女之血漿樣品中(圖22)。

為評估此等131種基因與妊娠之相關性，對所有的血漿樣品進行層次聚類。觀察到來自妊娠婦女(亦即妊娠早期及晚期)及彼等並不處於妊娠期的婦女(亦即非妊娠對照及分娩后)之血漿樣品間發生明顯分離(圖23)。

有趣的是，當比較此等131種基因在兩個妊娠晚期病例之血漿樣品與其相應胎盤及母體血細胞之間之表現模式時，觀察到胎盤與分娩前血漿樣品間及母體血細胞與產後血漿樣品間存在較密切相似性(圖24A)。此觀察結果支持以下論點：多數妊娠相關基因優先在胎盤中而不是母體血細胞中表現。此外，此等妊娠相關轉錄本在胎盤及母體血漿中之表現水平呈正相關(P<0.05，斯皮爾曼(Spearman)相關)(圖24B)。

B.在胎盤與母體血液中之差異基因表現

雖然吾人可經由直接檢查分娩前後的母體血漿樣品編錄一組妊娠相關基因，但吾人亦出於比較目的採集了胎盤及血細胞RNA-seq數據。假定妊娠相關基因應係彼等在胎盤中高水平表現且在母體血細胞中低水平表現之基因(如之前所報導)^10,15，吾人任意設定20倍差異作為最小截止值來進行基於組織的分析。該基於組織的分析總共得到798個潛在候選基因，其中計算了母體血漿中胎兒及母體貢獻之比例。當與全轉錄體(圖18A)相比時，鑑別出相對高比例的主要由胎兒貢獻的基因(圖25)。然而，基於血漿的策略勝過基於組織的策略，在於其可鑑別出更高比例的主要由胎兒貢獻之基因(圖25)。

C.與疾病或病症相關之基因

本文亦提供一種鑑別與妊娠相關病症相關的基因之方法。該方法包括獲取複數個第一序列讀段及複數個第二序列讀段。該等第一序列讀段係由測定自健康妊娠婦女之血漿樣品獲得之RNA分子之序列所產生。該等第二序列讀段係由測定自罹患妊娠相關病症或懷有罹患妊娠相關病症之胎兒之妊娠婦女之血漿樣品獲得之RNA分子之序列所產生。使該等第一序列讀段及該等第二序列讀段與參考序列進行比對，並指定一組候選基因。

根據該方法，然後使用序列讀段來測定各候選基因在來自兩種妊娠婦女之樣品中之表現水平。具體言之，就各候選基因而言，使用第一序列讀段測定對應候選基因之轉錄本之第一數量；及使用第二序列讀段測定對應候選基因之轉錄本之第二數量。轉錄本之第一數量及轉錄本之第二數量可經標準化。然後計算候選基因之轉錄本比率，其中該轉錄本比率包括轉錄本之第一數量除以轉錄本之第二數量。然後將該轉錄本比率與參考值比較。若該轉錄本比率偏離該參考值，則確定該候選基因與病症相關。

根據該鑑別與妊娠相關病症相關的基因之方法，在一些實施例中，該參考值為1。在一些實施例中，當轉錄本比率與該參考值之比率超過或低於截止值時，該轉錄本比率偏離該參考值。在一些實施例中，當轉錄本比率與參考值之差異超過截止值時，該轉錄本比率偏離該參考值。

若在其他所有條件均相同的情形下，基因在展示與不展示妊娠相關病症之妊娠婦女中之表現水平具有顯著差異，則該方法一般鑑定該基因與該妊娠相關病症有關。

先前已藉由使用與疾病有關的母體血漿RNA達成胚胎病症及妊娠病理之診斷及監測。例如，已顯示，促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)mRNA之母體血漿水平可用於非侵入性檢測及預測子癇前症^2,3。已證實母體血漿中之介白素1受體樣1(IL1RL1)mRNA之檢測可用於鑑別自然早產婦女⁸。亦已針對非侵入性評估胎兒生長及宮內生長受限研究了一組生長相關母體血漿RNA標記⁴。在本研究中，吾人推論，新穎的疾病相關的循環RNA標記可藉由直接比較正常妊娠婦女與患有妊娠併發症(諸如子癇前症、宮內生長受限、早產及胎兒染色體異常)的婦女之母體血漿轉錄體而鑑別。為證實該方法之可行性，吾人對得自三個出現子癇前症的妊娠婦女及七個孕期匹配的無併發症妊娠婦女之母體血漿樣品進行RNA-Seq。吾人鑑別出在子癇前症妊娠婦女之血漿中顯著提升之98個轉錄本(圖26)。最新鑑別的子癇前症相關轉錄本可潛在地用於預測、預示及監測該疾病。

該技術亦可用於預測及監測早產。該技術亦可用於預測即將到來的胎兒死亡。該技術亦可用於檢測基因突變所引起之疾病，只要相關基因轉錄於胎兒或胎盤組織中，且轉錄本可在母體血漿中檢測到即可。

血漿RNA-Seq可應用於其他臨床情境中。例如，本研究中所開發的血漿RNA-Seq方法將可潛在地用於研究其中已報導異常血漿RNA濃度的其他病理狀態(諸如癌症)^13,14。例如，藉由比較癌症患者在接受治療前後的之血漿轉錄體，可鑑別出用於非侵入性診斷應用之腫瘤相關的循環RNA標記。

VI.特異性基因之對偶基因表現模式

已採用RNA定序來檢查對偶基因表現模式²⁵。吾人假定，當RNA轉錄本自組織釋放至循環中時，給定基因之對偶基因表現模式將得以保留，因而可在血漿中檢測到。在本研究中，吾人已檢查兩種RNA轉錄本(亦即PAPPA(一種妊娠-特異性基因)及H19(一種母體所表現的印記基因)之對偶基因計數^26,27。

就PAPPA基因而言，吾人分析了SNP，rs386088，其含有胎兒特異性SNP對偶基因(圖27)。分娩後的血漿樣品中不存在PAPPA RNA-seq讀段表明其確實具有妊娠特異性⁴。值得注意的是，胎兒對偶基因讀取計數之比例在分娩前的母體血漿與胎盤RNA樣品間並無統計學顯著差異(P=0.320，χ²檢驗)，此表明，母體血漿數據反映了PAPPA在胎盤中之雙對偶基因表現模式。

吾人最近已報導，母體所表現的H19印記基因在胎盤及母體血細胞中之DNA甲基化模式可藉由對母體血漿DNA進行亞硫酸氫鹽DNA定序而檢測到²⁸。此處，吾人另外已檢查是否可在RNA水平上探究H19基因之基因組印記狀態。吾人首先聚焦於H19基因之外顯子1之SNP位點，rs2839698，其含有母體特異性對偶基因，亦即在胎兒中為AA，且在母親中為AG。如圖28中所示，在分娩後的母體血漿中僅檢測到G-對偶基因(圖28)。此單對偶基因模式符合其與印記對照區中rs4930098 SNP位點上之未甲基化的G-對偶基因之連鎖(圖29)。在分娩前的母體血漿中，當存在G-對偶基因時，亦檢測到由胎盤所貢獻之A-對偶基因(圖28)。在三個其他SNP位點(亦即rs2839701、rs2839702及rs3741219，其等帶有母體特異性對偶基因)中，發現存在類似的對偶基因模式，亦即在分娩前的母體血漿中為雙對偶基因，且在分娩後的母體血漿中為單對偶基因(圖28)。或許是此等SNP位點上之母體特異性對偶基因係呈相同的母體單倍型，其未被甲基化，且因而被轉錄。尤其，H19 RNA未表現於母體血細胞中(圖28)，此暗示血漿中之H19 RNA分子係源自母體組織/器官，而非血細胞。已被報導顯示H19表現之非胎盤及非胎兒組織包括腎上腺、骨骼肌、子宮、脂肪細胞、肝臟及胰腺²⁹。

VII.討論

在本研究中，吾人旨在開發一種利用RNA-seq提供母體血漿中之轉錄組活動之總體觀念之技術。之前，吾人已顯示，母體血漿中之部分胎兒DNA可藉由標的一個或若干個胎兒特異性基因座而計算，因為全部的胎兒基因組係均勻地出現在母體血漿³⁰。不同於循環DNA，母體血漿中之胎源性RNA轉錄本之比例之測量較不直接，因為其由於基因在胎兒及母體組織中之差異表現及或許會釋放於循環中而複雜化。藉由對母體血漿進行RNA-seq及檢查胎兒與母親間之多態性差異，吾人可估算由胎兒所貢獻之血漿轉錄本之比例。雖然母源性轉錄本在血漿轉錄體中佔主要地位，但可預期，在妊娠早期及晚期期間，母體血漿中分別有3.70%及11.28%之循環轉錄本係源自胎兒。此等胎源性轉錄本包括由胎兒及母體共同貢獻之RNA分子及彼等單獨由胎兒所貢獻之RNA分子。吾人發現，在妊娠早期及晚期期間，後者分別佔母體循環轉錄本之0.90%及2.52%。此等胎兒特異性基因在妊娠晚期期間之較高表現度可能與胎兒及胎盤之尺寸隨著妊娠進行而增加有關係。

在本研究中，吾人已證實，可觀察到妊娠特異性PAPPA基因在胎盤中之平衡RNA對偶基因表現，且可觀察到母體所表現的H19印記基因在母體血漿中之單對偶基因表現。此等數據暗示，母體血漿可用作研究對偶基因表現模式之非侵入性樣品來源。

藉由定量比較分娩前後的母體血漿樣品中之RNA轉錄本，吾人編制了131種在妊娠期間向上調節之基因(此係由其等在產後血漿樣品中之表現度減少所佐證)之清單。正如預期的，此等基因之概況可用於區分妊娠婦女與非妊娠婦女之血漿樣品。分娩前後的母體血漿樣品的該種直接比較容許吾人以高通量方式挑選出妊娠相關基因，該等基因在胎盤中之表現水平可不必如先前研究所證實的一樣要遠高於母體血細胞^10,15。本質上，該直接檢查血漿的方法提供另一種發現循環的妊娠相關RNA轉錄本之途徑，而無需事先瞭解胎盤組織及血細胞之轉錄體概況。

雖然吾人已顯示RNA-seq係一種分析血漿轉錄體概況之可行方法，但可進一步改善若干技術問題。第一，可藉由進一步優化定序方案而提高血漿RNA-seq之資訊產量，特定言之係耗盡來自血漿之高度轉錄的rRNA及血球蛋白基因。第二，吾人僅聚焦於參考轉錄本，且尚未探究個別同功異型物。未來的研究可包括藉由增加定序閱讀深度檢測新穎轉錄本及差異化分析剪接變異體及其同功異型物^31-33。第三，吾人在分析妊娠早期樣品之胎源性及母源性轉錄本之比例時已略去ASE-篩選，因為絨毛膜絨毛及羊水在進行基因分型分析時已耗盡。然而，吾人在妊娠晚期中已顯示，ASE-篩選對鑑別母體血漿中主要由胎兒及母體貢獻的基因並無顯著影響(圖16及17)。

總之，吾人已證實，RNA-seq技術可用於測量胎源性轉錄本之比例及鑑別母體血漿中之循環的妊娠相關基因。該研究已為更好的理解母體血漿之轉錄體全景鋪平道路，因此促進妊娠相關疾病中涉及之生物標記候選物之鑑別。吾人預計，該技術將為妊娠或胎盤相關疾病及其他疾病(諸如癌症)之分子診斷帶來新的途徑³⁴。

VIII.移植

如上所述，本文所述方法亦可用於移植。用於移植的方法可以針對胎兒分析之類似方式進行。例如，可獲得移植組織之基因型。實施例可鑑別出其中移植組織係異型接合及其中宿主生物體(例如，男性或女性)係同型接合之基因座。此外，實施例可鑑別出其中移植組織係同型接合及其中宿主生物體(例如，男性或女性)係異型接合之基因座。可計算相同比率，並與截止值相比較，以確定是否存在病症。

IX.電腦系統

本文所提及的任何電腦系統均可使用任何適宜數量的子系統。此等子系統之實例係顯示於圖30中的電腦裝置3000中。在一些實施例中，電腦系統包括單一電腦裝置，其中該等子系統可為該電腦裝置之組件。在其他實施例中，電腦系統可包括多個具有內部組件之電腦裝置，各者為一子系統。

圖30中所示子系統係經由系統匯流排3075相互連接。顯示額外的子系統，諸如印表機3074、鍵盤3078、存儲設備3079、耦合至顯示適配器3082之監視器3076及其他子系統。耦合至I/O控制器3071之週邊設備及輸入/輸出(I/O)設備可藉助任何數量此項技術中已知的構件(諸如串列埠3077)連接至該電腦系統。例如，串列埠3077或外部界面3081(例如乙太網路、Wi-Fi等)可用於將電腦系統3000連接至廣域網路，諸如網際網路、滑鼠輸入設備或掃描器。經由系統匯流排3075之相互連接容許中央處理器3073與各子系統通訊，並控制來自系統記憶體3072或存儲設備3079(例如，固定磁碟，諸如硬磁碟機或光碟)之指令之執行及子系統間之資訊交換。系統記憶體3072及/或存儲設備3079可包括電腦可讀取媒體。本文所述任何數據可自一組件輸出至另一組件，且可輸出至使用者。

電腦系統可包括複數個(例如)藉由外部界面3081或內部界面連接在一起之相同組件或子系統。在一些實施例中，電腦系統、子系統或裝置可經由網路通訊。在此等情形下，一臺電腦可視為用戶端，且另一臺電腦視為伺服器，其中各者可作為相同電腦系統之一部分。用戶端及伺服器各可包括多個系統、子系統或組件。

應瞭解，本發明之任何實施例均可以控制邏輯形式利用硬體(例如特殊應用積體電路或場可程式化閘陣列)及/或以模塊化或積體方式利用具有一般可程式化處理器之電腦軟體來實施。如本文中所使用，處理器在同一積體芯片上包括多核處理器，或在單一電路板或網路上包括多個處理單元。基於本文所提供的揭示內容及教示，一般技術者將知曉並瞭解利用硬體以及硬體及軟體之組合實施本發明實施例之其他方式及/或方法。

本申請案中所述任何軟體組件或函數均可根據使用任何適宜電腦語言(諸如，例如，利用(例如)習知或面向對象的技術之Java、C++或Perl)之由處理器執行之軟體代碼來實施。軟體代碼可以一系列指令或命令的形式儲存在用於儲存及/或傳輸之電腦可讀取媒體上，適宜的媒體包括隨機存取記憶體(RAM)、唯讀記憶體(ROM)、磁性媒體(諸如硬磁碟機或軟碟)或光學媒體(諸如壓縮光碟(CD)或DVD(數位多功能光碟))、快閃記憶體及其類似物。電腦可讀取媒體可為該等儲存或傳輸設備之任何組合。

此等程式亦可利用適合經由有線、光學及/或無線網路傳輸之載波信號來編碼及傳輸，該等網路遵循包括網際網路在內的多種協定。因而，根據本發明之一實施例的電腦可讀取媒體可使用以該等程式編碼之資料信號產生。用程式代碼編碼之電腦可讀取媒體可與相容設備一起封裝或由其他設備(例如經由網際網路下載)單獨提供。任何該種電腦可讀取媒體可位於單個電腦產品(例如硬磁碟機、CD或整個電腦系統)之上或之中，且可存在於一系統或網路內不同電腦產品之上或之中。電腦系統可包括監視器、印表機或其他適合向使用者提供本文所提及之任何結果之顯示器。

本文所述任何方法均可完全或部分利用包括一或多個處理器之電腦系統進行，該電腦系統可經組態以執行該等步驟。因此，實施例可係關於經組態以執行本文所述任何方法之步驟之電腦系統，其可能具有執行各自步驟或各自步驟組之不同組件。儘管以編號的步驟呈現，但本文方法之步驟可同時或以不同次序進行。另外，此等步驟之部分可與其他方法之其他步驟之部分一起使用。同樣，步驟之全部或部分可視情況選用。另外，任何方法之任何步驟可利用執行此等步驟之模組、電路或其他構件來執行。

特定實施例之具體細節可以任何適宜方式組合，而不會脫離本發明實施例之精髓及範疇。然而，本發明之其他實施例可係關於涉及各個別態樣或此等個別態樣之具體組合之具體實施例。

已出於說明及描述之目的呈現本發明示例性實施例之上述描述。其並非完全詳盡或無意將本發明限制於所述之明確形式，且根據上述教示，可進行多種修改及變化。該等實施例係經選擇及描述以最佳地闡明本發明之原理及其實際應用，從而使其他熟習此項技術者能夠在各種實施例中且在作出適於預期特定用途之各種修改下最佳地利用本發明。

除非明確有相反指示，否則引用的「一」、「一個」或「該」意欲指「一或多個」。

文中所提及的所有專利案、專利申請案、公開案及說明係出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。不承認任何一者係先前技術。

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Claims

一種利用來自懷有胎兒之女性個體之樣品診斷妊娠相關病症之方法，其中該妊娠相關病症係以基因在母體及胎兒組織中之反常相對表現水平為特徵之病症，該方法包括：獲取複數個序列讀段，其中該等序列讀段係自分析得自該樣品之RNA分子獲得，該樣品含有母源性及胎源性RNA分子之混合物；藉由電腦系統識別該等序列讀段在參考序列中之位置；鑑別出一或多個資訊基因座，其中該一或多個資訊基因座之各資訊基因座在第一實體中為相應第一對偶基因的同型接合，且其在第二實體中為該相應第一對偶基因及相應第二對偶基因的異型接合，其中該第一實體係女性妊娠個體或胎兒，且該第二實體係該女性妊娠個體及該胎兒中之另一者；篩選出該一或多個資訊基因座，以鑑別一或多個經篩選的資訊基因座：其等係位於該參考序列之表現區內，在該等複數個含有該相應第一對偶基因之序列讀段中至少有第一預定數量的序列讀段係位於該等基因座上，且在該等複數個含有該相應第二對偶基因之序列讀段中至少有第二預定數量的序列讀段係位於該等基因座上，就該等經篩選的資訊基因座各者而言：測定位於該經篩選的資訊基因座上且含有該相應第一對偶基因之序列讀段之第一數量，且測定位於該經篩選的資訊基因座上且含有該相應第二對偶基因之序列讀段之第二數量，計算該等第一數量之第一總和及該等第二數量之第二總和；計算該第一總和及該第二總和之比率，及將該比率與截止值比較，以確定該胎兒、母親或妊娠期是否罹患妊娠相關病症，該截止值係由一或多個自未患妊娠相關病症之女性妊娠個體獲得之樣品測出。
如請求項1之方法，其中該妊娠婦女之樣品係血漿樣品。
如請求項1之方法，其中該第二實體係該女性妊娠個體。
如請求項1之方法，其中該第二實體係該胎兒。
如請求項1之方法，其中計算該第一總和及該第二總和之比率包括用該第二總和除以該第一總和與該第二總和之總和。
如請求項1之方法，其中自該樣品獲得之RNA分子之分析包括測定該等RNA分子或其cDNA複本之序列。
如請求項1之方法，其中自該樣品獲得之RNA分子之分析包括進行數位PCR。
如請求項1之方法，其中識別該等序列讀段在參考序列中之位置包括使該等序列讀段對齊該參考序列。
如請求項1之方法，其中序列讀段之第一預定數量為1，且其中序列讀段之第二預定數量為1。
如請求項1之方法，其另外包括測定自母體組織獲得之基因組DNA之序列，以測定該女性妊娠個體在各資訊基因座上之基因型。
如請求項1之方法，其另外包括測定自胎盤、絨毛膜絨毛、羊水或母體血漿獲得之基因組DNA之序列，以確定該胎兒在各資訊基因座上之基因型。
如請求項1之方法，其另外包括估算該樣品中源於母體或胎兒的RNA之部分，其中該部分係用該比率乘以某一標量，該標量代表第二實體中經篩選的資訊基因座相對於第二對偶基因之表現之總表現水平。
一種測定得自懷有胎兒的女性個體的樣品中源於胎兒之RNA之部分之方法，該方法包括：獲取複數個序列讀段，其中該等序列讀段係自分析得自該樣品之RNA分子獲得，該樣品含有母源性及胎源性RNA分子之混合物；藉由電腦系統識別該等序列讀段在參考序列中之位置；鑑別出一或多個母體資訊基因座，其中各者在胎兒中為相應第一對偶基因的同型接合，且其在女性妊娠個體中為該相應第一對偶基因及相應第二對偶基因的異型接合；篩選出一或多個母體資訊基因座，以鑑別一或多個經篩選的母體資訊基因座：其等係位於該參考序列之表現區內，在該等複數個含有該相應第一對偶基因之序列讀段中至少有第一預定數量的序列讀段係位於該等基因座上，且在該等複數個含有該相應第二對偶基因之序列讀段中至少有第二預定數量的序列讀段係位於該等基因座上，就該等經篩選的母體資訊基因座各者而言：測定位於該經篩選的母體資訊基因座上且含有該相應第一對偶基因之序列讀段之第一數量，測定位於該經篩選的母體資訊基因座上且含有該相應第二對偶基因之序列讀段之第二數量，計算該第一數量與該第二數量之總和，用該第二數量除以該總和計算母體比率，測定表示該經篩選的母體資訊基因座上之總表現相對於該女性妊娠個體中之該相應第二對偶基因之表現之標量，用該母體比率乘以該標量得到母體貢獻，用一減去該母體貢獻計算胎兒貢獻，及測定該樣品中源於胎兒之RNA之部分，其中該部分係該等經篩選的母體資訊基因座之胎兒貢獻之平均值。
如請求項13之方法，其中該平均值係藉由該等經篩選的母體資訊基因座之總和來加權化。
如請求項13之方法，其中就經篩選的母體資訊基因座而言，假定該標量係2。
如請求項13之方法，其中該妊娠婦女之樣品係血漿樣品。
如請求項13之方法，其中自該樣品獲得之RNA分子之分析包括測定該等RNA分子或其cDNA複本之序列。
如請求項13之方法，其中自該樣品獲得之RNA分子之分析包括進行數位PCR。
如請求項13之方法，其中識別該等序列讀段在參考序列中之位置包括使該等序列讀段對齊該參考序列。
如請求項13之方法，其中對應該等一或多個經篩選的母體資訊基因座之序列讀段之第一預定數量係1，且其中對應該等一或多個經篩選的母體資訊基因座之序列讀段之第二預定數量係1。
如請求項13之方法，其另外包括測定得自母體組織之基因組DNA之序列，以測定該女性妊娠個體在各母體資訊基因座上之基因型。
如請求項13之方法，其另外包括測定得自胎盤、絨毛膜絨毛、羊水或母體血漿之基因組DNA之序列，以確定該胎兒在各母體資訊基因座上之基因型。
如請求項13之方法，其另外包括：鑑別一或多個胎兒資訊基因座，其中各者在該女性妊娠個體中為相應第一對偶基因的同型接合，且其在胎兒中為該相應第一對偶基因及相應第二對偶基因的異型接合；篩選出一或多個胎兒資訊基因座，以鑑別一或多個經篩選的胎兒資訊基因座：其等係位於該參考序列之表現區內，在該等複數個含有該相應第一對偶基因之序列讀段中至少有第一預定數量的序列讀段係位於該等基因座上，且在該等複數個含有該相應第二對偶基因之序列讀段中至少有第二預定數量的序列讀段係位於該等基因座上，就該等經篩選的胎兒資訊基因座各者而言：測定位於該經篩選的胎兒資訊基因座上且含有該相應第一對偶基因之序列讀段之第一數量，測定位於該經篩選的胎兒資訊基因座上且含有該相應第二對偶基因之序列讀段之第二數量，計算該第一數量與該第二數量之總和，用該第二數量除以該總和計算出胎兒比率，測定表示該經篩選的胎兒資訊基因座上之總表現相對於該胎兒中之該相應第二對偶基因之表現之標量；用該胎兒比率乘以該標量得到胎兒貢獻，及測定該樣品中源於胎兒之RNA之部分，其中該部分係該等經篩選的母體資訊基因座及該等經篩選的胎兒資訊基因座之胎兒貢獻之平均值。
如請求項23之方法，其中該平均值係藉由該等經篩選的母體資訊基因座及該等經篩選的胎兒資訊基因座之總和來加權化。
如請求項23之方法，其中就經篩選的胎兒資訊基因座而言，假定該標量係2。
如請求項23之方法，其中對應該等一或多個經篩選的胎兒資訊基因座之序列讀段之第一預定數量係1，且其中對應該等一或多個經篩選的胎兒資訊基因座之序列讀段之第二預定數量係1。
如請求項23之方法，其另外包括測定得自母體組織之基因組DNA之序列，以測定該女性妊娠個體在各胎兒資訊基因座上之基因型。
如請求項23之方法，其另外包括測定得自胎盤、絨毛膜絨毛、羊水或母體血漿之基因組DNA之序列，以確定該胎兒在各胎兒資訊基因座上之基因型。
如請求項13或23之方法，其另外包括藉由比較該樣品中源於胎兒的RNA部分與截止值診斷妊娠相關病症，該截止值係自一或多個得自未患該妊娠相關病症之妊娠女性個體之樣品測出。
如請求項29之方法，其中該截止值亦係自一或多個得自患有該妊娠相關病症之妊娠女性個體之樣品測出。
一種藉由分析來自懷有胎兒的女性個體之樣品來指定基因組基因座為母體或胎兒標記之方法，該方法包括：獲取複數個序列讀段，其中該等序列讀段係自分析得自該樣品之RNA分子獲得，該樣品含有母源性及胎源性RNA分子之混合物；藉由電腦系統識別該等序列讀段在參考序列中之位置；鑑別一或多個資訊基因座，其中各者在該第一實體中為相應第一對偶基因的同型接合，且其在第二實體中為該相應第一對偶基因及相應第二對偶基因的異型接合，其中該第一實體係該女性妊娠個體或胎兒，且該第二實體係女性妊娠個體及胎兒中之另一者；篩選出該等一或多個資訊基因座，以鑑別一或多個經篩選的資訊基因座：其等係位於該參考序列之表現區內，在該等複數個含有該相應第一對偶基因之序列讀段中至少有第一預定數量的序列讀段係位於該等基因座上，且在該等複數個含有該相應第二對偶基因之序列讀段中至少有第二預定數量的序列讀段係位於該等基因座上，就該等經篩選的資訊基因座各者而言：測定位於該經篩選的資訊基因座上且含有該相應第一對偶基因之序列讀段之第一數量，測定位於該經篩選的資訊基因座上且含有該相應第二對偶基因之序列讀段之第二數量，計算該第一數量與該第二數量之比率，當該比率超過某一截止值時，指定該經篩選的資訊基因座為該第二實體之標記，該截止值係自一或多個對照樣品測出，該一或多個對照樣品得自未患該妊娠相關病症之妊娠女性個體及/或非妊娠女性個體。
如請求項31之方法，其中該妊娠婦女之樣品係血漿樣品。
如請求項31之方法，其中該第二實體係該女性妊娠個體。
如請求項31之方法，其中該第二實體係該胎兒。
如請求項31之方法，其中計算該第一數量與該第二數量之比率包括用該第二數量除以該第一數量與該第二數量之總和。
如請求項31之方法，其中該截止值係0.2至0.5。
如請求項36之方法，其中該截止值係0.4。
如請求項31之方法，其中自該樣品獲得之RNA分子之分析包括測定該等RNA分子或其cDNA複本之序列。
如請求項31之方法，其中自該樣品獲得之RNA分子之分析包括進行數位PCR。
如請求項31之方法，其中識別該等序列讀段在參考序列中之位置包括使該等序列讀段對齊該參考序列。
如請求項31之方法，其中序列讀段之第一預定數量係1，且序列讀段之第二預定數量係1。
如請求項31之方法，其另外包括測定得自母體組織之基因組DNA之序列，以測定該女性妊娠個體在各資訊基因座上之基因型。
如請求項31之方法，其另外包括測定得自胎盤、絨毛膜絨毛、羊水或母體血漿之基因組DNA之序列，以測定該胎兒在各資訊基因座上之基因型。
如請求項31之方法，其另外包括基於經篩選的資訊基因座是否被指定為該第二實體之標記診斷妊娠相關病症。
如請求項31之方法，其另外包括針對該含有經篩選的資訊基因座之樣品中之RNA測定源自該第二實體之RNA之部分，其中該部分係藉由用該比率乘以某一標量而測出，該標量代表第二實體中經篩選的資訊基因座相對於第二對偶基因之表現之總表現水平。
如請求項45之方法，其中假定該標量係2。
如請求項45之方法，其另外包括測定源於該第一實體之RNA之部分，其係藉由用1減去該源於該第二實體之RNA部分。
一種系統，其包括一或多個經組態以執行請求項1至47中任一項之方法之處理器。
一種電腦產品，其包括儲存複數個用於控制處理器，以執行請求項1至47中任一項之方法之操作之指令之電腦可讀取媒體。