CN107488739A - 一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法，涉及分子诊断领域。本发明公开的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其包括针对选自Penta C和Penta D中的至少一种的内参微卫星位点扩增的内参引物，其可针对内参微卫星位点检测，将具有五核苷酸重复单元的Penta C和Penta D内参位点作为阳性质控，以指示待检样品是否被污染，提高检测结果的可信度。

Description

一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，具体而言，涉及一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法。

背景技术

结直肠癌(carcinoma of colon and rectum，CRC)是一种常见的严重危害人类健康的恶性肿瘤。随着人类社会的发展，人们的生活方式和生存环境发生了改变，生活压力日益增大，生存环境的污染日益严重，致使近年来结直肠癌的发病率呈现明显的上升趋势，而且发病年龄呈现年轻化态势。遗传性结直肠癌在结直肠癌体系中占重要比例，其具有遗传性、高发性、多发性和肿瘤发生的多器官性等特征，临床上依据有无多发性息肉病，将遗传性结直肠癌分为遗传性息肉病和遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)两大类，两类遗传性结直肠癌皆为常染色体显性遗传。据报道，遗传性非息肉病性结直肠癌约占结直肠癌的15％左右。

结直肠癌从发生机制上分为染色体不稳定和微卫星不稳定两种类型。微卫星是遍布人类基因组中的短串联重复序列。微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)是指由于缺失或插入重复单位引起肿瘤的DNA与同一个体的正常胚系DNA相比微卫星长度发生改变，即产生异常长度的等位基因。研究表明，15％结直肠癌是经MSI途径发生，MSI是由于错配修复基因发生缺陷引起，而遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)是由错配修复基因胚系突变所致的显性遗传病，90％以上的典型HNPCC患者具有MSI特征。另外，也有15％左右的散发性结直肠癌患者具有MSI特征。MSI的HNPCC发生的主要原因是生殖细胞的错配修复(mismatch repair，MMR)基因突变。hMLHl，hMSH2，hMSH6和hPMS2等任何一个或几个错配修复基因的失活都能导致MSI发生，散发结直肠癌病人多数仅有错配修复基因体细胞突变。

1997年，MSI国际研究合作组织在针对肿瘤的微卫星不稳定及复制错误表型检测的国际会议制定了统一的MSI检测标准，即Bethesda Guidelines。该标准明确MSI检测的参考检测位点，包括两个单核苷酸重复单元的微卫星位点(BAT-25和BAT-26)和三个二核苷酸重复单元的微卫星位点(D2S123，D5S346和D17S250)。应用本标准检测肿瘤样本的MSI状态时，5个微卫星位点如果检测出2个或者2个以上的位点发生改变，则被称为MSI-H型，即高频度微卫星不稳定，MSI-H型肿瘤表选出特有的临床及病理学表型。5个微卫星位点如果只检测出一个位点发生改变，则被称为MSI-L型，即低频度微卫星不稳定。5个微卫星位点都没有发生改变，则被称为MSS型，即微卫星稳定型。通常，由于MSI-L型和MSS型的临床表现无明显差别，所以将MSI-L型划入MSS型。

MSI结直肠癌与MSS结直肠癌相比，在预后和治疗等方面具有显著的差异，MSI结直肠癌检测临床意义包括预后性，预测性和HNPCC的辅助诊断和筛查三个方面。MSI-H II期结直肠癌5年无复发生存率高于MSS II期结直肠癌。即在II期结直肠癌患者中，MSI-H状态提示良好预后。5-氟尿嘧啶是结直肠癌术后辅助治疗的重要化疗药物。MSH-H II期结直肠癌患者有良好的预后但不能从5-氟尿嘧啶治疗中获益。从MSI-H结直肠癌中筛选出来的患者，就个人而言早期诊断和预防性息肉切除术可以降低CRC死亡率。此外，还可以为患者家族成员提供肿瘤预防和筛查。所以临床上已将MSI作为结直肠癌预后和制定辅助治疗方案的重要分子标记物，并协助HNPCC的筛选。在2011年关于结直肠癌筛查的NationalComprehensive Cancer Network指南中，已经将MSI检测列入必要检测项目。2017年5月，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)破天荒宣布“加速批准PD-1抗体用于确定有高频度微卫星不稳定或者错配修复基因缺陷的成人和儿童晚期或者转移性实体肿瘤患者”。FDA批文中明确规定只有高频度微卫星不稳定或错配修复基因缺陷的患者才能有较高的概率从PD-1(programmed death 1)抗体中获益，权威数据表明在用PD-1抗体治疗前，先要做MSI检测，因为只有MSI-H型病人，接受PD-1抗体治疗，有效率才比较高，MSS型病人，有效率很低甚至极低。

传统的基于PCR技术的MSI检测技术通常有两种，一种是通过对待检微卫星位点上下游的序列进行PCR扩增，扩增产物聚丙烯酰氨凝胶电泳，然后经过各种显示系统(放射自显影、银染等)分析有无迁移率的变化；另外一种技术为直接测序法，即对PCR扩增产物直接Sanger测序来检测微卫星位点是否发生重复单元的插入或者缺失。但是上述两种检测技术都各有缺陷。聚丙烯酰胺凝胶电泳技术存在操作繁琐，耗时长，通量低和灵敏度低等很多缺陷。直接测序法存在价格昂贵，所需实验条件较高，而且通量不高等缺陷。

另外，基因组中待检微卫星位点的序列拷贝数低，很难直接被检测。另外，待检的五个微卫星位点都是单核苷酸重复单元，微卫星长度的变化比较小，微卫星长度变化基本小于10bp，而传统的基于PCR方法的MSI检测方法灵敏度和准确性都比较低，而且完成五个位点检测需要进行多个PCR反应和后续对应的实验流程才能完成一个样本的检测。另外，现有肿瘤结直肠癌微卫星不稳定检测中，较少检测内参微卫星位点，缺乏阳性参照，致使部分检测结果的可信度降低。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其可针对内参微卫星位点检测，以指示待检样品是否被污染，提高检测结果的可信度。

本发明的另一目的在于提供一种结直肠癌微卫星不稳定检测的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述核酸组合的应用。

本发明的再一目的在于提供结直肠癌微卫星不稳定检测的方法。

本发明是这样实现的：

一种用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其包括：针对内参微卫星位点扩增的内参引物；

内参微卫星位点选自Penta C和Penta D中的至少一种。

一种结直肠癌微卫星不稳定检测的试剂盒，其包括上述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合。

上述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合在结直肠癌微卫星不稳定检测中的应用。

一种结直肠癌微卫星不稳定检测的方法，其包括：采用上述的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合对待检样品进行PCR扩增。

本发明具有以下有益效果：

本发明的提供的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其包括针对选自Penta C和Penta D中的至少一种的内参微卫星位点扩增的内参引物，其可针对内参微卫星位点检测，将具有五核苷酸重复单元的Penta C和Penta D内参位点作为阳性质控，以指示待检样品是否被污染，提高检测结果的可信度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例5中的采用实施例1提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合和Promega对照试剂盒检测S1样本的峰型图谱；

图2为本发明实施例5中的采用实施例1提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合和Promega对照试剂盒检测S2样本的峰型图谱；

图3为本发明实施例5中的采用实施例1提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合和Promega对照试剂盒检测S3样本的峰型图谱；

图4为本发明实施例5中的采用实施例1提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合和Promega对照试剂盒检测S4样本的峰型图谱；

图5为本发明实施例5中的采用实施例1提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合和Promega对照试剂盒检测S5样本的峰型图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法进行具体说明。

一方面，本发明实施例提供了一种结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其包括：针对内参微卫星位点扩增的内参引物；

内参微卫星位点选自Penta C和Penta D中的至少一种。

Penta C和Penta D均为五核苷酸重复单元，Penta C在基因组中的位置为9p13，其重复单元为[GTTTT]_3-15。Penta D在基因组中的位置为21q22.3，其重复单元为[AAAGA]_5-17。Penta C和Penta D相比其他STR位点具有高度的多态性和低水平的微卫星不稳定性，高度的多态性使其成为一个人的身份识别，保证每个人具有独特的特征图谱。低水平的微卫星不稳定性满足其作为内参的稳定性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，内参引物包括：SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3-4所示的第二引物对中的至少一种引物对。

其中，第一引物对针对Penta C位点检测，第二引物对针对Penta D位点检测。

当同时以Penta C和Penta D两个微卫星位点作为内参时，使用具有SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和具有SEQ ID NO.3-4所示的第二引物对在同一体系中进行多重PCR时可避免非特异性扩增，提高扩增特异性，同时有助于提高检测结果的可靠性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，核酸组合包括：针对待检微卫星位点扩增的检测引物；

待检微卫星位点选自BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24和MONO-27中的至少一种。

随着其在MSI检测方面的广泛和深入的应用，发现二核苷酸重复单元的STR位点在检测微卫星不稳定的状态时存在特异性和灵敏度偏低，同时需要相同人的正常组织作为对照才能判定待检组织的MSI状态。所以筛选与BAT-25和BAT-26同类的单核酸重复单元的STR位点替代D2S123，D5S346和D17S250更符合MSI检测的要求。大量的实验表明与上述的三个二核苷酸重复单元的STR位点相比，NR-21，NR-24和MONO-27的灵敏度和特异性更高，更符合MSI检测的要求。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，检测引物包括：SEQ ID NO.5-6所示的第三引物对、SEQ ID NO.7-8所示的第四引物对、SEQ ID NO.9-10所示的第五引物对、SEQ IDNO.11-12所示的第六引物对和SEQ ID NO.13-14所示的第七引物对中的至少一种引物对。

其中，第三引物对针对BAT-25位点检测，第四引物对针对BAT-26位点检测，第五引物对针对NR-21位点检测，第六引物对针对NR-24位点检测，第七引物对针对MONO-27位点检测。

在进行结直肠癌微卫星不稳定检测时，使用具有SEQ ID NO.5-6所示的第三引物对、SEQ ID NO.7-8所示的第四引物对、SEQ ID NO.9-10所示的第五引物对、SEQ ID NO.11-12所示的第六引物对和SEQ ID NO.13-14所示的第七引物对，在同一体系中进行多重PCR时可避免非特异性扩增，提高扩增特异性，同时有助于提高检测结果的可靠性。

采用上述核酸组合进行PCR扩增的产物可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术或测序进行分析，但为了提高分辨率和检测结果的精准度，本发明采用将上述PCR扩增的产物使用毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)技术进行分析。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第一引物对、第四引物对以及第五引物对均标记有第一荧光标记；

第二引物对和第三引物对均标记有第二荧光标记；

第六引物和第七引物对均标记有第三荧光标记；

第一荧光标记、第二荧光标记和第三荧光标记中的任意两者不相同。

采用三种不同荧光标记标记7对引物对，使得具有长度相邻的两种PCR产物在检测时表现出不同的荧光，有助于提高分辨率，便于阅读检测结果，避免误读。

需要说明的是，荧光标记可以标记在引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端，在某些特殊情况下(例如需要增强荧光信号的时)，也可以将引物对中的上游引物和下游引物的5’端均标记荧光标记。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第一荧光标记选自如下荧光标记中的任意一种：FAM、HEX、JOE、TAMRA和VIC；

第二荧光标记选自如下荧光标记中的任意一种：FAM、HEX、JOE、TAMRA和VIC；

第二荧光标记选自如下荧光标记中的任意一种：FAM、HEX、JOE、TAMRA和VIC。

另一方面，本发明实施例提供了一种结直肠癌微卫星不稳定检测的试剂盒，其包括上述的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合。

另一方面，本发明实施例提供了上述的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合在结直肠癌微卫星不稳定检测中的应用。

再一方面，本发明实施例还提供了一种结直肠癌微卫星不稳定检测的方法，其包括：采用上述的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合对待检样品进行PCR扩增。

进一步地，在本发明一些实施方案中，PCR扩增的体系(10μl)含有：2×MSI PCRMaster Mix 5μl，5×MSI primer mix 2μl，Hot start Taq DNAPolymerase 0.2μl,Nuclease-free ddH₂O 1.8μl，DNA模板为1μl。

其中，2×MSI PCR Master Mix包括：2×Hot Start PCR Buffer,0.6mM dNTP,8mMMgCl₂和3％Glycerol；

2×Hot Start PCR Buffer包括：40mM Tris-HCl(在25℃条件下pH 8.3),40mMKCl和10mM(NH4)₂SO₄；

5×MSI primer mix中含各待检微卫星位点的引物。

进一步地，在本发明一些实施方案中，PCR扩增的条件：95℃预变性3-5min；95℃变性25-45s，60℃退火60-120s，72℃延伸30-60s；30个循环；60℃最后延伸30-60min。

进一步地，在本发明一些实施方案中，方法包括：对PCR扩增得到的PCR产物进行毛细管电泳。

进一步地，在本发明一些实施方案中，待检样品为肿瘤样本其中，肿瘤样本是肿瘤细胞、肿瘤组织或肿瘤组织石蜡切片。

综上，本发明提供结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法可以基于多重荧光PCR技术和毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)技术的结合进行结直肠癌微卫星不稳定检测，其在MSI国际推荐的标准位点的基础上加入一个或两个内参微卫星位点(Penta C和Penta D)，作为阳性质控，用于排除样本DNA的污染，进一步提高MSI检测的精准度。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其包括：

针对内参微卫星位点扩增的内参引物，

其中，内参微卫星位点为Penta C和Penta D，内参引物包括SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3-4所示的第二引物对；

以及，针对待检微卫星位点扩增的检测引物。

其中，待检微卫星位点为BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24和MONO-27，检测引物包括：SEQ ID NO.5-6所示的第三引物对、SEQ ID NO.7-8所示的第四引物对、SEQ ID NO.9-10所示的第五引物对、SEQ ID NO.11-12所示的第六引物对和SEQ ID NO.13-14所示的第七引物对。

其中，每个引物对中的上游引物5’端具有荧光标记，各引物的具体信息见表1。

表1

本实施例提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合可以基于多重荧光PCR和毛细管电泳技术的结合对样本进行MSI检测，以两个内参微卫星位点(Penta C和Penta D)作为阳性质控，用于排除样本DNA的污染，提高MSI检测的精准度。

实施例2

本实施例提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的试剂盒，其包括实施例1提供的核酸组合。

本实施例提供的试剂盒的效果同实施例1。

实施例3

本实施例提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的方法，其包括如下步骤：

1采用实施例1提供的核酸组合对待检样本进行多重荧光PCR

1.1配制反应体系：

多重荧光PCR反应体系总体积为10μl，其中含有：2×MSI PCR Master Mix 5μl，5×MSI primer mix 2μl，Hot start Taq DNAPolymerase0.2μl,Nuclease-free ddH2O 1.8μl，DNA模板为1μl。

上述2×MSI PCR Master Mix包括：2×Hot Start PCR Buffer,0.6mM dNTP,8mMMgCl2和3％Glycerol。

上述2×Hot Start PCR Buffer包括：40mM Tris-HCl(在25℃条件下pH 8.3),40mM KCl和10mM(NH4)2SO4。

上述5×MSI primer mix中各待检微卫星位点的引物浓度分别为：

1μM NR-24-F(JOE)/R，0.75μM NR-21-F(FAM)/R，

0.5μM BAT-25-F(TAMRA)/R，0.75μM BAT-26-F(FAM)/R,

1μM MONO-27-F/R(JOE)，0.125μM Penta C-F(FAM)/R和0.125μM Penta D-F/R(TAMRA)。

1.2微卫星不稳定性检测的多重荧光反应条件如下：

95℃预变性3-5min；

95℃变性25-45s，60℃退火60-120s，72℃延伸30-60s；30个循环

60℃最后延伸30-60min。

2结直肠癌微卫星不稳定检测的多重荧光PCR产物CE电泳。

3微卫星不稳定性检测CE电泳结果数据分析。

实施例4

本实施例采用实施例1提供的核酸组合，检测五个结直肠癌患者的石蜡包埋组织切片(编号分别为：S1，S2，S3，S4和S5，石蜡包埋组织切片来自上海某医院病理科)，同时采用Promega公司的MSI analysis system v1.2作为对照，并严格按照其说明书进行操作。

1DNA抽提

采用石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)分别对五位患者的结直肠癌石蜡包埋组织切片和癌旁组织石蜡包埋切片进行基因组DNA抽提，严格按照说明书进行操作，抽提的基因组DNA采用微量分光光度计定量之后，吸取一部分稀释至5ng/μl。

2MSI检测反应体系和反应条件的建立

以上述获得的每例结直肠癌患者的一组基因组DNA为模板，建立如下反应体系：

其中，5×MSI primer mix中各待检微卫星位点的引物浓度分别为：1μM NR-24-F(JOE)/R，0.75μM NR-21-F(FAM)/R，

0.5μM BAT-25-F(TAMRA)/R，0.75μM BAT-26-F(FAM)/R,

1μM MONO-27-F/R(JOE)，0.125μM Penta C-F(FAM)/R和0.125μM Penta D-F/R(TAMRA)。

MSI检测反应体系按照如下程序运行：

3结直肠癌微卫星不稳定检测的多重荧光PCR产物CE电泳

(1)将GeneScanTM 500LIZ Size Standard和Hi-Di^TM formamide以1.5:100的比例充分混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入1μl多重荧光PCR产物，混合静置数分钟，短暂离心之后放入ABI3730 XL测序仪上，制备检测。

(2)打开ABI 3730XL测序仪数据采集软件，编辑上机检测的板标，导入检测程序点击运行，即可开始检测。

(3)检测完毕之后，将数据保存用于后续数据分析。

4微卫星不稳定性检测CE电泳结果数据分析，操作参考如下：

(1)导入原始数据。在File菜单中选择“New Project”，然后在“project type”对话框中选择“Microsatellite”。点击“Add sample to project”，选中待分析样本所在文件夹，点击add to list，点击对话框右侧的add，完成原始数据的导入。

(2)选择分析参数。在相应的analysis Method和Size Standard栏分别选择Microsatellite Default和CE电泳所用的LIZ Size Standard。

(3)数据分析。点击“analysis”按钮进行数据分析或者点击菜单“Analysis-Analyze”，在出现的“Save Project”对话框中输入保存的文件名，保存之后会自动分析。

(4)低质量数据的重新分析。分析之后选择“Analysis-low Quality To Top”，然后选中所有的低质量样品(SQ为红色或者黄色标示)，选择“Analysis-Size MatchEditor”，在出现的对话框中选择“Editor-Delete All Size Labels”或者在出现的对话框中选择“Editor-Override All SQ”点击“OK”，然后再重复一次数据分析。

(5)样本顺序的调整。为方便数据分析可以调整样品顺序，选择“Tools-TableSetting”，在出现的对话框中对样品的信息“Samples”及基因型“Genotypes”进行调整，点击“OK”。

(6)荧光标记颜色的显示。选中要分析的Maker，选择“Analysis-Display Polts”或者快捷键“Ctrl+L”。在“Samples Plot”页面对分析的Maker的参数进行调整。工具栏的“Plot Setting”为分析的类型；“Panes”为页面显示的Maker的个数，根据要求进行调整；根据Maker标记的荧光选择相应的颜色显示，一般FAM标记的染料颜色为蓝色、JOE和HEX标记的染料颜色为绿色、TRAMA标记的染料颜色为黄色(为了醒目，在软件中显示黑色)、ROX标记的染料颜色为红色、橙色一般为内参的染料颜色。根据Maker标记选择相应的颜色或者滤掉其他颜色。

(7)峰型图的横坐标和纵坐标的调整。根据需求选择菜单栏的“View”功能，对Maker峰图的横坐标和纵坐标的标示进行调整。

(8)视野范围的调整。根据片段大小选择相应的显示的横坐标和纵坐标范围。若要调整横坐标片段长度，在光标显示不同时选取一定的范围即可；若要调整纵坐标，则需要光标在纵坐标上点击右键，进行修改“Full view or Zoom to”。

(9)峰型图信息的查找。若要了解某一峰的具体信息即需要一个Table，则需要选中该峰，选择“View-Table filter-Show Selected Rows”，然后“Export Table”，输出的格式为“TXT”则需要转化为Excel格式。

(10)具体数据分析过程详见GeneMapper software说明书。

需要说明的是，在其他的实施例中，也可使用其他的仪器对CE电泳结果进行分析，相关的操作步骤根据说明书进行即可。

5结果判读

如图1-5所示(图中，横坐标代表碱基大小，纵坐标代表荧光信号强度。本发明从左到右的峰型图谱对应的位点依次为NR-24，NR-21，BAT-25，BAT-26，MONO-27，Penta C和Penta D。Promega对照试剂盒从左到右的峰型图谱对应的位点依次为NR-21，BAT-26，BAT-25，NR-24，MONO-27，Penta C和Penta D)，各样本的峰图在Penta C和Penta D均有出峰，说明待检样本没有受到污染，检测结果可信；

此外，编号为S1,S2,S3和S4四个样本的五个检测位点峰型图谱都没发生变化，判定这四位患者为MSS型；

编号为S5的样本的五个待检位点谱图都出现双峰，判定该患者为MSI-H型；

且与采用Promega对照试剂盒的检测结果想比，可以看出编号为S1,S2,S3和S4四位患者的五个检测位点峰型图谱都没发生变化，判定这四位患者为MSS型。编号为S5的一位患者的五个待检位点的谱图中有五个位点都出现双峰，判定该患者为MSI-H型。说明本发明提供的核酸组合与Promega对照试剂盒对结直肠癌患者的MSI类型判定一致，由此说明，本发明实施例提供的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合扩增特异性好，且检测结果的可靠性高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 生工生物工程（上海）股份有限公司

<120> 一种微卫星不稳定检测的核酸组合、试剂盒和方法

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagggatatg cactggtaat aga 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcatctgacc cggaaccag 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagcaagaca ccatctcaag aa 22

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atatttgcct aacctatggt cataacg 27

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgacattctg cattttaact atggctctaa 30

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgcctccaa gaatgtaagt gggag 25

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgacttcagc cagtatatga aattgga 27

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagcttcttc agtatatgtc aatgaaaaca 30

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcgtttaca aacaagaaaa gtgttgc 27

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcagcagaa ttccagccgg agtc 24

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgactccaaa aactcttctc ttccct 26

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgccattgca ttccaacctg g 21

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gagcttgcag tgagcagaga tcgttc 26

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgtgaaccac ctatgaattg cagatcc 27

Claims (10)

1.一种用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，其包括：针对内参微卫星位点扩增的内参引物；

所述内参微卫星位点选自Penta C和Penta D中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，所述内参引物包括：SEQ ID NO.1-2所示的第一引物对和SEQ ID NO.3-4所示的第二引物对中的至少一种引物对。

3.根据权利要求2所述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括：针对待检微卫星位点扩增的检测引物；

所述待检微卫星位点选自BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24和MONO-27中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，所述检测引物包括：SEQ ID NO.5-6所示的第三引物对、SEQ ID NO.7-8所示的第四引物对、SEQ ID NO.9-10所示的第五引物对、SEQ ID NO.11-12所示的第六引物对和SEQ ID NO.13-14所示的第七引物对中的至少一种引物对。

5.根据权利要求4所述的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，所述第一引物对、所述第四引物对以及所述第五引物对均标记有第一荧光标记；

所述第二引物对和所述第三引物对均标记有第二荧光标记；

所述第六引物和所述第七引物对均标记有第三荧光标记；

所述第一荧光标记、所述第二荧光标记和所述第三荧光标记中的任意两者不相同。

6.根据权利要求5所述的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合，其特征在于，所述第一荧光标记选自如下荧光标记中的任意一种：FAM、HEX、JOE、TAMRA和VIC；

所述第二荧光标记选自如下荧光标记中的任意一种：FAM、HEX、JOE、TAMRA和VIC；

所述第二荧光标记选自如下荧光标记中的任意一种：FAM、HEX、JOE、TAMRA和VIC。

7.一种结直肠癌微卫星不稳定检测的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-6中任一项所述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合。

8.权利要求1-6中任一项所述的结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合在结直肠癌微卫星不稳定检测中的应用。

9.一种结直肠癌微卫星不稳定检测的方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1-6中任一项所述的用于结直肠癌微卫星不稳定检测的核酸组合对待检样品进行PCR扩增。

10.根据权利要求9所述的结直肠癌微卫星不稳定检测的方法，其特征在于，所述方法包括：对PCR扩增得到的PCR产物进行毛细管电泳。