CN112553336B

CN112553336B - Snp在乳腺癌化疗耐药性检测领域的应用及其检测试剂盒

Info

Publication number: CN112553336B
Application number: CN202011501711.9A
Authority: CN
Inventors: 谢小冬; 赵庆丽; 王静
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2020-12-17
Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2040-12-17
Also published as: CN112553336A

Abstract

本发明公开了SNP在乳腺癌化疗耐药性检测领域的应用及其检测试剂盒，本发明属于生物医药技术领域。本发明SNP为CCND1基因SNP位点rs9344和/或TERT基因SNP位点rs33954691。乳腺癌化疗耐药性检测试剂盒，包括检测CCND1基因SNP位点rs9344和/或TERT基因SNP位点rs33954691的引物对，其中检测CCND1基因SNP位点rs9344的5条引物，如SEQ ID NO.1‑5所示，检测TERT基因SNP位点rs33954691的5条引物，如SEQ ID NO.6‑10所示。本发明首次发现位于CCND1基因上的rs9344位点和TERT基因上的rs33954691与乳腺癌化疗耐药的相关性，对乳腺癌化疗时进行耐药性的筛查，能有效起到风险预警、早期预估的作用。

Description

SNP在乳腺癌化疗耐药性检测领域的应用及其检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及SNP在乳腺癌化疗耐药性检测领域的应用及其检测试剂盒。

背景技术

乳腺癌(Breast Cancer，BC)是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，是全世界女性最常见的恶性肿瘤，虽然它主要发生在绝经后妇女中，但约有25％的乳腺癌患者会在其生育年龄受到影响。在过去的三十年中，乳腺癌是癌症死亡的第五大原因，据统计2012年新增乳腺癌病例166万例，死于乳腺癌52万例，占乳腺癌死亡的25.1％，占所有癌症死亡人数的14.7％。尽管随着医疗水平的不断提高，大多数国家的乳腺癌死亡率已大幅下降，但据2017年美国癌症协会发布的癌症年度统计报告显示乳腺癌的发病率仍居女性癌症发病之首，约占女性所有癌症的30％。在我国，2015年约有268600名妇女被确诊为乳腺癌，占所有新发癌症病例的15.1％，且乳腺癌的患病率随着人口老龄化而显著上升，乳腺癌已成为严重危害我国女性的健康问题。

临床治疗中尽管通过手术或者化疗乳腺癌的治愈率大幅提高，但近年来由于化疗方式的不正规化或患者本身的特异性体质，已发现很多乳腺癌患者对化疗表现出了耐药性，使化疗疗效降低了很多。目前对于乳腺癌化疗耐药的机制还不是很明确，大多研究都认为乳腺癌化疗耐药涉及多基因、多步骤、多个生物学过程。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指存在于某一(些)群体、正常个体的基因组DNA中单碱基的序列差异，在人类基因组中广泛存在。目前认为人类遗传基因的多态性90％以上是由SNP所引起的。随着人类基因组计划以及千人基因组计划的完成，已得出了迄今最详尽的基因多态性图谱。数据库公布人类基因组中大约存在1500万个常见的SNP，其中还有很多频率为1％～5％的罕见变异。在全基因组范围内，平均每100到1000个碱基会出现1个SNP位点，因此多数基因都会存在大量的SNP位点。

从基础医学到临床医学的各个领域，SNP都存在巨大的应用价值。SNP的研究不仅为基因诊断(尤其是疾病的早期诊断)提供了理论依据，而且在疾病治疗过程中对于药物敏感性和安全性的检测、疗效的预估及预后都具有重要意义。SNP由于其分布广、密度高而被认为是第三代遗传标志，目前认为许多疾病的发生发展、人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都与SNP相关。已有许多实验室将SNP应用于临床，在易感性及药物敏感性的判断等多个方面为临床提供理论依据。例如华法林药物敏感性基因检测(CYP2C9*3、VKORC1多态性检测)、氯吡格雷相关基因检测(CYP2C19*2和*3多态性检测)、他汀相关基因检测(SLOC1B1521T>C多态性检测)。但乳腺癌化疗中耐药性检测，还未见SNP应用的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为乳腺癌化疗耐药性风险的预估提供相应的解决方案，填补现有乳腺癌化疗耐药性的研究空白，进一步推动乳腺癌治疗的发展。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

SNP在乳腺癌化疗耐药性检测领域的应用。

进一步地，SNP为CCND1基因SNP位点rs9344和/或TERT基因SNP位点rs33954691。

本发明中，本领域技术人员可通过现有技术中任何能够检测SNP位点的技术来检测个体中上述SNP。例如，Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、等位基因特异性PCR-RFLP或联合应用上述方法。针对乳腺癌化疗耐药性：当所述CCND1基因SNP位点rs9344的基因型为AA或携带A时，乳腺癌化疗耐药风险增加；当所述TERT基因SNP位点rs33954691的基因型为GA时，乳腺癌化疗耐药风险增加。

进一步地，耐药性检测针对的是人体对蒽环类药物的耐药性。

一种乳腺癌化疗耐药性检测试剂盒，包括检测CCND1基因SNP位点rs9344和/或TERT基因SNP位点rs33954691的引物对，其中检测TERT基因SNP位点rs33954691的5条引物，如SEQ ID NO.1-5所示；检测CCND1基因SNP位点rs9344的5条引物，如SEQ ID NO.6-10所示。

进一步地，检测试剂盒还包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和SAP反应混合液反应体系、EXTEND混合液反应体系。

乳腺癌化疗耐药性检测试剂盒在乳腺癌化疗耐药性检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现位于CCND1基因上的rs9344位点和TERT基因上的rs33954691与乳腺癌化疗耐药的相关性。因此在此基础上提出一种通过SNP来检测乳腺癌化疗耐药性的方法和试剂盒，并且经临床实验研究验证，本检测方法具有可行性，本发明的检测试剂盒具有良好灵敏性、稳定性和特异性。本发明的试剂盒对乳腺癌化疗时进行耐药性的筛查，能有效起到风险预警、早期预估的作用。

附图说明

图1为DNA电泳结果图。泳道1-10：不同样本的DNA；M(Marker):100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp。

图2为CCND1基因rs9344位点的所有样本飞行质谱检测结果分析图。

图3为TERT基因rs33954691位点的所有样本飞行质谱检测结果分析图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本实施例中使用的材料和相关试剂如下：

1、实验材料

1.1所用仪器

台式高速冷冻离心机北京长流科学仪器公司

台式高速离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司

NanoDrop2000 Thermo

384-well SpectroCwIPw bioarray芯片 Sequenom,Inc

MassARRAY Nanodispenser点样机 Sequenom,Inc

MassARRAY Analyzer 4.0质谱仪 Sequenom,Inc

PCR反应仪美国PE公司

电泳仪北京六一仪器厂DYY-6B型

紫外分析仪北京六一仪器厂WD-9403C型

凝胶电泳成像系统 Bio-Rad公司

旋涡混合器上海精科实业有限公司

水浴锅国华电器有限公司

微波炉广东格兰仕集团有限公司

电子恒温水箱北京永光明医疗仪器厂

分析天平 METTLER TOLEDO AB-204E

微量移液枪 2.5ul、10ul、50ul、100ul、200ul 1000ul、

1.2所用试剂

苯酚(phenol,pw>7.8)；氯仿(chloroform)；异戊醇(isoamyl alcohol)；无水乙醇(absolute ethanol)；十二烷基磺酸钠(sodium dodecylsulphate SDS)；溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)；蛋白酶K(Merck KgaA,Germany)；；琼脂糖(西班牙BIOWEST)；白细胞裂解液：10mmol/L Tris-wCL(pw＝8.0)、0.1mmol/L NaCL、1mmol/L EDTA(pw＝8.0)；红细胞裂解液：10mmol/L Tris-wCL(pw＝8.0)、10mmol/L NaCL、5mmol/L MgCL2、TE缓冲液：10mmol/LTris-wCL(pw＝8.0)、1mmol/L EDTA(pw＝8.0)；

血液基因组DNA非柱式提取试剂盒(北京康为世纪生物有限公司)

dl 2000 Marker 上海生物科技有限公司

Tris平衡酚北京索莱宝科技有限公司

2、所用样本

本发明是在获得兰州大学伦理委员会的批准后进行的，并告知了所有受试对象，保证了他们的知情同意。本实验研究自2013年9月至2017年4月于原兰州军区兰州总医院收集到235例乳腺癌化疗病人血样。

化疗疗效的评价主要依据国际卫生组织(WwO)确定的实体瘤疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumor，RECIST)主要分为以下几种：

(1)完全缓解(complete response,CR)：所有靶病灶和非靶病灶均消失，且肿瘤标志物恢复至正常水平；

(2)部分缓解(partial response，PR)：基线病灶长径总和缩小≥30％；

(3)疾病稳定(stable disease,SD)：病灶缩小未达到PR或增大未达到PD，存在一个或多个非靶病灶和/或肿瘤标志物超出正常水平；

(4)疾病进展(progression disease,PD)：基线病灶长径总和增加≥20％或出现新病灶，或/和已存在的非靶病灶进展。

根据以上标准综合评价后，将CR和PR归为敏感组，SD和PD归为耐药组。其中化疗敏感组157例，化疗耐药组78例。

参与实验的样本均为晨起空腹抽取外周静脉血2ml,采用EDTA抗凝，-20℃冻存，临床资料经卡方检验，P>0.05,(见表1)两组除PR有统计学差异，其他均无显著性统计学差异。

表1被研究人群临床资料特征比较

3、实验方法

3.1基因组DNA的提取

方法一：传统的苯酚—氯仿方法提取

用新鲜的EDTA或肝素钠抗凝全血充分颠倒混匀，取全血400ul转移到2ml离心管中。

在2ml离心管中加入5～6倍体积的红细胞裂解液至满，轻轻颠倒混匀，冰浴2～3分钟(或直接放入冰箱内)可见褐白色清凉溶液，用移液枪轻轻吹打，轻柔颠倒混匀。0～4℃，12000rpm，离心10分钟。

见管底白色沉淀，倒去上清，尽可能倒尽红细胞裂解液，可用滤纸吸管口

重复操作步骤2-3。

加入白细胞裂解液STE 0.8ml,用移液枪轻轻冲打(打均匀，一定不能有团粒)

加入蛋白酶K 5ul(20mg/ml)至管底，轻轻吹打均匀，不能有团粒，让蛋白酶K均匀混合充分消化。

加入10％的SDS溶液30ul,终浓度为0.5％～1.0％，之后稍加吹打。

管口加盖，37℃水浴过夜。

加入等体积(1ml)的饱和酚，颠倒混匀5分钟。

0～4℃，12000rpm，离心10分钟，转移上清至新管中，弃下层。

重复步骤9-10.注意不要将中间蛋白吸入枪尖。

新转移液应等于1ml,加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1),颠倒混匀5分钟。

0～4℃，12000rpm，10分钟离心，转移上清至新小烧杯中，弃下层。

加入NaAc(3M)100ul(反应体积的1/10)，摇动混匀。

加入2.7ml冰无水乙醇(2～2.5倍反应体积)，摇动后放于冰箱中静置一会，10000rpm，0～4℃，10分钟离心。

用移液枪小心吸取凝结的DNA团块至新离心管中，用75％的乙醇溶液清洗两遍，离心7500rpm，5分钟。小心弃去上层清液，晾干DNA。

将DNA材料保存于100ul的TE缓冲溶液中备用。

方法二：血液基因组DNA非柱式提取试剂盒(北京康为世纪生物有限公司)

将冰箱保存的血液提前取出置于4℃冰箱让其自然解冻，并按样本顺序进行编号；

取300μl全血于2ml无菌离心管中，加入300μl(与样本等体积)Buffer FG1，上下颠倒混匀5次，10,000×g离心30秒，弃上清；

再向离心管中加入450μl(1.5倍样本体积)Buffer FG1，涡旋震荡，使沉淀完全分散。10,000g离心30秒，缓慢弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟；

向Proteinase K中加入1.25ml的Proteinase K Storage Buffer使其溶解，溶解后再将Buffer FG2与Proteinase K按100:1的比例混合；

加入150μl上述混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。通常涡旋震荡3-4次，每次5秒，使沉淀充分悬浮；

将离心管孵育10分钟，其间颠倒混匀数次，直至颜色从红色变成橄榄绿；

加入150μl异丙醇，上下颠倒彻底混匀至少20次直至出现丝状或簇状基因组DNA；

10,000×g离心5分钟，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干；

加入300μl 75％乙醇，涡旋震荡5秒，10,000×g离心5分钟，弃上清。

把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中；

空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净(至少5分钟)；

加入200μl Buffer GE，低速涡旋5秒，65℃孵育1小时溶解DNA，期间轻弹数次使其充分溶解；

测定已溶解的DNA溶液浓度，分装出母液冻存备用，工作液按实验要求稀释。

将提取的样本的全基因组DNA用1％琼脂糖凝胶电泳及Nano Drop 2000分光光度计进行纯度及浓度的分析，结果图1、表2。

表2样本DNA纯度和浓度抽查

检测结果分析：琼脂糖凝胶电泳DNA条带完整，无降解，无拖尾，1.8<A260/280<2.0，说明提取的DNA纯度和浓度都较好；若有不合格的样本，重新提取直至合格。

3.2SNP分型检测

(1)根据SNP位点，以该SNP位点为中心选取长度在100bp以上的一段基因序列；

(2)应用Assay Design 3.1软件(Sequenom公司，美国)设计反应所需要的引物，具体引物序列为：

rs33954691

1st-PCR PrimerSequences:5’-ACGTTGGATGGATGGAGTAGCAGAGGGAG-3’(SEQ IDNO.1)

2nd-PCR Primer Sequences:5’-ACGTTGGATGCACGAGCACCGTCTGATTAG-3’(SEQ IDNO.2)

UEP Sequences:5’-CATCCTCTCAGGTTTCA-3’(SEQ ID NO.3)

EXT1_SEQ:5’-CATCCTCTCAGGTTTCAC-3’(SEQ ID NO.4)

EXT2_SEQ:5’-CATCCTCTCAGGTTTCAT-3’(SEQ ID NO.5)

Rs9344

1st-PCR PrimerSequences:5’-ACGTTGGATGAGTGCAAGGCCTGAACCTGA-3’(SEQ IDNO.6)

2nd-PCR Primer Sequences:5’-ACGTTGGATGTTTCCGTGGCACTAGGTGTC-3’(SEQ IDNO.7)

UEP Sequences:5’-GGACATCACCCTCACTTAC-3’(SEQ ID NO.8)

EXT1_SEQ:5’-GGACATCACCCTCACTTACC-3’(SEQ ID NO.9)

EXT2_SEQ:5’-GGACATCACCCTCACTTACT-3’(SEQ ID NO.10)

(3)DNA质量检测，要求送检样本浓度≥20ng/μL，260/280在1.8-2.0之间，且DNA条带完整清晰无严重降解。

(4)PCR扩增反应在1.5ml的EP管中进行，主要是将下述组分混合后进行扩增，酶需放冰盒上，以免其失活。PCR反应体系、扩增条件如下表3。

表3 PCR反应体系

表4 PCR扩增条件

(5)在1.5ml EP管中配制SAP混合液进行PCR产物碱性磷酸酶处理，以去除游离的dNTPs，SAP反应混合液反应体系、反应条件如下表5。

表5 SAP反应混合液反应体系

表6 SAP反应混合液反应条件

(6)单碱基延伸反应，在PCR EP管中配制EXTEND混合液，反应体系、反应条件如表7。

表7 EXTEND混合液反应体系

表8 EXTEND混合液反应条件

(7)进行树脂纯化，将纯化后的样本板放在离心机中混匀30min，使树脂与延伸反应物充分接触后再低速离心；

(8)将纯化后的延伸产物进行点样，制备Spectro CwIP。

(9)使用MALDI-TOF质谱仪检测点样后的Spectro CwIP芯片，用TYPER4.0软件进行结果分析。

3.3、统计学分析

利用在线wardy–Weinberg平衡对各个位点等位基因频率实施在线检测，根据x2值确定其差异无显著性统计学差异。并运用SPSS(version 22.0；SPSS Inc,Illinois,USA)计算各位点基因型频率和等位基因频率，用优势比(odds ratio,OR)及其95％置信区间(95％confidence interval,95％CI)表示各位点的基因型和等位基因频率的相对风险度分析，敏感组和耐药组之间的差异用x2检验来确定有无显著性统计学意义。

结果如下：

1 SNP位点wardy-Weinberg平衡检测

结果如表9。

表9 wardy-Weinberg平衡检测

2不同位点基因型和等位基因频率检测结果

结果如表10。

表10多态性位点在敏感组和耐药组的基因型和等位基因频率

P*通过Fisher精确检验计算；OR odd ratio；CI confidence interval；

P calculated by Pearson chi-square test.

2.1 TERT基因rs33954691位点多态性

在敏感组中，rs33954691位点GG、GA和AA基因型频率分别是：0.643、0.287和0.070；耐药组中其相应的基因型频率分别是：0.487、0.462和0.051。

与野生型GG相比较，GA基因型在敏感组和耐药组之间有显著性差异，P＝0.010，OR＝2.126(1.196～3.781),而且AA基因型在敏感组和耐药组之间无显著性差异，P＝1.000，OR＝0.967(0.290～3.221)。

G，A等位基因频率在敏感组中分别为0.780和0.220；其在耐药组中的等位基因频率分别为0.718和0.282。

与野生型等位基因G相比较，A等位基因在敏感组和耐药组之间无显著性差异，P＝0.137，OR＝1.395(0.899～2.164)。

2.2 CCND1基因rs9344位点多态性

在敏感组中，rs9344位点GG、GA和AA基因型频率分别是：0.210、0.573和0.217；耐药组中其相应的基因型频率分别是：0.154、0.462和0.385。

与野生型GG相比较，GA基因型在敏感组和耐药组之间无显著性差异，P＝0.807，OR＝1.100(0.512～2.365),AA基因型在敏感组和耐药组之间有显著性差异，P＝0.033，OR＝2.426(1.035～5.527)。

G，A等位基因频率在敏感组中分别为0.497和0.503；其在耐药组中的等位基因频率分别为0.385和0.615。

与野生型等位基因G相比较，A等位基因在敏感组和耐药组之间有显著性差异，P＝0.022，OR＝1.580(1.068～2.336)。

尽管很多乳腺癌患者在术前应用化疗药物治疗后，肿瘤的体积有所缩小，但临床治疗过程中还是会出现应用了化疗药物治疗但疗效不佳的情况，其主要原因往往是在治疗过程中出现了化疗耐药的现象。目前对于肿瘤在化疗过程中出现耐药的机制研究有许多，但由于肿瘤细胞耐药的机制极其复杂，不仅与肿瘤的病理类型、临床分期等有关，还与个体的遗传因素相关。

很多研究通过药物基因组学，特别是利用单核苷酸多态性的研究认识到了个体遗传差异对化疗药物的疗效及不良反应的不同作用。

本实验研究采用了飞行质谱方法对所有样本进行候选SNP位点基因分型，该方法是研究SNP位点最常用的一种高通量分型检测技术。飞行质谱技术的应用目前已经比较成熟，无需进行标记即可同时进行40重反应，实验设计灵活、特异性好、灵敏度高、分型结果准确。当然，由于样本量有限，该结果可能还需要更大的样本量进行验证。本实验研究发现TERT和CCND1基因SNP多态性和乳腺癌化疗耐药有一定的相关性。目前为止，这是国内首次报道TERT和CCND1基因SNP多态性与中国西北地区人群乳腺癌化疗耐药的关联性的研究。该研究结果对于今后乳腺癌的基因诊断和药物的个体化治疗提供更加精准的基础数据。

TERT、CCND1基因SNP多态性和乳腺癌化疗的相关性：

本实验研究结果显示TERT基因rs33954691位点AA基因型和乳腺癌耐药的发生无显著性相关，但是GA基因型与乳腺癌耐药的发生有一定的显著相关性，P＝0.010，OR＝2.126(1.196～3.781)。

本实验研究结果发现CCND1基因rs9344位点的A等位基因、AA基因型与乳腺癌耐药的发生有显著相关性，P值分别是0.022、0.033，OR分别为OR＝1.580(1.068～2.336)、OR＝2.426(1.035～5.527)，从OR值大于1而且95％的置信区间也都大于1来看，A等位基因、AA基因型可以增加乳腺癌耐药的风险，因此可以认为A等位基因是乳腺癌耐药发生的易感等位基因。

TERT、CCND1基因SNP的位置和耐药的关系：

TERT基因上的rs33954691位点和耐药的发生有一定关系，可能会影响人群中端粒酶活性发挥其正常功能，进而影响了端粒的长度，使端粒长度变长，最终导致耐药的发生。然而这一推测还需通过功能实验进一步去验证。虽然本实验结果说明端粒酶基因rs33954691多态性位点可能与乳腺癌化疗耐药存在相关性，未来还需在扩大样本量继续探究其与乳腺癌耐药的相关性。

CCND1基因上的rs9344位点位于剪接位点处，在本实验中表现出与乳腺癌化疗耐药性有显著相关性，一方面是由于CCND1基因已被证实与乳腺癌的发生发展相关，另一方面可能是因为该位点位于剪接位点处这个特殊的位置，具体机制还有待验证。

总之，本研究建立飞行质谱技术平台对乳腺癌化疗患者的两个基因2个SNP位点进行了多态性检测。总共235例临床标本2个SNP位点检测应用，再次证实飞行质谱基因分型技术平台能够用于临床常规化的SNP分型，而且该法具备操作简便、价格低廉、闭管无污染等优点使其成为临床科研推广潜力最大的技术之一。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本发明为参考。

SEQUENCE LISTING

<110> 兰州大学

<120> SNP在乳腺癌化疗耐药性检测领域的应用及其检测试剂盒

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

5’- ACGTT GGATG GATGG AGTAG CAGAG GGAG-3’

5 10 15 20 25 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

5’- ACGTT GGATG CACGA GCACC GTCTG ATTAG-3’

5 10 15 20 25 30

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

5’- CATCC TCTCA GGTTT CA-3’

5 10 15 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

5’- CATCC TCTCA GGTTT CAC-3’

5 10 15 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

5’-CATCC TCTCA GGTTT CAT-3’

5 10 15 18

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

5’- ACGTT GGATG AGTGC AAGGC CTGAA CCTGA-3’

5 10 15 20 25 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

5’- ACGTT GGATG TTTCC GTGGC ACTAG GTGTC-3’

5 10 15 20 25 30

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

5’- GGACA TCACC CTCAC TTAC-3’

5 10 15 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

5’- GGACA TCACC CTCAC TTACC-3’

5 10 15 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

5’- GGACA TCACC CTCAC TTACT-3’

5 10 15 20

Claims

1.一种乳腺癌化疗耐药性检测试剂盒，其特征在于，包括检测CCND1基因SNP位点rs9344和/或TERT基因SNP位点rs33954691的引物对，其中检测TERT基因SNP位点rs33954691的5条引物，如SEQ ID NO.1-5所示；检测CCND1基因SNP位点rs9344的5条引物，如SEQ ID NO.6-10所示。

2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌化疗耐药性检测试剂盒，其特征在于，还包括基因组DNA抽提试剂、PCR反应体系试剂和SAP反应混合液反应体系、EXTEND混合液反应体系。