CN111172288A - 一种大肠癌多基因筛选探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明克服目前临床应用中仅对单个或几个激酶基因突变点做预测，不能满足实际临床检测诊断需求的问题，提供一种大肠癌多基因筛选探针，以及大肠癌基因筛选的方法及试剂盒，以达到高效检测基因突变，对大肠癌患者精准分型，并降低患者基因检测成本的目的。

Description

一种大肠癌多基因筛选探针及其应用

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种大肠癌多基因筛选探针及其应用。

背景技术

癌症是当今世界引起死亡与残疾的首要原因。每种肿瘤都包括遗传性(胚系)和肿瘤特异性(体细胞)变异。在过去的十年中，高通量测序和生物信息学技术取得巨大的进步，大量胚系和体细胞基因的突变信息被收集。大量临床实践已经证明，将癌症患者身上出现突变的特定蛋白作为靶点的治疗是有效的。为了实现精准医学的目标，即将正确的药物用于正确的患者，许多实验室已经开始在癌症基因检测中应用二代测序技术。

大肠癌的发生发展与许多信号通路异常密切相关，其中的关键分子一直是药物研发的热点。其中，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)以及它上下游信号分子，因其在大肠癌中的重要作用近年来受到越来越多的关注。如今越来越多的激酶的基因变异被证实与包括大肠癌在内的各种形式的肿瘤相关。已有报道支持，KRAS、NRAS、BRAF基因同时野生型的患者对靶向药物Regorafenib、Panitumumab、Cetuximab敏感，能够使之在治疗中获益；而BRAF的突变也使黑色瘤的抗药性增强。因此，对于突变的检测对靶向激酶药物在癌症中治疗效果评估，具有重大的应用价值。然而，目前临床应用中仅是针对单个或者几个激酶基因突变点的预测，并不能满足实际临床检测诊断的需求。

发明内容

本发明的目的是克服目前临床应用中仅对单个或几个激酶基因突变点做预测，不能满足实际临床检测诊断需求的问题，提供一种大肠癌多基因筛选探针，以及大肠癌基因筛选的方法及试剂盒，以达到高效检测基因突变，对大肠癌患者精准分型，并降低患者基因检测成本的目的。

本发明首先提供了一种大肠癌多基因筛选探针，其是通过如下方法制备得到的：

针对表1和表2中的所有大肠癌高发的高危突变基因，下载基因外显子编码序列，在3’端和5’端各增加50bp的侧翼序列；(ucsc数据库中基因组版本选择hg19/GRCH37)

利用Oligowiz2.0软件处理基因序列，获得Output.owz文件；

利用OligoWiz-2.1.0_OFFLINE.jar软件在windows系统下打开上述Output.owz文件，选择最小探针间距为55bp，最大探针数量为无限制，其余参数都使用默认值，导出探针列表；

在探针5’端添加一条SEQ NO.1的引物序列，3’端添加一条SEQ NO.2的引物序列，然后合成探针。

其中利用Oligowiz2.0软件处理基因序列的具体参数设定如下：

-length：目标Oligo优选长度为110个碱基；

-lmax和-lmin：严格限定探针的长度，必须为110bp；

-minlh：软件默认值为15；

程序运行的结果，重定向到owz后缀命名的文件；

其中SEQ NO.1：5’-GAAGCGAGGA TCAACT-3’；

SEQ NO.2：5’-CATTGCGTGA ACCGA-3’

其中大肠癌高发的高危突变基因，包括514个体细胞突变基因和83个拷贝数变异的基因，具体见表1和表2：

表1检测体细胞突变的基因列表

其中大肠癌重点关注体细胞突变基因为：KRAS、NRAS、BRAF、APC、CHEK2、PTEN、SMAD4、TP53、AKT3、CCND1、JAK2。

表2检测拷贝数变异的基因列表

其中大肠癌重点关注的拷贝数变异核心基因为：ERBB2、FGFR1、MYC、RB1。

本发明还提供了一种大肠癌基因筛选的方法，该方法为：

提取患者的DNA样本，包括血液样本的DNA、组织样本DNA及cfDNA；然后应用上述大肠癌多基因筛选探针进行检测生物信息学分析，得到的结果与上述表1和表2所列的突变基因及拷贝数变异基因进行对比，得到该患者的基因诊断结果。具体的说，一种大肠癌基因筛选的方法，包括如下步骤：

(1)DNA样本制备

提取病人的病灶组织及癌旁或血液组织进行DNA提取，石蜡包埋组织亦可；

(2)DNA样本文库构建

将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，然后采用KAPA文库构建试剂盒进行文库制备；(主要步骤有：DNA打断，末端补平，3’端加“A”，接头连接，纯化，文库扩增，纯化)文库制备完成后将其置于-20℃保存；

(3)杂交捕获并测序

应用上述大肠癌多基因筛选探针，与DNA文库进行杂交捕获(由捕获磁珠实现捕获DNA片段)，并送样测序；

(4)对测序结果进行生物信息学分析

测序结果为fastq文件，使用获取基因突变的算法(Broad发布)分析测序结果，得到基因突变的结果并注释；

主要步骤有fastq文件的质量控制，基因组联配，体细胞突变(somatic mutation)及胚细胞突变(germline mutation)的分析，进行注释；

用到的软件分别有：fastqc和fastx_toolkit用来做质量控制；bwa做联配，gatk及mutect2获得体细胞突变；HaplotypeCaller方法获得胚细胞突变；ANNOVAR做注释。

(5)结果比对得到突变结果

对样本的测序结果与表1和表2中的DNA筛选列表进行对比，得到该样本患者的基因突变结果。

在临床中，再结合临床信息得到最终诊断。

步骤(3)中也可以进行全基因组或者全外显子组测序，这样在步骤(5)中将分析结果与表1和表2中所列的多基因组筛选列表进行比较得到基因突变结果；但是应用本发明的大肠癌多基因筛选探针，可以降低成本。

本发明还提供了一种大肠癌基因筛选的试剂盒，该试剂盒包含上述大肠癌多基因筛选探针。

本发明提供的大肠癌多基因筛选探针的制备原理是：挑选TCGA数据库、METABRIC数据库、MSKCC-IMPACT数据库、美国大肠癌WGS数据库以及肿瘤医院大肠研究所数据库中与大肠癌发生发展及靶向治疗密切相关的基因，基于二代测序技术，利用生物素探针杂交法富集其中597个基因的重要外显子区域与部分内含子区域，并进行高深度测序，从而精准检测其中与大肠癌有明确临床相关性的基因突变、拷贝数变异等事件，并将该多基因筛选列表做成探针，通过DNA测序针对性地检测高危基因，可以更高效地检测出对诊断、治疗有指导意义的基因突变，对大肠癌患者进行精准分型。本发明对临床的诊断和发现靶向治疗的靶点具有重要指导意义。本发明可有针对性地检测突变基因，也可以降低患者基因检测的成本。

本发明的一种大肠癌基因筛选的方法可以通过两方面来应用。第一：对样本进行全基因组或全外显子测序，分析后得到所有基因的突变情况，找到本发明所列的基因，结合临床进行下一步分析；第二，对本发明所列基因构建探针，针对性地只测序样本的表1和表2中所列基因，分析得到突变情况后与临床结合进行下一步诊断。

根据本发明提供多基因探针，进行精准测序，得到基因突变结果后再结合患者样本的临床等信息，可以为该患者的临床诊断提供有力的参考，也对该患者的癌症发展情况有更深入的了解，方便精准制定治疗方案。

具体实施方式

本发明提供的前述大肠癌基因筛选的方法的步骤(2)到步骤(5)，测序工作由肿瘤医院精准中心完成；引物和探针合成由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成；实施例中所用的数据分析方法和软件为Broad发布的获取基因突变的算法：

用于分析的原始文件为fastq格式数据；用bwa进行联配，HaplotypeCaller方法获得germline mutation；对组织样本的体细胞突变分析，利用MuTect2.然后使用ANNOVAR加注释。具体内容为：

实施例1：

取一位临床确诊的大肠癌病人(复旦大学附属肿瘤医院)的癌组织及血液样本，提取DNA，使用试剂盒分别为天根生化科技(北京)有限公司,TGuide Cells/Tissue GenomicDNA Kit及天根生化科技(北京)有限公司,TGuide Large Volume Blood Genomic DNA Kit(1-3ml)。

表3样本质量控制

表3中主要包括DNA样本抽提的质量评估及测序的质量评估，是整个实验最基础的部分，数据质量的不合格将会影响后续结果的准确性及可信度。

2、DNA样本文库制备：

(1)先使用CovarisM220-DNA Shearing非接触式全自动超声波破碎仪对DNA随机打断。取DNA500ng，无核酸酶水(nuclease-free water)稀释至50μl，至130ulCovarismicroTUBE核酸打断管内，充分混匀。

(2)打开Covaris仪器，选取设置好的150-200bp的打断条件，将待打断的样本打断管正确放入Covaris仪器上，点击Start直至打断结束，取出打断管并简短离心以确保管壁没有附着。

(3)然后采用KAPA文库构建试剂盒(KAPA LTP Library Preparation Kit,RocheSequencing)进行文库制备。

3、RNA探针制备：

针对表1和表2中所有的大肠癌高发的高危突变基因，下载各个基因外显子编码序列，在3’端和5’端各增加50bp的侧翼序列(ucsc数据库中基因组版本选择hg19/GRCH37)；

利用Oligowiz2.0软件处理基因序列，获得Output.owz文件；

利用OligoWiz-2.1.0_OFFLINE.jar软件在windows系统下打开上述Output.owz文件，选择最小探针间距为55bp，最大探针数量为无限制，其余参数都使用默认值，导出探针列表；

在探针5’端添加一条SEQ NO.1的引物序列，3’端添加一条SEQ NO.2的引物序列，然后由合成探针。

从公司得到表1和表2目标基因的oligo pool，用1×TE(PH 8.0)，将oligo pool稀释到1ng/μl。用Herculase II Fusion DNA Polymerase kit(Agilent)扩增oligo序列。再用Ambion SP6 megascript kit(Thermo Fisher Scientific)进行RNA转录，探针制备完成。-80℃保存RNA探针，取部分RNA探针文库稀释至400ng/μl。

该方法制作的探针可以应用于200-300个样本，极大程度上降低了测序的成本。

4、杂交捕获及送样测序

(1)将2.5ul的1.0mg/ml human Cot-1 DNA、2.5ul的10.0mg/ml salmon spermDNA、1.5ul的Per 2.0和1.5ul的Post 1.0与总量不少于800ng体积约为5μl的DNA文库混匀后离心，标记为“DNA-block”,置于PCR仪上，盖热盖,95℃5min；65℃hold。

(2)配“bait”Mix反应体系于PCR反应管，RNA探针标记为“bait”,PCR仪温度降至65℃2.5min时，将“bait”管置于PCR仪上孵育，盖上热盖。

表4“bait”Mix反应体系成分

(3)配“hyb buffer”Mix反应体系于1.5ml离心管内，标记为“hyb buffer”Mix,待金属浴上温度升至65℃2.5min时，将“hyb buffer”Mix管置于金属浴上孵育，盖上热盖。

表5“hyb buffer”Mix反应体系成分

成分	体积
		20XSSPE	500ul
250XDelution	200ul
		10％SDS	20ul
0.5M EDTA	20ul
		nuclease-free water	240ul

(4).将PCR管“bait”放置入PCR仪2.5min后，从“hyb buffer杂交缓冲液”中吸取13μl Hyb Buffer移至“DNA-block”样品中，从“bait”孔中吸取6μl移至“DNA-block”样品中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，贴膜，盖上PCR仪热盖，65℃孵育过夜24h。

(5).链霉亲和素磁珠捕获：

准备捕获磁珠(Dynabeads M-270Streptavidin，Thermo Fisher Scientific)(捕获磁珠用来捕获DNA片段)。将所有过夜产物与磁珠充分混合半小时后，加165μl low-stringency buffer(表6)于圆底PP板每个孔中，混匀，室温静置15min。然后加入65℃预热的165ul的high-stringency buffer，重复洗涤三次后，加入30ul的nuclease-free water洗脱。采用Herculase II Fusion DNA Polymerase进行捕获目标区域DNA文库富集(Post-PCR反应)。然后进行文库的混合和送样测序。

表6 high-stringency buffer反应体系成分

成分	体积
		20×SSC	1.25ml
10％SDS	250μl
		nuclease-free water	23.5ml

表7 high-stringency buffer反应体系成分

成分	体积
		20×SSC	125μl
10％SDS	250μl
		nuclease-free water	24.6ml

5、然后将检测结果与DNA筛选列表进行比对，得到该患者的基因胚系突变结果，具体如下表8所示：

表8血细胞白细胞基因突变的检测结果

表8是患者的DNA样本测序之后经过之前描述的生物信息学分析结果中与前述表1中所列基因有关的突变的血白细胞(germline mutation)的基因变异的具体情况。

表9肿瘤组织多基因突变(somatic mutation)的检测结果

表9是患者的DNA样本测序之后经过之前描述的生物信息学分析结果中与前述表1中所列基因有关的突变的癌细胞(somatic mutation)的基因变异的具体情况。

表10组织多基因拷贝数变异检测结果

表10是患者的DNA样本测序之后经过之前描述的生物信息学分析结果中与前述表2中所列基因有关的突变基因拷贝数变异的具体情况。

表11检测结果总结及用药指导

表11是根据germline mutation及somatic mutation以及重点基因的拷贝数变异，得到该患者的耐药情况及其他情况，制定了如表11的用药指导方案。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种大肠癌多基因筛选探针，其制备方法为：

针对大肠癌高发的高危突变基因，下载基因外显子编码序列，在3’端和5’端各增加50bp的侧翼序列；ucsc数据库中基因组版本选择hg19/GRCH37；

利用Oligowiz2.0软件处理基因序列，具体参数设定如下：-length：目标Oligo优选长度为110个碱基；-lmax和-lmin：严格限定探针的长度，必须为110bp；-minlh：软件默认值为15；程序运行的结果，重定向到owz后缀命名的文件；其中SEQ NO.1：5’-GAAGCGAGGATCAACT-3’；SEQ NO.2：5’-CATTGCGTGA ACCGA-3’；获得Output.owz文件；

利用OligoWiz-2.1.0_OFFLINE.jar软件在windows系统下打开上述Output.owz文件，选择最小探针间距为55bp，最大探针数量为无限制，其余参数都使用默认值，导出探针列表；

在探针5’端添加一条SEQ NO.1的引物序列，3’端添加一条SEQ NO.2的引物序列，然后合成探针。

2.如权利要求1所述的大肠癌多基因筛选探针，其特征在于其中的高危突变基因包括：体细胞突变基因，见表1，以及拷贝数变异的基因，见表2：

表1检测体细胞突变的基因列表

表2检测拷贝数变异的基因列表

3.如权利要求2所述的大肠癌多基因筛选探针，其特征在于重点关注的体细胞突变基因为：KRAS、NRAS、BRAF、APC、CHEK2、PTEN、SMAD4、TP53、AKT3、CCND1、JAK2。

4.如权利要求2所述的大肠癌多基因筛选探针，其特征在于重点关注的拷贝数变异核心基因为：ERBB2、FGFR1、MYC、RB1。

5.一种大肠癌基因筛选的方法，包括：提取患者的DNA样本，包括血液样本的DNA、组织样本DNA及cfDNA；应用权利要求1至4所述大肠癌多基因筛选探针进行检测生物信息学分析，得到的结果与所述表1和所述表2所列的突变基因及拷贝数变异基因进行对比，得到患者的基因诊断结果。

6.如权利要求5所述一种大肠癌基因筛选的方法，具体包括如下步骤：

(1)DNA样本制备

提取病人的病灶组织及癌旁或血液组织进行DNA提取，石蜡包埋组织亦可；

(2)DNA样本文库构建

将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，然后采用KAPA文库构建试剂盒进行文库制备；文库制备完成后将其置于-20℃保存；

(3)杂交捕获并测序

应用上述大肠癌多基因筛选探针，与DNA文库进行杂交捕获，由捕获磁珠实现捕获DNA片段，并送样测序；

(4)对测序结果进行生物信息学分析

测序结果为fastq文件，使用获取基因突变的算法，分析测序结果，得到基因突变的结果并注释；

主要步骤有fastq文件的质量控制，基因组联配，体细胞突变，及胚细胞突变，的分析，进行注释；

用到的软件分别有：fastqc和fastx_toolkit用来做质量控制；bwa做联配，gatk及mutect2获得体细胞突变；HaplotypeCaller方法获得胚细胞突变；ANNOVAR做注释。

(5)结果比对得到突变结果

对样本的测序结果与所述表1和所述表2中的DNA筛选列表进行对比，得到该样本患者的基因突变结果。

7.一种大肠癌基因筛选的试剂盒，包含权利要求1所述大肠癌多基因筛选探针。