CN114058685B

CN114058685B - Pcr检测中的消化探针及其试剂盒

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Publication number: CN114058685B
Application number: CN202010782390.8A
Authority: CN
Inventors: 陈莹; 张奇; 张颖; 张晔
Original assignee: Beijing Yuewei Gene Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Yuewei Gene Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN114058685A

Abstract

本发明涉及PCR检测中的消化探针及其试剂盒。消化探针，其结构为：探针5’端‑‑探针中部‑‑探针3’端，本发明通过调整消化探针结构和引入碱基修饰，使得消化探针5’端结合能力较弱，3’端结合能力较强，从而在保证对消化目的片段消化效率的前提下，强化消化特异性，使得目的片段对应检测信号得到更有效的富集，最终实现大幅提升检测灵敏度，可以实现液体活检。

Description

PCR检测中的消化探针及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学领域中的临床分子诊断检测技术。本发明涉及PCR检测中的消化探针及试剂盒，特别是微卫星不稳定状态检测中野生型目标片断消化探针及其应用，可以提高微卫星不稳定(MSI)检测灵敏度，特别是可以应用于液体活检的MSI检测方法。

背景技术

微卫星序列是指核心序列为1～6个碱基的短串联重复结构，这些重复序列分布在整个人类基因组中。在DNA复制时插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象被称之为微卫星不稳定(Microsatellite Instability，MSI)。

微卫星不稳定(MSI)现象在很多实体瘤中都存在。MSI发生率最高的肿瘤类型包括子宫内膜癌(22-33％)、胃癌(22％)、结直肠癌(10-15％)、甲状腺癌(63％)、皮脂癌(35-60％)，在肝癌、黑色素瘤卵巢癌、壶腹癌、宫颈癌、食管腺癌、软组织瘤、头颈癌、肾癌等中发生率也有一定比例(2-10％)。其中对结直肠癌MSI的研究开展最早、最为深入，而且很多MSI相关理论和应用已经得到广泛认可，被NCCN指南、ASCO指南等推荐应用于临床。

以研究MSI相对较早和较为深入的结直肠癌为例：有大量证据表明，dMMR/MSI-H是II期结直肠癌患者预后良好的一个标志物，对于具有dMMR/MSI-H肿瘤的II期结直肠癌患者，3/4级分化(低分化)不再认为是高危因素；对于具有dMMR/MSI-H的II期结直肠癌患者，给予5-FU辅助化疗不能带来生存获益，反而会对患者不利。因此，II期CRC患者是否需要辅助化疗，需要综合考虑临床高危因素和MSI状态；随着免疫治疗相关研究的深入以及多款PD1/PD-L1药物上市，MSI检测作为预测PD1/PD-L1药物适用性主要指标之一，其检测需求更加重要和广泛。

检测MSI结直肠癌的方法主要有检测错配修复蛋白缺陷的免疫组织化学法和基于MSI检测的PCR方法。免疫组织化学检测4种主要的错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，通过检测错配修复蛋白缺失情况反应肿瘤的MSI状态。免疫组织化学法易受组织固定、染色条件等的影响而出现假阳性或假阴性结果，而且操作相对复杂、检测周期较长。

PCR方法通过扩增特定微卫星序列，根据正常组织与肿瘤组织微卫星序列长度的差异判断肿瘤MSI状态。美国国立癌症研究所(NCI)于1996和2004年颁布了Bethesda指南及该指南修订版。该指南对遗传性非息肉结直肠癌及散发性结直肠癌的MSI检测，推荐检测体系包括五个位点，其中两个位点为单碱基重复，三个为双碱基重复。同时，Bethesda指南确定MSI的标准为：>30％的位点不稳定为MSI-H，10％～30％为MSI-L，<10％为MSS。这一判定标准得到大多数临床和科研工作者认可。由于双碱基重复位点多态性、峰型判定困难以及双碱基重复位点常引起MSI-L检测结果，所以很多研究者认为双碱基重复位点不适合用于检测MSI，应该使用更多的单碱基重复位点。目前已有多款检测单碱基重复位点的体系或产品被广泛应用于科研与临床领域，如本公司基于专利CN201810126825.6的检测试剂盒，作为首款获得国家药品监督管理局批准的MSI检测产品，可用于临床检测。

液体活检一般指通过体液样本(如外周血、尿液、脑脊液等)而非传统组织样本进行检测的方法，主要检测对象包括循环肿瘤DNA(ctDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)和肿瘤特异抗体等。液体活检具有快速简便、无创、样本量充足、可连续性监测等优点，目前已成为个体化精准治疗研究和应用的热点之一。

常规的MSI检测是针对肿瘤组织进行的检测，如果能实现液体活检，将大幅扩展MSI检测的应用场景，同时为临床治疗提供更充分有效的辅助信息。液体活检MSI检测相对于传统MSI检测，可能的新应用领域包括：早期肿瘤筛查；术前判断MSI状态以选择适宜的治疗方案，如新辅助放化疗；术后复发检测；难以手术取样组织的检测等。

液体活检在技术上首要的问题是，如何在大量的正常野生型基因组背景下有效检测目的片段。对于通常的ctDNA液体活检检测，其检测目的片段是来源于肿瘤组织的突变DNA，多数是序列突变或非正常融合的DNA，相对而言还是较易与正常基因组DNA相区别。然而对于MSI检测，其目的片段是不稳定的微卫星位点序列，更难以与正常基因组DNA相区别。以NR27位点为例，正常基因组在该位点序列包含27个连续的A碱基，目的片段不稳定的微卫星位点通常包含15-24个连续的A碱基。从27个连续的A背景下区分15-24个连续的A，显然要比区分SNP、插入、缺失、融合等更为困难。常规技术方案(包括PCR、qPCR、HRM、NGS等)几乎无法实现所需的灵敏度和特异性。

为了解决上述困难，有研究者通过收集循环肿瘤细胞(CTC)回避灵敏度问题，但利用CTC的检测大幅增加了检测的成本和周期，而且对样本量的要求也更大，这些都不利于其在实际应用中使用。

目前已有少数通过不同的方法提高MSI检测检测灵敏度的报道，如：(1)通过COLD-PCR技术(How-Kit A,Daunay A,Buhard O,et al.Major improvement in the detectionof microsatellite instability in colorectal cancer using HSP110T17E-ice-COLD-PCR[J].Human Mutation,2017.)在PCR中富集不稳定位点并抑制野生型扩增，可以实现对HSP110一个位点的检测；(2)通过NaME-PrO方法(Ladas I,Yu F,Leong KW,et al.Enhanceddetection of microsatellite instability using pre-PCR elimination of wild-type DNA homo-polymers in tissue and liquid biopsies[J].Nucleic acidsresearch,2018.

)在扩增前倾向性消化野生型DNA，从而富集不稳定位点。前者虽然操作较简单，但对反应条件要求较高，难以同时检测多个微卫星位点。后者反应条件较为稳定，可以实现多个位点同时检测，但是由于其消化效率不足够高，使得在最终检测结果中还存在非常大量的野生型信号，影响了检测灵敏度，尤其是在多重扩增中这种不利影响尤其明显。

此现象不仅在微卫星不稳定(MSI)存在，在常规的PCR扩增中同样存在，只是因为在常规的检测中，目标片段与其它片段的碱基差别比较大，其对灵敏度的影响有限，但如果能在扩增之前，将与其它目标片段的片段消化掉，那么在目标片段的PCR扩增中，灵敏度将大大增加。

发明内容

针对上述领域中的需求，本发明提供一种优化的消化探针，在扩增前使体系对消化目标片段的消化效率显著提高，满足液体活检需要。

一种用于降低样本中野生型DNA含量，提高突变型DNA丰度的消化探针设计方法，其特征是：

针对于每个待检位点设置一组两条探针，分别对应待检位点的正链和负链；

探针与待检测位点野生型DNA序列完全一致或互补，与突变型DNA序列不完全一致；

探针3’部分与待检位点DNA结合能力较强，5’端与待检位点DNA结合能力相对较弱；

其中不同位点对应的消化探针与对应野生型目的片段结合应有相同或相近的Tm值；

所述消化探针与野生型目的片段结合的Tm值设置高于消化探针与突变型DNA结合的Tm值，同时不同消化探针之间结合成双链的Tm值要足够低。

所述探针的3’部分带有提高双链DNA稳定性的修饰。

上述的设计方法设计得到的微卫星不稳定状态检测中的消化探针，其结构为：探针5’端-探针中部-探针3’端，

所述的探针5’端，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列3’端相邻序列的互补碱基，长度0至3个碱基；

所述的探针中部，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列的互补碱基，碱基数量与对应位点野生型目的片段单碱基重复序列的重复数相同，或少一至两个碱基；

所述的探针3’端，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列5’端相邻序列的互补碱基，长度4至10个碱基。

优选：

其中探针5’端，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列3’端相邻序列的互补碱基，长度0-2个碱基；探针3’端，为与对应位点对应目的片段单碱基重复序列5’端相邻序列的互补碱基，长度4-6个碱基，所述探针3’端区域碱基添加有修饰，或以修饰碱基取代正常碱基，所述修饰包括MGB修饰、荧光基团修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、空间子修饰。

所述修饰基团为LNA修饰。

所述微卫星不稳定状态检测为以下6个单核苷酸重复位点中的一个或多个：NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27和MONO27。

所述消化探针的序列为下表中的一对或多对探针序列示：

消化探针名称	探针序列
		NR21-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGG(+C)C
NR21-T	CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAG(+C)AACA
		NR24-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATA(+G)G
NR24-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGT(+G)AG
		NR27-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGC(+C)A
NR27-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAC(+C)AG
		BAT25-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAT(+C)AA
BAT25-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA(+G)AA
		BAT26-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGG(+G)T
BAT26-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAC(+C)T
		MONO27-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATC(+C)T
MONO27-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA(+G)G

其中探针序列中的+为LNA修饰。

所述消化探针的序列改动1-3个碱基，或者其3’端末端进行改动；所述改动包括替换、增加或删除一个或更多个碱基，同时保留其与目的片段特异性结合的能力。

一种PCR检测试剂盒，含有上述的消化探针，和扩增目的片段的引物组合物。

所述目的片段为微卫星不稳定状态检测的6个单核苷酸重复位点：NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27、MONO27和3个对照位点；

所述微卫星不稳定状态检测以下6个单核苷酸重复位点：NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27和MONO27。

所述引物组合物为：

NR-21引物：

正向引物：5’-GAGTCGCTGGCACAGTTCTA-3’

反向引物：5’-FAM-ATATTCCTACTCCGCATTCACAC-3’

NR-24引物：

正向引物：5’-TTGCTGAATTTTACCTCCTGAC-3’

反向引物：5’-TAMAR-ATTGTGCCATTGCATTCCAA-3’

NR-27引物：

正向引物：5’-GGAAACAAAGCATTGAAGTCTGCAGT-3’

反向引物：5’-HEX-GAGGTTCTGAGTCGATAATACTAGC-3’

BAT-25引物：

正向引物：5’-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3’

反向引物：5’-HEX-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3’

BAT-26引物：

正向引物：5’-GGACAGTTTGAACTGACTACTT-3’

反向引物：5’-FAM-AGCTCCTTTATAAGCTTCTTCAGT-3’

MONO-27引物：

正向引物：5’-GAAATGGTGGGAACCCAG-3’

反向引物：5’-TAMAR-GGTGGATCAAATTTCACTTGG-3’。

还包括3个对照位点的引物：

PentaC引物：

正向引物：5’-CTGCCACACAGTTTCCTCCT-3’

反向引物：5’-FAM-ACTGAGCGCTTCTAGGGACTT-3’

PentaD引物：

正向引物：5’-AGTAGGATCACTTGAGCCTGGAA-3’

反向引物：5’-HEX-ATGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG-3’

Amel引物：

正向引物：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’

反向引物：5’-TAMAR-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’。

基于消化探针的思路，在扩增前，将非扩增目标片段作为消化目标片段先行去掉，以提高PCR扩增中的灵敏性。

微卫星不稳定状态检测整个流程包括核酸提取、消化、消化后模板的扩增、检测。本发明的核心创新在于消化步骤，其原理如下：消化体系中加入待检测核酸样本，以及与野生型目的片段模板互补的消化探针，消化探针可以与野生型目的片段模板形成较稳定的双链结构。如果样本中存在微卫星不稳定的目的片段，由于其长度与消化模板不一致，不能形成稳定的双链结构，再向体系中加入有消化双链DNA活性的核酸外切酶，该酶可以从5’端切断双链DNA，但它不消化单链DNA。在适当的条件下，野生型目的片段由于形成双链而被全部或大部分消化掉，而存在微卫星不稳定的目的片段由于不能形成双链结构而得以保留，最终达到富集微卫星不稳定的目的片段的效果，并用于后期的扩增、检测。

显然，消化探针的序列对最终富集效果起到决定性作用。对于消化探针，既要保证对野生型目的片段的有效消化，又要具备特异性保证不会对微卫星不稳定的目的片段进行消化。如果探针与目的片段结合能力过强，即使与不稳定的目的片段长度不匹配，也可能形成类似Ω形式的局部双链结构，从而被消化掉；如果结合能力不足，那么会有大量野生型目的片段没有被有效消化，远高于原本比例就很低的微卫星不稳定的目的片段，比例上的差异在后续的PCR扩增过程中得到指数放大，最终导致无法检测到微卫星不稳定的目的片段对应的信号。

对消化探针设计的另一个困难在于，对于每个位点，由于存在互补的两条链，所以需要两条消化探针分别去结合和消化，而这两条探针相互之间不能形成稳定的双链，否则探针双链会被外切酶切除，无法有效消化目的片段。

实现上述特异性的最直接的方法，是将消化探针与野生型目的片段结合的Tm值设置的尽量高于消化探针与微卫星不稳定的目的片段结合的Tm值，使得在特定温度下只有消化探针与野生型目的片段形成双链并被进一步消化掉。同时也要保证不同消化探针之间结合成双链的Tm值也要足够低，不会在特定温度下形成双链并被进一步消化掉。

对于MSI检测而言，其位点特性决定了它对消化探针的要求更加苛刻。绝大多数用于MSI检测的微卫星位点是A(互补链为T)重复的单碱基重复位点。按照Bethesda指南，与野生型差异3个碱基及以上则判定为MSI不稳定，也就是说需要富集的阳性信号与需要被消化掉的野生型最少仅相差3个碱基，消化探针必须能区分仅相差3个A(T)碱基的单碱基重复片段。以NR27位点的一条链为例，需要从27个连续的A背景下区分24个连续的A，这无疑对消化探针的结合能力和特异性提出非常苛刻的要求；另外，由于后续的MSI检测要检测多个单碱基重复位点，消化探针要保证特异性，不会消化其他位点。例如NR24位点的消化探针应该能够消化NR24位点的24个连续的A(T)，但不能消化NR27位点连续的A(T)，尤其是对于微卫星不稳定的NR27位点对应的同样是24个连续的A(T)；而且，探针之间不能形成双链。消化目的位点两条互补链所对应的两条探针，为例保证消化特异性，必须是一条包含二十几个连续的A，另一条包含二十几个连续的T。要在保证消化探针与要消化的目的片段的消化能力的同时避免包含二十几个连续的A和二十几个连续的T的探针之间形成双链，只能在有限的侧翼序列上做区分。

针对MSI位点特殊性，可以明确消化探针设计的若干原则。第一，消化探针的形式应该是，上游侧翼序列-重复碱基-下游侧翼序列，整体应与野生型目的片段序列尽量完全互补。可以有一侧没有侧翼序列，但显然不能两侧都没有；第二，消化探针的重复碱基应包含与野生型目的片段相对应数量的连续重复碱基，这是为了保证有效消化野生型目的片段，包含的连续重复碱基数量至多能再减少一两个，如果减少三个就会对应不稳定的目的片段；第三，通过重复片段两端的、位点特异的侧翼序列实现特异性。特异性包括区分不同位点、保证消化探针与微卫星不稳定目的片段的结合能力足够弱、保证探针之间结合能力足够弱；第四，不同位点对应的消化探针与对应野生型目的片段结合应有类似的Tm值，以保证可以在相同的条件下同时进行消化。

已经报道的文献中所使用的消化探针，其实际消化效果并不足够理想。推测是消化探针性能影响了消化效果并进一步影响最终检测性能。部分位点会有相当比例的野生型目的片段扩增产物，表明对野生型目的片段消化不完全。还有部分位点微卫星不稳定的目的片段扩增产物量非常低甚至无法有效识别，表明对不稳定的目的片段消化特异性不足。具体结果见实施例2及图3。

为了提升消化的特异性与效率，本发明对消化探针做了一系列的调整和优化。

调整的根本目的是使得消化探针5’端结合能力较弱，并加强3’端结合能力。这是因为双链DNA核酸外切酶是从5’反向第4-6个碱基开始切割，过强的5’端结合能力会导致5’端局部就可以在不依赖3’端结合能力的情况下形成双链，从而被消化。这也就意味着消化特异性差。与之相反，加强3’端结合能力，除了保证结合目的片段的强度外，也还强化了结合和消化的特异性。重复碱基是长度的不一致，在3’端较强结合情况下，会体现在5’端区域，使得长度的不一致的不稳定目的片段无法被消化。而且，即便3’端结合能力足够强，5’端结合能力也应该尽量弱，否则探针与目的片段形成Ω型结构，也是有可能被外切酶识别而消化掉。

为了达成上述目的，首先我们减少5’端侧翼序列的长度，增加3’端侧翼序列的长度。然后在3’端侧翼序列上进行修饰，进一步提升其结合能力。

3’端侧翼序列上进行修饰是必要的。否则，只能单纯通过增加侧翼序列长度提升结合能力。DNA片段越长，增加长度所带来的结合能力提升越不明显，考虑到重复序列已经有二三十碱基的长度，这种方式显然不适合。而且太长的片段更容易引起Ω型结构，形成5’端局部双链，造成非特异的消化。

具体地，针对下游MSI检测体系(本公司检测试剂盒)所检测的6个单核苷酸重复位点(NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27、MONO27)，我们设计并优化了若干组消化探针，表一是其中性能较好的一组。通过序列可见，所有位点消化探针都是类似的模式。所有5’端侧翼序列的长度在0或1碱基，3’端侧翼序列的长度在4-7碱基，且包含LNA修饰。LNA修饰位置选择在不同位点侧翼序列差异的碱基上，以提高不同位点之间的特异性。

在对实际样本的检测中(见实施例3)，这组消化探针展示出了优秀的消化能力，满足液体活检性能需求。

表一一组优化的消化探针

消化探针	探针序列
		NR21-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGG(+C)C
NR21-T	CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAG(+C)AACA
		NR24-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATA(+G)G
NR24-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGT(+G)AG
		NR27-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGC(+C)A
NR27-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAC(+C)AG
		BAT25-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAT(+C)AA
BAT25-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA(+G)AA
		BAT26-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGG(+G)T
BAT26-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAC(+C)T
		MONO27-A	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATC(+C)T
MONO27-T	TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA(+G)G

其中“+”表示LNA修饰。

本发明方法的特点：

本发明涉及PCR检测中的消化探针及其试剂盒。消化探针，其结构为：探针5’端--探针中部--探针3’端，本发明通过调整消化探针结构和引入碱基修饰，使得消化探针5’端结合能力较弱，3’端结合能力较强，从而在保证对消化目的片段消化效率的前提下，强化消化特异性，使得目的片段对应检测信号得到更有效的富集，最终实现大幅提升检测灵敏度，可以实现液体活检。该方法同样适用于常规的PCR扩增中，并不仅限于微卫星不稳定目的片段的检测中。

附图说明

图1为以外周血样本进行常规MSI检测的检测结果图。

图2为以肿瘤组织石蜡包埋组织样本进行常规MSI检测的检测结果图。

图3为以外周血样本，经消化后，进行MSI检测的检测结果图。

图4为以外周血样本，使用优化的消化探针消化后，进行MSI检测的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明

实施例1：常规MSI检测。

常规MSI检测需要对同一个体的两个样本同时进行检测，通常以肿瘤组织样本为检测样本，外周血或者癌旁组织样本为对照样本。通过比较肿瘤组织样本结果与对照样本结果是否存在差异，判定样本是否存在MSI。

本实施例中所检测的样本来自一位直肠癌患者。对照样本为术前采集的外周血样本A，检测样本为石蜡包埋的肿瘤组织样本B。

1.1 DNA提取

采用常规血液提取试剂盒对外周血样本A进行DNA提取；采用常规石蜡包埋组织DNA提取试剂盒对肿瘤组织样本B进行DNA提取，提取完毕后用紫外分光光度计测定浓度，并稀释成10ng/ul。

1.2 PCR扩增

利用本公司生产的微卫星不稳定检测试剂盒(专利CN201810126825.6)进行微卫星不稳定检测。该试剂盒扩增包含PCR反应液、引物混合液、酶混合液等。引物混合液包括6个单核苷酸重复位点、3个对照位点共9对引物，引物序列如下：

NR-21引物：

正向引物：5’-GAGTCGCTGGCACAGTTCTA-3’

反向引物：5’-FAM-ATATTCCTACTCCGCATTCACAC-3’

NR-24引物：

正向引物：5’-TTGCTGAATTTTACCTCCTGAC-3’

反向引物：5’-TAMAR-ATTGTGCCATTGCATTCCAA-3’

NR-27引物：

正向引物：5’-GGAAACAAAGCATTGAAGTCTGCAGT-3’

反向引物：5’-HEX-GAGGTTCTGAGTCGATAATACTAGC-3’

BAT-25引物：

正向引物：5’-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3’

反向引物：5’-HEX-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3’

BAT-26引物：

正向引物：5’-GGACAGTTTGAACTGACTACTT-3’

反向引物：5’-FAM-AGCTCCTTTATAAGCTTCTTCAGT-3’

MONO-27引物：

正向引物：5’-GAAATGGTGGGAACCCAG-3’

反向引物：5’-TAMAR-GGTGGATCAAATTTCACTTGG-3’

PentaC引物：

正向引物：5’-CTGCCACACAGTTTCCTCCT-3’

反向引物：5’-FAM-ACTGAGCGCTTCTAGGGACTT-3’

PentaD引物：

正向引物：5’-AGTAGGATCACTTGAGCCTGGAA-3’

反向引物：5’-HEX-ATGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG-3’

Amel引物：

正向引物：5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’

反向引物：5’-TAMAR-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’

将各反应试剂振荡混匀后，按如下比例进行配制：PCR反应液5ul，引物混合液2ul，酶混合液0.2ul，模板1ul，用无核酸酶纯水配制成10ul反应体系，置于PCR仪上进行扩增反应，反应条件如下，变性：95℃5min，扩增(35个循环)：94℃30s、60℃1min、72℃1min，延伸：60℃30min，保存：4℃。

1.3检测与数据分析

扩增产物进行毛细管电泳检测。根据检测样本数目配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液(0.5μL分子量内标+8.5μL甲酰胺)，涡旋振荡混匀；9μL上样混合液中添加1μL扩增产物，盖上封板胶盖，振荡混匀并离心；95℃变性5分钟，按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。检测建议设置进样时间为10秒、进样电压为3kV、运行时间为1800秒。

向GeneMapper软件中导入相关文件，包括Panel、Bin、对应的Analysis Method、ROX500内标。输入样品源数据(.fsa文件)，在相关参数选择栏中选定之前导入的文件，分析数据。

外周血A样本DNA扩增检测结果见图1，肿瘤组织B样本DNA扩增检测结果见图2。

1.4结果判读

通过比较外周血样本A和肿瘤组织样本B中6个单核苷酸重复位点的差异来判断肿瘤组织中这6个位点的不稳定状态。通过对图1和图2的比较可判断该样本为在NR-21、BAT-26、BAT-25、NR-27、NR-24、MONO-27六个位点都存在大小发生变化的扩增产物，说明该样本在这6个位点都不稳定，即该样本为MSI高度不稳定型的肿瘤组织。

实施例2：经过消化的MSI检测

在常规MSI检测扩增之前增加一步消化，可以特异性地消化掉野生型DNA片段，从而提高微卫星不稳定DNA片段的丰度，最终提升MSI检测灵敏度。

本实施中使用的是未经优化的普通消化探针。所检测样本与实施例一中的对照样本，术前采集的外周血样本A，为同一样本。

2.1 cfDNA提取

从外周血A中分离血浆(1600rcf离心10min；16000rcf离心10min)。使用cfDNA提取试剂盒提取外周血样本A血浆中cfDNA，提取完毕后用紫外分光光度计测定浓度，并稀释成10ng/ul。

2.2探针消化

所使用的探针来源于参考文献2(Ladas I,Yu F,Leong KW,et al.Enhanceddetection of microsatellite instability using pre-PCR elimination of wild-type DNA homo-polymers in tissue and liquid biopsies[J].Nucleic acidsresearch,2018.)，5对探针针对NR-21、BAT-26、BAT-25、NR-27、NR-24五个位点。探针序列信息如下：

NR-21探针：

正向探针：5’-CTGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

反向探针：5’-TGTTGCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGG-3’

NR-24探针：

正向探针：5’-GTCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTG-3’

反向探针：5’-GTCTCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAG-3’

NR-27探针：

正向探针：5’-TAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCA-3’

反向探针：5’-CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCAG-3’

BAT-25探针：

正向探针：5’-TGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGAAC-3’

反向探针：5’-TCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCAAAAAAA-3’

BAT-26探针：

正向探针：5’-GTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGTTA-3’

反向探针：5’-CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCTGA-3’

消化体系包含：PCR反应液3.75ul，酶反应液0.75ul，探针混合液1ul，模板1ul，用无核酸酶纯水配制成10ul反应体系。置于PCR仪上进行消化反应，反应条件如下：98℃反应2min，添加DSN酶(0.5U)，61℃消化20min，95℃失活2min。反应结束后立即进行下一步操作。

2.3 PCR扩增

利用本公司生产的微卫星不稳定检测试剂盒进行微卫星不稳定检测。10ul扩增体系中加入1ul消化产物作为模板。其余所有操作步骤同实施例1。

2.4检测与数据分析

检测与数据分析方法同实施例1。检测结果如图3。

2.5结果判读

经过消化的MSI检测结果如图3。将常规外周血检测结果(图1)作为对照，可以看到经消化的检测结果(图3)在NR-21、BAT-26、BAT-25、NR-27、NR-24五个经过消化处理的位点上，可以明确看到不稳定的产物，而未经过处理的MONO-27则看不到不稳定的产物。说明该患者肿瘤为MSI高度不稳定型。通过与常规肿瘤组织检测结果(图2)比较，各个不稳定产物的位置与组织样本中的不稳定样本大小一致，说明检测到的不稳定产物确实是来源于肿瘤组织的cfDNA。

通过增加消化步骤，可以实现不通过肿瘤组织，仅以外周血样本实现MSI检测。而没有经过消化步骤的常规方法，由于检测灵敏度不足，是无法从大量野生型片段背景下检测到不稳定的目的片段的，如图1以及图3中MONO-27位点。

虽然本实施例结果可以实现利用外周血样本检测MSI，但其检测效果并不足够理想。5个位点都会有相当比例的野生型目的片段扩增产物，表明对野生型目的片段消化不完全，说明消化效率不够高以至于还有较大量野生型模板未被有效消化。另一方面，还有部分位点微卫星不稳定的目的片段扩增产物量非常低甚至无法有效识别(BAT25和NR24)，这表明消化过程对不稳定的目的片段消化特异性不够好，有一定比例不稳定的目的片段也被消化损失了。

推测是消化探针性能影响了消化效果并进一步影响最终检测性能。本实施例所使用的消化探针，并未经过本发明所描述的调整和优化。它们部分5’末端侧翼序列较长，部分3’末端侧翼序列较长，相互之间并没有明显统一的设计原则和规律。

实施例3：使用优化的消化探针消化的MSI检测

在实施例2的基础上，使用一组根据本专利主张的原则进行优化后的MSI消化探针进行消化。所检测样本与实施例二所检测样本为同一样本，即实施例一中术前采集的外周血样本A。

3.1 cfDNA提取

采用实施例2中从外周血样本A中提取出的cfDNA进行本次实验。

3.2探针消化

使用的消化探针为经过优化的6对消化探针，针对位点NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27。消化探针序列信息见表一。

消化体系试剂配制及反应条件同实施例2。

3.3 PCR扩增

扩增体系试剂配制及反应条件同实施例1。

3.4检测与数据分析

检测与数据分析方法同实施例1。检测结果如图4。

3.5结果判读

使用优化后探针消化的MSI检测结果如图4。将常规外周血检测结果(图1)作为对照，可以看到经消化的检测结果(图4)在所有6个经过消化处理的位点上，可以明确看到不稳定的产物。说明该患者肿瘤为MSI高度不稳定型。通过与常规肿瘤组织检测结果(图2)比较，各个不稳定产物的位置与组织样本中的不稳定样本大小一致，说明检测到的不稳定产物确实是来源于肿瘤组织的cfDNA。

将使用优化后探针消化的MSI结果(图4)与非优化探针消化的结果(图3)对比，图4中突变峰与野生峰的比例明显高于图3，部分位点野生产物信号完全不可见或低至接近基线。这说明优化后的探针作用效果更加有效，以至于可以接近完全消化掉所有野生型模板并且不稳定模板没有显著损失。我们认为正是对消化探针设计的优化带来了上述性能的提升。

序列表

<110> 北京阅微基因技术有限公司

<120> PCR检测中的消化探针及其试剂盒

<141> 2020-08-06

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aggcc 25

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttttttttt tttttttttt ttagcaaca 29

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaatagg 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttttttttt tttttttttt ttttgtgag 29

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagcc a 31

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttttttttt tttttttttt tttttttacc ag 32

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaatcaa 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttttttttt tttttttttt tttttgagaa 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagggt 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttttttttt tttttttttt ttttttacct 30

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatcc t 31

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttttttttt tttttttttt tttttttgag g 31

Claims

1.微卫星不稳定状态检测中的消化探针，所述微卫星不稳定状态检测为以下6个单核苷酸重复位点中的一个或多个：NR21、NR24、BAT25、BAT26、NR27和MONO27；

所述消化探针的序列为下表中的一对或多对探针序列示：

其中探针序列中的+为LNA修饰。

2.一种PCR检测试剂盒，含有权利要求1所述的消化探针，和扩增目的片段的引物组合物；

所述引物组合物为：

NR-21引物：

正向引物：5’- GAGTCGCTGGCACAGTTCTA-3’，

反向引物：5’-FAM-ATATTCCTACTCCGCATTCACAC-3’，

NR-24引物：

正向引物：5’-TTGCTGAATTTTACCTCCTGAC-3’，

反向引物：5’-TAMAR-ATTGTGCCATTGCATTCCAA-3’，

NR-27引物：

正向引物：5’- GGAAACAAAGCATTGAAGTCTGCAGT-3’，

反向引物：5’-HEX-GAGGTTCTGAGTCGATAATACTAGC-3’，

BAT-25引物：

正向引物：5’-CTCGCCTCCAAGAATGTAAGT-3’，

反向引物：5’-HEX-TCTGCATTTTAACTATGGCTC-3’，

BAT-26引物：

正向引物：5’- GGACAGTTTGAACTGACTACTT -3’，

反向引物：5’-FAM- AGCTCCTTTATAAGCTTCTTCAGT -3’，

MONO-27引物：

正向引物：5’- GAAATGGTGGGAACCCAG -3’，

反向引物：5’-TAMAR- GGTGGATCAAATTTCACTTGG -3’。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，还包括3个对照位点的引物组合物；

PentaC引物：

正向引物：5’- CTGCCACACAGTTTCCTCCT-3’，

反向引物：5’- FAM-ACTGAGCGCTTCTAGGGACTT-3’，

PentaD引物：

正向引物：5’-AGTAGGATCACTTGAGCCTGGAA-3’，

反向引物：5’-HEX-ATGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG-3’，

Amel引物：

正向引物：5’- CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG -3’，

反向引物：5’-TAMAR-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG -3’。