JP2007504805A - Ｍａｓｐ−２結晶構造およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、MASP-2ポリペプチドの結晶およびその使用に関する。開示されるMASP-2結晶は、触媒活性のあるMASP-2ポリペプチドおよびチモーゲン MASP-2ポリペプチドを含む、MASP-2ポリペプチドの3次元構造を決定するのに有用である。本発明に開示されるように、該3次元構造は、MASP-2と相互作用する、および／またはMASP-2の活性を阻害する化合物の同定に使用することができる。

Description

発明の詳細な説明

本願に引用される全ての特許文献及び非特許文献もまた、引用により全体として本明細書に含まれる。

［技術分野］
本発明は、MASP-2の触媒ドメインを含むポリペプチドの結晶に関する。さらに、本発明は、MASP-2と相互作用しうる化合物および／またはMASP-2の活性を調節できる化合物を同定するインシリコスクリーニング方法のための該結晶の使用に関する。

［発明の背景］
補体系は、脊椎動物における自然免疫の重要な要素である。それは、侵入してくる病原性微生物および変化した宿主細胞を、オプソニン化および溶解を介して、認識し除去することができる。補体は、洗練されたカスケードシステムであり、セリンプロテアーゼ酵素が厳密な順番でお互いを活性化する。我々の現在の知識によると、補体系の活性化は、３つの独立した経路により開始可能である：古典的経路、レクチン経路、および第２経路。

古典的およびレクチン経路の第１の要素は、認識サブユニットおよび結合型セリンプロテアーゼよりなる超分子酵素複合体である (Gal and Ambrus, 2001)。古典的経路の認識サブユニットはC1qであり、これはN末コラーゲン様アームおよびC末球状頭部よりなり6本のチューリップの束に似ている。球状頭部は、活性化物質の構造に結合し、その結果コラーゲン様領域に結合したセリンプロテアーゼチモーゲン(C1r および C1s)が活性化される。１つのC1qがC1rおよびC1sプロテアーゼのヘテロ四量体(C1s-C1r-C1r-C1s)とともにC1複合体を形成する(Arlaud et al., 1987; Schumaker et al., 1987)。古典的経路における第１の酵素現象は、C1rチモーゲンの自己活性化である。活性化されたC1rはその後チモーゲンC1sを切断し、次にC3変換酵素酵素複合体の成分であるC2およびC4を切断および活性化する。

レクチン活性化経路の開始複合体は、一見C1複合体に似ている。レクチン経路の認識サブユニット、マンノース結合レクチン (MBL)は、C末球状C型レクチンドメインおよびN末コラーゲン様柄を有する (Turner, 1996)。MBLは、病原体表面に並んだ糖に結合することができ、結合型セリンプロテアーゼを介して補体カスケードの活性化を引き起こす。３つのセリンプロテアーゼ、マンノース結合レクチン結合型セリンプロテアーゼ-1、-2および-3 (MASP-1/-2/-3) (Thiel et al., 1997; Matsushita et al., 2000; Dahl et al., 2001)および小さい非酵素タンパク質MAp-19 (Stover et al., 1999; Takahashi et al., 1999)がMBLに結合する。MBL-MASP 複合体の構造および機能に関しては、不明な点が多く存在する。MBLのオリゴマー状態（三量体サブユニット２から６の範囲）およびそれに結合するMASPの数およびタイプ(Dahl et al., 2001; Thielens et al., 2001)に関して、様々なMBL-MASP 複合体が存在することが示されている。最近の証拠は、C1rおよびC1sとは異なり、MASP-1およびMASP-2は独立して作用することができ、ヘテロオリゴマーを形成せず、活性化されるのにお互いを必要としないことを示唆する。MASP-1およびMASP-2はいずれも自己活性化可能であり、活性化されたセリンプロテアーゼは、様々な基質に対して顕著な活性を示す (Ambrus et al., 2003)。 MASP-2はC1s様酵素であり、C4およびC2を切断する (Thiel et al., 1997; Rossi et al., 2001)。 しかしながら、C1sとは異なりMASP-2は自己活性化可能であり、それ故に他のプロテアーゼの寄与なしに補体カスケードを引き起こす (Vorup-Jensen et al., 2000)。２つのMBLサブユニットおよび２つのMASP-2分子よりなる複合体が最小の補体固定ユニット（complement fixing unit）であることが示されている (Chen and Wallis, 2001)。結果として、MASP-2ダイマーは、C1複合体においてC1r₂C1s₂四量体により仲介される全ての機能を果たすことができる。

C1r、C1s、MASP-1/-2/-3 酵素は、共通のモジュール組織を有するプロテアーゼのファミリーを形成する (Sim and Laich, 2000; Volanakis and Arlaud, 1998; Schwaeble et al., 2002)。これら酵素のN末相互作用領域は、２つのCUBドメインに囲まれたEGF様ドメインを含む。C末触媒領域は、２つの補体制御タンパク質(CCP) (SCRまたはsushiとも呼ばれる)モジュールが前に付いたセリンプロテアーゼ (SP) ドメインを含む。最近、MASP-2のCCP1-CCP2-SP、CCP2-SPおよびSPフラグメントが発現され、特徴決定された(Ambrus et al., 2003)。SPドメインは十分自己活性化でき、インタクトな分子と同じように効率的にC2基質を切断することができた。しかしながら、効率的なC4切断にはCCP2モジュールの存在が必須である。CCP2モジュールは、C4分子のためのさらなる基質結合部位を含むのかもしれない。このように、CCP2-SPフラグメントはそれゆえ、MASP-2の触媒ドメインと考えることができる。

X線結晶学研究により、チモーゲン C1rの触媒領域 (CCP1-CCP2-SP) (Budayova-Spano et al., 2002a)並びにチモーゲンおよび活性型C1r (Budayova-Spano et al., 2002b)および活性型C1s (Gaboriaud et al., 2000)の触媒領域(CCP2-SP)の構造が解析された。ごく最近、C1sのN末 CUB1-EGFフラグメント(Gregory et al., 2003)およびラットMASP-2のCUB1-EGF-CUB2 フラグメント(Feinberg et al., 2003) の構造が公開された。しかしながら、MASP酵素の触媒ドメインの3D構造についての情報はいずれも文献にて利用可能ではない。

［発明の概要］
MASPタンパク質の触媒ドメインの3D構造についての情報は、MASPタンパク質に相互作用することができる有用な化合物の同定を促進するであろう。例えば、活性および非活性なMASPの触媒ドメインの3D構造についての情報は有用でありうる。具体的には、MASPタンパク質の調節物質、例えば阻害物質を、MASPタンパク質の触媒ドメインの3D構造の情報を用いて設計することができる。

幾つかの技術的困難性にもかかわらず、本発明者らは、MASPタンパク質のフラグメントの結晶を調製し、その構造を解析することに成功した。

したがって、本発明の1つの目的は、MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドの結晶を提供することである。該ポリペプチドは、触媒活性があってもなくてもよい。

MASP-2の3D構造の情報は、MASP-2と相互作用しうる化合物を同定するのに使用することができる。例えば、インシリコスクリーニング方法を用いて、MASP-2と相互作用できる可能性の高い化合物を同定することができる。

このように、本発明のさらなる目的は、以下の工程を含む、MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドと相互作用することができる化合物を同定する方法を提供することである：
i)分子または分子複合体の三次元表示を作成するためのコンピューターシステムを提供する、ここで該コンピューターシステムは、
機械読み取り可能データがコードされたデータ保存マテリアルを含む機械読み取り可能データ保存媒体、ここで該データはMASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドの構造座標を含む;
該機械読み取り可能データを処理するための指示を保存するためのワーキングメモリ;
該機械読み取り可能データを該三次元表示へと処理するための該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能データ保存媒体につながるセントラルプロセシングユニット；および
三次元表示を表示するための該セントラルプロセシングユニットにつながるディスプレイ、を含む
；および
ii) コンピュータがそのメモリに該ポリペプチドの分子3Dモデルの構造座標を含むコンピュータ読み取り可能データをロードするように、該ポリペプチドの三次元表示を該ポリペプチドの結晶の構造座標から生成させるためのコンピュータに対する指示を実行する；
iii)１以上の被検化合物の分子モデルを生成させる;
iv)該分子モデルから、該ポリペプチドと該１以上の被検化合物の結合により形成されうる１以上の可能性ある分子複合体を計算する、
v)相互作用の程度および／またはそのような相互作用の位置および／または配向を示すアウトプットデータを生成させる、
vi)該ポリペプチドに相互作用することができる化合物を選択する。

本発明は、MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含む別のポリペプチドの構造座標を含む別のデータセットを用いて前記方法を繰り返しうることを含む。その方法は、具体的には、触媒活性のある１本のMASP-2ポリペプチドおよび触媒活性のない１本のMASP-2ポリペプチド、例えば二本鎖形態における１本のMASP-2ポリペプチドおよび一本鎖形態における１本のMASP-2ポリペプチド、を用いて繰り返すことができる。このように、その方法は、触媒活性のあるMASP-2ポリペプチドとだけ相互作用することができる化合物、または触媒活性のないMASP-2とだけ相互作用することができる化合物、または触媒活性のあるMASP-2および触媒活性のないMASP-2の両方と相互作用することができる化合物を選択することを含みうる。

インシリコ方法を使用してMASP-2と相互作用することができる化合物を選択することに続いて、インビトロにおいてその相互作用を確認することが望ましい場合が多い。

それゆえ、本発明の方法は、さらに以下の工程を含むことが好ましい：
vii)少なくとも１つの選択された化合物を提供する；
viii)MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを提供する;
ix)該ポリペプチドを該選択された化合物と相互作用のための条件下で接触させる;
x)該ポリペプチドと該選択された化合物の間の相互作用を検出し、それにより該ポリペプチドと相互作用することができる化合物を同定する。

インビトロ方法に使用するポリペプチドは、3Dモデルを構築するのにその座標を使用したポリペプチドと同じポリペプチドであってもよく、あるいは、同様にMASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含む異なるポリペプチドであってもよい。例として、インビトロ方法に使用するポリペプチドが完全長MASP-2ポリペプチドであって、一方、3Dモデルを構築するために使用するポリペプチドが単にMASP-2のCCP-2およびセリンプロテアーゼドメインを含むポリペプチドであってもよい。

本発明のさらなる目的は、本発明の方法により同定される、MASP-2ポリペプチドと相互作用することができる化合物を提供することである。

MASP-2の3D構造の情報はまた、MASP-2活性を阻害することができる化合物を同定するために使用しうる。具体的には、MASP-2活性に必要とされる部位と相互作用することができる化合物は、有用なMASP-2活性阻害物質でありうる。例えば、MASP-2のC4結合ポケットと相互作用することができる化合物は、有用なMASP-2阻害物質でありうる。

したがって、本発明のある目的は、以下の工程を含む、MASP-2活性を阻害することができる化合物を同定する方法を提供することである：
i)分子または分子複合体の三次元表示を作成するためのコンピューターシステムを提供する、ここで該コンピューターシステムは、
機械読み取り可能データがコードされたデータ保存マテリアルを含む機械読み取り可能データ保存媒体、ここで該データはMASP-2のセリンプロテアーゼドメインおよびCCP-2を含むポリペプチドの構造座標を含む;
該機械読み取り可能データを処理するための指示を保存するためのワーキングメモリ;
該機械読み取り可能データを該三次元表示へと処理するための該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能データ保存媒体につながるセントラルプロセシングユニット；および
該三次元表示を表示するための該セントラルプロセシングユニットにつながるディスプレイ、を含む
；および
ii) コンピュータがそのメモリに該ポリペプチド上の基質結合部位の分子モデルの構造座標を含むコンピュータ読み取り可能データをロードするように、該基質結合部位の三次元表示を該ポリペプチドの結晶の構造座標から生成させるためのコンピュータに対する指示を実行し、；
iii)１以上の被検化合物の分子モデルを作成する;
iv)該分子モデルから、該結合部位と該１以上の被検化合物の結合により形成されうる１以上の可能性ある分子複合体を計算する、
v)相互作用の程度および／またはそのような相互作用の位置および／または配向を示すアウトプットデータを生成させる、
vi) 該結合部位に相互作用することができる化合物を選択し、それによりMASP-2活性の阻害物質を同定する。

MASP-2ポリペプチドが触媒活性のあるMASP-2の場合、阻害物質は、例えば、活性部位に相互作用する化合物でありうる。MASP-2ポリペプチドがチモーゲンMASP-2の場合、阻害物質は、例えば、MASP-2自己切断部位と相互作用する化合物でありうる。そのような化合物は結果として、MASP-2の活性化を阻害しうる。

インシリコ方法を使用してMASP-2活性を阻害することができる化合物を選択することに続いて、インビトロにおいてその化合物の阻害特性を確認することが望ましい場合が多い。

すなわち、本発明の方法は、さらに以下の工程を含みうる：
vii) 少なくとも１つの選択された化合物を提供する;
viii) MASP-2を提供する;
ix) 該化合物の存在下および非存在下においてMASP-2活性を測定する；
x) 該化合物の存在下におけるMASP-2活性が非存在下よりも低い化合物を同定する。

本発明の目的はまた、本発明の方法により同定される、MASP-2活性を阻害することができる化合物を提供することである。

［発明の詳しい説明］
MASP-2
MASP-2タンパク質は、数多くのドメイン、すなわちCUB1、EGF、CUB2、CCP1、CCP2およびセリンプロテアーゼドメインを含む。MASP-2の略図を図５に示す。ヒトMASP-2内の個々のドメインの位置は図２に示す。

MASP-2の触媒ドメインとは、触媒活性を含む、MASP-2のいずれかのドメインである。通常、触媒ドメインは、少なくともMASP-2のセリンプロテアーゼドメインを含む。MASP-2の触媒活性は、好ましくは適切な基質、例えばチモーゲンMASP-2、C2および／またはC4に対するセリンプロテアーゼ活性である。触媒活性は、以下の「MASP-2活性」の節に記載されるいずれの方法を用いて測定してもよい。

ある態様において、本発明は、MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する、少なくとも150、例えば少なくとも175、例えば少なくとも200の連続するアミノ酸を含むポリペプチドに関する。そのようなポリペプチドは、本明細書において「MASP-2ポリペプチド」と呼ばれる。

MASP-2ポリペプチドは、好ましくは、MASP-2のセリンプロテアーゼドメインを含む。さらに、MASP-2ポリペプチドはまた、１以上のさらなるMASP-2のドメイン、例えばCCP-2ドメインを含んでも良い。好ましい態様において、該ポリペプチドは、CCP-2ドメインおよびMASP-2のセリンプロテアーゼドメインを含む。

「MASP-2」なる用語は、当業者に知られるMASP-2分子およびその機能的ホモログのいずれをも意味する。該MASP-2は、例えば哺乳類由来であってよく、例えばMASP-2はヒト由来であってよい。本発明の好ましい態様において、MASP-2は、配列番号１で特定されるヒトMASP-2であるか、あるいは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%、特に好ましくは少なくとも95%の配列番号１との相同性、またはより好ましくは同一性を有するその機能的ホモログである。

したがって、好ましい態様において、MASP-2のセリンプロテアーゼドメインを含むポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸363-686を含む。別の好ましい態様において、MASP-2のセリンプロテアーゼドメインを含むポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸299-686を含む。

MASP-2由来の配列に加えて、ポリペプチドは、他の配列、例えばMASP-2に由来しない少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは1-500、例えば1-250、例えば1-100、例えば1-75、例えば1-50、例えば1-25、例えば1-10の範囲のアミノ酸を含む追加ペプチド配列を含んでも良い。好ましくは、該追加ペプチド配列は、最大20、例えば最大10、例えば最大5、例えば約4のアミノ酸よりなる。追加ペプチド配列は、MASP-2フラグメントのN末またはC末に存在しても、あるいは内部に存在してもよい。好ましくは、そのフラグメントは、MASP-2由来フラグメントのN末またはC末に存在する。

本発明のある好ましい態様において、ポリペプチドは、配列 ALA SER MET THRの追加ペプチドを含む。好ましくは、該配列はN末に位置する。したがって、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸363-686のN末に配列 ALA SER MET THRが結合した配列からなることが好ましい。別の好ましい態様において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸299-686のN末に配列 ALA SER MET THRが結合した配列からなることが好ましい。

本発明の好ましい態様において、MASP-2ポリペプチドは、酵素活性のある形態 (本明細書において、触媒活性のある形態とも呼ばれる)である。したがって、ポリペプチドは、好ましくは野生型MASP-2の活性の少なくとも20%、例えば少なくとも30%、例えば少なくとも40%、例えば少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の活性を有する。MASP-2活性は、本明細書中の他所に記載のように測定することができる。ポリペプチドは、したがって、酵素活性のある二本鎖形態であることが好ましい。

本明細書で用いる「MASP-2ポリペプチド」なる用語は、MASP-2の一本鎖および二本鎖形態の両方を包含する。

本発明のある態様において、MASP-2は一本鎖形態である。一本鎖形態はまた、チモーゲンMASP-2とも称される。MASP-2を確実に一本鎖形態とするため、そのようなMASP-2は、１以上の変異を、好ましくは切断部位内に含む。したがって、本発明のある態様において、MASP-2ポリペプチドは、１以上のアミノ酸に変異が導入された配列番号１のMASP-2の少なくとも150の連続するアミノ酸を含んでも良い。具体的には、配列番号１のアミノ酸443-445の少なくとも１つに変異が導入されていることが好ましい。より好ましくは、MASP-2 ポリペプチドは、アミノ酸444に変異が導入された、好ましくはアミノ酸444がRからQに置換された、配列番号１のアミノ酸296-686を含んでも良く、あるいはそれよりなってもよい。

MASP-2ポリペプチドまたはMASP-2のセリンプロテアーゼドメインを含むポリペプチドの機能的同等物または機能的ホモログは、該ポリペプチドの既定のアミノ酸配列と少なくともいくらかの配列同一性を有するポリペプチド (例えば配列番号１に示すアミノ酸配列のフラグメント)である。機能的同等物はさらに、MASP-2活性の少なくとも30%、例えば少なくとも40%、例えば少なくとも50%、例えば少なくとも60%、例えば少なくとも70%、例えば少なくとも80%、例えば少なくとも90%、例えば少なくとも95%の活性を保持すべきである。MASP-2活性を測定する方法は本明細書中以下に記載される。「機能的同等物」および「機能的ホモログ」なる用語は、本明細書において互換的に使用される。

本発明の機能的ホモログには、本明細書において前述したように、既定のMASP-2ポリペプチド配列と相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。例えばそのようなポリペプチドは、本明細書にて前述した既定のポリペプチド配列と少なくとも約40％、例えば少なくとも約50％の相同性、例えば少なくとも約60％の相同性、例えば少なくとも約70％の相同性、例えば少なくとも約75％の相同性、例えば少なくとも約80％の相同性、例えば少なくとも約85％の相同性、例えば少なくとも約90％の相同性、例えば少なくとも92％の相同性、例えば少なくとも94％の相同性、例えば少なくとも95％の相同性、例えば少なくとも96％の相同性、例えば少なくとも97％の相同性、例えば少なくとも98％の相同性、例えば少なくとも99％の相同性を有する。

相同性は、好ましくは、いずれかの適したアルゴリズムによって、あるいはそのようなアルゴリズムのコンピュータによる実行によって、例えばIntelligenetics によるPC/GeneプログラムにおけるCLUSTALまたはWisconsin Genetics Softwareパッケージ, Genetics Computer Group (GCG) におけるGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAによって計算すればよい。アミノ酸配列間の相同性はさらに、周知のマトリクス、例えばBLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85、およびBLOSUM 90のいずれかを用いて計算してもよい。

本発明の機能的ホモログは、好ましくは、本明細書にて前述した、既定のMASP-2ポリペプチド配列と少なくとも約50％、好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約70％、さらに好ましくは少なくとも約75％、さらにより好ましくは少なくとも約80％、さらに好ましくは少なくとも約85％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、さらに好ましくは少なくとも95％の相同性を有する、最も好ましくは少なくとも98％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

機能的ホモログは、１のアミノ酸の他のいずれかのアミノ酸への置換を少なくとも１つ含むアミノ酸配列を含んでも良い。例えばそのような置換は、保守的アミノ酸置換であっても非保守的置換であってもよい。好ましくは、該置換は、保守的置換である。

保守的アミノ酸置換は、既定のアミノ酸グループ内の１のアミノ酸の、同じグループ内の別のアミノ酸への置換であり、ここで既定のグループ内のアミノ酸は、同様の、または実質的に同様の特徴を示す。本明細書において適用される「保守的アミノ酸置換」なる用語の意味において、１のアミノ酸は、以下を有することを特徴とするアミノ酸グループ内の別のアミノ酸に置換することができる：
i) 極性側鎖 (Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、TyrおよびCys,)
ii) 非極性側鎖 (Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、ProおよびMet)
iii) 脂肪族側鎖(Gly、Ala Val、Leu、Ile)
iv) 環状側鎖 (Phe、Tyr、Trp、His、Pro)
v) 芳香族側鎖 (Phe、Tyr、Trp)
vi) 酸性側鎖 (Asp、Glu)
vii) 塩基性側鎖 (Lys、Arg、His)
viii) アミド側鎖 (Asn、Gln)
ix) ヒドロキシ側鎖 (Ser、Thr)
x) 硫黄含有側鎖 (Cys、Met)、および
xi) モノアミノ-ジカルボン酸またはモノアミノ-モノカルボキシル-モノアミドカルボン酸であるアミノ酸 (Asp、Glu、Asn、Gln)。

アミノ酸の付加または欠失は、2〜5アミノ酸、例えば5〜10アミノ酸、例えば10〜20アミノ酸、例えば20〜50 アミノ酸の付加または欠失であってよい。しかしながら、50を超えるアミノ酸の付加または欠失、例えば50〜200アミノ酸の付加もまた、本発明に包含される。

本明細書に記載のポリペプチド化合物に加えて、ペプチド構造の重要な部分をまねて立体的に類似する化合物を作ることができ、そのような化合物もまた、本発明のペプチドと同じ様式にて使用することができる。これは、当業者に知られるモデリングおよび化学的デザインの技術により達成することができる。例えば、エステル化その他のアルキル化を行って、アミノ末端、例えばジアルギニンペプチド骨格のアミノ末端、を修飾し、テトラペプチド構造をまねることができる。このような立体的に類似するすべての構築物が本発明の範囲内であることは理解されるであろう。

N末がアルキル化されC末がエステル化されたペプチドもまた、本発明に包含される。機能的同等物にはまた、二量体または無関係な化学部分を含む、グリコシル化および共有結合性または集合性結合体が含まれる。そのような機能的同等物は、当業界に知られる方法によって、フラグメントに存在する基、例えばNおよびC末のいずれか一方または両方、に官能基を結合することによって調製することができる。

機能的同等物は、したがって、脂肪族もしくはアシルエステル、またはカルボキシ末端のアミド、アルキルアミン、またはカルボキシル側鎖を含む残基に結合したフラグメント、例えばアスパラギン酸残基でのアルキルアミンとの結合体;ヒドロキシル基含有残基のO-アシル誘導体、およびアミノ末端のアミノ酸またはアミノ基含有残基のNアシル誘導体、例えばMet-Leu-Pheとの結合体、を含みうる。アシル基の誘導体は、アルキル部分（C3-C10直鎖アルキルを含む)の群から選択され、それによりアルカノイル種および炭素環または複素環化合物が形成され、それによりアロイル種が形成される。反応基は、好ましくは、それ自体がタンパク質を反応性側鎖を介して不溶性マトリクスに架橋するのに使用されることが知られている二機能性化合物である。

機能的ホモログはさらに、本明細書において前述した既定のMASP-2ポリペプチド配列をコードする核酸配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸にコードされるポリペプチドであってもよい。

本明細書で用いるストリンジェントな条件とは、例えばSouthern E. M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517に記載されるサザンブロッティングおよびハイブリダイゼーションに関して通常適用されるストリンジェンシーを意味する。そのような目的について、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの工程を含めることは通常の実務である。その工程は、Sambrook et al., 1989、”Molecular Cloning/A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor（引用により本明細書に含まれる）に記載のように、通常、6x SSPE、5% デンハルト液、0.5% SDS、50% ホルムアミド、100μg/ml 変性済サケ精子DNA (42℃で18時間インキュベーション)を含む溶液を使用して行い、続いて2x SSCおよび0.5% SDSにて洗浄し (室温および37℃)、そして0.1x SSCおよび0.5% SDSにて洗浄する (68℃で30分間インキュベーション)。

結晶
本発明のMASP-2ポリペプチドの結晶は、好ましくは、X線回折を用いて該結晶の構造を決定するのに有用である。

好ましい態様において、結晶は、MASP-2のCCP-2およびセリンプロテアーゼドメインを含むポリペプチドの結晶である。結晶は、２以上、例えば２つのペプチドを含んでも良い。好ましい態様において、結晶は、MASP-2のCCP-2およびセリンプロテアーゼドメインを活性ある二本鎖形態において含む。

したがって、結晶は、原子座標の決定のため、少なくとも5 Å、好ましくは少なくとも4 Å、より好ましくは少なくとも3 Å、さらに好ましくは少なくとも2.5 Å、最も好ましくは少なくとも2.25 Åの分解能までX線を回折することが好ましい。

本発明の非常に好ましい態様において、結晶は、表３の構造座標またはそこから2.5 Å以下、好ましくは2.25 Å以下、より好ましくは2.0 Å以下、さらに好ましくは1.75 Å以下、さらにより好ましくは1.5 Å以下、例えば1.25 Å以下、例えば1.0 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する座標により表される空間的関係に配置した原子を含む。好ましくは、座標は、そこから2.5 Å以下、好ましくは2.25 Å以下、より好ましくは2.0 Å以下、さらに好ましくは1.75 Å以下、さらにより好ましくは1.5 Å以下、例えば1.25 Å以下、例えば1.0 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する。

好ましくは、結晶は、PDBにid 1q3xとして登録されている構造を含む、あるいはより好ましくはその構造よりなる。

結晶はまた、MASP-2のCCP-2およびセリンプロテアーゼドメインを一本鎖形態において含んでも良く、好ましくはそのようなMASP-2は切断部位内に少なくとも１つの変異を含む (前述のチモーゲン MASP-2に関する詳細を参照)。

本発明の別の態様において、結晶は、表４の構造座標またはそこから2.5 Å以下、好ましくは2.25 Å以下、より好ましくは2.0 Å以下、さらに好ましくは1.75 Å以下、さらにより好ましくは1.5 Å以下、例えば1.25 Å以下、例えば1.0 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する座標により表される空間的関係に配置した原子を含む。好ましくは、座標は、そこから2.5 Å以下、好ましくは2.25 Å以下、より好ましくは2.0 Å以下、さらに好ましくは1.75 Å以下、さらにより好ましくは1.5 Å以下、例えば1.25 Å以下、例えば1.0 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する。

結晶は、非対称単位につき２以上のMASP-2ポリペプチドを含んでも良く、本発明の好ましい態様において、結晶は、非対称単位につき複数のMASP-2ポリペプチドを含む。

結晶は、以下の範囲の単位格子寸法（unit cell dimension)を有することが好ましい：
a=40-42、好ましくは 40.5-41.5、より好ましくは約41
b=40.5-42.5、好ましくは 41-42、より好ましくは約41.5
c=102-104、好ましくは 102.5-103.5、より好ましくは約103
α=(=95.5-97.5、好ましくは 96-97、より好ましくは約96.4
β=(=90.8-92.8、好ましくは 91.3-92.3、より好ましくは約91.8
γ=(=118.5-120.5、好ましくは 119-120、より好ましくは約119.5

最も好ましくは、結晶は、以下のデータを有する

空間群: P1、2分子/非対称単位、
単位格子寸法：a=40.950 b=41.521 c=102.994 α=96.44 β=91.77 γ=119.52 Å。

MASP-2活性
ある局面において、本発明は、MASP-2活性を阻害することができる化合物を同定する方法に関する。MASP-2活性は、いずれの適したアッセイにより測定してもよい。有用なアッセイには、MASP-2/MBL複合体のセリンプロテアーゼ活性を試験するアッセイが含まれる。好ましいアッセイは、C2および／またはC4および／またはMASP-2の切断を測定するアッセイである。最も好ましくは、C2またはC4の切断を測定するアッセイである。

MASP-2活性の阻害物質は、C2および／またはC4沈着（deposition）の阻害、すなわちC2および／またはC4切断の阻害について試験してもよい。

アッセイは、MBL結合物質（MBL associating agent）が固定された固体表面を調製する工程、MBL/MASP-2複合体を該MBL結合物質に結合させる工程、およびMASP-2触媒反応の阻害をスクリーニングする工程を含むことができる。

固体表面は、いずれの有用な固体表面であってもよく、例えばマイクロタイターウェルである。MBL結合物質は、MBLが高い親和性で結合する化合物であればいずれであってもよく、例えばMBL抗体、マンナンまたはマンノースであり、しかしながら好ましくはマンナンである。MBL/MASP-2複合体はいずれの適した起源に由来するものであってもよく、例えば組換えMBL、組換えMASP-2または血清から精製されたMBLおよび／またはMASP-2であってよい。組換えMBL/MASP-2は、完全長MBL/MASP-2であってもよく、その機能的フラグメントであってもよい。さらに、組換えMBL/MASP-2は、１以上の他の化合物、例えば遺伝子タグ、に連結していてもよい。MBLおよび／またはMASP-2はいずれの適した種に由来してもよく、例えばヒトMBL/MASP-2であってよい。本発明のある態様において、MBL/MASP-2複合体は、完全血清中に存在しアッセイを行う前に精製されない。該アッセイはその後、基質、すなわちC4、の完全血清中における沈着の阻害について試験する。MASP-2触媒反応は、好ましくはC2および／またはC4の沈着である。

阻害活性についてスクリーニングする化合物を、結合したMBL/MASP-2に添加する。好ましくは、添加化合物なしのコントロールも行う。化合物は、具体的化合物の性質に応じていずれの適した濃度で添加してもよい。例えば、1μg/ml-10,000μg/mlの範囲、例えば5μ/ml-1000μg/mlの範囲、例えば10μg/ml-300μg/mlの範囲、例えば15μg/ml-200μg/mlの範囲、例えば20-100μg/mlの範囲の濃度である。

MASP-2基質は、MBL/MASP-2複合体に添加する。好ましくは、該基質は、C2もしくはC4のいずれか、またはその両者の混合物、あるいは人工のMASP-2基質である。ある好ましい態様において、基質はC4である。基質は、組換え手法により産生してもよく、あるいは血清由来基質であってもよい。基質は、使用前に精製されていてもされていなくてもよいが、好ましくは精製されている。沈着をモニターするため、基質は、検出可能な標識、例えば酵素、放射性化合物、蛍光化合物、色素、重金属、化学発光化合物などにより標識することができる。

しかしながら、沈着は、特異的結合物質、例えば消化された基質を特異的に認識する抗体、を用いて検出することが好ましい。例えばヒト補体C4cを認識する抗体が使用可能である。該抗体は、検出可能な標識により直接的または間接的に標識することができる。例えば、酵素、放射性化合物、蛍光化合物、色素、重金属、化学発光化合物または親和性化合物によってである。親和性化合物には、例えば他の抗体またはビオチン、ストレプトアビジンが含まれる。

上記工程は、いずれの都合のよい順序で行っても良く、すなわち、基質を阻害抗体より先に、またはそれと同時に添加してもよく、MBL/MASP-2複合体を基質と例えば5分から2時間混合してもよい。通常、MBL/MASP-2複合体が血清中に存在し、血清から前もって精製されていない場合、MBL/MASP-2、基質および抗体は事前に混合される。

本発明のある好ましい態様において、MASP-2の活性は、本明細書中の以下の実施例2、3および6に記載のいずれかの方法を用いて測定する。特に、C4沈着を阻害することができる化合物は、好ましくは実施例2または3に記載の方法の少なくとも一方において、好ましくは両方において、C4沈着を阻害できるであろう。C4沈着を阻害することができる化合物は、より好ましくは少なくとも実施例2に記載の方法にしたがいC4沈着を阻害することができるであろうし、一方完全血清においてC4沈着を阻害することができる化合物は、実施例3に記載のように完全血清においてC4沈着を阻害できるであろう。

結晶の調製
幾度かの試行錯誤の末、MASP-2ポリペプチドの結晶を調製するのに適した条件を同定した。

それゆえ、本発明のある局面は、以下の工程を含む、MASP-2の少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを含む結晶を調製する方法である：
i) 該ポリペプチドを提供する；
ii) 所望により、該ポリペプチドと相互作用することができる化合物を提供する；
i) 該ポリペプチドおよび所望により該化合物を、5-25%の範囲のポリエチレングリコール、0.01 M-0.5Mの範囲の塩、1-10%の範囲の、グリセロールおよび2-メチル-2,4-ペンタンジオールからなる群より選択されるアルコールを含むバッファー（該バッファーのpHは6-9の範囲である）中でインキュベートする条件下で結晶を成長させる；
ii) それにより該結晶を調製する。

本発明のある態様において、該ポリペプチドおよび該ポリペプチドと相互作用することができる化合物の共結晶が調製される。該化合物は、本明細書において後述するいずれの方法によって同定されたものであってもよい。したがって、本発明のある局面において化合物は、調節物質、例えばMASP-2活性の阻害物質、であってよい。

共結晶は、結合性が増強された最適化化合物の設計に有用である。特に、共結晶は、MASP-2のより良い阻害物質の設計に有用でありうる。

バッファーは、好ましくは5-25%の範囲、より好ましくは10-20%の範囲、さらに好ましくは12-18%の範囲、さらにより好ましくは14-16 %の範囲のポリエチレングリコール、最も好ましくは約15%のポリエチレングリコールを含む。ポリエチレングリコール (PEG)はいずれの適したPEGであってもよく、例えばPEG 4000、PEG 6000およびPEG 8000からなる群より選択されるPEGであり、好ましくは、ポリエチレングリコールはPEG 6000である。

バッファーは、好ましくは0.01 M-0.5 Mの範囲、より好ましくは0.02-0.4 Mの範囲、さらに好ましくは0.05-0.3 Mの範囲、さらにより好ましくは0.08-0.2 Mの範囲の塩、最も好ましくは約0.12 Mの塩を含む。塩はいずれの有用な塩であってもよく、好ましくは、塩はNaClである。

バッファーは、好ましくは1-10%の範囲、より好ましくは2-9%の範囲、さらに好ましくは3-8%の範囲、さらにより好ましくは4-6%の範囲の、グリセロールおよび2-メチル-2,4-ペンタンジオールからなる群より選択されるアルコール、最も好ましくは約5%の、グリセロールおよび2-メチル-2,4-ペンタンジオールからなる群より選択されるアルコールを含む。好ましくは、該アルコールはグリセロールである。

バッファーは、好ましくは6-9の範囲、より好ましくは6.5-8.5の範囲、さらに好ましくは7-8の範囲、さらにより好ましくは7.4-7.5の範囲のpHを有する。

インキュベーションは、適した温度で行うべきであり、好ましくは5-25℃の範囲、より好ましくは10-25℃の範囲、さらに好ましくは15-25℃の範囲、さらに好ましくは18-22℃の範囲、さらにより好ましくは約20℃の温度である。

結晶は、いずれの適した方法により成長させてもよく、例えばハンギングドロップ法である。

構造の決定
結晶の構造は、当業者に知られるいずれの方法により決定してもよく、例えばX線回折を用いる。構造が同定された後、該構造は、適したソフトウェアを用いて精密化することができる。

本発明のある態様において、分子置換技術を用いることができる。そのような技術には、三次元構造を決定したいポリペプチドまたは複合体の結晶についてX線回折データを得ることによって構造を決定することが含まれる。続いて、そのポリペプチドまたは複合体の三次元構造は、分子置換技術を用いて構造類似のタンパク質の既知の構造座標を参照してX線回折データを分析することによって決定される。MASP-2のドメインを含むポリペプチドの場合、C1rまたはC1における類似ドメインの構造座標を用いることができる。米国特許第5353236号に記載のように、例えば、分子置換は、既知の構造を有する分子を出発点として未知の結晶性サンプルの構造をモデリングする。この技術は、単位格子中に類似の構造、配向および位置を有する２つの分子は同様に回折する、という原理に基づく。分子置換には、既知の構造を未知の構造と同じ位置および配向にて単位格子中に位置付けることが含まれる。位置付けの後、単位格子中の既知の構造の原子を使用して、仮想回折実験から得られるであろう構造因子を計算する。これには、実験データと既知の構造のアラインメントが達成させるまで、既知の構造を6次元（six dimension）（3角度次元および3空間次元）において回転させることが含まれる。このおおまかな構造を各種の精密化技術により精密化して、より正確かつしばしばより高分解能の構造をもたらすことができる。例えば、実験データにより規定された構造について得られたモデルを、6次元において限定されたさらなる回転に供する剛体精密化（rigid body refinment）にかけて、約5%未満のポジショニングシフトとすることができる。精密化後のモデルを、さらに他の既知の精密化方法を用いて精密化してもよい。

MASP-2ポリペプチドまたは該ポリペプチドと相互作用化合物との複合体の三次元構造を決定するための別の方法は、ホモロジーモデリング技術である。ホモロジーモデリングには、１以上の関連タンパク質、タンパク質ドメインおよび／またはサブドメインの構造座標を用いて未知の構造のモデルを構築することが含まれる。ホモロジーモデリングは、三次元構造を解析しようとするタンパク質またはペプチドの共通または相同部分を、相同の構造エレメントの三次元構造にフィットさせることにより行うことができる。ホモロジーモデリングには、アミノ酸（または他の要素）が解析しようする関連構造のものと置換して三次元構造の一部または全てを再構築することが含まれうる。

構造決定の例は、実施例1に概説される。

本発明の結晶性ポリペプチドの構造座標は、三次元形状を表示するため、あるいはそれらが規定する構造座標もしくは三次元構造のコンピュータを使った操作または前記構造座標もしくは三次元構造に基づく演算処理が関与する他の用途のため、機械読み取り可能保存媒体、例えばコンピュータハードドライブ、ディスケット、DATテープ、CD-ROM等に、機械読み取り可能形態にて保存することができる。例えば、MASP-2ポリペプチドの三次元構造を規定するデータは、機械読み取り可能保存媒体に保存することができ、また、典型的には該保存媒体からデータを読み取ることができかつそのようなデータから表示を創出するための指示によりプログラムされたコンピュータを用いて、タンパク質構造の図形的三次元表示として表示することができる。本発明は、したがって、機械、例えば本発明の結晶性組成物の構造座標、例えば表３に示す座標または表４に示す座標、を表すデータを、さらなる所望のデータおよびそのようなデータを操作するための指示と共に含むメモリを有するコンピュータ、を包含する。そのようなデータは、様々な目的に、例えば他の関連構造の解明および医薬品開発に使用することができる。

そのような機械読み取り可能データの第１のセットは、第２の機械読み取り可能データのセットに対応する座標の少なくとも一部を第１のデータセットおよび第２のデータセットを用いて決定するための指示がプログラムされた機械を用いて、第２の機械読み取り可能データのセットと組み合わせてもよい。例えば、第１のデータのセットは、表３に示す複合体の座標または表４に示す座標の少なくとも一部のフーリエ変換を含むことができ、一方第２のデータのセットは、分子または分子複合体のX線回折データを含むことができる。

より具体的には、本発明のある目的は、MASP-2の触媒ドメインを含む共複合体の三次元構造情報を提供することである。そのため、我々は、別の類似のセリンプロテアーゼ、例えば別のMASPまたはポリペプチドと相互作用化合物の複合体、の結晶形態の三次元構造を、例えば分子置換またはホモロジーモデリング技術によって解析するための、本発明の結晶性組成物またはその一部の構造座標の使用を提供する。

例えば、分子置換を使用して、表３に示すような座標のセットを利用し、MASP-2の触媒ドメインを含むポリペプチドと相互作用化合物との結晶性共複合体の構造を決定することができる。分子置換を使用して、表４に示すような座標のセットを利用し、チモーゲンMASP-2ポリペプチドを含むポリペプチドと相互作用化合物との結晶性共複合体の構造を決定することができる。

構造の用途
本発明に記載のポリペプチドの3D表示は、幾つかの目的で、例えば類似のタンパク質またはポリペプチドの構造を決定するために (上記も参照)、あるいは該ポリペプチドと相互作用することができる化合物を設計するために、有用でありうる。

例えば、MASP-2ポリペプチドについて機械読み取り可能データにより規定される三次元構造は、各種化学物質または被検化合物に結合する能力について、コンピュータ的に評価することができる。本明細書で用いる「化学物質」なる用語は、化合物、少なくとも２つの化合物の複合体およびそのような化合物または複合体のフラグメントを意味する。

例えば、MASP-2ポリペプチドまたはその複合体の3D構造を規定する機械読み取り可能データの第１のセットは、対象とする化学物質または被検化合物の構造を規定する機械読み取り可能データの第２のセットと、MASP-2ポリペプチドまたはその複合体と結合する化学物質または化合物の能力および／またはそのような結合の位置および／または配向を評価するための指示がプログラムされた機械を用いて組み合わされる。そのような方法は、タンパク質表面とそのような化学物質との結合の位置、配向、およびエネルギーについての示唆を提供する。

データにより規定される三次元構造は、構造の目視による検討およびポリペプチド成分と相互作用化合物との結合の目視による検討を可能とする図の形式にて表示することができる。あるいは、より定量的またはコンピュータ的な方法を使用してもよい。例えば、本明細書に示す分子または分子複合体のいずれかと結合する化学物質の能力を評価するための本発明のある方法は、以下の工程を含む： (a)コンピュータ的手段を用いて、化学物質と結合部位あるいは分子または分子複合体の他の表面特徴との間のフィッティング操作を行う;および(b) 該フィッティング操作の結果を解析し、化学物質と結合部位との間の結合を定量する。

本発明はさらに、以下のための、本発明の結晶性組成物の構造座標またはその一部の使用を提供する：三次元構造内の、好ましくは結合部位内であるかまたは結合部位に近接する、反応性アミノ酸、例えばシステイン残基、を同定するため；分子表面、例えば水分アクセス可能表面またはすべての原子の空間充てんファンデルワールス表面を含む表面、を作成し可視化するため；タンパク質または複合体の表面特徴、例えば基質結合部位、の大きさおよび形状を計算し可視化するため；三次元構造内の、好ましくはリガンド結合部位内であるかまたは該結合部位に近接する、可能性ある水素結合ドナーおよびアクセプターの位置を決定する；三次元構造内の、好ましくはリガンド結合部位内であるかまたは該結合部位に近接する領域の疎水性および親水性を計算するため；および、対象とする選択した官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、メチレン、アルキル、アルケニル、芳香族炭素、芳香環、ヘテロ芳香環など）に関して好ましい相互作用エネルギーを有するタンパク質表面上の領域またはそれに隣接する領域を計算し可視化するため。前述の方法は、MASP-2ポリペプチド、および該ポリペプチドと可能性ある相互作用化合物の一部分との相互作用の特徴決定を行い、反応性アミノ酸（例えばシステイン）に特異的に共有結合することができる化合物を設計または選択するため、およびタンパク質の表面特徴に対して補完的な特徴（例えば、大きさ、形状、電荷、疎水性/親水性、水素結合に関与する能力、など）を有する化合物を設計または選択するために使用することができ、それらのセットは事前に選択されていてもよい。構造座標を用いると、複合体状態におけるタンパク質に対する所定のリガントの配向、結合定数または相対的親和性を予測または計算することも、またその情報を親和性が改善された化合物を設計または選択するために使用することもできる。

そのような場合、MASP-2ポリペプチドまたはその一部もしくは複合体の構造座標は、所望の操作を実行するための指示がプログラムされ、かつ必要なさらなるデータ、例えば可能性ある相互作用化合物またはその部分の構造的および／または機能的特徴を規定するデータ、各種アミノ酸の分子的特徴を規定するデータなど、を含む機械に、機械読み取り可能形態にて入力される。

本発明のある方法は、化学構造のデータベースからMASP-2ポリペプチドに結合することができる化合物を選択するための方法を提供する。この方法は、本発明の結晶性組成物の構造座標、例えばMASP-2ポリペプチドまたはその一部またはその複合体の三次元構造を規定する座標から出発する。その三次元構造に関連する点を、１以上の官能基との相互作用の好ましさに関して特徴決定する。続いて、先の特徴決定にしたがい、タンパク質との好ましい相互作用のため配置された１以上の官能基を含む候補化合物について、化学構造のデータベースをサーチする。そして、三次元構造との好ましい相互作用の点と最もよくフィットする構造を有する化合物が同定される。

そのようなサーチは、必須ではないものの大抵、コンピュータを用いて行われることが好ましい。その場合、MASP-2ポリペプチド、その一部、またはそのポリペプチド/相互作用化合物複合体の3D構造を規定する機械読み取り可能データの第１のセットは、対象とする１以上の部分または官能基を規定する機械読み取り可能データの第２のセットと、官能基とポリペプチドの原子との間の好ましい相互作用について好ましい位置を同定するための指示がプログラムされた機械を用いて、組み合わされる。そして、第３のデータのセット、すなわち、ポリペプチドと官能基との間の好ましい相互作用の位置を規定するデータが生成される。この第３のデータのセットは、続いて、１以上の化学物質の3D構造を規定する第４のデータのセットと、ポリペプチドとのそれぞれの好ましい相互作用の位置に最もよくフィットするよう配置された官能基を含む化学物質を同定するための指示がプログラムされた機械を用いて、組み合わされる。

前述の手段のいずれかにより選択または設計された構造を有する化合物は、MASP-2ポリペプチドに対する結合能力について試験されうる。

本発明のある好ましい態様において、化合物は、好ましくはMASP-2活性の調節物質である。例えば、MASP-2の基質結合部位に相互作用することができる化合物は、良好なMASP-2活性の阻害物質でありうる。したがって、前述の手段のいずれかにより選択または設計される構造を有する化合物は、MASP-2活性を調節する能力、例えばMASP-2活性を阻害する能力について試験されうる（上記を参照）。

当業者が認識するように、所定のポリペプチド（またはその一部または複合体）と本明細書に記載されるようなMASP-2ポリペプチドまたはその複合体との間の三次元構造の類似度（similarity）を決定するため、各種のコンピュータ的解析が使用可能である。そのような解析は、市販のソフトウェアアプリケーション、例えばQUANTA (Molecular Simulations Inc., Waltham, Mass.) version 3.3のMolecular Similarityアプリケーションを用いて、添付の使用説明書第３巻第１３４−１３５頁の記載のように実行することができる。

Molecular Similarityアプリケーションにより、相異なる構造、同じ構造の相異なるコンフォメーション、および同じ構造の相異なる部分の間の比較が可能となる。Molecular Similarityにおいて用いられる構造を比較するための方法は、以下の４つの工程に分けられる：(1) 比較すべき構造をロードする；(2) これら構造における原子同等性（atom equivalence）を規定する；(3) フィッティング操作を行う；および(4) 結果を解析する。

各構造は、名前により特定される。１つの構造が、ターゲット（すなわち固定構造）として特定される；残りの全ての構造は、ワーキング構造（すなわち、可動（moving）構造)である。QUANTA内の原子同等性は使用者のインプットにより規定されるので、本発明の目的のため我々は、比較する２つの構造間で保存されている全ての残基について同等原子をタンパク質骨格原子(N, Cα, (, CおよびO)と規定し、リジッドフィッティング（rigid fitting）操作のみを検討する。

リジッドフィッティング方法を用いる場合、ワーキング構造を変形（translate）および回転し、ターゲット構造との最適なフィッティングを得る。フィッティング操作には、特定の同等原子のペアのフィットの二乗平均平方根の差（root mean square difference）が絶対最小値となるように可動構造に適用しようとする最適な変形および回転をコンピュータで計算する、最小二乗フィッティングアルゴリズム（least squares fitting algorithm）が使用される。オングストローム単位で与えられるこの数字は、QUANTAにより報告される。

本発明の目的では、適当な本発明のタンパク質または複合体の構造座標、例えば表３に挙げる座標または表４に挙げる座標、と重ね合わせた場合に保存残基の骨格原子 (N, Cα,(, C, O)の二乗平均平方根偏差が1.5 Å未満であるMASP-2ポリペプチドまたはその分子複合体の構造座標のセットは、いずれも同一と考える。より好ましくは、二乗平均平方根偏差は1.0 Å未満である。 最も好ましくは、二乗平均平方根偏差は0.5 Å未満である。

「二乗平均平方根偏差（root mean square deviation）」なる用語は、平均からの偏差の二乗の相加平均の平方根を意味する。それは、トレンドまたはオブジェクトからの偏差またはばらつきを表現する方法である。本発明の目的では、「二乗平均平方根偏差」は、あるタンパク質の骨格における、本発明のタンパク質、例えば表３の構造座標により規定されるMASP-2のCCP-2/セリンプロテアーゼドメイン、または表４の構造座標により規定され、本明細書に記載されるMASP-2のチモーゲンCCP-2/セリンプロテアーゼドメイン、の骨格からのばらつきを規定する。

「最小二乗（least squares）」なる用語は、観察された値の偏差の二乗の合計が最小のものが最良推定値であるという原理に基づく方法を意味する。

本発明の結晶性物質について作成された構造座標、例えば表３に示す構造座標または表４に示す構造座標、を使用するため、しばしば、それらを三次元形状にて表示すること、または三次元形状に変換すること、あるいはそれらを操作することが必要であるか、または望ましい。これは典型的には、市販のソフトウェア、例えば構造座標のセットから分子またはその一部の三次元図形表示を生成できるプログラムを用いて、達成することができる。

例として、タンパク質構造を可視化または操作するためのコンピュータ プログラムの非限定的な例には、以下が含まれる：

Midas (Univ. of California, San Francisco)
MidasPlus (Univ. of Cal., San Francisco)
MOIL (Univeristy of Illinois)

Yummie (Yale University)
Sybyl (Tripos, Inc.)
Insight/Discover (Biosym Technologies)
MacroModel (Columbia University)
Quanta (Molecular Simulations, Inc.)
Cerius (Molecular Simulations, Inc.)
Alchemy (Tripos, Inc.)
LabVision (Tripos, Inc.)
Rasmol (Glaxo Research and Development)
Ribbon (University of Alabama)
NAOMI (Oxford University)
Explorer Eyechem (Silicon Graphics, Inc.)
Univision (Cray Research)
Molscript (Uppsala University)
Chem-3D (Cambridge Scientific)
Chain (Baylor College of Medicine)
O (Uppsala University)
GRASP (Columbia University)
X-Plor
(Molecular Simulations, Inc.; Yale Univ.)
Spartan (Wavefunction, Inc.)
Catalyst (Molecular Simulations, Inc.)
Molcadd (Tripos, Inc.)
VMD (Univ.of Illinois/Beckman Institute)
Sculpt (Interactive Simulations, Inc.)
Procheck (Brookhaven Nat'l Laboratory)
DGEOM (QCPE)
RE_VIEW (Brunel University)
Modeller (Birbeck Col., Univ. of London)
Xmol (Minnesota Supercomputing Center)
Protein Expert (Cambridge Scientific)
HyperChem (Hypercube)
MD Display (University of Washington)
PKB
(Nat’l Center for Biotech. Info., NIH)
ChemX (Chemical設計, Ltd.)
Cameleon (Oxford Molecular, Inc.)
Iditis (Oxford Molecular, Inc.)

そのようなプログラムによる本発明の結晶性物質についての構造座標の保存、移動、および使用のため、機械読み取り可能データがコードされたデータ保存マテリアルを含む機械読み取り可能な保存媒体が提供され、ここで該データは、該データを用いるための指示がプログラムされた機械、例えば上記記載のような１以上のプログラムがロードされたコンピュータ、を用いた場合に、本明細書に記載のいずれかの分子または分子複合体の図形的三次元表示を表示できるものである。データ保存マテリアルを含む機械読み取り可能な保存媒体には、常套的なコンピュータハードドライブ、フロッピーディスク、DATテープ、CD-ROM、および他の磁気、光磁気、光学、フロプティカル媒体およびコンピュータでの使用に適合しうる他の媒体が含まれる。

さらに好ましいのは、MASP-2ポリペプチドの構造座標、例えば表３に示す座標＋/−そのアミノ酸の保存された骨格原子から1.5 Å以下の二乗平均平方根偏差、により規定される分子または分子複合体の図形的な三次元表示を表示できる機械読み取り可能データ保存媒体である。本発明のこの局面の例示的態様は、好ましくはPDBフォーマットの表３の座標を含むデータセットがコードされた、常套的3.5”ディスケット、DATテープまたはハードドライブである。図１は、そのようなポリペプチドの図形的三次元表示を印刷したものを示す。

別の態様において、機械読み取り可能データ保存媒体は、機械読み取り可能データの第１のセットがコードされたデータ保存マテリアルを含み、ここで該データは表３または表４に示す構造座標（あるいはまたその誘導体）のフーリエ変換を含み、かつ該データを用いるための指示がプログラムされた機械を使用した場合に、分子または分子複合体のX線回折パターンを含む機械読み取り可能データの第２のセットと組み合わせて、機械読み取り可能データの第２のセットに対応する構造座標の少なくとも一部を決定できる。

そのようなシステムには、例えば、セントラルプロセシングユニット (「CPU」)、ワーキングメモリ（例えばRAM (ランダムアクセスメモリ)または「コア」メモリ、大容量メモリ（例えば１以上のディスクドライブまたはCD-ROMドライブ）であってよい）、１以上のブラウン管(「CRT」)表示端末、１以上のキーボード、１以上の入力ライン(IP)、および１以上の出力ライン(OP)（これらがすべて常套的な双方向システムバスによって相互接続している）を含むコンピュータが含まれる。

入力ラインによりコンピュータにつながっている入力ハードウェアは、様々な方法にて実施可能である。本発明の機械読み取り可能データは、電話線につながった１または複数のモデムまたは専用のデータラインを使用してインプットされうる。あるいは、またはさらに、入力ハードウェアは、CD-ROMドライブまたはディスクドライブを含んでも良い。CRT表示端末と併せて、キーボードもまた入力デバイスとして使用可能である。

出力ラインによりコンピュータにつながっている出力ハードウェアも同様に、常套的デバイスにより実施可能である。例として、出力ハードウェアには、本明細書に記載のQUANTAのようなプログラムを用いて本発明のタンパク質（またはその一部）の図形的表示を表示するためのCRT表示端末が含まれうる。出力ハードウェアはまた、ハードコピー出力を作成しうるためのプリンター、または後の使用のためシステムアウトプットを保存するディスクドライブを含みうる。

操作において、CPUは、各種の入力および出力デバイスの使用を調整し、大容量からのデータアクセス、およびワーキングメモリから、またはワーキングメモリへのアクセスを調整し、かつデータ処理工程の順序を決定する。様々なプログラムが、本発明の機械読み取り可能データを処理するために使用可能である。そのようなプログラムの例は、本明細書において前述される。本目的に適したアルゴリズムはまた、Cast-3D (Chemical Abstracts Service)、3DB Unity (Tripos, Inc.)、Quest-3D (Cambridge crystallographic Data Center)およびMACCS/ISIS-3D (Molecular Design Limited)のようなプログラムにおいても実行可能である。これらの幾何学的サーチは、立体的サーチによって補強可能であり、そこでは結合部位の大きさおよび形状の要件が許容されない寸法を有するヒットを除くために使用される。FRAPのFRBに適用されるサーチにおいて幾何学的および立体的要件を同期（synchronize）させうるプログラムには、CAVEAT (P. Bartlett, University of California, Berkeley)、HOOK (MSI) 、ALADDIN (Daylight Software)およびDOCK (http://www.cmpharm.ucsf.edu/kuntz-/kuntz.html and references cited therein)が含まれる。これらサーチプロトコールは全て、既存の法人データベース、Cambridge Structuralデータベースまたは化学業者が提供する利用可能な化学的データベースと併せて使用することができる。

MASP-2ポリペプチドと相互作用することができる化合物を同定するための方法の非限定的な例を実施例５に示す。

本発明のある態様において、本発明の方法には、MASP-2またはそのフラグメントと相互作用できる可能性のある数多くの化合物を同定することが含まれ、例えば本方法は、MASP-2またはそのフラグメントと相互作用できる可能性のある化合物のサブライブラリーの同定を含みうる。これは、いずれの常套的方法を用いても達成することができる。例えば、はじめに、コンビナトリアルライブラリーの可能性あるすべてのメンバーが、利用可能な試薬および確立された合成化学にしたがい列挙されうる。続いて個々のメンバーが別々に、MASP-2ポリペプチドの結合部位にドッキングされうる。最後に、最適なサブライブラリーが、それらのドッキングスコアのランキングおよび／または多様性の指標に基づき、合成のため選択されうる。迅速なライブラリー列挙のためのソフトウェアが開発されており、それには例えばSybylにおけるCombiLibMaker、Cerius2におけるAnalog Builder、およびMOE (MOE Software, Chemical Computing Group, 1010 Sherbrooke Street W., Suite 910, Montreal, Canada H3A 2R7)において利用可能なQuaSAR-CombiGen モジュールが含まれる。これらプログラムのほとんどは、フラグメントまたは反応のいずれかに基づくスキームを用いて、何百万もの化合物を含むコンビナトリアルライブラリーについてすべての2Dまたは3D構造を簡単に作成することができる。これらのソフトウェアパッケージ内の他のツールはまた、ドッキング前に仮想ライブラリーの大きさを縮小するために使用可能である。例えば、CombiLibMakerにより列挙されたライブラリーを続いてDiverse Solutions（Sybylにおいて利用可能）により解析し、化学的環境を適切に抽出するサブライブラリーを提供することができる。QuaSAR-CombiDesignは、MOEにおいて利用可能な別のコンビナトリアルライブラリー設計ツールであり、それは非列挙的コンビナトリアルライブラリー作成方法を提供し、例えばライブラリー生成中に統計学的抽出技術を用いて５つのフィルターのルールに対して試験し、使用者の規定した性質の範囲内である小規模なサブライブラリーを作成することができる。原則として、ライブラリー作成に続くドッキング工程は、DOCKまたはFlexX（著作権）のような利用可能なドッキングプログラムのいずれを用いても行うことができ、一方多様性の選択は、例えばDaylight、Tripos (Diverse Solutions)またはBCIから利用可能なソフトウェアを用いて、あるいは例えばDillerおよびMerzにより記載されるハイスループットドッキングにより、行うことができる。

別の例において、分割統治法（divide-and-conquer approach）が使用可能である。このストラテジーにおいては、コンビナトリアルライブラリー中のすべての物質構造を、可変置換基が共通テンプレート上に１または複数の部位を介して連結しているものとして可視化する。このテンプレートをはじめに結合部位とドッキングさせ、トップスコアのポーズのみを保存し、さらに検討する。続いて、個々の置換基を別個にテンプレートの各ポーズ上に連結し、どの置換基が結合部位とよくフィットできるかを評価する。トップスコアの置換基の組み合わせのみをさらに検討し、スコア付けし、結合部位に非常にうまくドッキングできる物全体の構造を同定する。これは、適したソフトウェア、例えばPRO SELECT、CombiBUILD、CombiDOCK、DREAM ++およびFlexX （著作権）を用いて行うことができる。

ある態様において、本発明の方法は、活性部位マップを用いて得られたファーマコフォアの適用を含む。本明細書において「活性部位」なる用語は、化合物との相互作用に関与する部位を意味し、触媒活性のある部位を意味するのではない。本方法は、例えば、見込みある複数の構造的に多様な被検化合物の生成を含む、コンピュータ的アプローチであってよい。複数の構造シリーズについてのサーチは、いずれかの適した方法を用いて、タンパク質構造情報をコンビナトリアルライブラリー設計と組み合わせることにより達成されうる。例えば「Design in Receptor」法 (Murrary et al., 1999)または本明細書において以下に概説される方法を用いることができる。例えばMason et al., 2000に記載されるような、複数のタンパク質コンフォメーションを明らかにする方法もまた使用可能であり、それにはモレキュラーダイナミックシュミレーションからの（例えばCarlson et al., 2000に記載のような)ダイナミックファーマコフォアモデルの作成が含まれる。分子フラグメントを用いて活性部位をマッピングするための実験的およびコンピュータ的ニードルスクリーニング法（needle screening approache）もまた、使用可能であり、例えばBoehm et al., 2000に記載される。部位の点をマッピングするのに適したソフトウェアツール（例えばGRIDおよびSITEPOINT）は、いずれも本発明に使用可能である。部位マップを生成させるためのMCSS技術もまた、使用可能である。

好適な方法は、例えばタンパク質構造の活性部位マップの生成を含む。続いて、すべての可能性ある2-、3-および4-点ファーマコフォアを部位マップから列挙し、ビットストリング (シグネチャー（signeture）)としてこれらファーマコフォアをコードし、インフォマティブライブラリー設計ツールを用いて選択された化合物により探索されるべき空間を規定することができる。本方法の成功を評価する測定基準は、ライブラリー設計において選択された活性骨格（active scaffold）の数であり、第２の指標は活性化合物の数である。部位マップ作成に適したアルゴリズムはいずれも使用可能であり、例えば各活性部位について10〜80の特徴的位置を生成させるアルゴリズムである。そのような方法の例は、実施例４に概説される。

本発明のある態様において、本発明の方法は、部分電荷（partial charge）および溶媒和パラメータ（salvation parameter）を伴うpdbq (Protein Data Bank)フォーマットにてMASP-2の3D構造を調製することを含む。部分電荷は、SYBYL 6.3のような適したコンピュータプログラムおよび例えばMulliken電子密度解析法（Mulliken population analysis method）を用いて、MASP-2ポリペプチドX線結晶構造に割り当てることができる。このように調製された構造は、mol2topdbqのような適したスクリプトを用いて、pdbqフォーマットに変換することができる。溶媒和パラメータ（solvation parameter）は、ADDSOLのようないずれかの適したコンピュータプログラムを用いて、MASP-2に割り当てることができる。

本発明のこの態様において、本方法はさらに、pdbqフォーマットのMASP-2と相互作用できる、および／または該MASP-2を阻害できる見込みのある化合物の構造をpdbqフォーマットにて調製することを含む。電荷は、例えばMulliken電子密度解析法を用いて割り当てることができる。

MASP-2と相互作用する、および／またはMASP-2を阻害する見込みのある化合物のドッキングのため、いずれの適したアルゴリズムも使用可能であり、例えばLamarckian Geneticアルゴリズムである。当業者は、そのアルゴリズムの使用に適したパラメータを容易に設定することができるであろう。ドッキングファイルに基づき、幾つかの性質を計算することができる。以下の性質の少なくとも１つのが決定されることが好ましい：推定自由エネルギー結合（free energy binding）、推定Kiまたは最終ドッキングエネルギー。通常、MASP-2と相互作用する、および／またはMASP-2を阻害する化合物は、低い推定自由エネルギーを有する。好ましくは、推定K_i は、好ましくは2.0x10^-6 M未満、より好ましくは1.0x10^-6 M未満、さらに好ましくは5x10^-7 M未満、より好ましくは1.0x10^-7 M未満、さらに好ましくは5x10^-8 M未満、より好ましくは1.0x10^-8未満、さらに好ましくは5x10^-9未満、例えば3.0x10^-9 M未満、例えば2x10^-9 M未満である。通常、MASP-2の阻害物質の推定K_i は、好ましくは2.0x10^-6 M未満、より好ましくは1.0x10^-6 M未満、さらに好ましくは5x10^-7 M未満、より好ましくは1.0x10^-7 M未満、さらに好ましくは5x10^-8 M未満、より好ましくは1.0x10^-8 M未満、さらに好ましくは5x10^-9 M未満、例えば3.0x10^-9 M未満、例えば2x10^-9 M未満であろう。

MASP-2活性の阻害物質
ある好ましい態様において、本発明は、MASP-2活性の阻害物質を同定する方法に関する。MASP-2の特異的基質結合部位と相互作用することができる化合物は、可能性あるMASP-2活性の阻害物質である。それゆえ、本発明のある目的は、MASP-2の基質結合部位に相互作用することができる化合物を同定することである。これは、例えば、本明細書中にて前述したいずれかの方法を用いて行うことができる。

MASP-2の天然基質には、MASP-2自身(自己活性化)、C2およびC4が含まれる。偽基質には、C1阻害物質が含まれる。したがって、基質結合部位は、C4結合部位、C2結合部位、MASP-2結合部位およびC1阻害物質結合部位からなる群から選択することができる。好ましくは、基質結合部位は、C4結合部位、C2結合部位およびMASP-2結合部位からなる群より選択される。より好ましくは、基質結合部位は、C4結合部位およびC2結合部位からなる群より選択される。

基質結合部位がC2結合部位の場合、好ましくは、MASP-2活性はC2切断である。基質結合部位がC4結合部位の場合、好ましくは、MASP-2活性はC4切断である。基質結合部位がMASP-2結合部位の場合、好ましくは、MASP-2活性はMASP-2自己活性化である。

C2、C4、MASP-2およびC1阻害物質に対するヒトMASP-2上の基質結合部位は、実施例1および図３に詳細に記載される。

MASP-2と特異的に相互作用する化合物
ある態様において、本発明は、MASP-2と特異的に相互作用する化合物の同定に関する。特に、本発明は、MASP-2活性の特異的調節物質の同定に関する。

本発明のある態様において、化合物は、MASP-2活性の特異的阻害物質である。したがって、好ましくは、化合物は、MASP-2のプロテアーゼ活性を阻害することができるが、他のセリンプロテアーゼのプロテアーゼ活性を阻害することはできない。特に、化合物は、MASP-2のプロテアーゼ活性を阻害することができるが、関連セリンプロテアーゼであるC1rおよびC1sのプロテアーゼ活性を阻害することはできないことが好ましい。

本発明の方法は、それゆえ、コンピュータ支援手段を用いて化合物がC1rおよび／またはC1sと相互作用できるか否かを計算することを含みうる。これは、本明細書においてMASP-2フラグメントと相互作用することができる化合物に関して前述したように行うことができる。そして、インシリコ方法により、MASP-2またはそのフラグメントと相互作用できるがC1rおよび／またはC1とは相互作用できないとして同定された化合物が選択されうる。

特異性は、例えば、結合アッセイ、競合アッセイまたは阻害/活性化アッセイのようなインビトロ方法を用いて確認することができる。

したがってある態様において、本発明は、以下の工程をさらに含む方法に関する：
i)コンピュータがそのメモリに第２のポリペプチドの分子モデルの構造座標を含むコンピュータ読み取り可能データをロードするように、該第２のポリペプチドの三次元表示を該第２のポリペプチドの結晶の構造座標から生成させるためのコンピュータに対する指示を実行する；
iii)該分子モデルから、該第２のポリペプチドと選択した１以上の被検化合物との結合により形成されうる１以上の可能性ある分子複合体を計算する；
iv)相互作用の程度を示すアウトプットデータを生成させる；
v)該第２のポリペプチドと相互作用することができない化合物を選択する。

好ましくは、該第２のポリペプチドは、C1r、C1s、MASP-1またはそれらのフラグメントを含み、該フラグメントは、好ましくはそのセリンプロテアーゼドメインを含む。

MASP-2と相互作用する化合物の最適化
前述の方法によりMASP-2と相互作用することができる化合物を同定した後、相互作用が増強されるよう該化合物を再設計することができる。特に、化合物がMASP-2活性の阻害物質の場合、続いて該化合物を出発点として、より効率的またはより特異的な阻害物質を設計することができる。

本発明のある態様において、MASP-2ポリペプチドと該化合物との共結晶が調製されうる。該共結晶は、例えば本明細書において前述したいずれかの結晶調製方法により調製すればよい。

該結晶の構造は、続いて、例えばMASP-2ポリペプチドの構造の決定のため前述したいずれかの方法を用いて決定することができる。

共結晶の構造が明らかとなれば、該構造に由来する情報を用いて、該ポリペプチドと相互作用することができる新規化合物を設計することができる。

化合物
MASP-2またはそのフラグメントと相互作用することができ、所望によりMASP-2の活性を調節することができる化合物は、いずれの有用な化学物質（chemical entity）であってもよい。例えば化合物は、有機低分子、ペプチド、模倣ペプチド（peptidomimetic）、核酸などであってよい。

本発明のある態様において、化合物は、コンビナトリアルライブラリー、例えば有機低分子のコンビナトリアルライブラリー、の成分であってよい。化合物はまた、仮想コンビナトリアルライブラリーの成分であってよい。

前述の方法により設計、選択および／または最適化した化合物は、当業界にて周知の多数の各種方法を用いて、MASP-2ポリペプチドに関する相互作用活性について評価することができる。

例えば、化合物は、天然の基質、例えばC2、C4またはMASP-2、の結合の競合的阻害物質として、活性を評価されうる。競合的阻害は、当業界にて知られる多数の利用可能な技術のいずれによって測定することができる。

化合物はまた、常套的結合アッセイによりMASP-2ポリペプチドまたはそのフラグメントとの相互作用について評価されうる。そのようなアッセイには、例えば、化合物の固体支持体上への固定化、MASP-2存在下におけるインキュベーション、洗浄、および例えばMASP-2特異的抗体を用いる固定化されたMASP-2の存在/非存在の検出、が含まれうる。しかしながら、他の適する方法もいずれも使用可能である。

化合物はさらに、MASP-2活性の調節について評価されうる。MASP-2活性についてのアッセイは本明細書において前述される。

MASP-2と相互作用することができる化合物は、幾つかの目的に好適でありうる。MASP-2活性の調節物質は、例えば、MBLectin経路の異常な活性を特徴とする臨床症状の処置に使用されうる。例えば、MASP-2活性の阻害物質は、慢性炎症性疾患の処置において、あるいは例えばアポトーシスまたはネクローシスによる大規模な細胞死を特徴とする臨床症状において、使用されうる。

MASP-2の阻害物質の非限定的な例には、NPGB、ロイペプチン、APMSF、PMSF、Pefabloc-SCまたはベンズアミジンが含まれる。

［実施例］
実施例１
発現および構造決定
ヒト組換えMASP-2 CCP2-SPフラグメントは、pET-17b 発現ベクターを用いてE.coli BL-21 DE3細胞において発現させた。組換えコンストラクト (328アミノ酸)は、MASP-2のIle363残基に続いて、N末にAla-Ser-Met-Thr 追加テトラペプチドを含む。本フラグメントの精製および機能的特徴決定は、他所に記載される(Ambrus et al., 2003)。ヒトMASP-2はグリコシル化された側鎖を含まないので、E.coli細胞で産生される組換えタンパク質は、天然源から単離されるものと同一である。

構造は、分子置換により解析し、2.25 Å分解能まで精密化した (表１)。精密化終了時、R_workおよびR_freeファクターはそれぞれ0.174および0.224であった。非対称単位は、コンフォメーションが幾分異なる２つの分子 (分子 A および Bと示す)を含む(図１Ａ）。97%の残基は、電子密度マップ上に構築できた。分子 Aの残基405 および分子 Bの残基389を除き、全ての残基がRamachandranプロットの最も好ましい(458)およびさらに好ましい(67)領域に存在する（分子 Aの残基405 および分子 Bの残基389は、広い意味では許容される領域に存在する）。

２つの分子のSPドメインのコンフォメーションは、439-441領域および一部の表面側鎖を除き、非常に良く似ている。非結晶学的制限（restraint）が、SPドメインの残りに適用された。CCP2モジュールのループコンフォメーションおよび両分子のドメイン間リンカーに小さな相違が存在する。グリセロール分子およびナトリウムイオン（いずれも結晶化媒体中に存在）が、電子密度マップ中に構築された。構造的に類似するC1r (Budayova-Spano et al., 2002b)およびC1s (Gaboriaud et al., 2000)を用いたCCPおよびSPドメインの比較を図１ＢおよびＣに示す。

CCP2モジュールの構造
６つのβストランド(B1-B6、図１Ｂ)を有するCCP2モジュール全体のコンフォメーションは、C1s (Gaboriaud et al., 2000)およびC1r (Budayova-Spano et al., 2002a,b)触媒フラグメント構造に見られるCCP2のものと非常によく似ている。CCP2モジュールの最高のB因子（B factor）は、ドメイン間リンカーから最も離れたものである。分子 BのN末セグメントおよびループB4-B5は無秩序である。分子 AおよびB についてのCCP2のCα原子の全体的相違 (r.m.s.d. 0.64Å)は、分子 AおよびC1s (Gaboriaud et al., 2000)についてのもの（0.79 Å）に匹敵する。これは、MASP-2におけるCCP2の顕著なレベルの柔軟性と対応する。C1r構造 (Budayova-Spano et al., 2002a,b)は、顕著に分解能が低く、このことは、それらの全体的相違が幾分高いことを説明しうる (C1r - C1r、MASP-2 - C1rおよびC1s - C1r ペアのr.m.s.d. 値は、それぞれ0.55-0.90 Å、0.84-1.07 Åおよび0.71-1.08 Åの範囲である）。図1Bは、βストランドB1、B2およびB4を重ね合わせた、分子 A、C1sおよびC1rの活性形態のCCP2モジュールを示す。分子 AのMASP-2タンパク質鎖のN末端は、CCP1-CCP2リンカーの一部である。それは、C1rのCCP1-CCP2-SPフラグメント構造(Budayova-Spano et al., 2002a)において検出されたものと類似のコンフォメーションを有し、CCP1-CCP2 接点周囲の立体配置（configuration）はC1rのものと類似するという以前の推測(Feinberg et al., 2003)を支持する。

CCP2モジュールの構造のC1rおよびC1sとの比較により、大きく異なる３つの領域が強調される。ループ B1-B2 (残基 379-385)において、[MASP-2ナンバリングがCCP2モジュールについて用いられる] C1sは欠失を有する。このループのコンフォメーションは、MASP-2およびC1rにおけるもとの類似する。ループ B3-B4 (残基 404-409)は、C1rおよびC1sのいずれにおいても無秩序である。MASP-2において、それはより短く、またそのコンフォメーションはAsn406およびGlu424の側鎖間の水素結合により安定化されている。大きな相違の第３の領域は、ループ B4-B5 (領域420-424)であり、それは３つの分子において同じ長さである。MASP-2におけるこのループのコンフォメーションは、Asn406 - Glu424 水素結合に加えて、Glu424およびLys422の側鎖の弱い静電相互作用により安定化されている。

MASP-2のCCP2モジュールのC1rおよびC1sへの重ね合わせにより、ループ領域 B2-B3 (残基397-401)およびヒンジ領域の残基430-433の位置におけるさらなる小さな相違が明らかになる。これらの相違は、MASP-2の場合に観察される、C1rおよびC1sのものと比較して顕著に異なる相対モジュール配向（realtive module orientation）に寄与する。

MASP-2分子 AおよびBの間に見られる主な相違は、CCP2モジュールの２つの末端のわずかなねじれに相当する: CCP2/SPインターフェースから遠い領域(ループ B1-B2、B3-B4およびB5-B6)はCCP2モジュールの長軸に対してねじれており、一方インターフェースに近い領域 (ループ B2-B3およびB3-B4)はそれに直角な軸に対してねじれている。B1-B2、B2-B3、B3-B4およびB5-B6 ループについての最大Cα原子シフトは、それぞれ1.7 Å、1.4 Å、1.3 Åおよび2.3 Åである。

セミフレキシブルCCP2/SPインターフェース
MASP-2分子AおよびBとC1rおよびC1sとの比較により、CCP2/SPインターフェースを形成するCCP2モジュールの領域のコンフォメーションにおける相違が明らかとなった。

制限された柔軟性は、CCP2/SPインターフェースにおいて異なるフラグメントとC1rの変異体構造との間にも観察された(Budayova-Spano et al., 2002b)。しかしながら、水素結合のネットワークおよびファンデルワールス接触は、チモーゲンC1r CCP1-CCP2-SP、C1r CCP2-SPの活性形態、およびC1sの構造の間で非常によく似ている。驚いたことに、MASP-2構造の両分子において、インターフェース相互作用の新規パターンが見られた。その上、我々は、分子AおよびBの相異なるドメイン配向をもたらす別のインターフェース相互作用を観察した(図2A)。C1r CCP2-SPチモーゲン形態は、C1s構造とMASP-2構造との中間のコンフォメーションと考えることができ、幾つかの水素結合と両方のタイプの接触を有するが、原子間距離が長い。

MASP-2の２つのコンフォメーション変異体の存在は、それらが同じ結晶構造中に存在することから、結晶化媒体における相違によって起こるアーチファクトではありえないことに注目すべきである。CCP2モジュールは結晶ネットワークにおいてゆるく結合しているので、MASP-2分子におけるドメイン配向は、いずれの結晶接触によっても偏ることはないであろう。それは、溶液中において現れるであろうドメイン内柔軟性を示唆し、その上様々な充実した機能に対応しうる。

インターフェース領域の相違は、MASP-2、C1rおよびC1sの相同構造において、CCP2モジュールに対するSPドメインの大きな転移（displacement）を引き起こす。CCP2構造のアラインメントにより、触媒性残基 Ser633 (c195) [キモトリプシンナンバリング（SPドメインを「c」でマーク）] Cα原子のMASP-2の同残基からの大きな転移が、C1s (11.1 Åおよび12.2 Åの距離)およびC1r (9.1 Åおよび13.9Åの距離)についてそれぞれ明らかとなった。これらの相違は、C1rとC1sとの間で観察されるものよりも顕著に大きい (最大距離 6.6 Å) (図2A)。CCP2モジュールの長軸は、C1s構造におけるモジュールインターフェースではSP表面に対してほぼ垂直であり、一方C1rにおいてはわずかに曲がっている。これに対して、CCP2の主軸とSP表面との間の角度は、MASP-2分子AおよびBについてそれぞれたった55°および48°である。しかしながら、埋まっているインターフェースのアクセス可能表面の領域は、これら分子についてよく似ている: MASP-2分子AおよびB、C1s、およびC1r構造について、それぞれ722Ų、748Ų、751Ųおよび578Ų-667Ų (Gaboriaud et al., 2000; Budayova-Spano et al., 2002a,b)。

インターフェースの相互作用残基の多くはC1rおよびC1sに記載のものと対応するが、明らかな相違も存在する。C1sと比較したMASP-2のドメイン間インターフェースの詳細な構造を図2B、CおよびDに示す。C1rおよびC1sに見られるように、B3-B4 ループの保存残基Phe400およびTyr401は、疎水性CCP2-SPリンカーとSPドメインの541-549 (c111-c119)および474-475 (c48-c49)の領域との間に結合する。しかしながら、MASP-2のリンカー残基429-434内のわずかな曲がりは、結果としてPhe400のシフトをもたらす：その側鎖はLeu544 (c114) Asn545 (c115)の上にあるが、対応するチロシンは隣のレジスタ（register）(Gly527 c115 および Pro528 c116)を有するC1sのジペプチド部分の上に位置する。ヒンジの曲がりのため、Tyr401側鎖はIle544 (c114) 骨格 NHから非常に遠く、C1sおよびC1r構造に見られる水素結合は構築されない。分子 BのTyr401 ヒドロキシル基は水分子 (W325)を介してVal542 (c112) カルボニル酸素に接続しており、一方分子 Aのものはさらに回転し、Asp475 (c49) 側鎖により水素結合によって安定化されている。両分子においてドメイン間水素結合がLys541 (c111)およびSer374側鎖によって形成されるが、これはC1sおよびC1r構造には見られない。

MASP-2構造の両変異体について、水分子の水素結合ネットワークがインターフェースを安定化する。両分子において、グリセロール分子が、Leu473 (c47)、Tyr474 (c48)の側鎖、残基Glu431、Pro432、Cys434 (c1)、および550 (c120) - 552 (c122)の骨格原子により形成される空洞（cavity）において結合する。この空洞はC1rおよびC1sにおいてはより開いており、またより疎水性の性質を有するが、それはTyr474が短い側鎖によって、およびGlu431が疎水性残基によって置換されているためである。C1sにおいて相互作用領域に見られる５つのプロリンのうち３つがMASP-2において変化している: Lys541 (c111)、Ser546 (c116)およびThr399 （C1rの場合１つしか異ならない ）。この領域の低いプロリン含量はまた、MASP-2において検出される高い柔軟性に寄与しうる。

MASP-2のCCP2/SPインターフェースについて観察される比較的高い柔軟性は、重要な機能的意味を有しうる。レクチン経路の開始酵素複合体の現在のモデルによれば、MBL分子に結合したMASP-2のホモダイマーが補体カスケードを引き起こしうる (Chen and Wallis, 2001; Wallis, 2002)。MASP-2は、そのN末CUB-EGF-CUB領域 (Thielens et al., 2001)を介してホモダイマーを形成する。C1rおよびC1sとは異なり、MASP-2およびMASP-1はヘテロオリゴマーを形成せず、MASP-2ダイマーが直接MBLに結合できる。MASP-2の機能的ユニットがホモダイマー形態であることは明らかである。MASP-2ホモダイマーがC1複合体におけるC1s-C1r-C1r-C1sテトラマーによって仲介される全ての機能(例えば、MBLへの結合、自己活性化、C4およびC2の切断)を発揮できることは注目すべきである。C1r₂C1s₂ テトラマーは、その機能に必要とされる高度の柔軟性を有する(Arlaud et al., 1987; Tseng et al., 1997; LorinczLQUincz et al., 2000)。理論的には、MASP-2ホモダイマーは、少なくともC1r₂C1s₂ テトラマーと同程度に柔軟でなければならない。にもかかわらず、C1r₂C1s₂ テトラマーは、同レベルの柔軟性を生み出すのにMASP-2ダイマーの２倍のヒンジポイントを有する。それゆえ我々は、MASP-2のヒンジ領域はC1rおよびC1sの対応する領域よりも大きなコンフォメーションの動きを許容すると考えることができる。CCP2およびSPドメインの間のヒンジの曲がりは、一方のSPドメインの活性部位が他方のSPドメインの活性化部位(Arg444-Ile445結合)と接触しなければならない自己活性化中のMASP-2ダイマーのSPドメインの正しいポジショニングに寄与しうる。自己活性化の後、SPドメインは、大きなタンパク質基質：C2およびC4にアクセスするよう、そのダイマーの外側を向かなければならない。MASP-2のCCP2/SPインターフェースが顕著な構造的変動を示すという事実は、この仮説と一致する。

SPドメインの構造
キモトリプシンセリンプロテアーゼファミリーの他のメンバーにおけるように、SPドメインは、互いに圧縮された２つの６ストランドβバレルドメインよりなり、２つのバレルの接点に触媒性残基 Ser633 (c195)、His483 (c57)およびAsp532 (c102)が位置する (図1C)。この構造は、活性あるコンフォメーションにおける触媒装置のエレメントを示す。MASP-2の２つの分子のSPドメインは、活性化ペプチドの440および441 (c10, c11) 残基および幾つかの表面側鎖を除いて、一見同等なコンフォメーションである。切断された活性化ペプチドのC末残基のみが無秩序であり、それは活性化SP構造に典型的である。

我々は、MASP-2の構造をC1r、C1s、消化および凝血（coagulation）セリンプロテアーゼに重ね合わせ、表面ループの構造的特徴を比較した (表２)。驚いたことに、幾つかの表面ループは、C1rまたはC1sよりもスロンビンまたはトリプシンに似ている。MASP-2はC1r（MBL/C1qによるターゲット表面の認識に際する自己活性化）およびC1s（C2およびC4切断）コンフォメーションと同様の機能を有するが、表面ループのほとんどはこれらのいずれとも異なる。

MASP-2、C1rおよびC1sのループ A [我々はPerona and Craik (1997)により提案されるループ命名法を用いる]は、MASP-2およびC1rのループ Aが同じ長さであるにも関わらず、位置においては類似するがコンフォメーションが異なる。MASP-2のみが、先行するヘリックスのループ B (残基485-496)の残基 485-490 (c59-c60d)への伸長を示す。このセグメントのコンフォメーションは、His490 (c60e)環がTyr486 (c60)およびLys489 (c60c) 側鎖炭素原子により挟まれることによって安定化される。ループ Bは、Gln488 Nε2 (c60b) Leu463 (c34) カルボニル酸素水素結合によりループ Aを安定化し、また、Tyr486 (c60)およびHis525 (c96) 側鎖の間に構築されるスタッキング相互作用によりループ Cを安定化する。MASP-2のループ DおよびEは、欠失を有する。ループ D MASP-2およびC1rは同様の位置を有するが、コンフォメーションは相異なる。

C1sにおいて、ループ CはC1rまたはMASP-2よりも顕著に長く、活性部位へのアクセスを制限する。MASP-2においては、ループ 2が基質結合部位をより狭くする挿入を有するが、それは他方の側からである。ループ 1および2は、基質特異的ポケットの底および一方の側面を形成し、それらはトリプシンと非常によく似たコンフォメーションを有する。ループ 3は、Pro 605 (c170B)およびPro606 (c170C)を用いてN末端から基質結合溝（groove）を閉じる。これに対して、C1rおよびC1sのループ 3はより長く(C1sのものは無秩序である)、いずれも基質結合溝をMASP-2のものよりも開いた状態としている。

C1r CCP1-CCP2-SPダイマー構造の場合、ループ領域BおよびEの幾つかの残基がCCP1-SP 相互作用における分子間接触に関与する。MASP-2の対応するループは、長さにおいて、またコンフォメーションにおいても異なり、これはMBL-MASP-2複合体の最近のモデル(Feinberg et al., 2003)とは対照的に、C1r チモーゲン形態について観察される相互作用およびダイマー形成の方法がMASP-2に直接当てはまらないことを示唆する。

MASP-2の基質特異性
MASP-2には少数の天然基質（チモーゲンMASP-2、C2、C4）および偽基質C1阻害物質しか存在せず、このことは基質結合亜部位（subsite）へのアクセスが制限されていることを示唆する。それらは全てP1位置[Schechter and Berger (1967)により提案される命名法]にArgを有するが、その周辺残基は大きさおよび極性においてこれら分子の間で様々であり、亜部位の柔軟性をいくらか必要とする (図3A)。阻害物質と複合体を形成したキモトリプシンファミリーのいくつかのメンバーの結晶構造に見られる基質結合亜部位の共通の特徴は、広く研究されている。我々は、そのような構造を、可能性ある亜部位を特徴決定するためMASP-2 SPドメインに重ね合わせた (図3B)。我々は、そのS1部位がC1rおよびC1sのものよりも深いことを見いだした。MASP-2においては、S2’およびS3亜部位が基質とより接触を構築しうる一方、S2およびS1’亜部位はC1rおよびC1sのものよりも露出している。MASP-2はC1sと基質を共有するが、その基質結合亜部位はほとんど相違する。

前述のように、ループ 1および2のコンフォメーションは、C1rおよびC1sのものより深いS1ポケットを形成するトリプシンのものと類似する。C1sとは対照的であるがC1rと同様に、基質結合ポケットへのアクセスは、Arg630 (c192) 側鎖炭素原子がLeu575 (c143)との疎水性接触により安定化されているため、いずれの無秩序な側鎖によっても影響されない。その結晶構造において、グリセロール分子はS1ポケットの入り口で結合し、ナトリウムイオンは近隣のAsp627 (c189)およびGlu662 (c221)の酸性側鎖にそれぞれ水分子およびSer657 (c217) O_Yを介して接続したポケットの底で結合する。

ナトリウムイオンはループ 2の657-662 (c217-c222) セグメントにより形成されるポケットにおいて結合するが、ループ 2はこの領域に１残基の挿入を含みキモトリプシンのものと類似のコンフォメーションを有する。ナトリウムイオンに配位したグリセロールおよび水分子がP1アルギニン残基に重なるため、ナトリウムイオンおよびグリセロール分子は基質結合に際してS1部位から解離しなければならない。S1特異性の一次決定因子であるAsp627 (c189)は、MASP-2結晶構造において基準（canonical）コンフォメーションに存在する。

結合ペプチドのN末部分と結合する溝は、C1rおよびC1sのものと比較して浅い。S2 亜部位は浅く、Phe529 (c99)はC1rおよびC1sのものと同様の位置にある。P2 残基の側鎖は部分的に溶媒に対して露出しているが、C1sにおいてはこの部位はループ Cによって埋まっている。水が仲介する水素結合は、P2 Gln 側鎖およびループ C のTyr523 (c94)およびGln526 (c96a) 側鎖によって構築されうる。S3 亜部位において、疎水性相互作用が、ループ 2のMet658 (c218)と基質の非極性P3側鎖とにより構築されうる。P3および残基 Gly656 (c216)により形成される水素結合は、結合ペプチドの骨格を安定化する。

離脱基（leaving group）側においては、亜部位へのアクセスはより制限される。S1’部位はC1rおよびC1sのように開いている。C4およびC1 阻害物質の小さなP1’側鎖はThr466 (c37)に接触することができるが、C2のP1’Lys 側鎖はループ BのGlu487 (c60a)と塩橋を形成しうる。P2’側鎖は疎水性または芳香族性であり、Gly631 (c193)およびArg630 (c192)、Leu581 (c148) 、Leu575 (c143)およびThr467 (c41)の側鎖炭素原子により形成される疎水性ポケットにおいて結合する。この亜部位はC1rおよびC1sにも存在する疎水性ポケットであるが、３つの酵素間で相異なる残基により組み立てられている。

Na⁺誘導性
幾つかの止血性プロテアーゼのNa⁺結合による活性の増強は、以前は位置c225における残基によって決定されると示唆されていた (Dang and Di Cera, 1996)。この残基は上記タンパク質においてはPheまたはTyrであるが、消化酵素においてはProであり、c224 カルボニル酸素がNa⁺結合に適する位置とならないようにしている。凝血酵素のさらなる特徴は、水チャンネルを介してNa⁺部位に接続するS1部位の開いた底部である。C1sおよびC1rについてはこの残基はTyrであるが、C1sおよびC1rにおいてそれぞれ３および２の残基欠失を有するループ 2による立体的閉鎖のため、Na⁺結合は構築され得ない。さらに、これら酵素のいずれについてもS1部位は閉鎖されている。

MASP-2は、Tyrを位置c225に有する酵素のさらなる例である。そのループ 2 領域は１残基の挿入を有する。我々のインビトロ実験は、MASP-2がNa⁺活性化酵素ではないことを示す(データ非提示)。MASP-2の構造は閉鎖されたS1部位を示すことから実験データと一致し、またループ 2の661-667 (c221A-c226) セグメントの骨格コンフォメーションは見かけ上トリプシンのものと等しい。MASP-2においては、Gln665 (c224)のカルボニル酸素もまたトリプシンのものとよく似た位置に存在し、C1rおよびC1sを含むチロシン c225を有する酵素のものとは異なる。

665-666 (c224-c225) ペプチド結合のトリプシン様コンフォメーションは、ループ 1の長さがMASP-2およびトリプシンにおいて等しく、またMASP-2およびトリプシンにおいてループ 1および2の間で類似の骨格-骨格相互作用が形成されるという事実により説明することができる。620-664 (c185-c223)および623-662 (c188-c221)水素結合は、残基 Gln665 (c224)のカルボニル基がLeu621 (c185)のカルボニル基に近接した状態を保ち、そのことがそのファミリーのc225プロリン含有酵素に以前見られた位置を保持させている。このことは、Na⁺結合部位の形成には、c225 残基の性質よりも、ループ 2の長さ、さらにループ 1の長さも重要であることを示唆する。

C4d上の可能性ある結合部位
機能的に活性なMASP-2の触媒フラグメントを用いた我々の以前の解析研究により、C2切断はMASP-2のSPドメインにより仲介されるが、MASP-2 CCP2-SPフラグメントのC4切断効率は単一のSPドメインと比較して高度に増強されていることがわかった (Ambrus et al., 2003)。C4切断におけるCCP2モジュールの基本的役割もまた、C1sについて確立された (Rossi et al., 1998)。MASP-2およびC1sのSPドメイン上の結合部位に加えて、CCP2モジュールがC4に対するさらなる結合部位を有する可能性が高い。相同構造複合体に基づき、我々はC4およびMASP-2/C1s CCP2 相互作用についてのモデルを提示する。

CCPモジュールは補体系に広範に存在し、補体成分の作用を調節および制御する重要な役割を有する。しかしながら、それらの結合部位およびそれらの作用の構造学的詳細はあまり知られていない。C4については、他のタンパク質のCCPモジュールの結合部位は知られていない。C4とC3との間の高い相同性を考慮すると、C4d上にC3dに類似のCCPモジュール結合部位がありそうである。その表面に補体受容体2 (CR2)のCCP1 モジュールが結合したC3dの構造が、C4dの構造とともに公開されている (Szakonyi et al., 2001, van den Elsen et al., 2002)。C3d-CR2 複合体は、MASP-2/C1sのCCP2モジュールのC4dによる結合をモデリングするための出発点として役立ちうる。C3d - CR2 複合体において、C3d鎖のNおよびC末端は、C3dのCCP結合表面の反対側である。結果として、C4dの対応する表面でのCCP結合は、C4およびMASP-2/C1sの間の複合体形成を、これら分子の他のドメインの立体障害なしに可能とする。

C3dとC4dの相同性にも関わらず、C3dのCCP結合相互作用は、２つの事実によりC4dに直接あてはめることができない：(1.) C3dの主鎖の水素結合およびH5ヘリックスのカルボキシルレート末端のキャッピングは、主鎖の原子位置におけるシフトおよびC3dおよびC4dの対応するヘリックスの長さの相違により起こるH5ヘリックスのカルボキシルレート末端における相違により、当てはめることができない(van den Elsen et al., 2002)。(2.) 相互作用のCCPモジュール側において、C1sおよびMASP-2のB1-B2ループの長さおよびコンフォメーションがCR2と異なり、またお互いも異なる。しかしながら、C3dおよびC4dについて、それらの推定CCP-モジュール結合表面の相異なる電荷分布 (すなわち、C3dの表面は酸性であるが、C4dの表面は中性である)がそれらの特異性に重要な因子であることが示唆された (van den Elsen et al., 2002)。MASP-2およびC1sのCCP2 表面上のC4d 表面に補完的な保存された電荷分布を有する領域の位置を決定することは、結合表面の同定にとってよい出発点でありうるが、証明するにはさらなる研究が必要である。

MASP-2およびC1sのCCP2ドメインの配列の比較により、５つの荷電残基が保存され、それらが全てN末領域に存在し、そのうち４つはB1 βストランドおよび短いB2-B3 ループに存在し、C4d 表面に対する静電的補完性を有する領域を形成していることが明らかとなった（図4A、BおよびC)。それゆえ、C4 とMASP-2/C1sとの複合体において、これら領域が分子のアラインメントを支配しているのかもしれない。可能性ある接触領域は以下である: C4dのArg1041/Lys1080とMASP-2のGlu378 (C1sのGlu356)、C4dのAsp1044/Asp1054/Glu1083 とMASP-2のArg376 (C1sのLys354) 、およびC4dのArg1148/Lys1155とMASP-2のGlu397/Glu398 (C1sのGlu372/Glu373)。これら側鎖の高い柔軟性は、立体的フィットを確認するための表面形状の微調整をも容易にする。MASP-2およびC1sのCd4結合の提案モデルを図4CおよびDに示す。

機能的意味
MASP-2は、自己活性化し、C3変換酵素酵素複合体の成分であるC4およびC2を切断することができるので、補体のレクチン経路の開始に重要な役割を果たす。補体活性化の古典的経路において、これらのタンパク分解活性は、２つの別個のプロテアーゼ: C1rおよびC1sにより仲介される。本研究に記載される構造は、自然免疫の構成要素であるレクチン経路のプロテアーゼの触媒機構についての最初の洞察を提供する。

MASP-2ダイマーは、C1複合体においてC1r₂C1s₂ テトラマーがC1qに結合するように、MBLのコラーゲン様の柄に結合する。インビトロ実験においてMBLがC1r₂C1s₂ テトラマーに結合し、またそれを活性化できることから (Ohta et al., 1990; Lu et al., 1990)、これら結合の性質および超分子複合体の構造は類似するに違いない。MBL - MASP-2 (Feinberg et al., 2003) およびC1 (Budayova-Spano et al., 2002b) 複合体の現在のモデルは、認識分子および結合型セリンプロテアーゼの両方の、活性化プロセスにおけるかなりの柔軟性を想定する。我々の本研究は、これらの観点を補強する: 我々は、MASP-2のCCP2/SPインターフェースでかなりの柔軟性を観察した。C1sの場合、CCP2モジュールは、側鎖のプロリンおよびチロシンリッチ疎水性フレームワークを介してSPモジュールの表面にしっかりと固定化される。C1rの場合、対応する相互作用はそれより弱く、柔軟性が検出される。MASP-2の場合、CCP2/SPインターフェースが柔軟であるだけでなく、その異なるコンフォーマーは異なる相互作用によって安定化される。自己活性化中、効率的切断のためには、相互作用するSPドメインの正確なポジショニングが必要とされる。C1rおよびMASP-2がいずれもCCP2/SPインターフェースにおいて柔軟性を示すという事実は、CCP2およびSPドメインの相対位置が自己活性化プロセスにおいて重要な因子でありうることを示唆する。

C1r₂C1s₂ テトラマーにおいて、C1r 分子は、触媒性CCP1-CCP2-SP領域を介して互いに結合している。これは、C1複合体の静止期（resting state）において２つのC1rモノマーのSPドメインが比較的近接していることを意味する。MASP-2分子は、しかしながら、N末 CUB1-EGF-CUB2 領域の相互作用を介してダイマーを形成するので、MASP-2モノマーのSPドメインはダイマーの両端に存在する。それゆえ、自己活性化中にMASP-2の末端のSPドメインを正しい位置とするために、顕著な柔軟性が必要なようである。それに続くC2およびC4基質の切断もまた、MASP-2ダイマーのコンフォメーション、特にSPドメイン、の顕著な動きが必要である。自己活性化中は近接しているSPドメインは、大きなタンパク質基質にアクセスするため離れなければならない。言い換えれば、MASP-2ダイマーの閉鎖された環状コンフォメーションは、開放形態に変換されなければならない。同様のコンフォメーション変化が、C1sがC4およびC2切断に関与するC1複合体において起こるはずである。MASP-2ダイマーと同様に、C1sのSPドメインはC1r₂C1s₂ テトラマーの両端に存在する。しかしながら我々は、そのテトラマーは前記ダイマーの約２倍の長さがあり、ヒンジポイントでの制限された柔軟性が結果として顕著なコンフォメーション変化をもたらしうることを考慮すべきである。それゆえ我々は、MASP-2の他の潜在的ヒンジポイント (例えば、CCP1-CCP2およびCUB2-CCP1接合部) は、対応するC1sの領域よりも、さらにおそらくC1rの領域よりも、柔軟であるとの仮説を立てることができる。

我々が以前に示したように、MASP-2の基質特異性は、CCP2およびSPドメインにより決定される (Ambrus et al., 2003)。MASP-2およびC1sのSPドメインは、効率的C2結合および切断にとって必要なすべての接触部位を含み、C1阻害物質と共有結合複合体を形成する。それゆえ、機能的に密接に関連する、高度に特異的なその２つのSPドメインにおいて、S1および亜部位の優先度（preference）を決定する表面ループのほとんどが相異なるコンフォメーションを示すことは驚くべきことである。同じ基質特異性が相異なる酵素-基質相互作用を介して実現されるようである。我々のMASP-2構造を用いて、他の活性化経路を妨害することなく、レクチン経路の望ましくない病的活性化(例えば、虚血再灌流の場合）を特異的に阻害するであろう合成阻害物質を設計することが可能である。

C4切断について、CCP2モジュールの存在は、効率的反応に必要である。我々は、CCP2モジュールがC4基質に対するさらなる結合部位を含むと仮定することができる。この推測は速度論データにより支持され、なぜならCCP2モジュールの存在がより強い基質の結合を示唆するK_M 値における減少を引き起こすからである(Ambrus et al., 2003)。 この現象は、CCPモジュールが分子の触媒的性質にも強く影響するC1r (Kardos et al., 2001)およびC1s (Rossi et al., 1998)と非常に良く似ている。モデリング研究 (中性子散乱測定に基づく）は、C4が溶液中で２つのドメイン構造を有することを示唆する(Perkins et al., 1990)。この２つのドメインは、C4bのファクター I切断の後に切り離されうるC4cおよびC4dフラグメントに相当する。両ドメインがCCPモジュール含有タンパク質に対する結合部位を含む可能性がある。C1sおよびMASP-2のSPドメインへのCCPモジュールの付加により引き起こされるC4切断の触媒効率の劇的な増加は、酵素と基質の間の非常に強い相互作用を示唆する。

我々はCCPモジュールがC4cおよびC4dドメインの両方と接触を構築している可能性を排除できないものの、本研究において我々は、C4d フラグメントの構造(van den Elsen et al., 2002)およびMASP-2およびC1SのCCP2モジュールの構造を用いてC4とプロテアーゼの間の相互作用をモデリングする。MASP-2およびC1のSPドメインの表面は、長さおよびコンフォメーションにおいて高度の多様性を示すループによって主に形成され、一方CCP2モジュールの表面は、構造的に保存された第二要素 （すなわち、β-² ストランド)により形成される。我々は、それゆえ、それらのCCP2モジュール上の可能性あるC4結合部位は同様の相互作用パターンを有すると考えることができる。部位特異的突然変異誘発により、CCP2-C4相互作用において提案される結合部位の側鎖の寄与が検討される。

材料および方法
結晶化およびデータ収集
高品質な結晶を得るため、結晶の成長のための数百の相異なる条件の試験も含め、多数の実験を行わなければならなかった。

各種条件には、各種濃度のPEG 6000およびPEG 3500 (10%〜30%)、各種温度(20℃および4℃)、各種pH値 (pH7〜pH8.5 、0.2ずつ増加)の試験が含まれる。他の因子、例えばNaClおよびグリセロールもまた変化させた。さらに、タンパク質濃度およびハンギングドロップの容量を最適化した。

等容量のリザーバーバッファー (30% PEG 6000、0.1 M NaCl、10% グリセロール、0.1M Tris pH7.5)とタンパク質溶液(0.8 mg/ml タンパク質濃度、140 mM NaCl、20 mM Tris pH7.4)を20℃で混合すると、良好な回折結晶が成長した。

結晶は、ハンギングドロップ法により20℃で成長させた。結晶は、2μlのリザーバー溶液および2μlのタンパク質溶液を混合して得た。リザーバー溶液には、30% PEG 6000、0.1M NaCl、10% グリセロールおよび0.1M Tris-HCl pH 7.5が含まれた。タンパク質溶液には、0.8 mg/mlの活性形態のMASP2 CCP2-SP (Ambrus et al., 2003)、140mM NaClおよび20mM Tris/HCl pH 7.4が含まれた。シンクロトロンデータは、LUREでDW32 ビームラインにて、およびSPring-8でBL41XUビームラインにて収集した。スケーリングの問題により、前者のデータセットを構造決定に用いた。Mosflm (Leslie, 1993)、およびCollaborative Computing Project 4 (CCP4, 1994)のプログラム SCALA (Evans, 1993)およびTRUNCATE (French and Wilson, 1978) を用いて、データを処理し、分解能は2.23 Åのスケールとした。非対称単位は２つの分子を含む。

構造決定および精密化
構造は、C1sのCCP2およびSPドメイン(PDB id 1elv)をサーチモデルとして用いて、Collaborative Computing Project 4のプログラム Beast (Read, 2001)を使用し、分子置換により解析した。精密化は、Refmac5 (Murshudov et al., 1997)により、制限最尤精密化（restrained maximum likelihood refinement）およびTLS 精密化 (Winn et al, 2001)を使用して実行した。Arp (Lamzin and Wilson, 1997)を、自動溶媒構築（automatic solvent building）に使用した。モデル構築は、O プログラム (Jones et al., 1991)を用いて行った。非対称単位の２つの分子において相異なるコンフォメーションにある幾つかの残基を除き、厳しい非結晶学的制限をSPドメインに適用した。最終モデルは、分子 Aの残基 362-440および445-686、および分子 Bの366-412、416-441および445-686を含む。構造の立体化学は、PROCHECK (Laskowski et al 1993)により評価した。精密化統計は表１に示す。

原子座標および構造因子は、Protein Data Bankにアクセションコード1q3xにて登録された。

図は、プログラム MOLSCRIPT (Kraulis, 1991)、Raster3D (Merritt and Bacon, 1997)およびSwiss-PDBViewer (Guex and Peitsch, 1997)を用いて生成させた。分子表面は、プログラム GRASP (Nicholls et al., 1991)を用いて生成させた。構造アラインメントは、O プログラムおよびSwiss-PDBViewerを用いて行った。表面エリアは、プログラム SURFACE (Lee and Richards, 1971)を用いて計算した。

実施例2
MASP-2触媒C4沈着の阻害についてのアッセイ
このアッセイは、３つの工程により構成させる 1) マンナンコートマイクロタイターウェルの調製、2) マンナンコートウェルへのrMBLおよびrMASP-2の結合、3) MASP-2触媒C4沈着の阻害についてのスクリーニング。

1) マンナンコートマイクロタイターウェルの調製:
96ウェルマイクロタイタープレート (FluroNunc, Nalgene Nunc Int., Denmark) を、コーティングバッファー (Na₂CO₃: 3.18 g/L; NaHCO₃: 5.86g/L; HClによりpH 9.6に調整)中のマンナン (10 mg/L, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)にて4℃で一晩コートする。ウェルをTBS (10mM Tris, 150mM NaCl, HClによりpH 7.4に調整)にて２回洗浄する。1 mg/mLのヒトアルブミン(State Serum Institute, Copenhagen Denmark)を添加した上記バッファーにおいて室温で１時間インキュベートし、ウェルをブロックする。ウェルをTBST＋Ca²⁺ (10mM Tris, 150mM NaCl, 10mM CaCl₂ ; 0.05%Tween 20, HClによりpH 7.4に調整、以降洗浄バッファー)にて３回洗浄すれば、使用可能な状態となる。

2) マンナンコートウェルへのrMBLおよびrMASP-2の結合:
0.8ng/ウェルの組換え精製ヒトHisタグ化MASP-2および1ng/ウェルの組換え精製ヒトMBLを、1 mg/mLのヒトアルブミン(State Serum Institute, Copenhagen Denmark)を添加した上記洗浄バッファーにおいて4℃で一晩インキュベートすることによって、マンナンコートマイクロタイターウェルに結合させる。その後ウェルを洗浄バッファーにて３回洗浄すれば、使用可能な状態となる。

3) MASP-2触媒C4沈着の阻害についてのスクリーニング:
阻害活性についてスクリーニングすべき化合物を、1 mg/mLのヒトアルブミン(State Serum Institute, Copenhagen Denmark)を添加した上記洗浄バッファー中にて、マンナンコートマイクロタイターウェルに結合したrMBL/rMASP-2に添加し、室温で1時間インキュベートする。ウェルを洗浄バッファーにて３回洗浄し、バッファー （バルビタールナトリウム (5 mM)、NaCl (181 mM)、CaCl2 (2.5mM) 、MgCl2 (1.25 mM) 、pH 7.4、1mg/mLのヒトアルブミン (State Serum Institute, Copenhagen Denmark)を使用前に添加）中にて、37℃で1.5時間、精製ヒト補体成分 C4 (約1.5-2 ng/mL)とインキュベートする。ウェルを洗浄バッファーにて3回洗浄し、0.89 mg/Lのビオチニル化ウサギ抗ヒト補体成分 C4c (Dako, Denmark, 標準的方法によりビオチニル化)を添加する。ウェルを室温で1時間インキュベートし、洗浄バッファーにて3回洗浄する。ユーロピウム標識ストレプトアビジン (Wallac, Turku, Finland) を、濃度0.1 mg/Lにて、カルシウムを除き50 μM EDTAを含めた上記洗浄バッファーに添加する。ウェルを室温で1時間インキュベートし、洗浄バッファーにて3回洗浄する。100μLのDelfia Enhancement Solution (Perkin Elmer Wallac, Norton, USA)を添加してウェルをデベロプし、環状シェーカーにて室温で５分インキュベートする。ウェルを Wallac Victor 2^d Multi counter 1420 (Wallac, Turku, Finland)にてカウントする。

阻害は、阻害物質が添加されていないウェルと比較して減少したカウントとして観察される。

実施例３
完全血清におけるMASP-2触媒C4沈着の阻害についてのアッセイ
解析すべき血清サンプルを、上記バルビタールバッファーにて250倍(最終濃度)に希釈し、C4 を添加する(1.5-2 ng/mL, 最終濃度)。阻害活性についてスクリーニングすべき化合物を添加し、サンプル5分から2時間の間37℃にてインキュベートする。通常、インキュベーションは15分である。前述のように調製したマンナンコートマイクロタイターウェルに100μlを添加し、37℃で1.5時間インキュベートする。ウェルを上記洗浄バッファーにて3回洗浄し、0.89 mg/Lのビオチニル化ウサギ抗ヒト補体成分 C4cを添加する (Dako, Denmark、標準的方法によりビオチニル化)。ウェルを室温で1時間インキュベートし、洗浄バッファーにて3回洗浄する。ユーロピウム標識ストレプトアビジン (Wallac, Turku, Finland) を、濃度 0.1 mg/Lにて、カルシウムを除き50 μM EDTAを含めた上記洗浄バッファーに添加する。ウェルを室温で1時間インキュベートし、洗浄バッファーにて3回洗浄する。100μLのDelfia Enhancement Solution (Perkin Elmer Wallac, Norton, USA)を添加してウェルをデベロプし、環状シェーカーにて室温で５分インキュベートする。ウェルを Wallac Victor 2^d Multi counter 1420 (Wallac, Turku, Finland)にてカウントする。

実施例4
相互作用化合物の設計
2.1.部位マップの生成
活性部位に補完的な特徴点（feature point）は、内部開発ソフトウェアツールを用いてコンピュータにより計算する。例えば、水素結合ドナーの特徴は、タンパク質活性部位における水素結合アクセプターの近くにマッピングされる。3D 座標およびラベル (アクセプター、ドナー、陰性、陽性、疎水性、および芳香族性) の収集物が、部位マップ（site map）と呼ばれる。技術的には、部位マップは、コンピュータにより別個に計算された３つのマップ、ESMap（静電的特徴点(P、NおよびH)を含む）、HBMap（水素結合特徴点 (DおよびA)を含む）およびAroMap（芳香族性特徴点(Ar)を含む）、の結合である。

静電的特徴マップ、ESMap、は、はじめに、プログラム PASS (Brady et al., 2000)において用いられる球体配置（sphere placement）アルゴリズムによって、コンピュータにて計算される。それは、タンパク質表面にそって埋没した容積（volume）の領域に、均等に分布した出発点（setof point） (ProbeMap)を生成させる。ProbeMapにおける点のサブセットには、タンパク質の局所的静電的特性に依存して、P、NおよびH 特徴点が含まれる。CVFF 分子力学力場を使用して、ProbeMapの各点iでの静電ポテンシャル、φiを、ProbeMapにおける全ての点について平均した平均ポテンシャルφおよび平均マグニチュード | φ |と共に、コンピュータにて計算する。φiの値は、点iがP、NまたはH 特徴点として含まれるか否かを、以下の定義にしたがい決定する。
φi ＞φ+1.5*σ(φ), i＝N 特徴点
φi ＞φ.1.5*σ(φ), i＝P 特徴点
|φ|.1.0*σ(|φ|)＜|φi|＜φ|+1.0* σ(|φ|),
i=H 特徴点

ここで、σ(X)は、量Xの平均についての標準偏差を意味する。これは、活性部位の全体的静電的環境に関して点の割り当てを正規化する。これは、特徴点割り当てを不当にゆがめることから、非荷電中性タンパク質構造 (結晶構造において解析されていない、または存在しない対イオンから生じうる) を提示する。

水素結合特徴マップ、HBMap、は、タンパク質の既知の水素結合原子から補完点を外側へ投影することによって決定される。得られる点のスーパーセットは、立体的衝突（steric clash）、不十分な埋没（burial）および同様の特徴点の最小限の近接に基づき、選別される。理想的水素結合点は、PDBにおいて観察される平均角度および距離に基づき位置決定される(例えば表３参照)。タンパク質と衝突する点は除かれる。しかしながら、ロバスト性（robustness）のため、重要な可能性ある水素結合位置を保持するために小さな位置的摂動（positional perturbation）が適用される。分岐水素結合点は、中程度にまたは強く水素結合に関与すると考えられるタンパク質原子の間で等しく分岐した点の完全な環を調べることによって、コンピュータにより発見される。

そのような環上の点は、それらが立体的衝突、埋没、および相互接近の条件に違反しない限り、分岐HB点として保持される。最終のHBMapを構築するため、理想および分岐のHB点の残ったセットを組み合わせて、相互接近に基づき選別にかける。

芳香族性特徴点のAroMapセットは、コンピュータにて、ベンゼン環をタンパク質活性部位に繰り返しドッキングさせトップスコアの立体配置の重心を保持することをによって、計算される。タンパク質は、極性水素CVFF力場を用いて示される。ドッキングは、局所最適化モード（local optimization mode）にて行われる。相異なる出発位置を用いて、１００の別々の局所ドッキングのトライアルを行う。スコアが最低エネルギー立体配置の5 kcal/molのエネルギーウィンドウ内であるドッキングした立体配置は、いずれもAroMapに含まれる。再度、埋没および相互接近に基づき、点を選別する。

2.2. ファーマコフォアのシグネチャー（signature）への変換
ファーマコフォアは、活性部位における特徴点に基づき、特徴点のすべての2、3、および4点サブセットの網羅的列挙により生成される。特徴点のすべてのペアについて、3D空間におけるそれらの距離が、前もってコンピュータにより計算される。ファーマコフォアの個別の表示に至るため、使用者の規定したビニングスキーム（binning scheme）を適用し、その距離をビニングする。4点ファーマコフォアの掌性をコードすることによってキラリティを示す。最大４つの特徴および距離の可能性ある組み合わせがいずれも表示されるように、各ファーマコフォアを独自のアドレス上にマッピングする。そのアドレスはファーマコフォアのバイナリ表示（binary representation）に使用され、シグネチャーと呼ばれる。シグネチャーの長さは、4点ファーマコフォアのコードについての最も可能性あるアドレスである。シグネチャーにおけるすべてのビットは、はじめ0にセットされる。ファーマコフォアを表示するため、シグネチャーにおけるそれぞれのアドレスでのビットをオンにする（1にセットする）。活性部位の表示のため、すべてのファーマコフォアを網羅的に列挙し、それぞれのビットをオンにする。

2.3. 複数の構造についてのシグネチャーの統合
複数のシグネチャーは、組み合わせることができる。複数のシグネチャーのバイナリ統合により、いずれかの構造に存在するすべてのファーマコフォアを表示するシングルビットストリング（single bit string）が生じる。コンセンサス閾値（consensus threshold） c はいずれも、複数の活性部位のコンセンサス表示の規定に使用可能である。すなわち、ファーマコフォアは、活性部位コンフォメーションの少なくともcに存在する。複数の活性部位のスナップショットを扱うこの方法は極めて好都合であることに注目すべきである。

2.4. 分子シグネチャー（Molecular Signature）
被検化合物は、以下のようにコードされる。第１に、各化合物について内部ツールを用いてコンフォーマーを作成し、その分子のほぼ完全なコンフォメーションモデルを作成する。特徴は、亜構造に基づくルールのセットを用いて割り当てられる。ファーマコフォアは、同じプロトコールにしたがいこれらの三次元特徴位置から活性部位について列挙され、それによりバイナリコーディングの適合性が保証される。しかしながら、複数のコンフォーマーがここに同時に表示されなければならない。これは、ある化合物の全てのコンフォーマーにわたって、１つのコンフォーマーについてのファーマコフォアの網羅的列挙を１つの追加ループ（extra loop）の中に含めることによりなされる。すなわち、ある化合物のいずれのコンフォーマーにおけるいずれのファーマコフォアも、シグネチャー中のそれぞれのビットをオンにすることによって表示される。

2.5. 分子シグネチャーマスキング
活性部位のバイナリ表示および同様に規定した分子のバイナリ表示を用いると、あるアドレスでのビットの意味は同じとなる(距離ビニング（distance binning）の許容範囲内にある、同じファーマコフォアとなる）。それゆえ、設計空間（design space）を表示することは、すべての分子シグネチャーを活性部位シグネチャーによりマスキングするという意味になる。シグネチャーをマスキングするとは、部位シグネチャーおよび分子シグネチャーのビットの論理積（logical and）を得ることを意味する。所定の分子について、活性部位に存在しないファーマコフォアを表すビットはオフされるが、活性部位内のファーマコフォアのビットは、分子におけるそれらの存在または不在に依存してオンにしてもオフにしてもよい。この方法では、活性部位によって規定されたファーマコフォア空間のみを考慮する。

2.6. インフォマティブライブラリー設計
インフォマティブ（Informative）ライブラリー設計は、所定の仮想ライブラリーに対する情報の返還（information return)を最適化する分子選択方法である。その目標は、特定の被検化合物に対する活性を決定する特徴のセット(ファーマコフォア)を検出することである。インフォマティブ設計は、得られるサブセットが相異なる、しかし重複ことになる手法にて被検化合物を検索するように、化合物のセットを選択することを目的とする。分子は、設計空間内の各ファーマコフォアがセットの分子において特有の出現パターンを有するように、合成およびスクリーニングのため選択される。この特有の「コード」により、化合物のセットをアッセイする場合に、実際の実験結果とは関係なく、重要なファーマコフォアの同定および保持が可能となる。これは、各分子において特有のファーマコフォア出現パターンを形成しようとする様々な方法と対照的である。

ある設計空間が与えられると、アルゴリズムは、ファーマコフォアクラスの大きさ全域で最もスムーズな分布により、できるだけ多くのファーマコフォアを解読することを最適化しようとする。ファーマコフォアクラスとは、すべてが同じコードまたはパターンを有するファーマコフォアのサブセットを意味する。最適解は、個々の各ファーマコフォアを解読可能にする化合物のセットであることに注目すべきである。しかしながらこれは、ソースプール、ビット一致（bit correlation）、または限定された選択のサイズのいずれかのため、不可能かもしれない。分子選択に関する束縛のない最適化のためのコスト関数（cost function）は、クラス分布のエントロピーである。エントロピーは、以下の式によって与えられる

（ここでHは特徴クラスのエントロピーであり、Cは相異なるクラスの数であり、fは設計空間における特徴の数であり、｜c｜はクラス iのサイズである。最適化の間、Hを最大とするように分子が選択される。

実施例5
MASP-2のCCP-2およびセリンプロテアーゼドメインの三次元モデルは、表３の結晶学的座標に基づき構築できる (実施例1も参照)。その分子モデリングは、市販の InsightII 2000 20 および SYBYL 6.2 21 ソフトウェアパッケージを用いて達成される。量子化学計算は、Gaussian 98. 22 を用いて実行される。コンピュータ作業はすべて、Silicon Graphics workstation (Indigo II and O2)において行われる。活性部位の大きさおよび空間配向は、InsightII内のBinding Site Analysisモジュールにおいて使用される格子解析により同定される。ポリペプチドをサーチするための格子の大きさは、1 Å x 1 Å x 1 Åにセットされる。ポリペプチドにおける溶媒アクセス可能表面はすべて、格子点により満たされ、少なくとも125の格子点を有するもののみが可能性ある化合物結合部位として許容される。化合物の結合に必要な活性部位中の重要な領域を探索するため、Multiple copy simultaneous search (MCSS) プログラムを用いて、ポリペプチドの活性部位中の所定の官能基の、エネルギー的に好ましい位置および配向を計算する。MCSS計算のため選択される官能基は、疎水性官能基、極性官能基および溶媒を示す、ベンゼン、プロパン、シクロヘキサン、フェノール、メタノール、エーテル、および水である。所定の官能基のレプリカは結合部位内部にランダムに分布し、そして同時かつ独立にエネルギー最小化される。分子ペアは、それらの間の二乗平均平方根偏差 (rmsd) が0.2 Å未満の場合に同一と考えられ、そのような場合、ペアの一方は除かれる。上記プロトコールは、活性部位を完全にサーチできるように、各官能基について例えば10回繰り返すことができる。計算はすべて、CHARMM 22 力場 および MCSS 2.1 プログラム.24を用いておこなうことができる。

新規設計プログラム LUDI を用いて、化合物結合に重要な活性部位中の領域をさらに探索することができる。InsightII/Bindin Site Analysis モジュールにより作成された格子点は、４つの亜部位に分けられる。各亜部位の重心上に集まる6 Å半径内の残基を用いて、相互作用部位を生成させる。そのプログラムにおいて、３つの異なるタイプの相互作用部位が規定される: 親油性、水素結合ドナーおよび水素結合アクセプター。LUDIサーチの間、標準的デフォルトパラメーターおよびそのプログラムにより供給されるフラグメントライブラリーを使用する。

最良の被検化合物、すなわちリード分子は、MCSS 最小値のいくつかを手動で結合させることにより構築することができる。新規結合は、候補リガンドに顕著な内部の歪み（strain）が導入されないように構築される。生成された構造の合成可能性は、フラグメント連結工程中に考慮される。新規に形成されたリガンド分子は、その後、InsightII 内のDiscover 95.0 プログラムにおいてCVFF力場を使用して、剛体タンパク質においてエネルギー最小化され、内部座標（internal coordinate）が正規化される。そして、In-sightII内のAffinity モジュールにおけるフレキシブルリガンドドッキング方法を使用して、Monte Carlo ドッキングプロトコールを使用して生成された分子の最低エネルギー位置を規定する。リード分子の規定半径 (6 Å)内の原子はすべて、動くことができる。Affinity プログラムにより供給される溶媒和格子を使用する。得られる化合物/MASP-2ポリペプチドシステムが以前の構造の既定のエネルギー寛容性の内の場合、そのシステムは最小化にかけられる。得られる構造は、Metropolis基準を用いるエネルギーチェック、およびそれまでに見つかっている構造に対する新規構造のrms距離のチェックに基づき許容される。最終コンフォメーションは、500〜300 Kのシュミレーションアニーニング方法により得られ、そして5000ラウンドのエネルギー最小化を行って収束させ、ここで得られる相互作用エネルギー値を使用してランク順を規定する。リード分子の各エネルギー最小化最終ドッキング位置は、LUDIにおける相互作用スコア関数を用いて評価する。

リード分子の同定の後、該分子を合成し、インビトロにて相互作用を確認してもよい。

実施例6
インシリコ阻害物質設計に関するMASP-2結晶構造の実証（validation）
MASP-2結晶構造を実証するため、我々は、実際の研究室においていくつかの既知のプロテアーゼ阻害物質を試験した。我々は、それらのIC50値にしたがい阻害物質をランク付けした。次の段階において、我々は、インシリコにおいて幾つかの選択した阻害物質をMASP-2構造にドッキングさせ、プロテアーゼ-阻害物質相互作用の強さを計算した。計算IC50値と測定IC50値はよく一致し、これは記載されるMASP-2構造がコンピュータに基づく阻害物質設計に適することを示唆する。

組換えMASP-2の酵素活性を測定するためのインビトロアッセイの開発
MASP-2の活性に対する阻害物質の効果を測定するため、我々は、組換えMASP-2および合成基質を用いるインビトロアッセイシステムを開発した。

試薬：
1.1 酵素
プロテアーゼ活性測定において、我々は、組換えMASP-2 CCP1-CCP2-SPフラグメント (ここでMASP2_YBも設計)を使用した。MASP-2の最小触媒ユニットはCCP2-SPフラグメントである。それは、タンパク質基質 (C2およびC4) を全体分子と同程度に効率的に切断する。本研究において我々は、そのプロテアーゼドメインの活性部位に相互作用する低分子量合成基質および阻害物質を使用した。CCPモジュールは、セリンプロテアーゼドメインの構造を安定化し、フラグメントが実験操作により適するようにしている。ストック溶液は、バッファー (145 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH＝7.5)中に0.2 mg/ml MASP-2 CCP1-CCP2-SPを含む。それは4℃で数週間保存された。

1.2 基質
MASP-2はトリプシン様セリンプロテアーゼなので、LysおよびArgの後ろでポリペプチド鎖を切断する。関連補体プロテアーゼのC1rおよびC1sは、Lys-O-RまたはArg-O-R 合成基質を用いてエステラーゼとして測定することができるが、それらのアミド分解活性は測定困難である。我々の予備的実験は、組換えMASP-2が合成チオールエステル Z-Lys-S-Bzl (Sigma) 基質を容易に切断することを示した。MASP-2 CCP1-CCP2-SP について、kcat/KM値は3X104M-1s-1であった。脱離基が発色団ヘルパー基質 DTDP (4,4’-ジチオジピリジン)と反応し、得られる複合体は分光光度法により324 nmにて検出できる。
ストック溶液の濃度は以下であった：
Z-Lys-S-Bzl 〜10mM（H₂O中）、-20℃で保存；
DTDP 20mM（DMF中）、-20℃で保存。
反応バッファーは、20mM HEPES pH=7.0、5 mM CaCl₂ であった。

1.3 装置
我々は、実験データを収集、操作および保存するためのGrafit 5 ソフトウェアを実行するコンピュータにつながったサーモステータブル（thermostatable） Jasco V560 分光光度計を使用した。反応はすべて、1ml クオーツキュベットにて行った。

組換えMASP-2の活性測定のためのプロトコール
1.) 正確な基質濃度の決定
サーモスタット（thermostate）を37℃にセットし、バッファーの温度を一定にする
コンピュータをオンにして、プログラムの実行を開始する
分光光度計をオンにする
２つのキュベット(リファレンスセルおよびサンプセル)をバッファーで満たす
パラメーターをセットする: 波長(324nm)、データファイルの位置
ゼロ点をセットするためAuto zeroを使用する
サンプルキュベットに985μlのバッファーを添加する
5μlのトリプシンストック溶液を添加する (c=0.5μg/ml)
測定プログラムを開始する
5μlの発色試薬DTDPストック溶液を添加する
5μlの基質 (Z-Lys-S-Bzl ) ストック溶液を添加し、ウェルを混合する
トリプシンにすべての利用可能な基質を切断させる(約2分)
以下の式を用いて実際の基質濃度を計算する：
C=200 (最大吸収)/ε324
ε324=19800M-1cm-1
2.) MASP-2活性の測定
バッファーをキュベットに添加する (985 μl)
MASP-2ストック溶液を添加する (5 μl)
反応混合物を37℃で30分間インキュベートする
基質濃度の２倍のモル濃度のDTDPを添加し、データ収集を開始する
基質ストック溶液を添加する
反応速度 (dAbs/dminを測定)を約200秒間測定する
曲線のはじめの部分(約10-20秒)に直線を適合させることにより反応速度を決定する
3.) 阻害物質の存在下におけるMASP-2活性の測定
バッファーをキュベットに添加する
5μlのMASP-2ストック溶液を添加する
適切な容量の選択した阻害物質を添加する(有機溶媒の容量は全反応容量の5%を超えてはならない)
ウェルを混合し、酵素を阻害物質とともに30分間37℃でインキュベートする
前節に記載のように進める
4.) 最適基質濃度の決定
阻害物質の効果が容易に検出可能な基質の最適作用濃度を決定するため、我々は様々な基質濃度にて酵素活性を測定した。

結論: 我々は、飽和に至らず、かつ良好な測定可能シグナルを生じることから、150μMの基質濃度を選択した。IC₅₀値は基質濃度に依存するので、以下の測定はすべて150μMの基質 (Z-Lys-S-Bzl)濃度で行ったことに注意することは重要である。

2. 組換えMASP-2の活性に対する幾つかのプロテアーゼ阻害物質の効果の測定
我々は、IC₅₀測定のため、９つのプロテアーゼ阻害物質を選択した:

表６に、９つの選択した阻害物質の、提案される作用濃度を含むいくつかの重要な特徴をまとめる。

阻害物質ストック溶液は、分注して-20℃にて保存し、過度の凍結融解サイクルを防止した。 MASP-2は、プロトコールに述べるように、活性測定の前に阻害物質と30分間37℃でインキュベートした。データポイントはすべて、３つの独立の測定の平均である。

2.1 PMSF
フェニルメチルスルホニルフルオライド
Mw=174.2 Da
セリンおよびシステインプロテアーゼの不可逆的阻害物質
７つの相異なる阻害物質濃度を試験し、Grafit 5 プログラムを用いて非線形曲線適合法（nonlinear curve fitting）によりIC₅₀を計算した。IC₅₀決定のためのデータセットを表７および図７に示す。

PMSFのIC₅₀は16.4μMである。

2.2 Pefabloc-SC
4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオライド
Mw=239.7 Da
セリンプロテアーゼの不可逆的阻害物質
１０の相異なる阻害物質濃度を試験し、Grafit 5 プログラムを用いて非線形曲線適合法によりIC₅₀を計算した。IC₅₀決定のためのデータセットを表８および図８に示す。

Pefabloc-SCのIC₅₀は221.7μMである。

2.3 ベンズアミジン
Mw=156.6 Da
セリンプロテアーゼの可逆的阻害物質
８つの相異なる阻害物質濃度を試験し、Grafit 5 プログラムを用いて非線形曲線適合法によりIC₅₀を計算した。IC₅₀決定のためのデータセットを表９および図９に示す。

ベンズアミジンのIC₅₀は0.688 nMである。

2.4 NPGB
p-ニトロフェニル p’-グアニジノベンゾアート
Mw=336,74 Da
セリンプロテアーゼの可逆的阻害物質
９つの相異なる阻害物質濃度を試験し、Grafit 5 プログラムを用いて非線形曲線適合法によりIC₅₀を計算した。IC₅₀決定のためのデータセットを表１０および図１０に示す。

NPGBのIC₅₀は229.6 nMである。

2.5 APMSF
4-アミジノ-フェニルメタン-スルホニルフルオライド
Mw=252.7 Da
セリンプロテアーゼの不可逆的阻害物質
１０の相異なる阻害物質濃度を試験し、Grafit 5 プログラムを用いて非線形曲線適合法によりIC₅₀を計算した。IC₅₀決定のためのデータセットを表１１および図１１に示す。

APMSFのIC₅₀は11.0μMである。

2.6 ロイペプチン
アセチル-Leu-Leu-Arg-al
Mw=426.6 Da
セリンおよびシステインプロテアーゼの可逆的阻害物質
８つの相異なる阻害物質濃度を試験し、Grafit 5 プログラムを用いて非線形曲線適合法によりIC₅₀を計算した。IC₅₀決定のためのデータセットを表１２および図１２に示す。

ロイペプチンのIC₅₀は7.7μMである。

2.7 E64
トランス-エポキシルスクシニル-L-ロイシルアミド(4-グアニジノ)-ブタン
Mw=357.4
システインプロテアーゼの不可逆的阻害物質
４つの相異なる阻害物質濃度を試験し、Grafit 5 プログラムを用いて非線形曲線適合法によりIC₅₀を計算した。IC₅₀決定のためのデータセットを表１３および図１３に示す。

E64は非常に弱いMASP-2の阻害物質であり、比較的高い阻害物質濃度でも効果が低い。プログラムにより、IC₅₀値を計算する(0.87 mM)。

2.8 キモスタチン
N-(Nα-カルボニル-([S,S]- α-(2-イミノヘキサヒドロ-4-ピリミジル)-グリシン)-X-Phe-al)-Phe X=Leu/Val/Ile
Mw=604.7 Da
セリンプロテアーゼの可逆的阻害物質
５つの相異なる阻害物質濃度を試験した。E64のように、MASP-2に対するキモスタチンの阻害作用は無視できる程度である (表１４のデータを参照)。

2.9 εACA
ε-アミノカプロン酸
Mw=131.2 Da
セリンプロテアーゼの可逆的阻害物質
５つの相異なる阻害物質濃度を試験した。E64およびキモスタチンのように、MASP-2に対するεACAの阻害作用は無視できる程度である (表１５のデータを参照)。

IC₅₀測定の結果のまとめ
以下の表１６に、９つの相異なる阻害物質を用いた我々の測定の結果をまとめる。阻害物質は、それらのIC₅₀値にしたがいランク付けする (＃1が最小のIC₅₀値を有し、それゆえ最良の阻害物質である)。

NPGBが、ナノモル範囲のIC₅₀を有する最良の阻害物質である。ロイペプチンは、NPGBより１桁大きいIC₅₀値を有するが、それでも非常に強力な阻害物質である。２つの関連阻害物質であるPMSPおよびAPMSFは、実際的に同じ阻害効果を示す。驚いたことに、新規に開発された非常に強力なセリンプロテアーゼ阻害物質であるPefabloc-SC (トリプシンおよびキモトリプシンに対するIC₅₀値は、それぞれ81μMおよび44μMである)は、MASP-2の平均的阻害物質である。ベンズアミジンは、小さいものの非常に特異的なセリンプロテアーゼ阻害物質である。３つの阻害物質は、実質的に阻害効果を示さなかった。E64は、システインプロテアーゼの阻害物質であり、セリンプロテアーゼを通常阻害しない。キモスタチンおよびεACAはセリンプロテアーゼ阻害物質であるが、組換えMASP-2の活性に対するそれらの阻害効果は、無視できる程度である。

3. ドッキングプログラムパッケージの適応および組換えMASP-2構造に対するインシリコスクリーニングプロトコールの開発
MASP-2の結晶構造を実証するため、我々は３つの異なる阻害物質 (ベンズアミジン、ロイペプチンおよびNPGB)を用いてドッキング手法を行った。これら阻害物質のIC₅₀値は、以前にインビトロ酵素活性アッセイを用いて測定している（前述）。我々は、我々の阻害物質の測定値とインシリコドッキングの結果とを比較した。AutoDock 3.05を阻害物質のMASP-2へのドッキングに使用し、データプレプロセシングに幾つかの他のプログラムを使用した。

3.1 データプレプロセシング:
3.1.1 酵素
酵素の3D構造は、部分電荷および溶媒和パラメーターを伴うpdbqs (Protein Data Bank)フォーマットであった。我々は、SYBYL 6.3によりMulliken電子密度解析法を用いてMASP-2のX線結晶構造 (pdb コード :1q3x)に部分電荷を割り当てた。酵素上の全体の電荷は、-11 eである。構造をmol2 ファイルフォーマット (/m-kollnolp.mol2)にて保存し、その後awkスクリプトmol2topdbqによりpdbqフォーマットに変換し、/m-kollnolp.pdbqとして保存した。
Autodockは、結合の自由エネルギーを計算するのに溶媒和パラメーターを必要とする。我々は、ADDSOL (Autodock 3.0パッケージ) プログラムにより溶媒和パラメーターを割り当て、結果を /m-kollnolp.pdbqsとして保存した。

3.1.2 阻害物質
阻害物質の構造もまた、pdbq ファイルフォーマットであった。SYBYL 6.3を使用してAM1 半経験的計算により阻害物質の3D構造を構築し、Mulliken電子密度解析法(ログファイル: /ligands/chymostatinam1.out, /ligands/npgbgaussian.out)により電荷を割り当てた。阻害物質は柔軟になるよう処理されたので、我々はAutotors (Autodock 3.0パッケージ)によりその分子の活性なねじれを規定した。以下の座標ファイルを阻害物質に使用した。

ベンズアミジン
名前: ベンズアミジン
Mw: 156.6 Da
ベンズアミジンの全体の電荷は＋1 eであり、2つの活性な回転可能結合を原子: C7_7、N1_8の間、並びにA1_1およびC7_7の間に有する。
ベンズアミジンの構造を図１４に示す。
ベンズアミジンの構造の座標ファイル(/ligands/ben.pdbq):

ロイペプチン
名前: アセチル-Leu-Leu-Arg-al
Mw: 426.6 Da
ロイペプチンの全体の電荷も+1 eであり、19の活性なねじれ角を有する。活性なねじれの位置はREMARKの列において挙げた。
ロイペプチンの構造を図１５に示す。
ロイペプチンの構造の座標ファイル(/ligands/leupeptin.pdbq):

NPGB
名前: p-ニトロフェニル-p-グアニジノベンゾアート
Mw: 336,74 Da

NPGBの全体の電荷は+1 eであり、７つの活性なねじれを有する。
NPGBの構造を図１６に示す。
NPGBの構造の座標ファイル(/ligands/npgb.pdbq):

3.2 ドッキング
我々は、ドッキングにAutoDock 3.05 プログラムを使用した。このプログラムをソースコードとして獲得し、デュアルLinuxワークステーション (dual 2.8GHz Xeon, 1GB RAM, RedHat 9.0 OS)上にコンパイルした。
文献に基づき、我々はLamarckian Genetic Algorithm (LGA) ドッキングストラテジーを使用した。主なパラメーターは以下である:

我々はすべてのドッキングを200回行い、十分なデータを収集し、最も可能性の高いドッキングコンフォメーションを選択した。ドッキングについてのさらなるパラメーターをドッキングパラメーターファイルに挙げる (/ben/ben.m-kollnolp.LGA.dpf, /leupeptin/ leupeptin.m-kollnolp.LGA.dpf, /npgb/npgb.m-kollnolp.LGA.dpf)。
ドッキングパラメーターファイル:
seed pid time ＃ ランダムジェネレーターに対するシード（seed）
types CANOH ＃ 原子タイプ名
fld m-kollxnolp.maps.fld ＃ 格子_データ_ファイル
map m-kollxnolp.C.map ＃ 原子特異的親和性マップ
map m-kollxnolp.A.map ＃ 原子特異的親和性マップ
map m-kollxnolp.N.map ＃ 原子特異的親和性マップ
map m-kollxnolp.O.map ＃ 原子特異的親和性マップ
map m-kollxnolp.H.map ＃ 原子特異的親和性マップ
map m-kollxnolp.e.map ＃ 静電マップ
move npgb.pdbq ＃ 小分子
about 1.1545 -0.1113 0.0793 ＃ 小分子中心
tran0 random ＃ 初期座標/Aまたはランダム
quat0 random ＃ 初期四元数（quaternion）
ndihe 7 ＃ 活性なねじれの数
dihe0 random ＃ 初期二面角（initial dihedrals）(相対)またはランダム
tstep 2.0 ＃ 変形（translation）工程/A
qstep 50.0 ＃ 四元数工程（quaternion step）/deg
dstep 50.0 ＃ ねじれ工程（torsion step）/deg
torsdof 5 0.3113 ＃ ねじれの自由度および計数（coeffiecent）
intnbp_r_eps 4.00 0.0222750 12 6 ＃ C-C lj
intnbp_r_eps 4.00 0.0222750 12 6 ＃ C-A lj
intnbp_r_eps 3.75 0.0230026 12 6 ＃ C-N lj
intnbp_r_eps 3.60 0.0257202 12 6 ＃ C-O lj
intnbp_r_eps 3.00 0.0081378 12 6 ＃ C-H lj
intnbp_r_eps 4.00 0.0222750 12 6 ＃ A-A lj
intnbp_r_eps 3.75 0.0230026 12 6 ＃ A-N lj
intnbp_r_eps 3.60 0.0257202 12 6 ＃ A-O lj
intnbp_r_eps 3.00 0.0081378 12 6 ＃ A-H lj
intnbp_r_eps 3.50 0.0237600 12 6 ＃ N-N lj
intnbp_r_eps 3.35 0.0265667 12 6 ＃ N-O lj
intnbp_r_eps 2.75 0.0084051 12 6 ＃ N-H lj
intnbp_r_eps 3.20 0.0297000 12 6 ＃ O-O lj
intnbp_r_eps 2.60 0.0093852 12 6 ＃ O-H lj
intnbp_r_eps 2.00 0.0029700 12 6 ＃ H-H lj
outlev 1 ＃ 診断アウトプットレベル
rmstol 0.5 ＃ クラスター_トレランス/A
extnrg 1000.0 ＃ 外部格子エネルギー
e0max 0.0 10000 ＃ 最大初期エネルギー（max initial energy）; リトライの最大数（max number of retries）
ga_pop_size 100 ＃ 集団中の個々の数
ga_num_evals 25000000 ＃ エネルギー評価の最大数
ga_num_generations 27000 ＃ 生成の最大数
ga_elitism 1 ＃ 次の生成へと残る上位の個々の数
ga_mutation_rate 0.02 ＃ 遺伝子変異率
ga_crossover_rate 0.8 ＃ クロスオーバー率
ga_window_size 10 ＃
ga_cauchy_alpha 0.0 ＃ Cauchy分布のαパラメーター
ga_cauchy_beta 1.0 ＃ Cauchy分布のβパラメーター
set_ga ＃ GAまたはLGAについて上記パラメーターをセット
sw_max_its 300 ＃ Solis ＆ Wets ローカルサーチの反復
sw_max_succ 4 ＃ rho変化の前の連続的成功
sw_max_fail 4 ＃ rho変化の前の連続的失敗
sw_rho 1.0 ＃ サンプルに対するローカルサーチ空間のサイズ
sw_lb_rho 0.01 ＃ rho上の低い方の限界（lower bound on rho）
ls_search_freq 0.06 ＃ 個々についてローカルサーチを行う可能性
set_psw1 ＃ 上記の偽Solis ＆ Wets パラメーターのセット
ga_run 200 ＃ この多数のハイブリッドGA-LSランを行う
analysis ＃ ランク付けされたクラスター解析を行う

ドッキングに必要な時間は、阻害物質の自由度を反映する。表１７にドッキングに要する時間をまとめる。

3.3 結果：
Autodockは、自由エネルギー関数を計算し、それに基づいて推定阻害定数 (Ki)を計算する。推定Ki値はIC50に比例するので、我々は測定値と計算値を比較することができる。

3.3.1 ベンズアミジン:
ベンズアミジンのドッキングの場合、我々は４つの十分に密集した近いクラスターを得たが、それは結果のログ (/ben/ben.m-kollnplo.LGA.dlg) ファイルに見られる:

最も可能性の高いドッキングコンフォメーションはRUN 133である。3D構造の座標は以下である:

200のドッキングコンフォメーションを重ね合わせた図を図１７に示す。空間的に近接する２つの別個のクラスターが存在する。

3.3.2 ロイペプチン:
ロイペプチンの場合、我々は、１つの十分に密集したクラスターを見いだし、これが最も可能性の高いドッキングクラスターを表すので、我々はこのクラスターから最も低いエネルギーの構造を選択した。
クラスタリングヒストグラム：

最も可能性の高いドッキングコンフォメーションは、RUN 100である。その3D構造の座標は以下である:

200のドッキングコンフォメーションを重ね合わせた図を図１８に示す。

3.3.3 NPGB:
NPGBは２つの近いクラスター(1 および 2)へとドッキングするので、我々はRUN 177を最も可能性の高いドッキングコンフォメーションとして使用した。

最も可能性の高いドッキングコンフォメーションは、RUN 177である。その3D構造の座標は以下である:

200のドッキングコンフォメーションを重ね合わせた図を図１９に示す。

ドッキング結果ファイル (＊.dlg)を解析することにより、幾つかの性質を得ることができる。表１８に主なドッキング結果をまとめる。

結合の推定自由エネルギーに基づき、阻害物質にランク付けすることができる。阻害物質の強さは結合の自由エネルギーに反比例するので、最強の阻害物質は最低の結合エネルギーに属する。

4. 結論
MASP-2は、補体のレクチン経路の非常に特異的なセリンプロテアーゼであり、C2およびC4タンパク質基質を切断する。本発明は、X線結晶学による、MASP-2の触媒領域 (CCP2-SP)の3D構造の解析について記載する（上記実施例１参照）。この例において、インシリコ阻害物質設計のためのX線構造の使用が実証されている。我々は、MASP-2の活性に対する９つの低分子量阻害物質の効果を測定した。実験的に決定したそれらのIC₅₀値にしたがい阻害物質をランク付けし、３つの阻害物質をインシリコドッキング研究のため選択した。それらのIC₅₀値にしたがい阻害物質を選択した: 1.) 非常に強い阻害物質 (NPGB; IC₅₀=229 nM)、2.) マイクロモル範囲のIC₅₀値を有する比較的強い阻害物質(ロイペプチン; IC₅₀=7,7μM)、および3.) 弱い阻害物質 (ベンズアミジン; IC₅₀=688 μM)。我々は、各阻害物質のIC₅₀値を、計算したKi値とともに比較した（表１９参照）。

ドッキングアプローチの結果は、研究室における実験と良く一致する。インシリコの結果によると、NPGBが最良の阻害物質であり、最小のKi値を有する。ロイペプチンについては、多少大きなKiが計算されたが、ドッキングの結果はなお、かなり良好な酵素-阻害物質相互作用を示す。ベンズアミジンの場合、ドッキング手法は、この阻害物質が非常に特異的なMASP-2の阻害物質ではないことを示す実験結果を支持する (K_i値はNPGBのものより３桁大きい）。
これらの結果は、そのMASP-2結晶構造がインシリコにおける阻害物質スクリーニングおよび設計に適することを示す。

実施例7
表４は、配列番号１のアミノ酸296〜686の一次配列を有するチモーゲンMASP-2の構造座標を含み、ここでアミノ酸R444はQに変異している。

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MASP-2 CCP2-SPフラグメントの全体構造。(A) 結晶構造の分子 A (ダークグレー)および分子 B (ライトグレー)の、SPドメインを重ね合わせた立体リボン図。CCP2モジュールのβストランドおよびC末をラベルする。３つ一組の触媒残基を棒で示し、「a.s.」とラベルする。(B)分子 AのCCPモジュールのC1s (ライトブルー) および C1r (緑)の同モジュールへの重ね合わせ（βストランドをラベル）。(C) 分子 Aの活性SPドメインのC1sおよびC1rの同ドメインへの重ね合わせ（活性部位残基を棒で示す）。ループは、Perona and Craik (1997)にしたがいラベルしている。 CCP2/SPインターフェース領域。(A) CCP2モジュールを重ね合わせた、MASP-2 分子 A (赤)、分子 B (黄色)、C1s (ライトブルー)およびC1r (CCP2-SP活性形態: ライトグリーン)の骨格コンフォメーションを示す。インターフェース接触のトポロジーにおける相違により、MASP-2の活性部位(空間充填表示で示されるセリン c195 側鎖; CCP2-SPチモーゲンについてはミディアムグリーン、CCP1-CCP2-SP チモーゲンではダークグリーンで示される) は、C1rおよびC1sのものと比較して顕著にシフトしている。B-D は、Aの図を90°回転した図（側面図）を表す。MASP-2 分子 A (B)、分子 B (C) 、およびC1s (D) のCCP2/SPインターフェース 領域を示す。MASP-2においてドメイン間接触を形成する残基、およびC1sの対応する残基を、球および棒にて示す。MASP-2において、これら残基は水素結合ネットワーク(緑の点線で示す)を形成するが、これはC1sでは構築されない。明瞭にするため、いくつかの側鎖原子は示しておらず、炭素原子およびSPドメインのリボン表示を青で示し、分子間リンカーのものを黄色で示し、N末ループおよびB1はローズで、CCP2モジュールの残りはオレンジで、それぞれ示す。 MASP-2の基質結合亜部位。(A) 天然基質: MASP-2、C2およびC4、並び偽基質 C1 阻害物質について、P4-P4’セグメントの配列を示す。 (B) MASP-2基質結合亜部位領域の分子表面の立体図を残基タイプにより着色する（酸性: 赤、塩基性: 青、極性: 黄色、疎水性: グレー)。C2のP4-P2’残基を表すモデルペプチド (棒で描写)をMASP-2構造に重ね合わせて示す。 C4d上のMASP-2およびC1sの可能性ある結合部位。MASP-2 CCP2モジュール (A) および C1s CCP2モジュール (B) の分子表面を同じ観察点から示し、静電ポテンシャルについて着色している (赤: 陰性、青: 陽性)。MASP-2およびC1sの間で保存された荷電残基をラベルする。結晶構造において無秩序な側鎖を加えた。 (C) C4dの可能性あるCCP結合部位上に重ね合わせたMASP-2 (マゼンダ) および C1s (ライトブルー) リボン表示を背面から示す。モデルは、C3dとC4dの間の構造的相同性に基づき構築している。C4dの分子表面表示を静電ポテンシャルについて着色し (赤: 陰性、青: 陽性)、MASP-2/C1s CCP2モジュールと静電相互作用を形成しているであろう残基をイタリックにてラベルする。側鎖 C1s E356 / MASP-2 E378 のコンフォメーションは調節した。(D) 重ね合わせた構造の側面図。C4dのリボン表示はライトパープルで示し、そのCおよびN末およびチオエステル領域をラベルしており、一方MASP-2およびC1sはそれぞれマゼンダおよびライトブルーで示す。 個々のドメインを示すMASP-2の略図。 MASP-2における個々のドメインの存在を示す、ヒトMASP-1、MASP-2、C1rおよびC1s配列のアラインメント。４種類のタンパク質において保存されているアミノ酸をさらにアスタリスクで示す。 図７は、PMSFおよびMASP2_YBのIC₅₀測定を表す。 図８は、PefablockおよびMASP2_YBのIC₅₀測定を表す。 図９は、ベンズアミジンおよびMASP2_YBのIC₅₀測定を表す。 図１０は、NPGBおよびMASP2_YBのIC₅₀測定を表す。 図１１は、APMSFおよびMASP2_YBのIC₅₀測定を表す。 図１２は、ロイペプチンおよびMASP2_YBのIC₅₀測定を表す。 図１３は、E64およびMASP2_YBのIC₅₀測定を表す。 図１４は、ベンズアミジンの構造を表す。 図１５は、ロイペプチンの構造を表す。 図１６は、NPGBの構造を表す。 図１７Ａは、200の、MASP-2の基質結合ポケットにおけるベンズアミジンのドッキングコンフォメーションの重ね合わせ図を示す。近接する２つの別個のクラスターが存在する。図１７Ｂは、MASP-2の基質結合ポケットにおけるベンズアミジンの構造を表す。タンパク質は表面に示され、ベンズアミジンは球および棒の表示にて示される。 図１８Ａは、200の、MASP-2の基質結合ポケットにおけるロイペプチンのドッキングコンフォメーションの重ね合わせ図を示す。図１８Ｂは、MASP-2の基質結合ポケットにおけるロイペプチンの最小エネルギーコンフォメーションを表す。タンパク質は表面に示され、ロイペプチンは球および棒の表示にて示される。 図１９Ａは、200の、MASP-2の基質結合ポケットにおけるNPGBのドッキングコンフォメーションの重ね合わせ図を示す。２つの近接するクラスターがはっきりと確認できる。図１９Ｂは、MASP-2の基質結合ポケットにおけるNPGBの最小エネルギーコンフォメーションを表す。タンパク質は表面に示され、NPGBは球および棒の表示にて示される。

Claims (58)

1. MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドの結晶。
2. ポリペプチドが該セリンプロテアーゼドメインを含む、請求項１記載の結晶。
3. 該ポリペプチドがさらにMASP-2のCCP-2ドメインを含む、請求項２記載の結晶。
4. MASP-2が配列番号１のヒトMASP-2またはその機能的ホモログであり、該機能的ホモログが配列番号１に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の結晶。
5. ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸483〜633を含む、請求項１記載の結晶。
6. ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸363〜686を含む、請求項１記載の結晶。
7. ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸363〜686、および少なくとも１アミノ酸、好ましくは約４アミノ酸の追加ペプチドより成る、請求項１記載の結晶。
8. MASP-2がアミノ酸443〜445の少なくとも１つが変異している配列番号１のヒトMASP-2である、請求項１記載の結晶。
9. 該結晶が、原子座標を決定するためX線を少なくとも5 Å、好ましくは少なくとも4 Å、より好ましくは少なくとも3 Å、さらに好ましくは少なくとも2.5 Å、最も好ましくは少なくとも2.25 Åの分解能まで回折する、請求項１記載の結晶。
10. 該結晶が、表３の構造座標またはそこから2.5 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する座標により表される空間的関係にて配置された原子を含む、請求項１記載の結晶。
11. 該結晶がa=40.950、b=41.521、c=102.994、α=96.44、β=91.77、γ=119.52の単位格子寸法を有する、請求項１記載の結晶。
12. 該結晶が、表４の構造座標またはそこから2.5 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する座標により表される空間的関係にて配置された原子を含む、請求項１記載の結晶。
13. MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを含む結晶を調製する方法であって、以下の工程を含む方法：
    i) 該ポリペプチドを提供する；
    ii) 所望により該ポリペプチドと相互作用することができる化合物を提供する；
    iii) 該ポリペプチドおよび所望により該化合物を、5〜25%の範囲のポリエチレングリコール、0.01 M〜0.5Mの範囲の塩、1〜10%の範囲のグリセロールおよび2-メチル-2,4-ペンタンジオールからなる群より選択されるアルコールを含むバッファーにおいてインキュベートする条件のもと結晶を成長させる、ここで該バッファーのpHは6〜9の範囲である；
    iv) それにより該結晶を調製する。
14. 工程iii)が5〜25℃の範囲の温度でのインキュベーションを含む、請求項１２記載の方法。
15. 該ポリペプチドがMASP-2のCCP-2およびセリンプロテアーゼドメインを含む、請求項１２記載の方法。
16. MASP-2が配列番号１のヒトMASP-2またはその機能的ホモログであり、該機能的ホモログが配列番号１に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項１２記載の方法。
17. ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸299-686を含む、請求項１６記載の方法。
18. ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸299-686および最大２０アミノ酸、好ましくは約４アミノ酸の追加ペプチドからなる請求項１６記載の方法。
19. MASP-2がアミノ酸443〜445の少なくとも１つが変異している配列番号１のヒトMASP-2である、請求項１２記載の方法。
20. 該結晶が、原子座標を決定するためX線を少なくとも5 Å、好ましくは少なくとも4 Å、より好ましくは少なくとも3 Å、さらに好ましくは少なくとも2.5 Å、最も好ましくは少なくとも2.25 Åの分解能まで回折する、請求項１２記載の方法。
21. MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドと相互作用することができる化合物を同定する方法であって、以下の工程を含む方法：
    i) 分子または分子複合体の三次元表示を作成するコンピューターシステムを提供する、ここで該コンピューターシステムは、
    機械読み取り可能データがコードされたデータ保存マテリアルを含む機械読み取り可能データ保存媒体、ここで該データはMASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150のアミノ酸を含むポリペプチドの構造座標を含む;
    該機械読み取り可能データを処理するための指示を保存するためのワーキングメモリ;
    該機械読み取り可能データを該三次元表示へと処理するため該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能データ保存媒体につながるセントラルプロセシングユニット；および
    該三次元表示を表示するための該セントラルプロセシングユニットにつながるディスプレイ、を含む；および
    ii) コンピュータがそのメモリに該ポリペプチドの分子モデルの構造座標を含むコンピュータ読み取り可能データをロードするように、該ポリペプチドの結晶の構造座標から該ポリペプチドの三次元表示を生成させるためのコンピュータに対する指示を実行する；
    iii) １以上の被検化合物の分子モデルを生成させる;
    iv) 該分子モデルから、該ポリペプチドと該１以上の被検化合物の結合により形成されうる１以上の可能性ある分子複合体を計算する、
    v) 相互作用の程度および／またはそのような相互作用の位置および／または配向を示すアウトプットデータを生成させる、
    vi) 該ポリペプチドに相互作用することができる化合物を選択する。
22. 以下の工程をさらに含む、請求項２１記載の方法：
    vii) 少なくとも１つの選択された化合物を提供する；
    viii) MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150のアミノ酸を含むポリペプチドを提供する;
    ix) 該ポリペプチドを該選択された化合物と相互作用のための条件下で接触させる;
    x) 該ポリペプチドと該選択された化合物の間の相互作用を検出し、それにより該ポリペプチドと相互作用することができる化合物を同定する。
23. 該ポリペプチドがMASP-2のCCP-2ドメインおよびセリンプロテアーゼドメインを含む、請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
24. MASP-2が配列番号１のヒトMASP-2またはその機能的ホモログであり、該機能的ホモログが配列番号１と少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
25. ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸299-686を含む、請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
26. ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸299-686および最大２０アミノ酸、好ましくは約４アミノ酸の追加ペプチドより成る、請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
27. 構造座標が、表３に示す座標、または保存されたタンパク質骨格原子に関してそこから1.5 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する座標である、請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
28. 構造座標が、表４に示す座標、または保存されたタンパク質骨格原子に関してそこから1.5 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する座標である、請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
29. 該ポリペプチド上の基質結合部位の3D表示を生成させることおよび該部位に相互作用することができる化合物を選択することを含む、請求項２１記載の方法。
30. 基質結合部位がC4結合部位である、請求項２９記載の方法。
31. 基質結合部位がC2結合部位である、請求項２９記載の方法。
32. 基質結合部位がMASP-2結合部位である、請求項２９記載の方法。
33. 基質結合部位がC1阻害物質結合部位である、請求項２９記載の方法。
34. 選択された化合物がMASP-2活性の調節物質である、請求項２１記載の方法。
35. 選択された化合物がMASP-2活性の阻害物質である、請求項２１記載の方法。
36. 選択された化合物がMASP-2活性の活性化物質または増強物質である、請求項２１記載の方法。
37. さらに以下の工程を含む、請求項２１から３６のいずれかに記載の方法：
    i) コンピュータがそのメモリにC1rのセリンプロテアーゼドメインを含む第２のポリペプチドの分子モデルの構造座標を含むコンピュータ読み取り可能データをロードするように、該第２のポリペプチドの三次元表示を該第２のポリペプチドの結晶の構造座標から生成させるためのコンピュータに対する指示を実行する；
    i) 該分子モデルから、該第２のポリペプチドと選択した１以上の被検化合物との結合により形成されうる１以上の可能性ある分子複合体を計算する；
    ii) 相互作用の程度を示すアウトプットデータを生成させる；
    iii) 該第２のポリペプチドと相互作用することができない化合物を選択する。
38. さらに以下の工程を含む、請求項２１から３６のいずれかに記載の方法：
    v) コンピュータがそのメモリにC1rのセリンプロテアーゼドメインを含む第２のポリペプチドの分子モデルの構造座標を含むコンピュータ読み取り可能データをロードするように、該第２のポリペプチドの三次元表示を該第２のポリペプチドの結晶の構造座標から作成するためのコンピュータに対する指示を実行する；
    i) 該分子モデルから、該第２のポリペプチドと選択した１以上の被検化合物との結合により形成されうる１以上の可能性ある分子複合体を計算する；
    ii) 相互作用の程度を示すアウトプットデータを生成させる；
    iii) 該第２のポリペプチドと相互作用することができない化合物を選択する。
39. MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを含む結晶および該ポリペプチドと相互作用することができる少なくとも１つの選択された化合物を調製することをさらに含む、請求項２１から３８のいずれかに記載の方法。
40. 結晶が請求項１３から２０のいずれかに記載の方法により調製される、請求項３９記載の方法。
41. 該結晶の構造が決定される、請求項３９記載の方法。
42. 該構造に起因する情報から該ポリペプチドと相互作用することができる別の化合物を調製することをさらに含む、請求項２１から４１のいずれかに記載の方法。
43. 請求項２１から４２のいずれかに記載の方法により同定された、MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150のアミノ酸を含むポリペプチドと相互作用することができる化合物。
44. MASP-2活性を阻害することができる化合物を同定する方法であって、以下の工程を含む方法：
    i) 分子または分子複合体の三次元表示を作成するコンピューターシステムを提供する、ここで該コンピューターシステムは、
    機械読み取り可能データがコードされたデータ保存マテリアルを含む機械読み取り可能データ保存媒体、ここで該データはMASP-2のCCP-2およびセリンプロテアーゼドメインを含むポリペプチドの構造座標を含む;
    該機械読み取り可能データを処理するための指示を保存するためのワーキングメモリ;
    該機械読み取り可能データを該三次元表示へと処理するための該ワーキングメモリおよび該機械読み取り可能データ保存媒体につながるセントラルプロセシングユニット；および
    三次元表示を表示するための該セントラルプロセシングユニットにつながるディスプレイ、を含む；および
    ii) コンピュータがそのメモリに該ポリペプチド上の基質結合部位の分子モデルの構造座標を含むコンピュータ読み取り可能データをロードするように、該基質結合部位の三次元表示を該ポリペプチドの結晶の構造座標から生成させるためのコンピュータに対する指示を実行する；
    iii) １以上の被検化合物の分子モデルを生成させる;
    iv) 該分子モデルから、該結合部位と該１以上の被検化合物の結合により形成されうる１以上の可能性ある分子複合体を計算する、
    v) 相互作用の程度および／またはそのような相互作用の位置および／または配向を示すアウトプットデータを生成させる、
    vi) 該結合部位に相互作用することができる化合物を選択し、それによりMASP-2活性の阻害物質を同定する。
45. 以下の工程をさらに含む、請求項４４記載の方法：
    i) 少なくとも１つの選択された化合物を提供する；
    ii) MASP-2を提供する；
    ix) 該化合物の存在下および非存在下においてMASP-2活性を測定する；
    x) 該化合物の存在下におけるMASP-2活性が非存在下よりも低い化合物を同定する。
46. 基質結合部位がC4結合部位である、請求項４４または４１のいずれかに記載の方法。
47. 基質結合部位がC2結合部位である、請求項４４または４１のいずれかに記載の方法。
48. 基質結合部位がMASP-2結合部位である、請求項４４または４１のいずれかに記載の方法。
49. 基質結合部位がC1阻害物質結合部位である、請求項４４または４１のいずれかに記載の方法。
50. MASP-2活性がC4切断である、請求項４４記載の方法。
51. MASP-2が配列番号１のヒトMASP-2またはその機能的ホモログであり、該機能的ホモログが配列番号１に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項４４から４６のいずれかに記載の方法。
52. 構造座標が、表３に示す座標、または保存されたタンパク質骨格原子に関してそこから1.5 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する座標である、請求項４４または４１のいずれかに記載の方法。
53. 構造座標が、表４に示す座標、または保存されたタンパク質骨格原子に関してそこから1.5 Å以下の二乗平均平方根偏差を有する座標である、請求項４４または４１のいずれかに記載の方法。
54. 該MASP-2のセリンプロテアーゼドメインに由来する少なくとも150の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを含む結晶および該結合部位に相互作用することができる少なくとも１つの選択された化合物を調製することをさらに含む、請求項４０から４９のいずれかに記載の方法。
55. 結晶が請求項１３から２０のいずれかに記載の方法により調製される、請求項５０記載の方法。
56. 該結晶の構造が決定される、請求項５１記載の方法。
57. 該構造に起因する情報から該結合部位と相互作用することができる別の化合物を調製することをさらに含む、請求項５２記載の方法。
58. 請求項４４から５３のいずれかに記載の方法により同定された、MASP-2活性を阻害することができる化合物。

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